CN101016557A - 体外泌香制备的麝鼠香活性组分、制备工艺及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种体外泌香制备的麝鼠香活性组分，包含七个碳到二十一个碳的环烷酮类、脂肪酸及其酯类、三个碳到三十三个碳的环烷醇类、醛类和烯类，剥取麝鼠香香腺囊、剪下皮质部分用PBS漂洗，加原代培养液制成悬液，排种在培养瓶底壁上，加入培养液培养，选择生长到致密阶段的细胞，加入胰蛋白酶进行消化，用吸管轻轻吹打细胞单层，吸出并移入另一培养瓶中，再加入培养液，恒温培养，分离出麝鼠香油状物，加入胰蛋白酶反应后，加入1，3丙二醇或丙酮，静置，分离，加入高锰酸钾，用活性炭静置再除去高锰酸钾，离心，用1，3丙二醇萃取，再除去溶剂。制备工艺简单易行，产品质量稳定，产率高，适合规模化工业生产。易于储存，是一种新动物香料及药物药材。
Description
技术领域：
本发明涉及一种体外泌香即克隆制备的麝鼠香活性组分、制备工艺及其用途，更确切的说，是涉及一种以体外培养麝鼠香囊分泌物为原料制备的麝鼠香活性组分、制备工艺及其用途。
背景技术：
天然动物香料包括麝香、灵猫香、河狸香、龙涎香和麝鼠香，麝鼠香是四大名香之后通过多年的研究发现的又一珍贵的天然动物香料新资源。天然动物香料的资源十分匮乏，其数量比例与植物香料和合成香料极不协调。资源极为稀少。天然麝香为林麝和马麝香腺囊所分泌，生产的国家也很少，每只麝产香也仅有15克左右。灵猫香为大、小灵猫的香腺囊的分泌物，灵猫在世界上的数量和香的产量也很少。河狸香更是有名无实。龙涎香为大海中抹香鲸的肠道排出，是一种漂浮不定的资源。可见天然动物香料的资源种类甚少，数量也极为有限。即使在这种情况下，麝鹿、灵猫和河狸这些动物都因濒临灭绝而被国内外有关组织列为濒危动物，其产品麝香、灵猫香和河狸香也被严禁使用。使得本来就十分缺乏的珍贵天然动物香料资源少得不能再少，形成了国内外诸多以天然动物香料生产各类产品的厂家没有原料生产其相应产品的特殊历史阶段。而麝鼠香则是由成龄雄麝鼠的香腺囊分泌，每只年产香量达到2.65±0.76克。麝鼠年产2-3胎，胎产仔6只左右，是一种繁殖速度快、饲养成本低的产香动物。麝鼠香天然动物香料新资源的利用无疑为世界提供了充足的天然动物香料来源。
麝鼠香为乳白色粘稠物，在放置过程中极不稳定，作为动物香料不能直接投放市场，必须通过酶促热反应分子修饰的加工技术，将麝鼠香转化为香气纯正、浓郁、留香持久、具有典型动物香韵味，表达出天然品优美细腻的动物香灵气的麝鼠香天然动物香料。
麝鼠香天然动物香料可以广泛地应用于日用化工、烟酒和食品及服饰等领域的调香。麝鼠香在医药上应用也更为广泛，有抗炎、促生长、降低心肌耗氧量，有防治脑血栓、脉管炎、冠心病及心脏负担过重等多方面的活性。
通过组织学、组织化学和电镜等的发现，麝鼠香腺属复管泡状腺，分腺末房和排香管两部分，分泌麝鼠香的方式为顶浆分泌。分泌的动态过程为麝鼠香在腺细胞内合成，储存聚集于胞质内，随分泌物的增加，逐渐移至细胞表面、突出，并连同部分细胞膜和胞质脱离细胞。此排香管可分为细导管、小导管、中导管和大导管四级，小导管由3-4层复层扁平上皮细胞组成，中级导管由6层复层扁平上皮细胞组成，而大导管由3层低柱状上皮细胞组成。顶浆分泌后，腺细胞在细胞器的作用下，再次进行修复、重复产生和分泌麝鼠香。麝鼠香腺腺泡分泌麝鼠香具有周期性分泌规律，周而复始地进行。
国内外的学者都在致力于研究麝鼠香替代麝香来解决目前天然动物香料资源不足的情况，通过体外细胞分泌制备麝鼠香是保障原料供应的来源之一。应用改良的细胞培养液，进行体外泌香，建立麝鼠体外生产麝鼠香的工厂化技术，在工业上大规模生产，使其广泛应用于日化、烟酒、医药和食品等方面代替麝香作为新的天然动物药材及其香料用于留香剂、定香剂及功能性食品。
发明内容：
本发明的目的在于提供体外泌香即克隆制备的麝鼠香活性组分，该组分含有环烷酮类、不饱和脂肪酸及其酯类、环烷醇类、有机醛类及烯类化合物。
本发明另一目的在于提供一种麝鼠香活性组分的制备工艺。
本发明的再一目的在于提供一种麝鼠香活性组分的用途。
本发明所述的麝鼠香活性组分的含量为：
C7-C21的环烷酮类成分 0.01％-21％
C7-C21的脂肪酸及其脂类 0.01％-16％
C3-C33的环烷醇类成分 0.1％-30％
C3-C33的醛类成分 0.01％-20％
C3-C33的烯类成分 0.01％-20％
本发明所用的麝鼠香腺，选用成年雄性麝鼠香腺囊，采用手术活体剥取麝鼠香腺囊。
本发明体外泌香制备麝鼠香活性组分的工艺包括以下步骤：
(1)原代培养(组织块培养)
1)取材：用消毒过的解剖剪取香腺组织，放入消毒过的培养皿中，用PBS溶液(氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，加水定容至1000ml)漂洗2～3次以清去血污；
2)分离组织：在培养皿中用消毒过的眼科剪将组织反复剪成0.5mm2-1mm2的小块，再用PBS吹打清洗；
3)接种：用吸管加2滴原代培养液(RPMI1640 85％、小牛血清10％、PHA0.1ml 3％、肝素10u/ml 2％、双抗500u/ml分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，每5ml培养液中加入约0.5ml新鲜血液)，用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀，制成悬液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液，将其均匀的排种在培养瓶底壁上；
4)培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入3-4ml培养液，盖好瓶塞，置于37℃恒温培养箱中培养2h-3h，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢反转培养瓶使培养液覆盖组织块，继续静放培养；
5)三天后开始对接种培养的细胞进行常规检查：将培养瓶轻轻置于倒置相差显微镜下，如果无污染且细胞生长良好，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色，此时可补加或更换培养液，10d-15d后可长成单层细胞，这时可进行传代培养；
(2)传代培养
1)倒置相差显微镜下选择生长到致密阶段的细胞，弃旧培养液；
2)用少量HanK`S液加入培养瓶中轻轻震荡后弃之，加入0.25％胰酶5-8滴进行消化，轻动培养瓶使消化液湿润整个细胞层，室温作用2min-5min，肉眼观察瓶底细胞单层，待其出现针孔般大小空隙时即可弃去消化液，若见消化程度不够，可再消化1min，若见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能弃掉消化液，应直接进行下一步骤；
3)加入3ml-4ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞单层，直到细胞脱落形成细胞悬液，吹打均匀后吸出1ml已入另一培养瓶中，再加入4ml培养液，盖好瓶盖，置37℃恒温培养箱中培养；
4)每天对传代细胞进行观察，注意是否有污染及生长情况，如生长良好可每隔3d换液一次，5d-7d可再传代；
(3)麝鼠香活性组分的制备工艺：
1)麝鼠香腺腺细胞经细胞克隆分化生产的香腺腺细胞分泌物加入一倍量的胰蛋白酶在-10℃-120℃温度下进行反应3-40小时，得混合液；
2)加混合液一倍量的1，3丙二醇或丙酮，充分混合，静置1-73小时；
3)混合液2000转/分离下层和上层溶液，加入高锰酸钾1-50mg反应0.5-100小时；
4)用0.8-10倍量活性碳静置1-36小时，除去高锰酸钾；
5)离心后置于-10℃-100℃温度下，用1，3丙二醇萃取次数为1-8次，每次加入溶液量为3-10倍，再除去溶剂所得麝鼠香活性组分为50-90％。
本发明所述的麝鼠香活性组分采用薄层层析、紫外光谱、红外光谱、气相色谱、气-质谱仪等实验手段分析，主要活性组分如表1：
表1麝鼠香苯溶性主要活性组分
| 色谱峰号 | 化合物名称 | 分子式 | 相对分子质量 | 峰面积(％) |
| 12345678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940414243 | 环十五烷酮9-烯十八酮环十六烷酮十六碳酸油酸3-甲基环十五烷酮环十七烷酮环十五烷醇9-烯环十七烷酮9-烯环十七烷酮油酸乙酯2-炔十五醇油酸2-乙基-4-戊烯酮环十六烷酮12-甲基-1，5，9，11-十三四烯环十二烷酮二甲缩醛-9，12-十八碳二烯2-炔十五醇12-甲基-1，5，9，11-十三四烯11-烯十六酸1，6，9-十四三烯2-烯十三酮1，6，9-十四三烯胆甾醇10，13-二甲基-3，8，14，17-四羟基-20-羰基-5-烯胆甾醇十八烷酮9-烯十八酮6，9-二烯十五碳醇1，2-二甲基-3，5-二(1-甲乙烯基)-环己烷3-羟基-4，4-二甲基-5，7，9-三烯胆甾烷环十七烷醇9-烯十六酸甲酯9-烯环十七烷醇9-烯环十七烷醇9-烯十六碳酸8，11，14-三烯二十碳酸环十七烷醇17-羟-17甲-15烯雄甾烷乙烯十六醇醚环十七烷醇3-乙酰化氧-4，4-二甲基-5，7，9-三烯雄甾烷二十七醇 | C15H28OC18H34OC16H24OC16H32O2C18H34O2C16H30OC17H32OC15H30OC17H30OC17H30OC20H38O2C15H28OC18H34O2C7H12OC16H24OC14H22C12H22OC20H38O2C15H28OC14H22C16H32OC14H22C13H24OC14H24C27H46OC23H3O7C18H36OC18H34OC15H28OC14H24C29H46OC17H34OC17H32O2C17H32OC17H32OC16H32O2C20H34O2C17H34OC20H32OC18H36OC17H34OC22H36O2C27H56O | 224266248256282238252226250250310224282112248190182310224190240192196192386422268266224192410254268252252254306254288268254344396 | 5.823.940.591.451.750.2717.930.923.271.830.463.444.480.430.431.100.790.570.350.260.280.350.240.283.730.264.890.433.650.460.4518.320.666.751.031.052.970.500.241.583.310.330.28 |
本发明还提供了麝鼠香活性组分在制药、食品、日用化工、烟酒服饰中的用途。
本发明所述的活性组分在制备治疗心肌缺血、缺氧、冠心病、脉管炎及抑制血小板聚集和抑制血栓形成的药物中应用。
本发明所述的活性组分为天然动物香料作为留香剂和定香剂的用途。
本发明所述的麝鼠香活性组分作为药品、食品，可以制成酊剂、软胶囊、滴丸、喷剂和片剂等剂型，服用方便。
本发明对所述的麝鼠香活性组分的药理活性的研究结果发现：
1、小白鼠ip麝鼠香120mg/kg在促进体重增长的同时，还能促进前列腺促精囊，免疫器官胸腺和脾脏的发育，说明麝鼠香促进动物生长是多方面的。
2、麝鼠香具有明显的促进肝脏中SOD的活性，提高清除因脂质过氧化产生的超氧负离子的能力，阻止过氧化脂质丙二醛的形成，减慢细胞内的脂质过氧化反应过程，显示出较强的抗衰老活性，麝鼠香的抗衰老活性呈现明显的量效关系，即口服120mg/Kg比口服60mg/Kg和30mg/Kg的抗衰老明显。
3、麝鼠香具有非常明显的稳定内环境的作用，主要体现在麝鼠香(12mg10ml试管)能对抗在0.4％低渗NaCl和0.8％的高渗NaCl溶液的去纤血溶血。通过腹腔注射麝鼠香12mg 8天，又能对抗红细胞在0.45％NaCl溶液的体内抗溶血作用。对抗红细胞膜破裂，稳定红细胞膜的作用显著。
4、麝鼠香抗溶血活性研究表明，麝鼠香可对抗0.4％-0.8％梯度的低渗和高渗溶液的溶血作用，在极低渗0.35％和0.30％仅呈现微溶血。麝鼠香具有极明显的稳定红细胞的活性。
5、麝鼠香对麻醉犬的药理活性研究结果表明，麝鼠香能降低心肌耗氧量，减少血氧的利用，降低血压，减慢心率，增加冠脉血流量，对临床治疗心脏负担过重有良好的应用前景。
6、麝鼠香具有抗炎、抑菌的药理活性。
7、麝鼠香通过毒理实验，毒性小，无刺激作用，使用安全。
通过以上研究可以得出本发明的优点在于：
1、本发明提供了可代替麝香的天然动物香料麝鼠香活性组分，从而确定麝鼠香的医药用途，开拓了一个新的天然动物香料新资源。
2、本发明制备的麝鼠香安全无毒，无刺激，可长期室温储存，质量稳定，药理活性方面强于麝鼠香腺分泌物，预示着其有很好的应用前景。
3、本发明原料来源丰富，制备工艺简单，可制作成片、丸、喷剂、胶囊等剂型，使用方便。
4、本发明单方配制成药物具有抗炎、耐缺氧、降低心肌耗氧量、减少血氧的利用、降低血压、减慢心率、增加冠脉血流量以及抗衰老、抗凝血和溶栓等多种活性，有利于防治冠心病、心脏肥大、心脏负担过重以及防治脑血栓、脉管炎等危重疾病。
5、临床试验表明，本发明制备的天然动物香料麝鼠香口服见效快，无毒副作用。
6、本发明通过麝鼠香的二次加工即分子修饰的技术工艺研制出麝鼠香活性组分。本品呈浅黄色流状液体。相对密度(25/25℃)0.9084。折光指数(20℃)1.4851。酸值(以mg·KOH/g计)3.3。具有典型的动物氤氲香气，香气清灵、柔和、留香持久、头香稍带酯类的果香，香气较纯正。当麝鼠香香料稀释1000倍时仍可嗅辩到，香气较强。增加了其抗衰老、清除自由基、降低心肌耗氧量、减少血氧的利用、降低血压、减慢心率、增加冠脉血流量、抑抑因栓形成、增强抗炎作用，缩短戊巴比妥钠的睡眠时间、促进生长发育等治疗作用。
7、利用麝鼠香腺分泌物作为药物和留香剂，必须通过本发明的制备工艺才能起到其应有的作用和保证日化用品的芳香作用，而且只有通过本发明的制备工艺制备的麝鼠香才能达到麝鼠香标准。
本发明所述的制备工艺简单易行，产品质量稳定，产率高，适合规模化工业生产。采用本发明制备的麝鼠香活性组分含有大量的不饱和脂肪酸，增加了其生物活性，适合于作为天然药物药材及香料，经大量实验证明麝鼠香活性组分不仅具有抗炎、抗衰老和抑菌等药理活性，而且在心血管方面也有很好的药理活性，它能显著降低心肌耗氧量、减少血氧的利用、降低血压、减慢心率、增加冠脉血流量以及抗衰老、抗凝血和溶栓等，有利于防治冠心病、心脏肥大、心脏负担过重以及防治脑血栓、脉管炎等危重疾病。同时麝鼠香作为新的天然动物香料可广泛应用于日用化工、食品、烟酒服饰的调香。尤其麝鼠香活性组分在化妆品工业中可作为留香剂和定香剂。而且麝鼠香活性组分无毒副作用，无刺激，室温下可长期保存，质量稳定，易于储存，可替代麝香、灵猫香、灵涎香及河狸香成为新的天然动物香料及药物药材。
附图说明：
图1是原代第7天细胞图片；
图2是2代第5天细胞图片；
图3是传2代第3天细胞图片；
图4是传3代第5天细胞图片。
具体实施方式
以下通过试验例来进一步阐述本发明所述活性组分的有益效果。试验例l本发明所述的天然动物香料麝鼠香活性组分的药理实验。
一、麝鼠香的抗衰老活性
1、麝鼠香对雄性幼年小鼠生长的影响
取雄性小白鼠24只，体重11.75±2g，分三组，对照组和麝鼠香组各9只，丙酸睾丸素组6只。实验期喂机制饲料块、葵花籽，饮水随意摄取。3组小白鼠分别ip麝鼠香120mg/Kg，丙酸睾丸素6.0mg/Kg和生理盐水5.0ml/Kg连续给药13天，于给药后第3、6、8、10和13天称体重。结果见表2。
表2麝鼠香对未成龄小白鼠体重增长的影响(
±SE)
| 组别 | mg/kg(只) | 给药前体重 | 给药后体重 | ||||
| 麝鼠香(g)丙酸睾丸素(6)对照(9) | 1206.05.0 | 11.87±0.3213.61±0.9411.7±0.34 | 1.44±0.161.79±0.510.92±0.22 | 5.55±0.384.69±1.384.692±0.28 | 7.02±0.34**7.69±0.84*5.48±0.32 | 8.87±0.47**9.60±0.62***6.31±0.42 | 10.89±0.95**10.15±1.02**6.83±0.57 |
注：*p＜0.05 **p＜0.01 ***P＜0.001与对照组比较，下同。
表2可见，ip麝鼠香第6天，小白鼠体重较对照组有所增加，第8～13天，体重增长迅速，与对照组比较，差异显著，P＜0.01。其作用强度与ip丙酸睾丸素6.0mg/Kg相似。
2、麝鼠香对雄性幼年小白鼠前列腺——贮精囊及睾丸重量的影响
将试验1中各组小鼠称重后，断头处死，摘取前列腺——贮精囊、睾丸。胸腺和脾脏称重，结果见表3。
表3麝鼠香对未成龄小鼠各器官发育的影响(
±SE)
| 组别mg/kg | 睾丸 | 前列腺-储精囊 | 胸腺 | 脾脏 |
| 对照(9)麝鼠香(9)6.0丙酸睾丸素(6)120 | 55.5±1.4455.3±13.7050.40±4.50 | 8.60±1.6789.00±5.83***27.10±6.01*** | 29.0±3.8429.5±5.4846.3±5.37** | 56.0±4.1866.5±11.0103.7±10.95** |
3、麝鼠香对肝组织中超氧化歧化酶活性及丙二醛含量的影响取各组小白鼠肝组织测定超氧化物歧化酶的活性。结果见表4。
表4鼠香对肝组织中超氧化歧化酶活性及丙二醛含量的影响(
±SE)
| 组别 | SOD(μg/g肝) | MDA(n mol/g肝) |
| 对照(11)麝鼠香(12)120麝鼠香(11)60麝鼠香(10)30 | 59.7±13.474.6±16.7*68.0±15.866.7±13.0 | 15.0±4.69.7±2.9**12.1±3.215.3±4.1 |
表4可见，麝鼠香三个剂量组对小鼠肝脏超氧化物歧化酶的活性均有不同程度的增强作用，尤以ip麝鼠香120mg最强(P＜0.01)，其它两组亦显示出增强的趋势，显示出明显的量效关系。
麝鼠香也有较明显地降低丙二醛的含量作用，同时也显示出了量效关系。
二、麝鼠香对小白鼠红细胞膜的稳定作用
1、麝鼠香对稳定小白鼠红细胞膜的作用
腹腔注射麝鼠香12mg/Kg，连续给药8天，对照组静脉注射生理盐水5.0ml/Kg。于末次给药后1小时，抽取心脏血0.2ml制备成2％红细胞悬液，取0.2ml放至0.45％氯化钠溶液中，倒置2次，2000×g离心2min，取上清液于420nm测OD值，以OD值评价麝鼠香对小白鼠红细胞膜的保护作用，结果见表5。
表5麝鼠香对小白鼠红细胞膜的保护作用组别OD值(
±SE)
| 组别 | 对照组(7) | 麝鼠香组(7) |
| OD值 | 0.3043±0.124 | 0.0467±0.026* |
表5可见，iv麝鼠香0.4mg，可明显保护小鼠红细胞膜的作用。
2、麝鼠香的抗溶血活性
取10支试管，分别加入0.30％、0.35％、0.40％、0.45％、0.50％、0.55％、0.60％、0.65％、0.70％和0.80％的不同低渗和高渗浓度的氯化钠溶液，于每支试管内放入0.2％去纤血0.1ml，加入12mg麝鼠香，观察麝鼠香对抗体外溶血的活性。
结果表明，麝鼠香具有极强的抗溶血活性。它可以对抗0.4％至0.8％的不同梯度的低渗和高渗溶液的溶血作用，在极低渗0.35％和0.30％仪呈现微溶血。可见，麝鼠香具有极明显的稳定细胞膜的活性。
试验例2本发明所述的麝鼠香活性组分的毒理实验
样品：麝鼠香腺分泌物为吉林省特产研究所麝鼠香香料新产品研究课题组提供，采集时间为6-8月份，采用人工活体取香的方法(陈玉山等1996)，采集后放置冰箱(-18℃)贮藏。
麝鼠香香料产品为麝鼠香腺分泌物经过分子修饰(二次加工)制备的产品，由吉林省物产研究所提供。
实验动物：家兔，雌雄兼用，体重(2.5-3.0Kg)。豚鼠，雌雄兼用，体重250-300g。远交系昆明种小白鼠，雌雄兼用，体重20-24g。由吉林省白求恩医科大学实验动物中心提供。
方法与结果
1、香腺分泌物及麝鼠香香料产品对小鼠皮肤毒性的影响
取小白鼠70只，雌雄各半，体重20±2.0g，随机分成7组，每组10只，动物稳定两天，第一组为空白对照组，给小白鼠涂抹同体蒸馏水。第2、3、4组分别产香腺分泌物高、中、低浓度组，分别给各组每只小鼠涂抹香腺分泌物和麝鼠香香料。分组后的动物背部除毛，用日本脱毛剂(协和产业株式会社)脱毛，约2-2.5cm，饲养三天，按各组及不同浓度涂抹，见表6。分别涂抹30天，观察小白鼠涂抹处皮肤变化及活动情况，并记录。实验后，动物继续稳定5天，对各组小白鼠进行皮肤破皮实验，将上述分组小鼠，在除毛处中心用手术剪刀剪开5mm直径切口，造成皮肤破皮模型，酒精(70％)消毒，两天后，按表中所述剂量及组别涂抹5次/三天，再次观察皮肤变化活动情况，并记录。然后将全部雌雄小鼠投入繁殖。观察香腺分泌物及麝鼠香香料对繁殖性能及胚胎畸变作用。
外观检查的结果表明，全部小鼠饮食正常，活动自如，未破皮的小鼠皮肤饱满、光滑、无异常变化。破皮小鼠组小鼠对照及实验组皮肤均愈合，未出现任何毒副作用。
投入繁殖的小鼠性活动正常，雌性小鼠均受孕，产仔数、仔幼鼠重量与对照组无明显差异，见表7。外观及剖检均未出现畸变。香腺分泌物及麝鼠香香料没有致畸作用。
表6香腺分泌物及麝鼠香香料对小鼠皮肤毒性、破皮皮肤愈合作用
| 组别 | 剂量(g) | 动物数(只) | 皮肤反应 | 破皮愈合 | 活动情况 |
| 对照香腺分泌物1香腺分泌物2香腺分泌物3麝鼠香香料1麝鼠香香料2麝鼠香香料3 | 1.00.20.50.80.20.50.8 | 10101010101010 | 光滑光滑饱满光滑饱满光滑饱满光滑饱满光滑饱满光滑饱满 | 愈合皱折愈合愈合愈合愈合愈合愈合 | 活动自如活动自如活动自如活动自如活动自如活动自如活动自如 |
表7麝鼠香和麝鼠香香料对小鼠繁殖及胎仔致畸作用
| 组别 | 剂量(g) | 动物数(只) | 产仔数(只) | 畸变数(只) | 活动情况 |
| 对照香腺分泌物1香腺分泌物2香腺分泌物3麝鼠香香料1麝鼠香香料2麝鼠香香料3 | 1.00.20.50.80.20.50.8 | 10101010101010 | 6.2±0.27.4±0.36.5±0.25.9±0.36.1±0.26.8±0.37.1±0.4 | 无无无无无无无 | 自如自如自如自如自如自如自如 |
2、香腺分泌物及麝鼠香香料对家兔皮肤刺激性的影响
取家兔50只，雌雄不拘，体重2.5-3.0Kg，分成七组，第一组为空白对照组给同体积水(蒸馏水)、第2、3、4组分别香腺分泌物1、2、3，第5、6、7组分别为麝鼠香香料组，每只实验家兔涂抹香腺分泌物及麝鼠香香料剂量见表8。分别将各组家兔固定，分别将背部两片10×6cm面部皮肤除毛，用酒精和碘消毒除毛处皮肤，各组家兔分别按剂量涂抹香腺分泌物及麝鼠香香料30天，观察受试家兔用药部位有无变化，反应强度判定标准见表9。
表8香腺分泌物及麝鼠香香料对家兔皮肤刺激的影响
| 组别 | 剂量(g) | 动物数(只) | 体重(Kg) | 涂抹天数(天) | 皮肤刺激强度 |
| 对照香腺分泌物1香腺分泌物2香腺分泌物3麝鼠香香料1麝鼠香香料2麝鼠香香料3 | 2.01.01.52.01.01.52.0 | 10101010101010 | 2.8±0.22.9±0.12.7±0.32.8±0.22.6±0.32.9±0.22.8±0.1 | 30303030303030 | 无无无无无无无 |
表9皮肤刺激实验反应强度判定标准
| 分级 | 局部 |
| 无刺激轻度刺激中度刺激严重刺激 | 无异常改变充血、红斑红斑、少量出血、水肿、少量丘疹、小水泡形成红斑、皮下丘疹、水肿、有很多水泡形成并形成大水泡，褶烂，表皮脱落，溃疡形成等。 |
观察结果表明，给药后48小时观察家兔用药部位皮肤，各组家兔均未见充血、水泡形成、褶烂、表皮脱落、变性坏死，香腺分泌物及麝鼠香香料各不同剂量组对家兔皮肤均无任何异常现象，对皮肤无任何毒性刺激，用样30天后，其活动、采食正常。使用安全。30天后，将家兔处死，取用药部位皮肤，进行病现场切片检查，涂抹部位皮肤无任何异常改变。更无诱发癌变。高剂量组香腺分泌物及麝鼠香料外用无任何刺激及致癌作用。
3、香腺分泌物及麝鼠香香料对豚鼠过敏反应的影响
取豚鼠35只，雌雄不拘，体重250-300g，随机分成7组。分别对各组豚鼠背部脱两块6×4cm面积的皮肤，进行除毛，同时用酒精及碘酒消毒。经处理的豚鼠，第1组为对照组给同体积的蒸馏水，第2、3、4组涂抹香腺分泌物0.2、0.5、0.8克，第5、6、7组分别涂抹麝鼠香香料0.2、0.5、0.8克，各组动物连续涂抹5天，观察受试豚鼠用药部位有无变化。判定标准如下：
_无异常反应
±蜷缩、竖毛、其它无异常
+抓鼻、竖毛、不安、呼吸急迫、轻度紫绀
++竖毛、呼吸明显困难、紫绀、四肢无力、腹部贴地爬行。
+++死亡
经用药后观察，香腺分泌物及麝鼠香香料皆无任何异常表现。
停止涂抹香腺分泌物及麝鼠香香料后7天，再度用香腺分泌物及麝鼠香香料进行攻击3天(相同剂量和相同刺激方法)，以便观察香腺分泌物及麝鼠香香料产品对豚鼠也无任何过敏反应。进一步证明，香腺分泌物及麝鼠香香料使用安全，无过敏等不良反应。
4、香腺分泌物及麝鼠香香料对小白鼠静脉一次性注射的急性毒性观察
取小白鼠20只分两组，每组10只，体重31±2.6克，逐只给小白鼠静脉注射(尾静脉)香腺分泌物及麝鼠香香料0.8克(最大注射剂量)，观察香腺分泌物及麝鼠香香料的毒性反应。
结果表明，两组小鼠注射香腺分泌物及麝鼠香香料0.8克后，均未出现死亡，所不同的是，注射后小鼠表现不安后，均不同表现活动减少。次日后，活动正常，观察七天后，无一只出现死亡。
试验例3中国农业科学院特产研究所麝鼠课题组研制的麝鼠香雪花膏1号、2号、3号、4号和麝鼠香香水抗衰老、抗炎及抑菌等方面的活性研究。
一、麝鼠香医用化妆品对小鼠皮肤SOD活性的影响
将132只小鼠腹部毛剪净至3cm的椭圆形，分两批实验。两批小鼠各66只，每批均分6组。1～5组分别为麝鼠香香水、麝鼠香雪花膏1、2、3和4号，6组为对照组。首批小鼠按表中所示剂量每天上午8.30开始一次涂膏和香水，对照组涂水。连续两周。末批小鼠于2周内每天上午9.00和下午3.00涂膏和香水二次。末次涂膏和香水1h后，断头处死动物，取下涂膏和香水处皮肤剪成碎块，按Geller方法分离SOD，按蓝开蔚等方法进行测定。结果见表10。
表10麝鼠香化妆品对小鼠SOD(μg/g皮肤)的影响
| 组别 | 动物数(只) | 剂量 | 日一次涂膏霜香水SOD(μg/g皮肤) | 日二次涂膏霜香水(SOD(μg/g皮肤) |
| 麝鼠香香水麝鼠香膏霜1麝鼠香膏霜2麝鼠香膏霜3麝鼠香膏霜4对照 | 111111111111 | 0.05ml0.1g0.1g0.1g0.1g0.1g | 15.3±6.219.1±5.4※14.4±3.119.8±7.5※16.5±4.514.1±3.4 | 23.2±9.828.1±9.3※※24.8±5.7※※25.8±5.5※※※28.7±10.2※※15.6±4.6 |
注：※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※ P＜0.001与对照组比较，下同。
麝鼠香雪花膏1号和3号无论每日1次或两次涂沫，均可明显增强小鼠皮肤SOD的活性，但每日两次涂沫SOD的活性更明显。2号和4号一次涂沫SOD的活性不明显，但增加到每日两次涂膏显示出较强的SOD活性，麝鼠香1～4号膏均显示出明显的量效关系。麝鼠香香水无明显提高小鼠皮肤SOD的活性。
二、麝鼠香医用化妆品对小鼠脂褐质的影响
取前述实验动物肝脏按蓝开蔚方法用甲醇∶氯仿(2∶1)抽取液5ml在玻璃匀浆器中制备组织匀浆，匀浆液40℃温育5min后，1500g离心10min，上清液在RF-510荧光分光光度计上测定脂褐质含量。测定时以0.1μg/ml(0.05M硫酸配制)喹宁为荧光基准物质，激发光波长365nm，发射光波长435nm，狭缝10nm，增益2/9。结果见表11。
表11麝鼠香化妆品对小鼠脂褐质(μg/g肝)的影响
| 组别 | 动物数(只) | 剂量 | 日一次涂膏霜香水脂褐质(μg/g肝) | 日二次涂膏霜香水脂褐质(μg/g肝) |
| 麝鼠香香水麝鼠香膏霜1麝鼠香膏霜2麝鼠香膏霜3麝鼠香膏霜4对照 | 111111111111 | 0.05ml0.1g0.1g0.1g0.1g0.1g | 1.58±0.180.62±0.18※※※1.0±0.16※※0.74±0.19※※※0.80±0.08※※※1.82±0.38 | 0.99±0.23※0.72±0.10※※※1.0±0.19※0.88±0.07※※※0.74±0.10※※※1.18±0.13 |
结果表明，除麝鼠香香水外，其余4种麝鼠香膏霜无论每日一次或两次涂擦皆有非常明显地降低小鼠肝脏中脂褐质的含量，作用强度也相似。麝鼠香香水每日一次涂擦降低小鼠肝脂褐质含量的作用不明显，但每日增加到两次有较明显地降低脂褐质的效果。
三、麝鼠香医用化妆品对小鼠血清过氧化脂质(LPO)含量的影响
前述实验动物断头取血制备血清，按硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定血清LPO含量。取血清0.3ml加入20％三氯醋酸2.5ml混匀后加入0.61％TBA1ml，沸水煮沸30min后取出，流水冷却至室温，加正丁醇4ml振荡混匀抽提TBA与丙二醛缩合产生的色素，1500×g离心10min，取上清液用751一型分光光度计测定含量。测定时以同样操作的TEP为标准，正丁醇调零，波长为535nm。结果见表12。
表12麝鼠香化妆品对小鼠血清中丙二醛的含量影响
| 组别 | 动物数 | 剂量 | 日一次涂膏霜香水MDA(nmol/mg) | 日二次涂膏霜香水MDA(nmol/mg) |
| 麝鼠香香水麝鼠香膏霜1麝鼠香膏霜2麝鼠香膏霜3麝鼠香膏霜4对照 | 111111111111 | 0.05ml0.1g0.1g0.1g0.1g0.1g | 0.566±0.1250.48±0.2690.264±0.134※0.33±0.109※0.237±0.045※※0.502±0.211 | 0.466±0.1770.415±0.14※0.272±0.124※※※0.325±0.096※※※0.297±0.19※※※0.548±0.135 |
结果表明，5种麝鼠香化妆品除香水外，其余4种膏霜皆有较明显的降低小鼠血清中LPO含量的作用，每日两次较一次效果更明显，呈明显的量效关系。
四、麝鼠香医用化妆品对小鼠肝单胺氧化酶(MAO-B)的影响
前述小鼠断头处死取肝组织按五本样方法制厉匀浆，经分级离心制备单胺氧化酶源，以苄胺作为MAO的底物，比色测定MAO-B活性。结果见表13。
表13麝鼠香化妆品对小鼠肝单胺氧化酶的影响
| 组别 | 动物数 | 剂量 | 日一次涂膏香水MAO-B(nmol/mgPro·h) | 日二次涂膏香水MAO-B(nmol/mgPro·h) |
| 麝鼠香香水麝鼠香膏霜1麝鼠香膏霜2麝鼠香膏霜3麝鼠香膏霜4对照 | 111111111111 | 0.05ml0.1g0.1g0.1g0.1g0.1g | 13.3±5.09.5±3.65.9±3.1※※9.0±11.0※※6.5±4.4※※13.4±4.2 | 20.2±2.4※19.2±2.1※※18.1±1.5※※※17.8±1.9※※※18.5±1.7※※22.6±2.6 |
表13可见，5种麝鼠香医用化妆产品对小鼠肝组织中单胺氧化酶(MAO-B)具有不同地抑制作用。尤其以膏霜2、3和4号明显。膏霜1号和香水只有达到每日两次抹擦才显示出抑制单胺氧化酶的活性。
五、麝鼠香医用化妆品对上鼠抗炎作用的影响
取小鼠60只，均分6组，1～5组分别为麝鼠香香水、麝鼠香膏霜1、2、3和4号，6组为对照组。连续在小鼠腹部(剪净腹毛)涂擦麝鼠香膏霜或香水(0.1g或0.05ml/只)，每日一次，末次涂擦1h后，逐只用二甲苯0.05ml涂在两只耳部致炎之后剪下小鼠两侧耳朵，按徐淑云方法用胶塞打孔器打下同一部位固定大小的耳圈组织称重，以左右耳重量差评定肿胀度。
结果表明，对照组肿胀度为9.59±2.81mg，麝鼠香香水为5.51±2.27(P＜0.01)，麝鼠香膏霜1号为5.47±2.89mg(P＜0.05)，2号为5.13±1.25mg(P＜0.001)，3号为6.31±1.6(P＜0.05)，4号为6.43±2.19(P＜0.05)。表明5种麝鼠香化妆品均具有较强的抗炎作用。但尤其以膏霜2号和香水抗炎效果更明显。
六、麝鼠香医用化妆品对小鼠腹部皮肤真皮组织形态结构的影响
取36只小鼠，雌雄不拘，分六组，每组6只，于两周内每天涂擦麝鼠香化妆品一次，末次涂擦1h后，细心剪下皮肤，常规制做组织切片，行HE染色。观察各组小鼠皮下真皮组织的形态变化。
结果表明，五种麝鼠香膏霜组小鼠皮下(香水除外)真皮中毛细血管丰富，腺体发达，结缔组织中的网状纤维、胶原纤维和弹性纤维等均较对照增加。显示出较好的润肤保健皮肤的基础。麝鼠香香水无此作用。
七、麝鼠香医用化妆品对抑菌作用的影响
选用标准的金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，用营养琼脂(上海医学化验所试剂厂产品)制成平板，将1.5×108ml/菌液分别涂于平板内，然后在平板上打洞，每洞直径为6mm，每洞加麝鼠香膏霜剂0.1g，香水0.05ml 37℃培养24h，测定抑菌环大小。结果见表14。
表14麝鼠香医用化妆品对抑菌作用的影响
结果表明，5种化妆品对金葡、白区和大肠三种菌株皆有不同程度地抑菌活性，其中麝鼠香香水活性最强，膏1、3号有中度抑菌作用，膏霜2号抑菌作用较弱。
八、麝鼠香EM霜对脂溢性皮火和脂溢性角化病的治疗观察
应用麝鼠香EM霜治疗脂溢性皮炎和脂溢性角化病取得了较好的疗效。在20例脂溢性角化病中，显效3例，有效15例，总有效率达90％，用药2个月即能看到效果。另外，在30例脂溢性面部皮炎病中，治愈9例，有效20例，总有效率达96.7％，效果明显，在用药后3～5日内炎症即开始消退，痒感减轻。
以下通过实施例进一步阐述本发明活性组分的制备方法
实施例1
一、原代培养(组织块培养)：
1.取材：用消毒过的解剖剪取香腺组织，放入消毒过的培养皿中，用PBS(氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，加水定容至1000ml)漂洗3次以清去血污。
2.分离组织：在培养皿中用消毒过的眼科剪将组织反复剪成1mm2的小块，再用PBS吹打清洗。
3.接种：用吸管加2滴原代培养液(RPMI1640 85％、小牛血清10％、PHA0.1ml 3％、肝素10u/ml 2％、双抗500u/ml，分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液。每5ml培养液中加入约0.5ml新鲜血液。)，用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀，制成悬液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液，将其均匀的排种在培养瓶底壁上。
4.培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入4ml培养液，盖好瓶塞，置于37℃恒温培养箱中培养3h，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢反转培养瓶使培养液覆盖组织块，继续静放培养。
5.观察：三天后开始对接种培养的细胞进行常规检查，将培养瓶轻轻置于倒置相差显微镜下，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色。更换培养液。15d后可长成单层细胞，这时可进行传代培养，见图1、图2。
二、传代培养：
1.选材：倒置相差显微镜下选择以生长到致密阶段的细胞，弃旧培养液。
2.消化：用少量HanK’s液加入培养瓶中轻轻震荡后弃之，加入0.25％胰酶8滴进行消化，轻动培养瓶使消化液湿润整个细胞层，室温作用5min，肉眼观察瓶底细胞单层，待其出现针孔般大小空隙时即可弃去消化液，直接进行下一步骤，见图3。
3.分瓶扩大培养：加入4ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞单层，直到细胞脱落形成细胞悬液，吹打均匀后吸出1ml已入另一培养瓶中，再加入4ml培养液，盖好瓶盖，置37℃恒温培养箱中培养，见图4。
4.观察：每天对传代细胞进行观察，注意是否有污染及生长情况等，如生长良好可每隔3d换液一次，7d可再传代。
三、制备麝鼠香活性组分：
取上述传代培养的麝鼠香腺细胞，加入一倍量的胰蛋白酶，在-10℃温度下进行反应3小时，得混合液，加混合液一倍量的1，3丙二醇，充分混合，静置1小时，混合液2000转/分离下层和上层溶液，加入高锰酸钾1mg反应0.5小时，用0.8倍量活性碳静置1小时，除去高锰酸钾，离心后置于-10℃温度下，用1，3丙二醇萃取次数为1次，每次加入溶液量为3倍，再除去溶剂所得麝鼠香活性组分为50％。
实施例2
一、原代培养(组织块培养)：
1.取材：用消毒过的解剖剪取香腺组织，放入消毒过的培养皿中，用PBS(氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，加水定容至1000ml)漂洗2次以清去血污。
2.分离组织：在培养皿中用消毒过的眼科剪将组织反复剪成0.5mm2的小块，再用PBS吹打清洗。
3.接种：用吸管加2滴原代培养液(RPMI1640 85％、小牛血清10％、PHA0.1ml 3％、肝素10u/ml 2％、双抗500u/ml，分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液。每5ml培养液中加入约0.5ml新鲜血液。)，用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀，制成悬液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液，将其均匀的排种在培养瓶底壁上。
4.培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入3ml培养液，盖好瓶塞，置于37℃恒温培养箱中培养2h，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢反转培养瓶使培养液覆盖组织块，继续静放培养。
5.观察：三天后开始对接种培养的细胞进行常规检查，将培养瓶轻轻置于倒置相差显微镜下，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色。更换培养液。10d后可长成单层细胞，这时可进行传代培养。
二、传代培养：
1.选材：倒置相差显微镜下选择以生长到致密阶段的细胞，弃旧培养液。
2.消化：用少量HanK’s液加入培养瓶中轻轻震荡后弃之，加入0.25％胰酶5滴进行消化，轻动培养瓶使消化液湿润整个细胞层，室温作用2min，肉眼观察瓶底细胞单层，待其出现针孔般大小空隙时即可弃去消化液。直接进行下一步骤。
3.分瓶扩大培养：加入3ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞单层，直到细胞脱落形成细胞悬液，吹打均匀后吸出1ml已入另一培养瓶中，再加入4ml培养液，盖好瓶盖，置37℃恒温培养箱中培养。
4.观察：每天对传代细胞进行观察，注意是否有污染及生长情况等，如生长良好可每隔3d换液一次，5d可再传代。
三、制备麝鼠香活性组分：
取上述传代培养的麝鼠香腺细胞，加入一倍量的胰蛋白酶，在30℃温度下进行反应24小时，得混合液；加入混合液一倍量的丙酮，充分搅拌混合，静置24小时；将混合液2000转/分离下层和上层溶液，加入高锰酸钾20mg反应40小时；用6倍量活性碳静置24小时，除去高锰酸钾；离心后置于30℃温度下，用1，3丙二醇萃取次数为4次，每次加入溶液量为6倍，再除去溶剂所得麝鼠香活性组分为72.9％。
实施例3
一、原代培养(组织块培养)：
1.取材：用消毒过的解剖剪取香腺组织，放入消毒过的培养皿中，用PBS(氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，加水定容至1000ml)漂洗3次以清去血污。
2.分离组织：在培养皿中用消毒过的眼科剪将组织反复剪成1mm2的小块，再用PBS吹打清洗。
3.接种：用吸管加2滴原代培养液(RPMI1640 85％、小牛血清10％、PHA0.1ml 3％、肝素10u/ml 2％、双抗500u/ml，分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液。每5ml培养液中加入约0.5ml新鲜血液。)，用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀，制成悬液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液，将其均匀的排种在培养瓶底壁上。
4.培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入3.5ml培养液，盖好瓶塞，置于37℃恒温培养箱中培养2.5h，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢反转培养瓶使培养液覆盖组织块，继续静放培养。
5.观察：三天后开始对接种培养的细胞进行常规检查，将培养瓶轻轻置于倒置相差显微镜下，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色。更换培养液。12d后可长成单层细胞，这时可进行传代培养。
二、传代培养：
1.选材：倒置相差显微镜下选择以生长到致密阶段的细胞，弃旧培养液。
2.消化：用少量HanK’s液加入培养瓶中轻轻震荡后弃之，加入0.25％胰酶6滴进行消化，轻动培养瓶使消化液湿润整个细胞层，室温作用4min，肉眼观察瓶底细胞单层，待其出现针孔般大小空隙时即可弃去消化液。直接进行下一步骤。
3.分瓶扩大培养：加入3.5ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞单层，直到细胞脱落形成细胞悬液，吹打均匀后吸出1ml已入另一培养瓶中，再加入4ml培养液，盖好瓶盖，置37℃恒温培养箱中培养。
4.观察：每天对传代细胞进行观察，注意是否有污染及生长情况等，如生长良好可每隔3d换液一次，7d可再传代。
三、制备麝鼠香活性组分：
取上述传代培养的麝鼠香腺细胞，加入一倍量的胰蛋白酶，在120℃温度下进行反应40小时，得混合液；加入混合液一倍量的1，3丙二醇，充分搅拌混合，静置73小时；将混合液2000转/分离下层和上层溶液，加入高锰酸钾50mg反应100小时；用10倍量活性碳静置36小时，除去高锰酸钾；离心后置于100℃温度下，用1，3丙二醇萃取次数为8次，每次加入溶液量为10倍，再除去溶剂所得麝鼠香活性组分为90.0％。
Claims (7)
1、一种体外泌香制备的麝鼠香活性组分，其特征在于：包含七个碳到二十一个碳的环烷酮类、脂肪酸及其酯类、三个碳到三十三个碳的环烷醇类、醛类和烯类成分，是通过如下工艺制备的：
(1)原代培养
1)取材：用消毒过的解剖剪取香腺组织，放入消毒过的培养皿中，用PBS溶液漂洗2～3次以清去血污；
2)分离组织：在培养皿中用消毒过的眼科剪将组织反复剪成0.5mm2-1mm2的小块，再用PBS吹打清洗；
3)接种：用吸管加2滴原代培养液，用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀，制成悬液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液，将其均匀的排种在培养瓶底壁上；
4)培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入3-4ml培养液，盖好瓶塞，置于37℃恒温培养箱中培养2h-3h，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢反转培养瓶使培养液覆盖组织块，继续静放培养；
5)三天后开始对接种培养的细胞进行常规检查：将培养瓶轻轻置于倒置相差显微镜下，如果无污染且细胞生长良好，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色，此时可补加或更换培养液，10d-15d后可长成单层细胞，这时可进行传代培养；
(2)传代培养
1)倒置相差显微镜下选择生长到致密阶段的细胞，弃旧培养液；
2)用少量HanK`S液加入培养瓶中轻轻震荡后弃之，加入0.25％胰酶5-8滴进行消化，轻动培养瓶使消化液湿润整个细胞层，室温作用2min-5min，肉眼观察瓶底细胞单层，待其出现针孔般大小空隙时即可弃去消化液，若见消化程度不够，可再消化1min，若见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能弃掉消化液，应直接进行下一步骤；
3)加入3ml-4ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞单层，直到细胞脱落形成细胞悬液，吹打均匀后吸出1ml已入另一培养瓶中，再加入4ml培养液，盖好瓶盖，置37℃恒温培养箱中培养；
4)每天对传代细胞进行观察，注意是否有污染及生长情况，如生长良好可每隔3d换液一次，5d-7d可再传代；
(3)麝鼠香活性组分的制备工艺：
1)麝鼠香腺囊分泌物加入一倍量的胰蛋白酶在-10℃-120℃温度下进行反应3-40小时，得混合液；
2)加入混合液一倍量的1，3丙二醇或丙酮，充分混合，静置1-73小时；
3)混合液2000转/分离下层和上层溶液，加入高锰酸钾1-50mg反应0.5-100小时；
4)用0.8-10倍量活性碳静置1-36小时，除去高锰酸钾；
5)离心后置于-10℃-100℃温度下，用1，3丙二醇萃取次数为1-8次，每次加入溶液量为3-10倍，再除去溶剂所得麝鼠香活性组分为50-90％。
2、根据权利要求1所述的体外泌香制备的麝鼠香活性组分，其特征在于：所述的麝鼠香活性组分的含量为：
C7-C21的环烷酮类成分0.01％-21％
C7-C21的脂肪酸及其脂类0.01％-16％
C3-C33的环烷醇类成分0.1％-30％
C3-C33的醛类成分0.01％-20％
C3-C33的烯类成分0.01％-20％。
3、一种体外泌香制备的麝鼠香活性组分的制备工艺，其特征在于：该工艺包括下列步骤：
(1)原代培养
1)取材：用消毒过的解剖剪取香腺组织，放入消毒过的培养皿中，用PBS溶液漂洗2～3次以清去血污；
2)分离组织：在培养皿中用消毒过的眼科剪将组织反复剪成0.5mm2-1mm2的小块，再用PBS吹打清洗；
3)接种：用吸管加2滴原代培养液，用弯头吸管前端将组织块轻轻吹打均匀，制成悬液，然后仍用吸管前端吸取组织悬液，将其均匀的排种在培养瓶底壁上；
4)培养：将培养瓶慢慢翻转，使瓶底向上，加入3-4ml培养液，盖好瓶塞，置于37℃恒温培养箱中培养2h-3h，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上后，再缓慢反转培养瓶使培养液覆盖组织块，继续静放培养；
5)三天后开始对接种培养的细胞进行常规检查：将培养瓶轻轻置于倒置相差显微镜下，如果无污染且细胞生长良好，可见培养液颜色由原来的橘红色变成黄色，此时可补加或更换培养液，10d-15d后可长成单层细胞，这时可进行传代培养；
(2)传代培养
1)倒置相差显微镜下选择生长到致密阶段的细胞，弃旧培养液；
2)用少量HanK`S液加入培养瓶中轻轻震荡后弃之，加入0.25％胰酶5-8滴进行消化，轻动培养瓶使消化液湿润整个细胞层，室温作用2min-5min，肉眼观察瓶底细胞单层，待其出现针孔般大小空隙时即可弃去消化液，若见消化程度不够，可再消化1min，若见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能弃掉消化液，应直接进行下一步骤；
3)加入3ml-4ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞单层，直到细胞脱落形成细胞悬液，吹打均匀后吸出1ml已入另一培养瓶中，再加入4ml培养液，盖好瓶盖，置37℃恒温培养箱中培养；
4)每天对传代细胞进行观察，注意是否有污染及生长情况，如生长良好可每隔3d换液一次，5d-7d可再传代；
(3)麝鼠香活性组分的制备工艺：
1)麝鼠香腺囊分泌物加入一倍量的胰蛋白酶在-10℃-120℃温度下进行反应3-40小时，得混合液；
2)加入混合液一倍量的1，3丙二醇或丙酮，充分混合，静置1-73小时；
3)混合液2000转/分离下层和上层溶液，加入高锰酸钾1-50mg反应0.5-100小时；
4)用0.8-10倍量活性碳静置1-36小时，除去高锰酸钾；
5)离心后置于-10℃-100℃温度下，用1，3丙二醇萃取次数为1-8次，每次加入溶液量为3-10倍，再除去溶剂所得麝鼠香活性组分为50-90％。
4、根据权利要求3所述的体外泌香制备的麝鼠香活性组分的制备工艺，其特征在于：原代培养液为RPMI1640 85％、小牛血清10％、PHA0.1ml 3％、肝素10u/ml 2％、双抗500u/ml分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，每5ml培养液中加入约0.5ml新鲜血液。
5、根据权利要求1所述的体外泌香制备的麝鼠香活性组分在制药、食品、日用化工、烟酒服饰中的应用。
6、根据权利要求1所述的体外泌香制备的麝鼠香活性组分在制备治疗心肌缺血、缺氧、冠心病、脉管炎及抑制血小板聚集和抑制血栓形成的药物中的应用。
7、根据权利要求1所述的体外泌香制备的麝鼠香活性组分作为留香剂和定香剂的用途。
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|---|---|---|---|---|
| CN103777020A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-05-07 | 北京林业大学 | 一种通过粪便睾酮含量判定林麝泌香活动时间的方法 |
| CN104962511A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-10-07 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用 |
| CN112515039A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-03-19 | 广西壮族自治区畜牧研究所 | 喂养香狸的饲料及生产方法 |
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2006
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