CN101016550A - 阳离子聚合物基因转染试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

阳离子聚合物基因转染试剂及其制备方法，涉及一种阳离子聚合物，尤其是涉及一种阳离子聚合物基因转染的试剂。提供一种阳离子聚合物介导的基因转染，具有效率高、细胞毒性低、使用安全、操作简便等优点，能很好满足各种研究中基因转染要求的阳离子聚合物基因转染试剂及其制备方法。试剂包括阳离子聚合物和基因转染试剂工作液，阳离子聚合物为具有分支结构、分子量为30KD的聚合物；基因转染试剂工作液含生理盐水、二甲基亚砜和甘油。制备时先合成阳离子聚合物，再制备基因转染试剂工作液，最后将阳离子聚合物和基因转染试剂工作液混合得阳离子聚合物基因转染试剂。

Description

阳离子聚合物基因转染试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种阳离子聚合物，尤其是涉及一种阳离子聚合物基因转染的试剂。

背景技术

基因转染是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内，并使核酸在细胞内维持其生物功能”。基因转染技术历经物理方法转染(包括生物粒子导入、电穿孔和显微注射)、生物方法转染(病毒介导的转染)以及生化方法转染等阶段。转染效率、细胞毒性、使用安全性以及转染程序的繁简程度是基因转染技术的最重要指标。物理方法转染需要转染设备，而且相关参数难于把握，不适于一般研究工作；病毒介导的基因转染不适于大部分类型的细胞，病毒的安全性问题阻碍了其使用(参见：Verma I M，Somia N.Gene therapy-promises，problemsand prospects.Nature，1997，389：239-242)，而且病毒载体制备方法复杂，价格昂贵也严重限制了其在基因转染中的应用(参见：Arhsall E.Gene therapy death prompts review of adenovirusvector.Science，2000，286：2244-2245)；生化方法介导的基因转染是目前最普遍使用的方法。

生化方法介导的基因转染，需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法由于转染效率低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。20世纪80年代中期建立的阳离子脂质体介导的基因转染，在体外基因转染中有很高的效率，一度成为主要的转染试剂。但阳离子脂质体用于动物体内基因转染时，由于它迅速被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性(参见：IshiwataN，Suzuki S，Ando et al.Characteristics and biodistribution of cationic liposomes and their DNAcomplexes.J.Control Rel，2000，69：139-148)，因此，在很大程度上限制了其应用(参见：Filion M C，Phillips N C.Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectorsformulated with cationic lipids toward immune effector cells.Biochim Biophys Acta，1997，1329：345-356；Filion M C，Phillips N C.Major limitations in the use of cationic liposomes for DNAdelivery.Int.J.Pharm，1998，162：159-170)。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物作为最新型化学物质用于介导基因转染正日益受到重视。阳离子聚合物介导的基因转染，具有效率高、细胞毒性低、使用安全、简便等优点，能很好满足各种研究的基因转染要求，已成为欧美等发达国家研发基因转染试剂的焦点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的采用物理方法、生物方法和生化方法等基因转染中所存在的上述不足，提供一种阳离子聚合物介导的基因转染，具有效率高、细胞毒性低、使用安全、操作简便等优点，能很好满足各种研究中基因转染要求的阳离子聚合物基因转染试剂及其制备方法。

本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂包括阳离子聚合物和基因转染试剂工作液，其中阳离子聚合物为具有分支结构、分子量为30KD的聚合物；基因转染试剂工作液由生理盐水、二甲基亚砜和甘油组成，按体积比的含量是生理盐水∶二甲基亚砜∶甘油＝(40～60)∶(39～59)∶1；按质量/体积比阳离子聚合物∶基因转染试剂工作液＝(1～10)g∶100ml。

本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂的制备方法包括以下步骤：

1)合成阳离子聚合物：在反应体系中首先加入双蒸水和硫酸，搅拌后采用油浴加热至90℃，加入浓度为1％的氮丙啶(1克氮丙啶事先溶解于100ml的异丁醇溶液中)，再加入引发剂Vazo50、二乙醇胺和4-二甲胺吡啶，通入氮气，控制温度恒定为90℃，反应时间为4～8h，冷却至室温，产物经减压浓缩后，采用柱层析提纯，即得到所需要的阳离子聚合物；按质量和体积比各原料的含量为双蒸水∶硫酸∶氮丙啶∶引发剂∶二乙醇胺∶4-二甲胺吡啶＝100ml∶(15～25)ml∶(2～8)ml∶(0.2～0.4)g∶(45～60)ml∶(7.5～10.5)g。

2)制备基因转染试剂工作液：将生理盐水、二甲基亚砜和甘油按配比混合，按体积比的含量是生理盐水∶二甲基亚砜∶甘油＝(40～60)∶(39～59)∶1。

3)制备阳离子聚合物基因转染试剂：将阳离子聚合物和基因转染试剂工作液混合，在56℃水浴加热，溶解，然后经0.2μm的滤器过滤，配制成本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂，按质量/体积比阳离子聚合物∶基因转染试剂工作液＝(1～10)g∶100ml。

在本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂的制备方法中其关键技术是：

1)阳离子聚合物的制备：阳离子聚合物分子中氨基带正电荷，能与DNA分子结构中磷酸根负电荷通过静电作用，形成阳离子聚合物/DNA复合物，理论上阳离子聚合物的分子量越大，转染效率越高，当分子量低于10KD时，几乎不显示转染效率。然而，分子量越大，则转染试剂的细胞毒性越大。因此，制备适宜分子量的阳离子聚合物是本发明的技术关键。

2)基因转染试剂工作液的制备：(1)工作液中不能含有“质子泵”抑制剂及其类似物：阳离子聚合物的转染效率依赖于其在内涵体中捕捉质子的能力，当它们被酸化时，质子被捕捉进入内涵体，使得内涵体渗透膨胀，最终崩解，避免DNA被内涵体酶的降解，而质子泵抑制剂及其类似物(如巴洛霉素A1和力球肮霉素A等)可抑制该过程，使转染效率下降7～74倍。(2)用于工作液配置的缓冲溶液的选择：研究表明，在无盐介质中，阳离子聚合物几乎不显示任何转染效率。这是由于在该介质中，阳离子聚合物包裹DNA所形成的“微粒”不能累积于细胞表面，并局限了内涵体释放DNA，所以，必须选择适当的缓冲溶液来配置该试剂。(3)添加剂的使用：为了促进阳离子聚合物/DNA复合物进入细胞膜的跨膜过程，必须使用适当的一些帮助分子(help molecule)作添加剂，包括复制的缺陷腺病毒、氯喹、甘油以及基因融合肽，以提高转染效率。(4)助溶剂的使用：为了提高阳离子聚合物的溶解性，以及更有利于细胞膜的跨膜过程，选择二甲基亚砜作为助溶剂，以提高转染效率。

本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂具有以下用途：

基因转染试剂是基因转染技术所需试剂，基因转染技术广泛应用于基因组功能研究(包括基因表达调控、基因功能、信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究，以及生命科学的开发应用研究等诸多领域。应用行业包括从事基因组功能和基因治疗研究的科研院所和高等院校、开展基因治疗临床应用的卫生医疗单位，以及从事生物药品(基因工程药品、生物疫苗和诊断试剂)研发生产的生物技术企业。

以下给出本发明中的主要成分阳离子聚合物介导基因转染的作用机制：1)阳离子聚合物/DNA复合物的形成：阳离子聚合物的化学结构显示，它表面带有很高的阳性电荷势能，每第3个原子带有一个能被质子化的氨基氮结构。阳离子聚合物表面带正电荷，而质粒DNA带负电荷，二者通过静电作用形成阳离子聚合物/DNA复合物。2)阳离子聚合物/DNA复合物与细胞的作用：该复合物能被表面带负电荷的细胞膜吸附，在通过膜的融合和细胞的内吞作用，偶尔也可通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成内涵体(endosome)，然后DNA从内涵体释放，进入细胞质中，最终进入细胞核进行转录、表达。3)质子海棉体效应学说：阳离子聚合物/DNA复合物从内涵体释放到细胞质中的过程，可以用质子海棉体效应学说来解释。该学说是基于阳离子聚合物带有很高的阳性电荷电位，其每第三个原子是个能被质子化的氨基氮，驱使质子流入内涵体内(酸化)，并伴随氯离子的被动流入，这时的内涵体就好比一个吸收质子的海绵体。由于质子在内涵体中的聚集，导致包涵体渗透膨胀，并最终瓦解，将DNA释放到细胞中，而使DNA免受内涵体酶酶解，并使其在细胞核内释放，从而提高基因表达水平。

与现有采用物理方法、生物方法和生化方法等基因转染相比，本发明具有以下突出优点：

本发明所述的阳离子聚合物转染试剂其转染效率高、细胞毒性低、使用简便，比磷酸钙和阳离子脂质体相比具有明显的优势，其产品技术指标和使用效果与国外同类产品相比达到先进水平。本发明所述的试剂与磷酸钙、阳离子脂质体、国外的阳离子聚合物转染试剂技术指标对比参见表1。

表1

指标		磷酸钙	阳离子脂质体	阳离子聚合物(国外)	本发明试剂
						转染效率(GFP基因为报告基因)	普通细胞	＜50％	＞60％	＞60％	＞60％
难转细胞	＜5％	＜5％	15-20％	≥20％
					细胞毒性(以细胞存活率计)		＜85％	＞85％	＞90％	＞90％
遇血清转染效率是否下降		是	是	否							否
					是否需换培养基		是	是	否	否
转染操作		繁琐	繁琐	简单							简单
					使用细胞范围		窄	宽	宽	宽
试剂使用剂量(1ml试剂可转染次数，6孔板)		165～200次	50～200次	165次							165～330次
					储存条件/期限		4℃/12个月	4℃/6-12个月	4℃/12个月	4℃/12个月

具体实施方式

实施例1：阳离子聚合物基因转染试剂的制备

合成阳离子聚合物：在阳离子聚合物的合成中，首先由氮丙啶单体，经环化聚合，再经酸催化而成具有分支结构，分子量为30KD的阳离子聚合物。

在反应体系中首先加入200ml双蒸水和30ml 18.4mol/L浓硫酸，搅拌，采用油浴加热至90℃，严格维持在此温度，缓慢滴加4ml 1％氮丙啶，滴加的速度一定要尽可能的慢，使得产生的热量足于让反应体系维持在90℃，而不能超过95℃。再加入0.4g引发剂(Vazo50)、90ml二乙醇胺、15克4-二甲胺吡啶，通入氮气，强烈搅拌，控制恒定温度90℃，反应时间4h。冷却至室温，产物经减压浓缩后，采用柱层析提纯，即得到所需要的阳离子聚合物。

制备基因转染试剂工作液：将生理盐水40ml、二甲基亚砜59ml和甘油1ml混合成基因转染试剂工作液100ml。

制备阳离子聚合物基因转染试剂：取1g阳离子聚合物与100ml基因转染试剂工作液混合，在56℃水浴加热溶解，然后经0.2μm的滤器过滤，配制成阳离子聚合物基因转染试剂。

通过含性能和转染效果的实验，结果表明，上述所得的阳离子聚合物基因转染试剂是一种高转染效率，低细胞毒性，且适用细胞类型较广泛的转染试剂。而其简单，快捷的实验步骤，在研究实验中同样具有很好的优越性。

实施例2：阳离子聚合物基因转染试剂的制备

合成阳离子聚合物：在阳离子聚合物的合成中，首先由氮丙啶单体，经环化聚合，再经酸催化而成具有分支结构，分子量为30KD的阳离子聚合物。

在反应体系中首先加入200ml双蒸水和50ml 18.4mol/L浓硫酸，搅拌，采用油浴加热至90℃，严格维持在此温度，缓慢滴加16ml 1％氮丙啶，滴加的速度一定要尽可能的慢，使得产生的热量足于让反应体系维持在90℃，而不能超过95℃。再加入0.8g引发剂(Vazo50)、120ml二乙醇胺、21克4-二甲胺吡啶，通入氮气，强烈搅拌，控制恒定温度90℃，反应时间8h。冷却至室温，产物经减压浓缩后，采用柱层析提纯，即得到所需要的阳离子聚合物。

制备基因转染试剂工作液：将生理盐水60ml、二甲基亚砜39ml和甘油1ml混合成基因转染试剂工作液100ml。

制备阳离子聚合物基因转染试剂：取10g阳离子聚合物与100ml基因转染试剂工作液混合，在56℃水浴加热溶解，然后经0.2μm的滤器过滤，配制成阳离子聚合物基因转染试剂。

实施例3：阳离子聚合物基因转染试剂的制备

合成阳离子聚合物：在阳离子聚合物的合成中，首先由氮丙啶单体，经环化聚合，再经酸催化而成具有分支结构，分子量为30KD的阳离子聚合物。

在反应体系中首先加入200ml双蒸水和40ml 18.4mol/L浓硫酸，搅拌，采用油浴加热至90℃，严格维持在此温度，缓慢滴加10ml 1％氮丙啶，滴加的速度一定要尽可能的慢，使得产生的热量足于让反应体系维持在90℃，而不能超过95℃。再加入0.6g引发剂(Vazo50)、100ml二乙醇胺、18克4-二甲胺吡啶，通入氮气，强烈搅拌，控制恒定温度90℃，反应时间6h。冷却至室温，产物经减压浓缩后，采用柱层析提纯，即得到所需要的阳离子聚合物。

制备基因转染试剂工作液：将生理盐水50ml、二甲基亚砜49ml和甘油1ml混合成基因转染试剂工作液100ml。

制备阳离子聚合物基因转染试剂：取6g阳离子聚合物与100ml基因转染试剂工作液混合，在56℃水浴加热溶解，然后经0.2μm的滤器过滤，配制成阳离子聚合物基因转染试剂。

实施例4：本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂结合DNA能力的研究

基因转染试剂必须具有很强的DNA结合能力，这是转染试剂必需具备的初步条件。本发明采用DNA延滞实验检测基因转染试剂结合DNA的能力。在电场中，带负电荷的质粒DNA由负极向正极泳动，在凝胶中显示典型的质粒条带。若基因转染试剂能够结合DNA，则整个阳离子聚合物/DNA的复合体的负电荷减弱，分子量增大，在电场中的泳动速度变慢，或停止泳动，有时甚至向反方向缓慢移动。实验结果说明本发明的所述的阳离子聚合物基因转染试剂有较强的DNA结合能力。

实施例5：本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂的基因转染效率的验证(以HEK293人胚肾细胞株为例)

为了研究本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂的转染效果，使用不同报告基因，不同转染试剂(本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂、美国Invitrogen公司阳离子脂质体Lipofectamine、美国Qbiogene公司阳离子聚合物JetPEI和美国Qiagen公司SuperFect)，对靶细胞人胚肾细胞HEK293进行基因转染实验，分析比较转染效率和细胞毒性。

将HEK293细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔种植2.0×10⁵个细胞，细胞培养液总体积500μl。将细胞放置在37℃，5％CO₂孵育16～24h，细胞密度约40％～50％。将0.6μg质粒DNA和转染试剂分别稀释于30μl Opti MEM中，然后将30μl转染试剂稀释液滴加到30μl质粒DNA的稀释液中，边加边用旋涡振荡器振荡，室温温育15min。其中本发明的阳离子聚合物基因转染试剂和质粒的质量比从32∶1到8∶1，其他转染试剂用量参照厂家说明书。将转染试剂/DNA混合物(60μl)加入细胞培养液中，轻轻摇匀，置于37℃，5％CO₂孵育48h，基因表达分析。

1.观察绿色荧光蛋白(GFP)表达：

用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。每孔找3个具有代表性的视野，各观察100个细胞，计算阳性细胞的百分率。绿色荧光蛋白基因(GFP)阳性细胞越多，信号越强，表明转染率越高。研究结果表明本项目的转染率最高，阳性细胞占65％左右，而且荧光强度最强。其它试剂转染效率约50-63％，而且荧光强度较弱。说明用所制备的阳离子聚合物转染的细胞，不仅阳性百分率高，而且在单个细胞中表达的GFP量多。

2.荧光素酶活性检测

荧光素酶是从荧火虫分离得到的。荧光素酶能够催化荧光素反应生成氧化荧光素，同时分解ATP并将其中的化学能转化为光能。在适宜的条件下，荧光素酶活性越高，该化学反应产生的光越多。在基因转染48h后，检测转染的细胞荧光素酶活性。实验表明，本项目基因转染试剂显示最高的转染率，当其与DNA质量比为16时，转染细胞荧光素酶活性高出10⁹RLU/mg蛋白，分别是Jet PEI，Superfect和Lipofectamine转染细胞最高活性的5，2.3和1.6倍。说明本项目转染效率较其它试剂高。

3.β-半乳糖苷酶染色

LacZ基因表达的产物为β-半乳糖苷酶，其催化水解反应能把X-Gal水解成蓝色的5-溴-4-氯-靛青。基因转染后，蓝色细胞越多说明Lac Z gene的转染率越高。比较实验表明，本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂转染的HEK 293细胞，95％以上显示蓝色信号，而其它3种试剂转染细胞的阳性率分别为75％，85％和80％。

实施例6：特殊细胞株基因转染效率的验证

为进一步探讨本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂对目前市售试剂难以转染的细胞的转染效果，选用人脐静脉上皮HUV-EC细胞作为研究对象进行研究。用本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂、Jet PEI、Superfect和Lipofectamine分别将质粒pEGFPN1转染到HUV-EC中，结果发现，本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂的转染效率仍为最高，阳性细胞约占20％；Jet PEI和Superfect的转染效率分别为15％和12％左右。需特别指出的是，在各种常规转染实验中表现较好的Lipofectamine，在此细胞中几乎没有转染效率。说明本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂对于某些原代培养细胞来说也是一种很好的转染试剂(＜0.05％)。

实施例7：基因转染程序优化

阳离子聚合物不被血清清除，转染时阳离子聚合物/DNA复合物可以直接加到细胞培养基中，接下来只是等待转染分析，而无需在这前后更换培养基质和清洗细胞，这就大大地简化了转染程序。转染实验可以在半小时内完成，可以节约很多宝贵的实验时间，并使转染实验便于安排和调整，而传统的基因转染却又复杂繁琐得多。

实施例8：适应范围

本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂适用于原代培养细胞和转化细胞株，适合转染的细胞株范围广泛。

实施例7：细胞毒性实验

除基因转染效率外，细胞毒性也是一个非常重要的参数。通常细胞毒性的高低用半致死剂量(ID50或LD50)来表示。考虑到基因转染效率和细胞毒性是密切相关的，即要达到一定转染效率，总会产生一定程度的细胞毒性。比较基因转染效率最高时的细胞毒性更有意义，因为即使某试剂毫无毒性，若其无转染效率，对基因转染研究来说也是毫无意义。

在基因转染48h后，用MTT法测定了细胞存活率。由于通过基因转染效率实验，已经发现各种转染试剂与DNA的最佳比例，例如当阳离子聚合物/DNA比例为16时，荧光素酶基因转染效率最高。比较了各种试剂转染效率最高时，细胞的存活率。研究表明，在最佳浓度时，Jet PEI，Superfect和Lipofectamine 2000细胞存活率为分别为91.25％，87.69％和83.65％，细胞毒性很低，而本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂转染的细胞的存活率大部分为94.23％，毒性最低。

Claims (2)

1.阳离子聚合物基因转染试剂，其特征在于包括阳离子聚合物和基因转染试剂工作液，其中阳离子聚合物为具有分支结构、分子量为30KD的聚合物；基因转染试剂工作液由生理盐水、二甲基亚砜和甘油组成，按体积比的含量是生理盐水∶二甲基亚砜∶甘油＝40～60∶39～59∶1；按质量/体积比阳离子聚合物∶基因转染试剂工作液＝(1～10)g∶100ml。

2.如权利要求1所述的阳离子聚合物基因转染试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)合成阳离子聚合物：在反应体系中首先加入双蒸水和硫酸，搅拌后采用油浴加热至90℃，加入浓度为1％的氮丙啶，再加入引发剂Vazo50、二乙醇胺和4-二甲胺吡啶，通入氮气，控制温度恒定为90℃，反应时间为4～8h，冷却至室温，产物经减压浓缩后，采用柱层析提纯，即得到所需要的阳离子聚合物；按质量和体积比各原料的含量为双蒸水∶硫酸∶氮丙啶∶引发剂∶二乙醇胺∶4-二甲胺吡啶＝100ml∶(15～25)ml∶(2～8)ml∶(0.2～0.4)g∶(45～60)ml∶(7.5～10.5)g。；

2)制备基因转染试剂工作液：将生理盐水、二甲基亚砜和甘油按配比混合，按体积比的含量是生理盐水∶二甲基亚砜∶甘油＝40～60∶39～59∶1；

3)制备阳离子聚合物基因转染试剂：将阳离子聚合物和基因转染试剂工作液混合，在56℃水浴加热，溶解，然后经0.2μm的滤器过滤，配制成本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂，按质量/体积比阳离子聚合物∶基因转染试剂工作液＝(1～10)g∶100ml。