CN104962511A - 一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用，属于细胞生物学技术领域。本发明是采取的处于泌香期的麝鼠的香腺组织，立即置于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中进行清洗处理，清除香腺的外围组织，切割处理后的香腺组织并利用4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗后离心分离，再利用二型胶原酶进行消化处理，消化后离心分离，培养分离得到的沉淀组织。本发明简化了麝鼠香腺分泌细胞的体外分离培养步骤，只需得到均匀的小块香腺组织，直接就可以进行培养操作，且能保证细胞的生长条件接近于体内微环境。同时，本发明可简单快速的得到纯度较高的分泌细胞，极大的缩短了分泌细胞分离纯化的过程。

Description

一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

麝鼠分泌的麝香也叫麝鼠香，其中含有与天然麝香相同的麝香酮、降麝香酮、烷酮等主要成分，可广泛应用于传统的中药和香料领域。麝鼠香是由香腺分泌细胞所分泌的，因此体外分离培养麝鼠香腺分泌细胞既可为研究香腺的分泌机理提供试验材料，又可为体外生产麝鼠香的应用提供理论依据。

目前关于体外分离培养麝鼠香腺分泌细胞的技术，多是采用相关蛋白酶消化后混合培养的方法。这种方法使培养体系中即含有分泌细胞又含有支持细胞，又因为支持细胞的分裂速度远远大于分泌细胞，细胞经过几次传代后，培养系统中所剩分泌细胞寥寥无几，给分泌细胞的纯化及培养带来很大的困扰。因此蛋白酶消化后混合培养的方法得到的分泌细胞产量及质量都不高，并极大的耗费了时间、财力以及人力。

发明内容

为解决目前麝鼠香腺分泌细胞分离纯化培养的不足，本发明提供了一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法，该方法是采取的处于泌香期的麝鼠的香腺组织，立即置于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中进行清洗处理，清除香腺的外围组织，切割处理后的香腺组织并利用4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗后离心分离，再利用二型胶原酶进行消化处理，消化后离心分离，培养分离得到的沉淀组织。

所述方法的步骤如下：

1)采取处于泌香期的雄性麝鼠的香腺组织并立即将所得的香腺组织于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中进行清洗处理，洗去表面残留的香腺液，清洗完将所得香腺浸泡于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中；

2)去除步骤1)所得香腺组织中得到外围组织，并将组织移入含有4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液的培养皿中；

3)利用动物组织切割器将切割步骤2)的香腺，并利用4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗，离心分离清洗后的香腺组织，弃去上清液；

4)利用二型胶原酶对步骤3)离心得到的香腺组织进行消化处理，处理后离心并弃去上清液；

5)利用DMEM/F-12培养液培养步骤4)分离得到的香腺组织沉淀。

优选地，所述4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液，青霉素和链霉素的浓度为500U/mL。

优选地，步骤2)所述外围组织，是香腺周围残留的脂肪、血管、结缔组织及薄膜。

优选地，步骤3)所述利用动物组织切割器切割，是将所得香腺组织切割为厚度为0.7cm的组织碎片。

优选地，所述离心分离，是在1000rpm的条件下离心5min。

优选地，步骤4)所述利用二型胶原酶进行消化处理，是使用离心所得香腺组织体积4-6倍的150U的二型胶原酶进行消化处理。

优选地，步骤5)所述利用DMEM/F-12培养液培养，是先在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下倒置培养4h，再加入胎牛血清继续培养，第二天吸取并弃去胎牛血清后，加入新鲜DMEM/F-12培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下继续培养，再换液培养直至分泌细胞汇集成片。

所述方法的具体步骤如下：

1)在无菌条件下采取处于泌香期的雄性麝鼠的香腺组织，并迅速将所得的香腺组织置于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中清洗3-5次，洗去表面残留的香腺液，清洗完再将所得香腺浸泡于10ml，4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中；

2)去除步骤1)所得香腺组织周围的残留的脂肪、血管、结缔组织及薄膜，再将组织移入到经过4℃预冷的10ml含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液的培养皿中；

3)利用动物组织切割器将切割步骤2)的香腺切割为厚0.7cm的香腺组织碎片，并利用10ml 4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗，去除残留香腺液后，再1000rpm条件下离心5min，弃去上清液；

4)利用步骤3)所得香腺组织碎片总体积5倍的150U的二型胶原酶进行消化处理，处理结束后再于1000rpm条件下离心5min，弃去上清液；

5)向步骤4)所得的消化香腺组织碎片中加入2ml新鲜DMEM/F-12培养液，吹打均匀后于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下倒置培养4h，培养结束后再加入500μl胎牛血清，在于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下正置培养过夜，培养结束后将吸走胎牛血清后，加入1ml新鲜的DMEM/F-12培养液，再于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下48h，培养结束后加入5ml 新鲜DMEM/F-12培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下继续培养，重复更换培养液直至香腺细胞从香腺组织碎片的周围长出并汇集成片。

所述任一方法用于获取麝鼠香腺分泌细胞。

本发明有益效果：

1.麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的现有培养技术多为蛋白酶消化法，步骤繁琐，费时费力。本发明简化了麝鼠香腺分泌细胞的体外分离培养步骤，只需得到均匀的小块香腺组织，直接就可以进行培养操作，而且还能够保证细胞的生长条件接近于体内微环境。

2.麝鼠香腺组织经二型胶原蛋白酶短时消化后，可使组织块周围的结缔组织离散，暴露出香腺组织的分泌单元，从而使分泌单元的主要成分-分泌细胞从分泌单元周围爬出，并在本专利培养条件下快速成片生长。在此条件下的细胞大部分都是分泌细胞，可简单快速的得到纯度较高的分泌细胞，极大的缩短了分泌细胞分离纯化的过程。

附图说明

图1为实施例1香腺组织块及其周围生长的分泌细胞。

图2为实施例3香腺分泌细胞及其周围的支持细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所使用的材料、试剂、方法和仪器，未经特殊声明，均为本领域常规的材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

本发明所用的动物组织切割器械是根据专利号为ZL201420335401.8的专利制作获得的。实施例1

1)将试验用6月龄处于泌香期的麝鼠中香腺组织于无菌环境中取出，并迅速置于4℃预冷的500U/ml青、链霉素PBS中，冲洗5次后备用；

2)去除香腺组织周围残留的脂肪、血管及结缔组织，剥去香腺组织外围的薄膜，用动物组织切割器械将香腺组织切成厚度为0.7cm的均匀小块组织；

3)使用4℃预冷的500U/ml青、链霉素PBS清洗厚度为0.7cm的均匀小块香腺组织，清洗8次后，观察上清液由浑浊变为澄清，1000rpm/min离心5min，弃上清；

4)向装有小块香腺组织的15ml的离心管中加入5ml的150U的二型胶原蛋白酶，吹打均匀后，迅速置于离心机中1000rpm/min离心5min，弃上清；

5)加入2ml新鲜DMEM/F-12培养液，吹打均匀后，使用移液管将组织均匀的铺在规格为25cm²的细胞培养瓶中，将培养瓶倒置后弃去残余培养液，于37℃、5％CO₂、饱和湿度 的条件下倒置培养4h；

6)4h后，向铺有小块香腺组织的细胞培养瓶中加入500μl的胎牛血清，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下正置过夜培养香腺组织块；

7)培养17h后，将细胞培养瓶中500μl的胎牛血清吸走，加入1ml新鲜DMEM/F-12培养液，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下培养48h后，换液，加入5ml新鲜DMEM/F-12培养液于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下继续培养香腺组织块；

8)继续培养7d左右，显微镜下观察有大量分泌细胞从香腺组织块周围爬出，并汇合成片，其间只夹杂少量的支持细胞，采用胰酶短时消化法去除掺杂的支持细胞，进而对分泌细胞进行消化传代培养。

实施例2

与实施例1的区别在于： 

利用动物组织切割器将香腺切割为厚0.8cm的香腺组织碎片，二型胶原酶的浓度为200U，加入二型胶原酶的体积为6ml。培养后获得的细胞经观察与实施例1所得的细胞没有明显区别。

实施例3

本实施例提供了一种现有技术中常用的麝鼠香腺组织细胞的培养方法，具体步骤如下：

1)将试验用一岁龄处于泌香期的雄性麝鼠香腺组织于无菌环境中取出，使用4℃预冷的青、链霉素PBS冲洗5次后去除香腺组织周围残留的脂肪、血管及结缔组织，剥去香腺组织外围的薄膜，使用眼科剪或手术刀将香腺组织剪成厚度均匀的大小为1mm³小块组织；

2)使用4℃预冷的青、链霉素PBS清洗香腺组织小块，清洗8次，观察上清液由浑浊变为澄清，1000rpm/min离心5min，弃上清；

3)向装有小块香腺组织的15ml的离心管中加入6ml 150U的二型胶原蛋白酶，吹打均匀后，置于37℃恒温水浴锅中消化2h，再加入0.25％的胰蛋白酶继续消化15min，消化结束后，1000rpm/min离心5min，弃上清； 

4)加入5ml新鲜DMEM/F-12培养液，吹打均匀，使用移液管将香腺细胞均匀铺在规格为25cm²的细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下培养17h；

5)培养17h后，更换新鲜DMEM/F-12培养液于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下继续培养香腺细胞，2d更换培养液一次；

6)继续培养7d左右，显微镜下观察并分析结果，见图2。

将实施例1和实施例3培养方法的效果进行比较，结果见表1：

表1 实施例1和实施例3培养方法的对比

从表1可以看出，利用本发明所提供的方法，可直接获得纯度较高的分泌细胞，仅掺杂少量的支持细胞，可利用胰蛋白酶短时消化法及贴壁时间的不同将支持细胞清除；而传统方法获得的支持细胞较多，分泌细胞较少，在后续的分离纯化中支持细胞逐渐占优势，分泌细胞则寥寥无几，所得的成功率较低。因此，本发明方法在实验操作的简单、快速、省时及成功率等方面明显优于现有方法。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法，其特征在于，是采取的处于泌香期的麝鼠的香腺组织，立即置于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中进行清洗处理，清除香腺的外围组织，切割处理后的香腺组织并利用4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗后离心分离，再利用二型胶原酶进行消化处理，消化后离心分离，培养分离得到的沉淀组织。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)采取处于泌香期的雄性麝鼠的香腺组织并立即将所得的香腺组织于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中进行清洗处理，洗去表面残留的香腺液，清洗完将所得香腺浸泡于4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中；

2)去除步骤1)所得香腺组织中得到外围组织，并将组织移入含有4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液的培养皿中；

3)利用动物组织切割器将切割步骤2)的香腺，并利用4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗，离心分离清洗后的香腺组织，弃去上清液；

4)利用二型胶原酶对步骤3)离心得到的香腺组织进行消化处理，处理后离心并弃去上清液；

5)利用DMEM/F-12培养液培养步骤4)分离得到的香腺组织沉淀。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液，青霉素和链霉素的浓度为500U/mL。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述外围组织，是香腺周围残留的脂肪、血管、结缔组织及薄膜。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述利用动物组织切割器切割，是将所得香腺组织切割为厚度为0.4-1.0cm的组织碎片。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)所述离心分离，是在1000rpm的条件下离心5min。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述利用二型胶原酶进行消化处理，是使用离心所得香腺组织体积4-6倍的100-300U的二型胶原酶进行消化处理。

8.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤5)所述利用DMEM/F-12培养液培养，是先在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下倒置培养3-5h，再加入胎牛血清继续培养，第二天吸取并弃去胎牛血清后，加入新鲜DMEM/F-12培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下继续培养，再换液培养直至分泌细胞汇集成片。

9.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)在无菌条件下采取处于泌香期的雄性麝鼠的香腺组织，并迅速将所得的香腺组织置于4℃预冷的500U青霉素和500U链霉素的磷酸盐缓冲溶液中清洗3-5次，洗去表面残留的香腺液，清洗完再将所得香腺组织浸泡于10ml，4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中；

2)去除步骤1)所得香腺组织周围的残留的脂肪、血管、结缔组织及薄膜，再将组织移入到经过4℃预冷的10ml含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液的培养皿中；

3)利用动物组织切割器将切割步骤2)的香腺切割为厚0.7cm的香腺组织碎片，并利用10ml 4℃预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液清洗5-8次，去除残留香腺液后，再1000rpm条件下离心5min，弃去上清液；

4)利用步骤3)所得香腺组织碎片总体积5倍的150U的二型胶原酶进行消化处理，处理结束后再于1000rpm条件下离心5min，弃去上清液；

5)向步骤4)所得的消化香腺组织碎片中加入2ml新鲜DMEM/F-12培养液，吹打均匀后于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下倒置培养4h，培养结束后再加入500μl胎牛血清，在于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下正置培养过夜，培养结束后将吸走胎牛血清后，加入1ml新鲜的DMEM/F-12培养液，再于37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下48h，培养结束后加入5ml新鲜DMEM/F-12培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下继续培养，重复更换培养液直至香腺细胞从香腺组织碎片的周围长出并汇集成片。

10.权利要求1-9所述任一方法，其特征在于，用于获取麝鼠香腺分泌细胞。