CN101011579A

CN101011579A - 细胞浆靶向壳寡糖－脂肪酸嫁接物载药胶团的应用

Info

Publication number: CN101011579A
Application number: CNA2006101556072A
Authority: CN
Inventors: 胡富强; 杜永忠; 袁弘; 游剑
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2026-12-29
Also published as: CN101011579B

Abstract

本发明提供一种细胞浆靶向壳寡糖－脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明提供的壳寡糖－脂肪酸嫁接物载药胶团是作为一种靶向给药载体材料，载有的药物为紫杉醇。本发明提供的壳聚糖－脂肪酸嫁接物载药胶团，应用于分子靶标位于细胞浆的药物的靶向治疗，最大可提高约20倍的抗肿瘤药物疗效。本发明提供的壳聚糖－脂肪酸嫁接物载药胶团，是低毒性的胶团，具有快速透过细胞膜、很少被细胞内溶酶体破坏、滞留细胞浆的功能，并通过自身疏水性内核的特性、负载分子靶标位于细胞浆的疏水性抗肿瘤药物，形成嫁接物载药胶团，为高效抗肿瘤治疗提供新型的纳米靶向给药系统。

Description

细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的应用

技术领域

本发明属细胞浆靶向抗肿瘤药物载体的制备与应用，涉及细胞浆靶向的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的制备方法及其抗肿瘤药效。

背景技术

肿瘤一直是直接威胁人类健康的重大疾病，肿瘤化疗由于药物本身缺乏分子靶向性，因而出现治愈率低、毒副作用巨大等重大治疗问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织(器官)、细胞及亚细胞器是解决癌症化疗治愈率低和毒副作用的重要手段之一。目前国内外的科学家通过纳米载体技术在抗肿瘤药物的组织(器官)和细胞靶向上取得了一定的进展，但并没有取得突破性的疗效，其本质在于绝大多数抗肿瘤药物的分子作用靶点位于细胞内，因此肿瘤细胞内药物分子作用靶点(亚细胞器)靶向性纳米载体材料技术的研究开发是突破癌症化疗瓶颈的关键。

聚合物胶团(polymeric micelles，PMs)是近几年正在发展的一类新型的纳米载体，具有增溶、靶向、低毒和长循环的优点。聚合物胶团由两亲性的聚合物在水性环境中自发形成，具有独特的核-壳结构。其内核可为难溶性药物提供储库，亲水性外壳则可进行理化性质修饰，负载多肽蛋白类药物及基因药物，并达到体内靶向分布、逃避单核巨噬细胞的吞噬、提高生物膜转运等作用。聚合物胶团自身可通过“增强的透过及滞留效应”(enhanced permeability andretention effect)聚集到肿瘤组织。

紫杉醇是从紫杉树皮中提取出来的新型天然抗肿瘤药物，其化学结构是紫杉烷类中一种四环二萜类化合物。它通过与细胞微管蛋白结合，促进微管聚合，抑制其解聚，使细胞有丝分裂受到阻断，从而抑制肿瘤生长。紫杉醇在甲醇、乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂中可溶，而在水中的溶解度小于0.03mg·mL^-1。因此，尽管紫杉醇具有良好的抗肿瘤活性，但由于在水中的溶解度很小，使其静脉注射给药带来很大困难。为解决这一难题，人们在注射剂中加入了表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor EL)。聚氧乙烯氢化蓖麻油虽能增加紫杉醇的水溶性。但会引起包括严重过敏反应在内的多种不良反应。将紫杉醇制成纳米粒给药系统，可以克服上述困难，提高生物利用度，增强靶向疗效。

壳聚糖是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。壳聚糖被广泛应用于药物辅料、止血材料、组织工程支架等。虽然以壳聚糖为基本材料所制备的微粒和纳米粒已广泛应用于药物载体材料的研究，但由于壳聚糖本身的亲水性结构，使它难以被细胞大量摄取，无法实现亚细胞器靶向。

将含羧基的疏水性物质脂肪酸(如硬脂酸)与壳寡糖分子结构中的部分氨基嫁接，可增强壳寡糖分子结构的疏水性，制备得到的壳寡糖-脂肪酸嫁接物能够在水性介质中通过自聚集形成嫁接物胶团。该嫁接物胶团的疏水性内核可增溶疏水性的药物分子。通过控制嫁接物合成过程中的投料比例，可形成高氨基取代度的嫁接物，增加嫁接物胶团的疏水性，从而使该嫁接物胶团具备被细胞快速摄取，并滞留于细胞浆的功能。该载体材料的应用，可大幅度提高分子靶标位于细胞浆的抗肿瘤药物的疗效。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明提供的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团是作为一种靶向给药载体材料，应用于细胞浆靶向的抗肿瘤药物的制备中，该胶团载有的药物为紫杉醇。所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团是由平均分子量1.5kD～51kD的壳寡糖与C₁₀～C₂₂的脂肪酸嫁接形成，壳寡糖脂肪酸的氨基取代度为1-50％，临界胶团浓度＜0.1mg/ml，当壳寡糖-脂肪酸嫁接物浓度超过临界胶团浓度时，该嫁接物在水性介质可自发形成胶团，粒径介于20-200nm，胶团表面带正电荷。

壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团，当壳寡糖-脂肪酸嫁接物浓度超过临界胶团浓度时，在水性介质中可自发形成嫁接物胶团，胶团具备被细胞快速摄取，并滞留于细胞浆的功能。本发明所说的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团的组成及制备方法已在专利申请号为200610051601.0“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”和专利申请号200610050516.2“一种非病毒基因转染载体及制备方法和用途”中公开。

本发明提供的壳聚糖-脂肪酸嫁接物载药胶团，应用于分子靶标位于细胞浆的药物的靶向治疗，最大可提高约20倍的抗肿瘤药物疗效，该载紫杉醇嫁接物胶团具体通过以下方案获得：

20mg嫁接物溶于5ml溶有浓度为0.5mg/ml紫杉醇的水和二甲基亚砜的混合溶液(1∶9，v∶v)，室温条件下搅拌3小时后，置于分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析过夜，透析原液5000rpm离心5分钟，去除析出的疏水性抗肿瘤药物。上清液过0.22μm的微孔滤膜，冷冻干燥后即得疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载紫杉醇胶团。

本发明的有益之处是：合成低毒性的壳聚糖-脂肪酸嫁接物胶团，该胶团具有快速透过细胞膜、很少被细胞内溶酶体破坏、滞留细胞浆的功能，并通过自身疏水性内核的特性、负载分子靶标位于细胞浆的疏水性抗肿瘤药物，形成嫁接物载药胶团，为高效抗肿瘤治疗提供新型的纳米靶向给药系统。

附图说明

图1为壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的A549细胞摄取荧光显微镜照片。

图2为壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团在pH6.2和7.4条件下的药物释放曲线。

图3为紫杉醇溶液和壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团与A549细胞共孵育后，细胞内的药物浓度经时变化。

图4为壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的Hela细胞摄取荧光显微镜照片。

图5为紫杉醇溶液和壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团与Hela细胞共孵育后，细胞内的药物浓度经时变化。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1 疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效

以肿瘤细胞抑制率评价疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。具体方法为：在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×10³个肿瘤细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO₂孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中加入疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加20μL噻唑兰(MTT)(5mg/mL)溶液，置于37℃、5％CO₂孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜l50μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％

由于该嫁接物载体毒性低、具有被细胞快速摄取，并滞留于细胞浆的功能，因此可作为分子靶标位于细胞浆的抗肿瘤药物靶向治疗载体。

实施例2 疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在肺癌A549细胞上的抗肿瘤治疗应用

1)壳寡糖-硬脂酸嫁接物的制备：

取平均分子量分别为34kD的壳寡糖0.4g，精密称量，加30mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1∶100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖∶硬脂酸(摩尔比)1∶50，称取硬脂酸溶于20mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400rpm磁力搅拌条件下，80℃恒温反应5小时，冷却至室温(25℃)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳寡糖-硬脂酸嫁接物。

采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量的壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2mL，37℃孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳寡糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为34.7％。

采用芘荧光法测定壳寡糖-硬脂酸的临界胶团浓度。制备不同浓度壳寡糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7×10^-7mol/L)，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定I₃₇₅/I₃₉₆倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶团浓度为0.002mg/mL。

1mg/mL的嫁接物胶团溶液在不同pH条件下的粒径和表面电位见表1。

表1嫁接物胶团在不同pH条件下的粒径和表面电位：

pH	粒径(nm)	表面电位(mV)
pH	粒径(nm)	表面电位(mV)	5.0	/	/
6.2	129.9±26	25.7±0.8	5.0	/	/
6.2	129.9±26	25.7±0.8	7.4	44.3±14	28.5±0.5

2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的亚细胞器转运：

壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的亚细胞器转运研究采用异硫氰基荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物进行。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物20mg溶解于2.4mL的50％甲醇溶液中。另取5.0mg异硫氰基荧光素，精密称定后溶解于5.0mL乙醇。取0.5mL FITC的乙醇溶液与0.5ml蒸馏水混合，在冰浴、避光与磁力搅拌条件下，将壳寡糖-硬脂酸嫁接物的甲醇溶液慢慢加到FITC-乙醇溶液中，继续反应24小时后，使用蒸馏水透析(MWCO 10,000)24小时，最终得FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物，避光保存备用。

取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO₂，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，使用PH7.4的缓冲溶液(PBS)润洗2遍后分别加入新鲜培养液1mL及FITC标记壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液(终浓度：160μg·ml^-1)，孵育一定时间后，用PBS冲洗细胞2遍，置荧光倒置显微镜观察并拍照。嫁接物与A549细胞孵育2小时后嫁接物细胞摄取的荧光显微镜照片参见图1，其中图a为FITC荧光照片，图b为核染照片。

3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的制备：

20mg嫁接物溶于5ml溶有浓度为0.5mg/ml紫杉醇的水和二甲基亚砜的混合溶液(1∶9，v∶v)，室温条件下搅拌3小时后，置于分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析过夜，透析原液5000rpm离心5分钟，去除析出的疏水性抗肿瘤药物。上清液过0.22μm的微孔滤膜，冷冻干燥后即得疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团。

经测定，壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的粒径为49.2nm，表面电位为27.6mV。药物包封率为89.5％，载药量为6.5％。

壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的药物体外释放采用透析法，在不同pH的水性介质(含1M水杨酸钠)中进行。将2mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的冷干粉末，分散于1ml溶出介质后，置于分子量为7000的透析袋中，将装有药物的透析袋置于20ml溶出介质中，在37℃，100rpm的搅拌速度下进行药物的体外释放试验，定时取样，每次取样后换新鲜的释放介质，所取样品经分子量为10000的超滤膜超滤后，高效液相色谱法(HPLC)测定上清液中的药物浓度。壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团在pH6.2和7.4条件下的药物释放曲线和药物分子经透析袋的扩散曲线参见图2。

4)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤疗效

本发明以肿瘤细胞抑制率评价疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。具体为：在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×10³个A549细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO₂孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和紫杉醇溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加20μL噻唑兰(MTT)(5mg/mL)溶液，置于37℃、5％CO₂孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

细胞抑制率％＝(空白对照组吸光度-实验组吸光度)/空白对照组吸光度×100％经计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为580μg/mL，紫杉醇溶液的IC50为3.14μg/mL，而壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.20μg/mL。结果表明壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低毒性材料，紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在肺癌A549细胞上可提高抗肿瘤疗效15.7倍。

5)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团与A549细胞共孵育后细胞内的药物浓度经时变化测定。

紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后药物疗效的提高可能与药物分子靶标的药物浓度提高有关，本发明以紫杉醇溶液为对照，测定了壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团与A549细胞共孵育后细胞内的药物浓度经时变化。具体方法为：取A549细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO₂，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，PBS润洗2遍后分别加入新鲜培养液1mL及紫杉醇溶液或载药壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液，孵育一定时间后，用冷PBS冲洗细胞2遍，中止细胞摄取和吸附在细胞表面的药物或载药胶团，胰酶消化后，收集细胞，加入甲醇稀释，探头超声破坏细胞膜后，离心分离，取上清液HPLC测定药物浓度。紫杉醇溶液和紫杉醇壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团与A549细胞共孵育后，细胞内的药物浓度经时变化参见图3。

根据图3可知，Hela细胞内的药物浓度，在细胞与相同浓度的药物共孵育的情况下随着孵育时间的延长而增加，并随着药物浓度的增加而增加。紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包封后，由于嫁接物胶团被细胞的快速摄取，细胞内的药物浓度大大提高。细胞分别与含2μg/ml药物的嫁接物载药胶团溶液或与10倍药物量的紫杉醇溶液(20μg/ml)共孵育6小时后，前者细胞内的药物浓度与后者相比还增加56％左右。

实施例3 壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团在宫颈癌细胞Hela细胞上的抗肿瘤治疗应用

1)壳寡糖-硬脂酸嫁接物的制备：

2)壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的亚细胞器转运：

壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团的亚细胞器转运研究采用异硫氰基荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物进行。取壳寡糖-硬脂酸嫁接物20mg溶解于2.4mL的50％甲醇溶液中。另取5.0mg异硫氰基荧光素，精密称定后溶解于5.0mL乙醇。取0.5mL FITC的乙醇溶液与0.5ml蒸馏水混合，在冰浴、避光与磁力搅拌条件下，将壳寡糖-硬脂酸嫁接物的甲醇溶液慢慢加到FITC-乙醇溶液中，继续反应24小时后，使用蒸馏水透析(MWCO10,000)24小时，最终得FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物，避光保存备用。

取Hela细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO₂，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，PBS润洗2遍后分别加入新鲜培养液1mL及FITC标记壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团溶液(终浓度：160μg·ml^-1)，孵育一定时间后，用PBS冲洗细胞2遍，置荧光倒置显微镜观察并拍照。嫁接物与Hela细胞孵育2小时后嫁接物细胞摄取的荧光显微镜照片参见图4，其中图a为FITC荧光照片，图b为核染照片。

3)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的制备：

壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的药物体外释放采用透析法，在不同pH的水性介质(含1M水杨酸钠)中进行。将2mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的冷干粉末，分散于1ml溶出介质后，置于分子量为7000的透析袋中，将装有药物的透析袋置于20ml溶出介质中，在37℃，100rpm的搅拌速度下进行药物的体外释放试验，定时取样，每次取样后换新鲜的释放介质，所取样品经分子量为10000的超滤膜超滤后，高效液相色谱法(HPLC)测定上清液中的药物浓度。壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团在pH6.2和7.4条件下的药物释放曲线和药物分子经透析袋的扩散曲线见图2。

4)壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效

本发明以肿瘤细胞抑制率评价疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。具体为：在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×10³个Hela细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO₂孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物、壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和紫杉醇溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加20μL噻唑兰(MTT)(5mg/mL)溶液，置于37℃、5％CO₂孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

经计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的IC50(细胞半数致死率)为610μg/mL，紫杉醇溶液的IC50为5.50μg/mL，壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.28μg/mL。结果表明壳寡糖-硬脂酸嫁接物为低毒性材料，紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在宫颈癌细胞Hela细胞上可提高抗肿瘤疗效19.6倍。

5)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团与Hela细胞共孵育后细胞内的药物浓度经时变化测定。

紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后药物疗效的提高可能与药物分子靶标的药物浓度提高有关，本发明以紫杉醇溶液为对照，测定了壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团与Hela细胞共孵育后细胞内的药物浓度经时变化。具体方法为：取Hela细胞，在含有约10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养(5％CO₂，37℃孵箱)。当细胞达对数生长期时，即可进行接种。取对数生长期细胞，PBS润洗后，加入胰酶消化并用培养液稀释，按每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔培养板内，孵箱内培养24小时。24孔培养板内细胞贴壁生长后，弃去旧培养液，PBS润洗2遍后分别加入新鲜培养液1mL及紫杉醇溶液或载药壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团溶液，孵育一定时间后，用冷PBS冲洗细胞2遍，中止细胞摄取和吸附在细胞表面的药物或载药胶团，胰酶消化后，收集细胞，加入甲醇稀释，探头超声破坏细胞膜后，离心分离，取上清液HPLC测定药物浓度。紫杉醇溶液和紫杉醇壳寡糖硬脂酸嫁接物胶团与Hela细胞共孵育后，细胞内的药物浓度经时变化参见图5。

由图5可知，Hela细胞内的药物浓度，在细胞与相同浓度的药物共孵育的情况下随着孵育时间的延长而增加，并随着药物浓度的增加而增加。紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包封后，由于嫁接物胶团被细胞的快速摄取，细胞内的药物浓度大大提高。细胞分别与含2μg/ml药物的嫁接物载药胶团溶液或与10倍药物量的紫杉醇溶液(20μg/ml)共孵育6小时后，前者细胞内的药物浓度还比后者高一倍左右。

实施例4壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团在人乳腺癌细胞MCF-7细胞上的抗肿瘤治疗应用

1)壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团的制备：

2)壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效

本发明以肿瘤细胞抑制率评价疏水性抗肿瘤药物的壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团的抗肿瘤药效。具体为：在96孔细胞培养板中，每孔加入含5×10³个MCF-7细胞的100μL培养液，置37℃、5％CO₂孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的壳寡糖-硬脂酸嫁接物载药胶团溶液和紫杉醇溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔。正常DMEM培养液继续培养48小时，每孔加20μL噻唑兰(MTT)(5mg/mL)溶液，置于37℃、5％CO₂孵箱继续培养4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，用多功能酶标仪测定吸光度，并计算细胞抑制率。细胞抑制率采用下式计算：

经计算，紫杉醇溶液的IC50为0.361μg/mL，壳寡糖硬脂酸嫁接物载药胶团溶液的IC50为0.072μg/mL。结果表明紫杉醇经壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团包载后，在人乳腺癌细胞MCF-7细胞上可提高抗肿瘤疗效5倍左右。

Claims

1.一种细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的壳寡糖-脂肪酸嫁接物胶团是由平均分子量1.5kD～51kD的壳寡糖与C₁₀～C₂₂的脂肪酸嫁接形成，壳寡糖脂肪酸的氨基取代度为1-50％，临界胶团浓度＜0.1mg/ml，当壳寡糖-脂肪酸嫁接物浓度超过临界胶团浓度时，该嫁接物在水性介质可自发形成胶团，粒径介于20-200nm，胶团表面带正电荷，其特征是：该胶团载有的药物为紫杉醇，壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团是作为一种靶向给药载体材料。

2.根据权利要求1所述的一种细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：该载有紫杉醇药物的嫁接物胶团通过以下方案实现：

20mg嫁接物溶于5ml溶有浓度为0.5mg/ml紫杉醇的水和二甲基亚砜的混合溶液，体积比为1∶9，室温条件下搅拌3小时后，置于分子量为3500的透析袋中，蒸馏水透析过夜，透析原液5000rpm离心5分钟，去除析出的疏水性抗肿瘤药物，上清液过0.22μm的微孔滤膜，冷冻干燥后即得壳寡糖-脂肪酸嫁接物载紫杉醇胶团。

3.根据权利要求1所述的一种细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：在制备抗肺癌A549细胞的抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的一种细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：在制备抗宫颈癌Hela细胞的抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的一种细胞浆靶向壳寡糖-脂肪酸嫁接物载药胶团在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：在制备抗人乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤药物中的应用。