CN103777020A - 一种通过粪便睾酮含量判定林麝泌香活动时间的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过粪便睾酮含量判定林麝泌香活动时间的方法。本发明公开的一种辅助判断林麝泌香活动时间的方法，包括如下步骤：在5月-8月连续每天测定林麝的粪便中的睾酮含量，得到粪便中的睾酮占每克干粪的质量比例，记作A；从测定的第一天开始，在第m天开始连续3天的A值显著大于第m-1天的A值，将第m天记作泌香活动准备起始时间点，之后在第n天开始连续3天的A值降至第m-1天的A值水平及以下，将第n+2天记作泌香活动确定终止时间点，在泌香活动准备起始时间点至泌香活动确定终止时间点之间的时间段内发生泌香活动。本发明的方法既对动物没有干扰，也能准确预测香腺活动的起始，为雄麝泌香期的管护和预测提供科学依据。

Description

一种通过粪便睾酮含量判定林麝泌香活动时间的方法
技术领域
本发明涉及一种通过粪便睾酮含量判定林麝泌香活动时间的方法。
背景技术
麝科物种是亚洲特产野生动物(吴家炎等,2006；盛和林等，2007)，目前普遍认为有5-6个独立的种(Groves,1995；Zhang，1998；Yang，1999)。麝香腺囊是雄麝的特有器官，位于腹下部阴囊与脐带之间。麝香腺能分泌一种特殊物质——麝香，是名贵的药材和香料。我国是麝资源最丰富的国家，种群数量曾占世界总量的70％以上，麝香产量也曾占全世界产量的90％以上。因麝香的巨大市场需求及高昂的价格，我国麝资源遭受严重的非法盗猎和过度利用，麝种群数量已由上世纪50年代的200-300万头下降至目前的6-7万头，分布区呈现急剧缩减。所有麝类动物均被纳入濒危野生动植物国际贸易公约附录中（CITES，1979）和濒危物种保护红皮书中（IUCN，1996）。我国已将所有麝类物种列为国家I类重点保护物种（国家林业局，2003）。
麝香是一种重要的外激素，影响麝类动物的繁殖活动（Flerov，1952；Homes，1999）。我国自1958年开始麝类动物的人工养殖，旨在获取高品质和高产量的麝香。雄麝在泌香期的生物学特征是养麝业关注的问题，多年研究表明，雄麝在泌香期会发生显著的行为和生理变化，主要有食欲下降乃至拒食，香囊肿胀，体温升高，尿液pH值变化等(李复东等,1980；尹淑媛和戴卫国,1990)。雄麝香腺活动早期及随后的泌香期是管护林麝的关键时期，掌握雄麝香腺活动状态显得尤为重要。因麝类动物应激性极高，不易接近，导致香囊的外部形态变化难以观测；行为观察较简单直观，然而，食欲不佳及拒食行为容易与一些病态行为相混淆，且时间上滞后；体温升高及尿液pH值不是香腺活动的特定指标，易与体况及疾病症状相混淆。因此，迄今尚无判定雄麝香腺早期活动的准确方法。研究证实，雄麝泌香活动受控于下丘脑-垂体-生殖腺-香腺，睾酮是香腺活动的诱因（李复东等，1980；毕增书等，1981；尹淑媛等,1990）。由此，测定雄麝睾酮值可准确判定香腺活动的起止，但迄今尚未见有关雄麝睾酮变化与泌香活动的详尽报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过粪便睾酮含量判定林麝泌香活动时间的方法。
本发明提供的一种辅助判断林麝泌香活动时间的方法，包括如下步骤：在5月-8月连续每天测定林麝的粪便中的睾酮含量，得到粪便中的睾酮占每克干粪的质量比例，记作A；从测定的第一天开始，在第m天开始连续3天的A值显著大于第m-1天的A值，将第m天记作泌香活动准备起始时间点，之后在第n天开始连续3天的A值降至第m-1天的A值水平及以下，将第n+2天记作泌香活动确定终止时间点，在泌香活动准备起始时间点至泌香活动确定终止时间点之间的时间段内发生泌香活动；
所述干粪为水分的质量百分含量为37.9±9.8%的粪便；
所述泌香为林麝遗漏麝香香液或弥散麝香香味。
一种辅助判断林麝泌香活动时间的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：在5月-8月连续每天测定林麝的粪便中的睾酮含量，得到粪便中的睾酮占每克干粪的质量比例，记作A；从测定的第一天开始，将A连续3天大于1877.0ng/g的第一天记作泌香活动准备起始时间点，之后将A连续3天低于1877.0ng/g的最后一天记作泌香活动确定终止时间点，在泌香活动准备起始时间点至泌香活动确定终止时间点之间的时间段内发生泌香活动；
所述干粪为水分的质量百分含量为37.9±9.8%的粪便；
所述泌香为林麝遗漏麝香香液或弥散麝香香味。
上述方法中，所述林麝的粪便中的睾酮含量的测定时间选取如下：每天的同一时间取所述林麝的粪便测定所述林麝的粪便中的睾酮的含量；
所述时间具体为每天早上6：00-8:00。
上述任一所述的方法中，所述泌香活动的发生时间点在所述泌香活动准备起始时间点之后第7-15天。
粪便中睾酮含量作为标志物在辅助判断林麝泌香活动时间中的应用也属于本发明的保护范围。
检测粪便中睾酮含量的物质在制备辅助判断林麝泌香活动时间的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述泌香为林麝遗漏麝香香液或弥散麝香香味。
林麝在泌香期（5-8月）粪便中的睾酮仅出现一次持续的高水平期，提示林麝仅有一次泌香活动。
林麝粪便睾酮明显上升的时间点较之拒食行为能更早、更准确的判断林麝香液渗出及麝香香味弥散，成为雄麝泌香期管护的重要指示参数。
本发明具有以下优点：
（1）本发明针对雄麝特殊的泌香活动，遴选准确、简单的判定香腺活动的方法。
（2）本发明首次揭示雄麝睾酮分泌规律，证实每只雄麝在泌香期仅有一次泌香活动。
（3）本发明首次采用非损伤性方法，即采用粪便睾酮含量确定雄麝香腺活动的时间，这种方法既对动物没有干扰，也能准确预测香腺活动的起始，为雄麝泌香期的管护和预测提供科学依据。
附图说明
图1-图26分别为26只林麝的睾酮含量变化趋势图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
睾酮酶联免疫诊断试剂盒购自北京北方生物技术研究所，产品目录号为E-88-96。
实施例1、粪便睾酮含量与林麝泌香的关系
本专利的实施例中，泌香活动是指林麝遗漏麝香香液/弥散麝香香味。
一、在2012年5-8月间，每天采集同一组（16只）成年健康雄麝的粪样，采集时间为每天早上6：00-8:00，得到雄麝粪便。
二、粪便睾酮的提取与测定
将雄麝粪便参照Wasser（2000）和Yu（2010）的方法提取粪便激素，具体操作如下：将解冻后的雄麝粪便置于研钵中研碎，混匀后，称取0.5g湿粪于盛有5ml体积百分含量为90%的乙醇水溶液的离心管中，震荡1min，60℃温育20min，2500rpm离心20min，上清液倒于坩埚中，沉淀中加入5ml同等浓度的乙醇，震荡2min，2500rpm离心15min，合并两次上清液，60℃蒸干，加1ml甲醇，震荡回收，-20℃保存备用。
三、粪便睾酮测定
酶联免疫检测睾酮的原理：采用酶联免疫竞争法检测待测样品中的睾酮含量。首先用羊抗兔包被微孔板，制成固相二抗，然后加入待测样品、辣根过氧化物酶标记睾酮（睾酮（HRP）复合物）以及抗睾酮抗体，使之形成包被二抗-抗睾酮抗体-睾酮（HRP）复合物，睾酮（HRP）复合物的结合量与待测样品中的睾酮含量成反比。经显色后再用酶标仪测定吸光值，通过计算机拟合浓度-吸光值曲线，根据浓度-吸光值曲线反算出待测样品中的睾酮含量。
采用北京北方生物技术研究所的睾酮酶联免疫诊断试剂盒测定粪便睾酮水平（单位为ng/ml），再将得到的浓度换算成睾酮占每克干粪（干粪指的是烘干水分后的粪便，水分的质量百分含量为37.9±9.8%）的质量比例（单位为ng/g）。
四、数据处理
实验取得的数据通过SPSS13.0进行数据分析，使用origin8.0数据绘图。数据结果以"Mean士SE"的形式表示。所分析的数据都通过单一样本K-S检验（One-SampleKolmogorov-Smirnov Test）进行正态分布检验。组内数据使用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较采用独立样本T检验（Independent-samples T test），使用这两种检验均进行了方差齐性检验，显著水平设置α=0.05。雄麝粪便睾酮含量采用平方欧式距离（Euclidean distance）进行系统聚类分析（Systematic clusteranalysis）。
五、实验结果
（一）雄麝粪便睾酮的含量
16只实验雄麝粪便睾酮的测定结果为，最高值为25264.8ng/g，最低值为273.7ng/g。各个体的睾酮变化如图1-图16所示。运用系统聚类法处理16个实验雄性林麝个体的粪便睾酮值，得出所有实验个体的粪便睾酮值可分为两组，即高睾酮值组和低睾酮值组。运用独立样本T检验逐一比较每个实验林麝的两组数据的差异性，得出所有个体的高睾酮值组和低睾酮值组之间存在显著性差异（P<0.05）。因此得出，实验期间雄性林麝存在一个睾酮显著上升的时间段。
（二）粪便睾酮高值组和低值组的统计处理
采用迭代法处理每个个体的低值组和高值组的粪便睾酮值，去除平均值±2SD以外的值，直到所有的值均在平均值±2SD范围内，由此求得每个个体粪便睾酮的低值组的平均值M1=695.3ng/g。同理，求得每个个体粪便睾酮的高值组的平均值M2=4313.5ng/g。经过独立样本T检验，两者存在显著差异（P<0.05）。
（三）粪便睾酮低值组的“标准值”
采用迭代法处理所有个体的M1数据集合，求得该数据集合的平均值和标准差，定义为M3：即M3=M1±2SD=695.3±2×163.7ng/g，此值为粪便睾酮未显著上升前的“标准值”。
（四）粪便睾酮高值组的“标准值”
采用迭代法处理所有个体的M2数据集合，求得该数据集合的平均值和标准差，定义为M4，即M4=M2±2SD=4313.5±2×1218.3ng/g,此值为粪便睾酮显著上升后的“标准值”。
（五）粪便睾酮明显上升的判断标准
以M2的下限值（M2-2SD）判断雄麝粪便睾酮值是否达到睾酮高值组的水平，即显著上升。计算得出M2-2SD=1877.0ng/g，该值即为指示值1（Indicator value，IV1）。
六、同时进行雄麝的麝香香液/麝香香味出现的时间（以下简称香味/香液出现时间）、拒食行为出现及持续的时间，并计算粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较拒食行为出现提前的天数、粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较香液/香味出现时间提前的天数、粪便睾酮含量降至粪便睾酮明显上升之前的水平的时间点（即粪便睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g的最后一天）较拒食行为结束推迟的天数，结果如表1所示。
表1中，睾酮较拒食提前的天数为粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较拒食行为出现提前的天数，睾酮较香液/香味出现时间提前的天数为粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较香液/香味出现时间提前的天数，睾酮降至粪便睾酮明显上升之前的水平较拒食结束推迟的天数为粪便睾酮含量降至粪便睾酮明显上升之前的水平的时间点（即粪便睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g的最后一天）较拒食行为结束推迟的天数。
编号为1-16的雄麝的粪便睾酮含量显著上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0的第一天）、出现拒食行为的时间点以及出现香液遗漏/香味弥散的时间点分别如图1-图16所示，图1-图16中的箭头所表示的含义均相同。
表1雄麝香液/香味出现的时间、拒食行为出现及持续的时间、睾酮含量显著上升及
持续的时间及以上三者之间的关系
Figure BDA0000461503740000051
Figure BDA0000461503740000061
表1中睾酮高峰持续时间为粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）到粪便睾酮含量降至粪便睾酮明显上升之前的水平的时间点（即粪便睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g的最后一天）的天数。
本实施例得出的一种判断林麝泌香活动时间的方法如下：在5月-8月连续一定时间测定林麝的粪便睾酮含量，得到粪便中的睾酮占每克干粪（干粪指的是烘干水分后的粪便，水分的质量百分含量为37.9±9.8%）的质量比例（单位为ng/g），从测定的第一天开始，当睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g时，将这三天中的第一天记作泌香活动准备起始时间点，若睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g，将这三天中的最后一天记作泌香活动确定终止时间点，在泌香活动准备起始时间点至泌香活动确定终止时间点之间的时间段内发生泌香活动。
实施例2、利用粪便睾酮含量判断林麝泌香
一、在2013年5-8月间，每天采集同一组（10只）成年健康雄麝的粪样，采集时间为每天早上6：00-8:00，得到雄麝粪便。
二、粪便睾酮的提取与测定同实施例1。
得到每只个体的粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天，以及粪便睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g的最后一天，此时间段记作睾酮高峰持续时间，如表2所示，表2中的粪便睾酮明显上升时间即为粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天。
同时进行雄麝的麝香香液/麝香香味出现的时间（以下简称香味/香液出现时间）、拒食行为出现及持续的时间，并计算粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较拒食行为出现提前的天数、粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较香液/香味出现时间提前的天数、粪便睾酮含量降至粪便睾酮明显上升之前的水平的时间点（即粪便睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g的最后一天）较拒食行为结束推迟的天数，结果如表2所示。
表2中，睾酮较拒食提前的天数为粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较拒食行为出现提前的天数，睾酮较香液/香味出现时间提前的天数为粪便睾酮明显上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）较香液/香味出现时间提前的天数，睾酮降至粪便睾酮明显上升之前的水平较拒食结束推迟的天数为粪便睾酮含量降至粪便睾酮明显上升之前的水平的时间点（即粪便睾酮含量连续3天低于1877.0ng/g的最后一天）较拒食行为结束推迟的天数。
编号为1-10的雄麝的粪便睾酮含量显著上升的时间点（即粪便睾酮含量连续3天高于1877.0ng/g的第一天）、出现拒食行为的时间点以及出现香液遗漏/香味弥散的时间点分别如图17-图26所示，图17-图26中的箭头所表示的含义均相同。
表2雄麝香液/香味出现的时间、拒食行为出现及持续的时间、睾酮显著上升及持续
的时间及以上三者之间的关系
Figure BDA0000461503740000071
由图17-图26以及表2可以得出实施例1得出的一种判断林麝泌香活动时间的方法可行，该方法较之拒食行为更准确的指示出泌香活动，成为雄麝泌香期管护的重要指示参数。

Claims (7)

1.一种辅助判断林麝泌香活动时间的方法，包括如下步骤：在5月-8月连续每天测定林麝的粪便中的睾酮含量，得到粪便中的睾酮占每克干粪的质量比例，记作A；从测定的第一天开始，在第m天开始连续3天的A值显著大于第m-1天的A值，将第m天记作泌香活动准备起始时间点，之后在第n天开始连续3天的A值降至第m-1天的A值水平及以下，将第n+2天记作泌香活动确定终止时间点，在泌香活动准备起始时间点至泌香活动确定终止时间点之间的时间段内发生泌香活动；
所述干粪为水分的质量百分含量为37.9±9.8%的粪便；
所述泌香为林麝遗漏麝香香液或弥散麝香香味。
2.一种辅助判断林麝泌香活动时间的方法，包括如下步骤：在5月-8月连续每天测定林麝的粪便中的睾酮含量，得到粪便中的睾酮占每克干粪的质量比例，记作A；从测定的第一天开始，将A连续3天大于1877.0ng/g的第一天记作泌香活动准备起始时间点，之后将A连续3天低于1877.0ng/g的最后一天记作泌香活动确定终止时间点，在泌香活动准备起始时间点至泌香活动确定终止时间点之间的时间段内发生泌香活动；
所述干粪为水分的质量百分含量为37.9±9.8%的粪便；
所述泌香为林麝遗漏麝香香液或弥散麝香香味。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述林麝的粪便中的睾酮含量的测定时间选取如下：每天的同一时间取所述林麝的粪便测定所述林麝的粪便中的睾酮的含量。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述泌香活动的发生时间点在权利要求1或2所述的泌香活动准备起始时间点之后第7-15天。
5.粪便中睾酮含量作为标志物在辅助判断林麝泌香活动时间中的应用。
6.检测粪便中睾酮含量的物质在制备辅助判断林麝泌香活动时间的产品中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述泌香为林麝遗漏麝香香液或弥散麝香香味。
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