CN102633934B - 一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法与应用 Download PDF

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本发明公开了一种组胺改性的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法和应用，其中采用甲基丙烯酸缩水甘油酯环氧基开环与胍基丁胺和组胺的末端氨基反应，将胍基丁胺与组胺通过化学键链接到甲基丙烯酸缩水甘油酯上，最后引发改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体进行自由基无规聚合，最终使带正电的胍基丁胺与具有质子缓冲作用的组胺键接到高分子链上。该胍基丁胺载体具有良好的生物相容性和促进复合物跨膜的能力。组胺改性又在不影响载体细胞毒性的前提下增加了复合物的内涵体逃逸能力，有效改善了胍基丁胺作为转基因载体的效率和性能，可作为高效非病毒基因载体用于基因治疗，实现提高胍基丁胺载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。

Description

一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种转基因载体及其制备方法，更具体地说，涉及一种组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体在基因治疗中取得了一些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究，其主要包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。
阳离子高聚物作为非病毒载体的一种，它既具有非病毒载体的优点(即低毒性，低免疫原性和低致癌性)，还有自身的优势——易于制备和携带目的基因能力高，这些更加有利于其作为转基因载体的应用。常见的阳离子高聚物能够通过强静电作用有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较为稳定。这些PECs易于细胞内化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。因此，阳离子高聚物已成为非病毒基因载体的重要组成部分，但是阳离子高聚物作为基因载体应用时，仍呈现出了一些问题，例如生物相容性差、有毒性、形成的复合物从内涵体逃离的能力弱以及转染效率低等。载体/DNA复合物从内涵体逃离的能力是影响载体转染效率的一个重要因素。具有较强“质子缓冲作用”的载体如聚乙烯亚胺进入内涵体后，会进一步质子化，使得大量的抗衡阴离子进入，渗透压增大使内涵体破裂而利于复合物的逃离。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物相容性好、毒性小、具有质子缓冲作用的阳离子高聚物作为非病毒型转基因载体进行使用。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备上述阳离子高聚物的方法。
本发明的目的还在于提供一种上述阳离子高聚物的应用。
本发明的上述目的通过下述技术方案予以实现。
本发明使用改性聚甲基丙烯酸缩水甘油酯作为阳离子高聚物，当作转基因载体进行使用。
本发明的阳离子高聚物基因载体，以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯为主链，取代基为胍基丁胺与组胺，其分子式如下：
分子式所示的结构为无规聚合物，其中两种重复单元的聚合度m和n由投料时两种单体的摩尔决定，一般来说可选择m∶n＝(1-3)∶(3-1)，优选1∶3、2∶2、3∶1。
一种制备组胺修饰的线性胍基丁胺转基因载体的方法，按照下述步骤进行：将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯在碱性的条件下进行非均相反应，使得甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基打开进而与胍基丁胺和组胺的末端氨基反应。反应完全后，用乙醚萃取除去未反应的甲基丙烯酸缩水甘油酯。最后在酸性、无氧惰性气体(如氮气、氩气或者氦气)保护的条件下，以过硫酸铵为引发剂，引发经胍基丁胺和组胺改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体进行自由基无规聚合，最终经透析冻干即得组胺修饰的线性胍基丁胺转基因载体。
在上述制备方法中，将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯混合非均相反应时，一般在pH＝9-10、温度为35℃的条件下反应至少24小时，优选24-48小时，可通过进一步延长反应时间来提高反应效果。胍基丁胺与组胺的总用量应大于甲基丙烯酸缩水甘油酯，以保证甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基尽量全部参与反应；同时未参加反应的甲基丙烯酸缩水甘油酯可通过乙醚萃取除去。无规聚合反应应在pH＝4-5、温度为65℃的无氧氮气保护条件下反应至少24小时，优选24-48小时，可通过进一步延长反应时间来提高反应效果。反应结束后，采用透析方式进行提纯；采用冻干的方法得到产物。
本发明技术方案的制备方法通过附图1所示的核磁谱图予以证实：用400MHz高分辨超导核磁共振仪Varian UNITY plus-400以氘代水为溶剂检测样品氢谱，可知图中d(δ ＝3.1)、e(δ＝7.8)、f(δ＝6.8)、g(δ＝1.5)、h(δ＝1.5)处特征峰的存在，证实了通过甲基丙烯酸缩水甘油酯中环氧基开环进而与胍基丁胺、组胺的仲胺反应，成功将小分子胍基丁胺与组胺引入到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯分子链上。
在本发明的技术方案中，胍基丁胺是精氨酸的代谢产物，本身具有生物活性，在大脑中合成，几乎分布于体内所有的器官，并呈器官特异性分布。它是一种神经递质或调质，参与多个生物学作用，影响细胞的粘附和增殖。其结构中含有一个丁胺基活性基团和胍基基团，带正电荷，且胍基具有类似于细胞穿膜肽的作用，有利于跨膜。组胺是组氨酸的脱羧产物，其咪唑环的pKa为6.15，具有很强的内涵体质子缓冲能力，且组胺以及咪唑基团由于在生理条件下具有较低的电荷密度，其细胞毒性一般较低。
利用本发明的载体进行细胞毒性试验，采用MTT比色法进行测试。MTT的化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臢(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此反应。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢，用酶联免疫检测仪在570纳米波长处测定其吸光值，间接的反映活细胞的数量。具体实验步骤为：
(1)称取25毫克MTT放入小烧杯中，加5毫升PBS(pH＝7.4)在磁力搅拌器上搅拌30分钟，溶解后，用0.22μm一次性滤器除菌，4℃避光待用(两周内有效，长期保存在-20℃)。
(2)分别将接种好细胞的96孔板中每个孔换上180微升含10％FBS的DMEM培养基，并加入20微升不同浓度的载体溶液，在37℃，5％CO2条件下培养24小时后，将每孔的培养基完全吸出，每孔加入180微升的无血清的新鲜DMEM培养基和20微升MTT溶液。继续培养4小时。
(3)小心吸弃96孔板中孔内培养上清液，并在每孔中加入150微升DMSO，在脱色摇床上振荡溶解10分钟。
(4)选择570纳米波长，在酶联免疫检测仪上测定每孔细胞的光吸收值，记录结果。
(5)以未经处理的裸细胞作为对照，以空白孔调零。细胞存活率计算为样品吸光度/对照组吸光度×100％(每个样品以三个孔重复实验，所得结果取均值和标准偏差)。
由测试结果可知，当载体浓度上升细胞存活率出现下降，达到2000ug/ml时，细胞 存活率都在85％-90％以上，说明具有很好的生物相容性。
本发明技术方案的优点在于制备方法简单，合成条件温和，以具有跨膜作用和良好生物相容性的胍基丁胺作为压缩DNA的基团，减小了载体的细胞毒性且有利于复合物的跨膜。同时用具有质子缓冲作用的组胺对载体进行修饰，这一改性在不影响载体细胞毒性的前提下增加了复合物的内涵体逃逸能力，有效改善了胍基丁胺作为转基因载体的效率和性能，可作为高效非病毒基因载体用于基因治疗，实现提高胍基丁胺载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。
附图说明
图1是胍基丁胺和组胺修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的核磁谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：
取50ml圆底烧瓶，将胍基丁胺硫酸盐(1.71g，7.5mmol)、组胺二盐酸盐(0.46g，2.5mmol)与水(10ml)加入烧瓶中(即胍基丁胺硫酸盐与组胺二盐酸盐的摩尔比为3/1)，搅拌均匀直至成透明液体。滴加约1ml的氢氧化钠溶液(4M)调节反应体系的pH值到10左右。在强烈的搅拌下，1ml甲基丙烯酸缩水甘油酯(ρ＝1.074g/ml，7.6mmol)缓慢滴入反应体系中，35℃进行反应24小时。用乙醚对反应液进行萃取，将下层液体收集到50ml圆底烧瓶中，用1ml盐酸溶液(4M)调节体系pH值到5左右，加入过硫酸铵(12mg，0.05mmol)在65℃无氧氮气保护条件下无规聚合24小时。反应产物用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干即得最终产物。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中，用0.22μm滤器滤菌。与含Luciferase报告基因的pGL3质粒DNA溶液混合配制成复合物，载体/DNA的复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24小时后，换液，继续培养24小时。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.08×107RLU/mg protein。
实施例2：
取50ml圆底烧瓶，将胍基丁胺硫酸盐(1.14g，5mmol)、组胺二盐酸盐(0.92g，5 mmol)与水(10ml)加入烧瓶中(即胍基丁胺硫酸盐与组胺二盐酸盐的摩尔比为2/2)，搅拌均匀直至成透明液体。滴加约2ml的氢氧化钠溶液(4M)调节反应体系的pH值到10左右。在强烈的搅拌下，1ml甲基丙烯酸缩水甘油酯(ρ＝1.074g/ml，7.6mmol)缓慢滴入反应体系中，35℃进行反应24小时。用乙醚对反应液进行萃取，将下层液体收集到50ml圆底烧瓶中，用2ml盐酸溶液(4M)调节体系pH值到5左右，加入过硫酸铵(12mg，0.05mmol)在65℃无氧氮气保护条件下无规聚合24小时。反应产物用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干即得最终产物。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中，用0.22μm滤器滤菌。与含Luciferase报告基因的pGL3质粒DNA溶液混合配制成复合物，载体/DNA的复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24小时后，换液，继续培养24小时。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.13×107RLU/mg protein。
实施例3：
取50ml圆底烧瓶，将胍基丁胺硫酸盐(0.57g，2.5mmol)、组胺二盐酸盐(1.38g，7.5mmol)与水(10ml)加入烧瓶中(即胍基丁胺硫酸盐与组胺二盐酸盐的摩尔比为1/3)，搅拌均匀直至成透明液体。滴加约3ml的氢氧化钠溶液(4M)调节反应体系的pH值到10左右。在强烈的搅拌下，1ml甲基丙烯酸缩水甘油酯(ρ＝1.074g/ml，7.6mmol)缓慢滴入反应体系中，35℃进行反应24小时。用乙醚对反应液进行萃取，将下层液体收集到50ml圆底烧瓶中，用2ml盐酸溶液(4M)调节体系pH值到5左右，加入过硫酸铵(12mg，0.05mmol)在65℃无氧氮气保护条件下无规聚合24小时。反应产物用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干即得最终产物。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中，用0.22μm滤器滤菌。与含Luciferase报告基因的pGL3质粒DNA溶液混合配制成复合物，载体/DNA的复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24小时后，换液，继续培养24小时。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.02×107RLU/mg protein。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯在碱性的条件下进行非均相反应，使得甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基打开进而与胍基丁胺和组胺的末端氨基反应，反应完全后，用乙醚萃取除去未反应的甲基丙烯酸缩水甘油酯；最后在酸性、无氧惰性气体保护的条件下，以过硫酸铵为引发剂，引发经胍基丁胺和组胺改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体进行自由基无规聚合，最终经透析冻干即得组胺修饰的线性胍基丁胺转基因载体；所述组胺修饰的线性胍基丁胺转基因载体，以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯为主链，取代基为胍基丁胺与组胺，其分子式结构如下：
其中两种重度单元的聚合度m：n为(1—3)：(3—1)。
2.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，所述无氧惰性气体为氩气或者氦气。
3.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯混合非均相反应时，一般在pH＝9—10、温度为35℃的条件下反应至少24小时；胍基丁胺与组胺的总用量应大于甲基丙烯酸缩水甘油酯，以保证甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基尽量全部参与反应。
4.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，将胍基丁胺、组胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯混合非均相反应时，一般在pH＝9—10、温度为35℃的条件下反应24—48小时；胍基丁胺与组胺的总用量应大于甲基丙烯酸缩水甘油酯，以保证甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基尽量全部参与反应。
5.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，无规聚合反应应在pH＝4—5、温度为65℃的无氧氮气保护条件下反应至少24小时。
6.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，无规聚合反应应在pH＝4—5、温度为65℃的无氧氮气保护条件下反应优选24—48小时。
7.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法，其特征在于，聚合反应结束后，将产物通过透析方法进行提纯，使用透析袋的截留分子量3500，在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干即得组胺修饰的胍基丁胺基线性聚合物转基因载体。
8.根据权利要求1所述的一种制备线性聚合物转基因载体的方法制备的线性聚合物转基因载体在基因转染领域的应用，用于非病毒转基因载体，实现对DNA的安全高效运输。
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