CN101001863B - 坦普盖特衍生物、代谢物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备坦普盖特衍生物的合成代谢物的方法。还提供了这些化合物和用这些衍生物检测样品中坦普盖特代谢物的方法。

Description

坦普盖特衍生物、代谢物及其用途
发明背景
本发明提供了坦普盖特(tanaproget)的新型衍生物。
坦普盖特为被开发用于避孕的可替代目前可得的口服避孕药的强效的、非甾体类孕酮受体激动剂。从避孕疗法中除去甾体类黄体酮可降低口服避孕药常见的副反应。
发明简述
本发明提供了活性化合物坦普盖特的代谢物。这些化合物在监测用坦普盖特治疗的方法和试剂盒中是有效的。
在这些代谢物中，已分离出少见的S-连接的葡糖苷酸缀合物，S-葡糖苷酸坦普盖特，现在已能合成。坦普盖特葡糖苷酸曾首先被鉴定为代谢物，但当其给予患者时，其为前药，可在体内被葡糖醛酸酶酶解为坦普盖特。因此，本发明提供了作为坦普盖特前药给药的葡糖苷酸衍生物制剂。在一个实施方案中，通过口服途径给药以使肠中的葡糖醛酸酶活性的优势最大化。
从下面的本发明的详述中，会明白本发明的其他方面和优势。
发明详述
本发明的衍生物为独特的合成代谢物，据信其与服用坦普盖特后受试者产生的代谢物是生物等价的。因此本发明的衍生物可用作试剂盒的标准品用以监测坦普盖特治疗，并用以产生坦普盖特代谢物的特异性抗体。这些抗体可用于监测和研究坦普盖特治疗的效果。
另外，本发明的坦普盖特葡糖苷酸衍生物可作为前药给予受试者，其在体内裂解为坦普盖特的活性形式。因此，本发明还提供了包含本发明坦普盖特葡糖苷酸衍生物的药用组合物和试剂盒以及使用其将坦普盖特给予受试者的方法。受试者可包括任何哺乳动物，优选雌性的，包括人类和非人类。
本文所用的被称为″NSP-989″或″坦普盖特″[Wyeth]的PR激动剂化合物以下述核心结构为特征：
Figure A20058002734000061
示例的核心结构，5-(4，4-二甲基-2-硫代-1，4-二氢-2H-3，1-苯并嗪-6-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲腈，其合成方法以及这些化合物的用途如美国专利No.6,436,929、美国专利申请No.11/113,794(2005年4月25日提交的)和美国临时专利申请Nos.60/675，550(2005年4月28日提交的)；60/675,551(2005年4月28日提交的)；60/675,599(2005年4月28日提交的)；60/675,737(2005年4月28日提交的)；和60/675,738(2005年4月28日提交的)中所描述。本领域中熟练技术人员很容易明白其它获得坦普盖特的合适的合成方法。本发明并不受坦普盖特制备方法的限制。
本发明提供了上述核心结构的葡糖苷酸衍生物。本发明的衍生物可包含一个或多个不对称中心，因此可存在旋光异构体和非对映异构体。虽然下文中没有指出其立体化学，但本发明包括这些旋光异构体和非对映异构体；以及外消旋和拆分的、对映异构纯R和S立体异构体；以及其它R和S立体异构体的混合物及其药学可接受盐。
在一个实施方案中，葡糖苷酸部分通过羟吲哚环上的N原子相连。该衍生物可以下述结构为特征：
Figure A20058002734000071
在另一实施方案中，葡糖苷酸部分通过羟吲哚环连接的S原子连接。在一个实施方案中，该衍生物以下述结构为特征：
Figure A20058002734000072
在另外的实施方案中，这些化合物具有下面的立体化学：
本发明的葡糖苷酸衍生物可采用常规技术合成得到。例如，将坦普盖特的无水中性溶剂(如DMF)的溶液在氮气下滴加到稀释于溶剂中的强碱(如氢化钠)溶液中，然后用干冰冷却。混合后，加入乙酰溴-α-D-葡糖醛酸酯的溶液。然后将反应溶液升至室温，搅拌。约8-24小时后，将反应溶液在水和有机溶剂如乙酸乙酯之间分配。萃取水层。合并的有机层用饱和氯化钠(NaCl)溶液(100mL)洗涤，干燥，真空除去溶剂。
或者，可采用合适的方法在酶系统中制备本发明的葡糖苷酸衍生物。
可用常规技术回收纯化的粗品坦普盖特衍生物。在一个实施方案中，可通过美国临时专利申请No.60/675,738(2005年4月28日提交的)中描述的方法来纯化坦普盖特衍生物，在此通过引用结合到本文中。在另一实施方案中，可将粗萃取液通过HPLC反相柱，用溶剂梯度洗脱以从粗产物中除去未反应的坦普盖特和起始原料和试剂。本领域中熟练技术人员很容易选择用于柱梯度洗脱的合适的溶剂。在本文的实施例中，乙腈/甲醇和乙腈/乙酸铵被用作溶剂。合并包含坦普盖特衍生物的流分，蒸发纯化溶剂，得到坦普盖特衍生物混合物。可用薄层色谱法或本领域中已知的其它方法进行纯化。
为了分离单体衍生物，可采用色谱技术对纯化的混合物进行进一步分离。例如，可用高效液相色谱法(HPLC)。根据本发明公开内容本领域中的熟练技术人员很容易明白分离所用的合适的柱子和条件。
在其它方面，本发明包括药用组合物和包含将药学有效量的上面描述的作为孕酮受体激动剂的一种或多种坦普盖特葡糖苷酸衍生物给予受试者(如避孕的育龄雌性动物或其它治疗目的哺乳动物)的治疗方法。
本发明的坦普盖特葡糖苷酸化合物，无论是单独使用还是联合使用，可用于避孕方法、绝经前的、围绝经期和/或绝经后的激素替代疗法方法，以及治疗和/或预防皮肤病、(子宫)功能异常性出血、动情期同步、子宫肌瘤、子宫内膜异位、多囊性卵巢综合征、以及子宫内膜、卵巢、乳腺、结肠和前列腺的癌和腺癌。本发明另外的用途和括刺激食物摄取。
术语″皮肤″是指哺乳动物形式的外部覆盖层，包括但不限于表皮、真皮和皮下组织。通常，皮肤可包含其它部分如毛囊和汗腺。皮肤病包括，如痤疮和多毛症。
术语″痤疮″包括其中皮肤毛孔阻塞和/或从而发炎的任何皮肤病。术语痤疮包括但不限于表面痤疮，包括黑头粉刺、发炎性丘疹、表面囊肿和脓疱；以及深度痤疮，包括深度感染块(deep inflamedmodules)和脓填充囊肿。特别的痤疮病包括但不限于普通粉刺、粉刺性痤疮、丘疹性痤疮、月经前痤疮、青春期前痤疮、中毒性痤疮、美容剂痤疮、香膏剂痤疮、去垢剂性痤疮、人工痤疮、革兰氏阴性痤疮、红斑痤疮、须部假毛囊炎、毛囊炎、口周皮炎和化脓性汗腺炎(hiddradenitis suppurativa)。术语″多毛症″是指其中在身体不该过度生长毛发的区域毛发生长过度的皮肤病。
许多皮肤病可用本发明的化合物治疗，包括毛囊和皮脂腺的皮肤病。在一个实施方案中，皮肤病其中如痤疮和多毛症可按照本发明治疗。
其它皮肤病包括皮肤干燥/皲裂、皮脂异常(seboria)、牛皮癣或脱毛症可用本发明的化合物和组合物治疗。本发明还可有效用于治疗皮肤从而对抗环境条件影响。
本发明还包括采用本文的化合物和任选药学可接受载体或赋形剂的药用组合物。当所述化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学可接受载体或赋形剂如溶剂稀释剂等混合，并可以片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、包含如约0.05-5％悬浮剂的混悬剂、包含如约10-50％糖的糖浆剂以及包含约20-50％乙醇的酏剂等口服给药，或以无菌注射溶液或在等渗介质中包含约0.05-5％悬浮剂的混悬液胃肠外给药。这些药用制剂可包含，例如，约25-约90％的坦普盖特衍生物与载体，更通常为约5％-60％重量。
根据所用的特定坦普盖特葡糖苷酸衍生物、给药方式和所治疗病症的严重性，所用坦普盖特衍生物的有效剂量可有所不同。但是，一般而言，当本发明化合物以日剂量为约0.5-约500mg/kg动物体重，任选以分份剂量每天1-4次给药，或以持续释放形式给药时，可得到满意的效果。对于大多数大型哺乳动物，总日剂量为约1-100mg，或约2-80mg。适于内用的剂型包含在与固体或液体药学可接受载体的充分混合的混合物中的约0.5-500mg的坦普盖特衍生物。可调节该剂量方案以获得最佳治疗效果。例如，可每日给予几份分份剂量或可根据治疗情况的紧急事件按比例减少剂量。
除口服给药外，这些坦普盖特葡糖苷酸衍生物还可经静脉、肌肉或皮下途径给药。固体载体包括淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和高岭土，液体载体包括无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油如玉米、花生和芝麻油，要适合坦普盖特衍生物的性质和给药所需的特定形式。在药用组合物的制备中常用的辅剂包括如调味剂、着色剂、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、抗坏血酸、BHT和BHA。
从方便制备和给药的观点来看，优选的药用组合物为固体组合物，特别是片剂和硬-填充或液体-填充胶囊。坦普盖特葡糖苷酸衍生物的口服给药为目前优选的。
这些坦普盖特衍生物还可胃肠外给药或腹膜内给药。这些坦普盖特衍生物的游离碱或药学可接受盐的溶液或混悬液可在水中适当与表面活性剂如羟丙纤维素混合而制备。分散体还可在甘油、液体、聚乙二醇及其混合物在油中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射使用的药用形式包括无菌水溶液或分散体和使用临时制备成无菌溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，剂型必须为无菌的且必须易于从注射器出口流出。在生产和储存条件下必须稳定，并必须能在对抗微生物如细菌和真菌的污染的情况下保存。所用载体可为包含如水、乙醇(如甘油、聚乙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。
本发明提供了设计用于本文描述的治疗方案的药用制剂的试剂盒或包装。在一个实施方案中，这些试剂盒被设计为21天、28天、30天或31天周期内每日口服，其中包括每日口服一次。当所述组合物被连续服用时，包装或试剂盒可包含以每片形式存在的组合物。当所述组合物被周期性不连续服用时，包装或试剂盒可包含安慰剂以在不需服用组合物的那些天服用。
在一个实施方案中，所述试剂盒被构建成适合在周期的每一天服用的单个口服制剂或联用口服制剂的形式，包括在特定的每一天服用的口服片剂，在另外的实施方案中，一个口服片剂将包含每个适合的联用日剂量。
在一个实施方案中，试剂盒可包含本发明化合物在21天、28天、30天或31天周期的单个阶段的日剂量。或者，试剂盒可包含本发明化合物在28天、30天或31天周期的前21天的单个阶段的日剂量。试剂盒还可包含本发明化合物在30天或31天周期的前28天的单个阶段的日剂量。
在另一实施方案中，试剂盒可包含本发明化合物和雌激素在21天、28天、30天或31天周期的单个联用阶段的日剂量。或者，试剂盒可包含本发明化合物和雌激素在28天、30天或31天周期的前21天的单个联用阶段的日剂量。试剂盒还可包含本发明化合物和雌激素在30天或31天周期的前28天的单个联用阶段的日剂量。
在另一实施方案中，28-天试剂盒可包含第一阶段的14-28个本发明化合物的日剂量单元；第二阶段的1-11个雌激素日剂量单元；以及任选地，第三阶段的周期剩余日子的口服和药学可接受安慰剂。
在又一实施方案中，28-天试剂盒可包含第一阶段的14-21个本发明化合物的日剂量单元；第二阶段的1-11个雌激素的日剂量单元；以及任选地，第三阶段的周期剩余日子的口服和药学可接受安慰剂。
在另一实施方案中，28-天试剂盒可包含第一阶段的18-21个本发明化合物的日剂量单元；第二阶段的1-7个雌激素的日剂量单元；以及任选地，在28天周期剩余的0-9天的每天的口服和药学可接受安慰剂。
在另一实施方案中，28-天试剂盒可包含第一阶段的本发明化合物的21个日剂量单元；第二阶段的3个第22-24天的雌激素日剂量单元；以及任选地，在第三阶段的第25-28天的每一天的4个口服和药学可接受安慰剂的日剂量单元。
在再一实施方案中，服用方案中的每个药学活性成分的日剂量在每个特定的给药阶段保持固定。另外优选所描述的日剂量单元以所描述的次序给药，先是第一阶段，然后依次是第二和第三阶段。为了使促进每个服用方案的依从性，试剂盒可包含所描述的安慰剂以在周期最后的日子里服用。
已知本领域许多包装或试剂盒都用于分配口服使用的药剂。在一个实施方案中，包装具有对28天周期的每一天的用药指示，其可为标记的泡罩包装、刻度剂量器包装或瓶子。
代谢物及其用途
本发明的坦普盖特葡糖苷酸衍生物可有效用于在受试者中监测用坦普盖特或坦普盖特前药(如S-葡糖苷酸坦普盖特化合物)的治疗。另外，本发明提供了有效用于监测用坦普盖特及其前药的治疗的其它坦普盖特代谢物。当用作试剂和/或标准品时，坦普盖特代谢物化合物可被标记，如用放射性的、荧光的或比色分析的标记物标记。
在一个实施方案中，本发明还提供了分离的坦普盖特代谢物，其可通过酶或合成制备。这些代谢物可选自坦普盖特葡糖苷酸衍生物。包含坦普盖特核心结构和任选取代的其它合适的代谢物包括如在硫代羰基上具有硫酸残基(sulfate moiety)的坦普盖特；在吡咯环上具有羟基的坦普盖特；在苯基吡咯环上具有羟基的坦普盖特；以及有氨基甲酸酯代替硫代羰基的坦普盖特。
这些坦普盖特代谢物中的一种或多种可用作标准品，即，在检测样品中坦普盖特代谢物存在的方法中作为对照。本文所用″样品″是指生物样品如从个体分离出的组织或体液(包括但不限于血浆、血清、脑脊液、尿、淋巴、眼泪、唾液和组织切片)，或从体外细胞培养组分以及从环境分离到的样品。
在另一实施方案中，坦普盖特代谢物的一种或多种可被用于产生用于检测样品中坦普盖特代谢物的存在的抗体。适当地，抗体为坦普盖特衍生物的特异性单克隆或多克隆抗体。在一个优选的实施方案中，该抗体选择性地与本发明的坦普盖特衍生物结合，并从坦普盖特及其其它代谢物中识别该代谢物。
本文所用术语″抗体″包括可与坦普盖特和/或其代谢物特异性反应的其片段，如Fv片段和F(ab)2片段。
可采用其中抗原为本发明的衍生物的标准技术来制备本发明坦普盖特衍生物的特异性抗体。参见，如Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY。
坦普盖特代谢物特异性位点的多克隆和单克隆抗体可用于开发免疫测定或治疗药物监测(TDM)试剂盒。这些测定可包括但不限于直接、抑制、竞争性或三明治免疫测定(ELISA或其它测定系统)、RIA、固相或液相测定或自动测定系统。
当使用竞争性测定时，抗体的竞争者可为与测定板结合的坦普盖特衍生物，或标记的衍生物如荧光标记的衍生物、放射标记的衍生物或氘标记的衍生物。
如果需要，可用试剂盒以使本发明的方法更容易。本发明的试剂盒可包含适当标记的示踪物、一种抗体、标准品、使用说明书和包装。示踪物的标记可为任何合适的标记，如放射性的、荧光的或比色分析的标记。为了方便，试剂盒中的组分可为冻干形式。
本发明的测定方法具有这样的优点：其可使用标准生物分析设备迅速和简单地进行，得到准确且可重现的结果。此外，可采用全血从而无需提取。
本发明还提供了适于检测样品(如血或尿)中坦普盖特代谢物的量的测定试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包括从样品中的坦普盖特代谢物置换药物的结合竞争者；和与药物结合但不明显与结合竞争者结合的抗体。
下面的实施例是为了示例本发明而不是对其范围的限制。本领域中熟练技术人员会了解虽然在下面的实施例中提到了特定的试剂盒条件，但可对这些进行修改，且这些修改也包含在本发明的精神和范围内。
下面的实施例为生产本发明化合物的方法的示例。
实施例1-从大鼠肝微粒体制备坦普盖特S-葡糖苷酸
坦普盖特的葡糖苷酸在雄性大鼠肝微粒体内制备，其结构经液相色谱(LC)/质谱(MS)和核磁共振(NMR)光谱鉴定为S-葡糖苷酸缀合物。该代谢物还被鉴定为雄性和雌性大鼠、犬和人肝微粒体中主要的代谢物，其还是在大鼠、犬和人血-浆中发现的主要药物相关成分。同时该S-葡糖苷酸还可用N-葡糖苷酸合成制备。这两个合成的葡糖苷酸可用HPLC分离，它们的结构都由LC/MS和NMR光谱鉴定。
在下面的方案中，用名称NSP-989代替坦普盖特。
Figure A20058002734000141
A.坦普盖特的孵育和坦普盖特葡糖苷酸的萃取
采用稍做修改的由Lake[Lake，B.In Biochemical Toxicology：APractical Approach，Snell，K，Mullock，B(eds)，IRL Press：England，1987，183-215]描述的差速超离心法实验室内部(in-house)制备Sprague-Dawley大鼠肝微粒体。微粒体蛋白和细胞色素P450的含量分别由Bradford [Bradford，MM Anal.Biochem.1976；72：248-254]和Omura和Sato[Omura，T，Sato，R J Biol.Chem.1964；238：2370-2378]的方法测定。蛋白浓度和P450含量分别为50.9mg/mL和0.42nmol/mg蛋白。乙酸铵、氯化镁和二磷酸尿苷葡萄糖醛酸(UDPGA)购自Sigma化学品公司(St.Louis，MO)。用于提取和色谱分析的溶剂为HPLC等级或ACS试剂等级(Mallinckrodt Baker，Phillipsburg，NJ)。
用坦普盖特(40μM)、UDPGA(5mM)、氯化镁(10mM)和雄性大鼠肝微粒体(1.5mg/mL)在pH7.4的0.1M磷酸钾缓冲液中，在37℃下进行孵育(100mL)。将样品在37℃下预孵育1分钟，加入UDPGA开始反应。3小时后，用冰浴冷却样品以终止反应。用乙醚(200mL×2)萃取两次以从样品中除去未反应的坦普盖特。
通过固相萃取法采用C-18柱用甲醇(10mL)洗脱来萃取坦普盖特葡糖苷酸和剩下的未反应的坦普盖特。在室温在真空下旋转蒸发蒸干甲醇洗脱液。残留物用50％乙腈的水溶液(5mL)萃取，并以3500rpm离心15min。通过装有半制备柱的Waters 2690
Figure 200580027340210000210003_1
HPLC系统分析上层清液部分(800μL)。在Phenomenex LunaTM柱(C18，250×10mm ID，5μm粒径)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成坦普盖特代谢物的分离，代谢物通过在310nm监测UV吸光度而测定。将自动采样器的温度设为6℃，柱子为室温。乙酸铵(10mM，pH4.5)和乙腈分别用作流动相A和B。采用下面的梯度以2mL/min的流速以及5min柱后再平衡进行洗脱：0min 20％B、1min 20％B、10min 40％B、20min 70％B、25min 95％B、28min 95％B、30min 20％B。在这些条件下，在15.5min收集到坦普盖特葡糖苷酸峰(M1)，进行NMR光谱分析。将包含葡糖苷酸缀合物峰的流分收集到干净的试管中，收集后立即在干冰上冷冻。合并所有葡糖苷酸流分，旋转蒸发除去乙腈。通过固相萃取法采用C-18柱从水性洗脱液中萃取出葡糖苷酸。用水(2mL)洗涤残留的缓冲液，用50％甲醇的水溶液洗脱葡糖苷酸缀合物。在室温在真空下旋转蒸发蒸干甲醇/水洗脱液。将剩下的水溶液转移到5mL的锥形瓶中通过冻干除去水。继续干燥残留物过夜以除去另外的水分，然后进行NMR光谱分析。
B.HPLC/MS分析条件：
在此项工作中应用Micromass Quattro UltimaTM三级串联四级杆质谱仪(triple quadrupole mass spectrometer)(Waters Corp.，Milford，MA)。其装有电喷射离子化(ESI)接口，以正和负离子化模式操作。该质谱仪的设置为：ESI喷射电压2.5KV、锥电压(cone)50V、质量分辨0.7Da±0.2Da半高峰宽、脱溶剂气流量900-1000L/h、锥气流量50-80L/h、离子源模块温度(source block temperature)80℃、脱溶剂气体温度(desolvation gas temperature)250℃。用MicromassMassLynx软件(Waters Corp.，versions 3.5 and 4.0)分析LC/MS数据。
用于从大鼠肝微粒体分离坦普盖特葡糖苷酸的色谱分析的溶剂为HPLC等级或SCS试剂等级(Mallinkrodt Baker，Phillipsburg，NJ andEMD Chemicals，Gibbstown，NJ)。与质谱连接的HPLC系统为WatersAlliance model 2695TM HPLC系统。其装有内部自动采样器和设定监测210-350nm的996型二极管阵列UV检测器。分离在装有DeltabondTM C18保护柱(10×2mm)(ThermoElectron Corp.，Bellefonte，PA)的Phenomenex Luna C18(2)柱(150×2mm，5μm)(Phenomenex，Torrance，CA)上完成。流速为0.3mL/min。在LC/MS样品分析过程中，在评价代谢物之前，从质谱仪中转移出达10分钟的初始气流量。流动相A为10mM乙酸铵的水溶液，pH4.5，(由等摩尔量的乙酸铵和乙酸的0.5M母液稀释)，流动相B为乙腈。所用的线性流动相梯度为：0min 10％B、1min 10％B、10min 15％B、35min 17.5％B、36min 25％B、50min 30％B、55min 50％B、60min 90％B、62min90％B、65min 10％B、75min 10％B。
C.LC/MS结果
质子化和脱质子化产生的坦普盖特葡糖苷酸分子离子([M+H]+和[M-H]-，分别在m/z 474和472)，其表示分子量为473。大于坦普盖特176Da。在正离子化质谱从m/z 474和在负离子化质谱从m/z 472失去176Da产生的碎片离子在正离子化模式中在m/z 298，在负离子化模式中在m/z 296，其被指定为坦普盖特。在负离子化模式中在m/z 175观察到葡糖醛酸的离子碎片。m/z 339的离子碎片来自葡糖醛酸环的断裂。这些数据与坦普盖特葡糖醛酸缀合物相符。
D.NMR光谱
在所有NMR样品中采用氘化的二甲基亚砜(DMSO-d6)。对于分离自大鼠肝微粒体的代谢物样品，其溶解在氩气下在手套袋(glovebag)中进行，以减少对大气水的吸收。通常，将总量为200μL的DMSO-d6中的50μL用来冲洗装有真空干燥的样品的管形瓶，然后将其转移到3mm的NMR管中。在500(Varian InovaTM仪器)和600(Bruker AvanceTM仪器)MHz获取NMR光谱数据。总体NMR工作在装有VarianTM 3mm1H观测间接检测探针(observe indirect detectionprobe)的Varian Inova 500TM MHz仪器上进行。相对于内标TMS(δ0.0)记录1H和13C的化学位移δ(ppm)。在DMSO-d6中，1H化学位移参照残留质子化的DMSO的δ2.49，13C化学位移参照内标DMSO-d6的δ39.5。相对于液氨(δ0.0)并参照外标甲酰胺的δ112.0记录15N的化学位移。质子的多重性如下记录：s＝单峰，d＝双重峰，dd＝双双峰和m＝多重峰。J值为以Hz表示的1H-1H偶合常数。
1H-NMR实验的通用参数包括5000Hz谱宽，32K基准点，45°脉冲宽度，1秒驰豫延迟和根据样品浓度平均从32-＞1000扫描。用谱线增宽(～0.5Hz)或高斯过程途径(gaussian processing routines)来增加信噪比(S/N)。13C-NMR实验的通用参数包括25,000Hz谱宽，64K基准点，45°脉冲宽度，1秒驰豫延迟和平均至少10,000扫描以达到最佳S/N。此外，采用2Hz谱线增宽来增加S/N。所有的光谱数据在25℃下获得。
采用几种类型的2D NMR实验以确定1H-1H和1H-13C关联性。这些类型包括确定三-键1H-1H关联性的gCOSY实验，确定一-、二-、三-和四-键1H-13C关联性的gHSQC和gHMBC实验以及确定经空间(through-space)关联的NOESY或ROESY。
尽管采用新鲜分离的坦普盖特葡糖苷酸样品进行了几次尝试，但样品的纯度和浓度通常太低(＜70％的纯度和估计溶液中的总量为＜20μg)，其阻碍了完整2D NMR数据的采集。此外，在微粒体孵育和随后的分离步骤期间，溶液容易快速产生坦普盖特的氨基甲酸酯类似物(坦普盖特的硫被氧置换)。尽管如此，还是从分离自大鼠肝微粒体的坦普盖特葡糖苷酸获得了可差不多完成1H和13C分配的足够的化学位移、偶合和2D NMR相关的数据。但是，单从得自微粒体的样品无法确定葡糖苷酸的连接位置。在大鼠肝微粒体孵育样品的gHMBC NMR光谱中仅观察到一个关键的质子-碳异核相关，就是从H-1′(5.10ppm)-C-6(161.63ppm)。但是，该相同交叉峰被希望能推测该代谢物是N-还是S-葡糖苷酸(即在两种情况下为3-键偶合)。
实施例2一合成坦普盖特葡糖苷酸缀合物的制备
Figure A20058002734000181
A.HPLC/MS和NMR分析条件：采用Waters Alliance 2695TMHPLC与Waters ZQTM质谱仪联用获取合成化合物的HPLC/MS数据。样品通常采用前述[Mallis，LM，Sarkahian，AB，Kulishoff，JM，Jr，Watts，WL，Jr.J.Mass Spectrom.2002；37：889-896]的开放存取(open-access)LC/MS方法分析。
除2外，所有NMR样品使用溶于CDCl3(氘化的溶剂来自Aldrich，Milwaukee，WI)的氘化二甲亚砜(DMSO-d6)。在300(Bruker DPXTM仪器)、400(Varian InovaTM仪器)、500(Varian InovaTM仪器)和600(BrukerAvanceTM仪器)MHz获取NMR光谱数据。总体NMR实验工作在装有VarianTM 3mm1H观测间接检测探针的Varian Inova 500TM MHz仪器上进行。在DMSO-d6中的化学位移δ(ppm)如前描述的对坦普盖特葡糖苷酸的报告。在CDCl3中，1H化学位移参照残留质子化的CHCl3在δ7.27，13C化学位移参照内标CDCl3在δ77.7。15N的化学位移如前描述的对坦普盖特葡糖苷酸的报告。
1H-NMR和13C-NMR实验的通用参数如前对坦普盖特葡糖苷酸的描述。所有光谱数据在25℃下获得。用以确定1H-1H和1H-13C关联性(connectivities)的2D NMR实验为gCOSY、gHSQC、gHMBC、NOESY和ROESY。
B受保护的坦普盖特的S-葡糖醛酸(2)的制备
在氮气下将坦普盖特(0.292g，1.0mmol)的无水二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)溶液滴加到冷至约-70℃(干冰)的氢化钠(NaH)(0.052g，2.2mmol)的DMF(50mL)溶液中。搅拌10分钟后，滴加乙酰溴-α-D-葡糖醛酸甲酯(0.396g，1mmol)的DMF(10mL)溶液，然后将反应溶液升至室温，总共搅拌24小时。24小时后，将反应溶液在水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)之间分配。水层再用乙酸乙酯(100mL)萃取。用饱和氯化钠(NaCl)溶液(100mL)洗涤合并的有机层，干燥(硫酸镁，MgSO4)，真空除去溶剂。将粗产物的等分试样在低压反相C18(RediSep/ISCO，125×25mm ID，40μm粒径)色谱条件下用50-95％乙腈/水梯度洗脱。用75-80％乙腈/水洗脱的流分中包含坦普盖特的S-受保护的(D)-葡糖醛酸衍生物(2)。共得到由NMR光谱测定纯度为95％的约200mg的(2)(32％分离产率)。所有化学品购自Aldrich(Milwaukee，WI)，未经进一步纯化或干燥而使用。
C.坦普盖特的N-(3)和S-葡糖醛酸(4)衍生物的制备
在单独的反应中，在氮气下将坦普盖特(0.146g，0.5mmol)的无水DMF(5mL)溶液滴加到冷至约-70℃(干冰)的NaH(0.027g，1.1mmol)的DMF(25mL)溶液中。搅拌10分钟后，滴加乙酰溴-α-D-葡糖醛酸甲基酯(0.198g，0.5mmol)的DMF(5mL)溶液。将反应混合物升至室温，共搅拌8小时。将反应溶液在水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)之间分配。水层再用乙酸乙酯萃取(100mL)。用饱和NaCl溶液(100mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，真空除去溶剂，得到0.350g粗产物。向该产物的一部分(0.210g)中加入MeOH/Hunig′s碱((异-Pr)2NEt)/H2O(5mL/2mL/2mL)溶液，将所得溶液在室温下搅拌8.5小时。然后用HCl(浓，约1.5mL)调节反应溶液至pH2.5，用半制备反相色谱纯化，采用YMC-Pack CN 150×20mm，S-5μm柱，用15-35％乙腈的10mM(水)乙酸铵溶液梯度洗脱。从反复的注射中，得到约5mg N-(D)-葡糖醛酸衍生物(3)(3％从坦普盖特的分离产率)和15mg S-(D)-葡糖醛酸衍生物(4)(10％从坦普盖特的分离产率)，经NMR和LC/MS分析和比较纯度＞98％。
实施例3-合成化合物与M1的比较
从微粒体衍生的代谢物和合成化合物的光谱和色谱数据的广泛比较来看，所述代谢物确定为坦普盖特的S-(β)-D-葡糖苷酸。
合成化合物2即坦普盖特的受保护的S-葡糖苷酸的正离子化模式的LC/MS光谱(未显示)给出的质子化分子离子峰[M+H]+在614，表示分子量为613。失去297Da得到m/z 317，其被指定为[M+H-坦普盖特]+。在m/z 257的离子信号被指定为m/z 317-乙酸(C2H4O2)，在m/z 197观察到的离子被指定为m/z 257-乙酸(C2H4O2)。同样，在m/z 155的离子被指定为m/z 197-乙酰基(C2H3O)+H。S-葡糖苷酸4的质子化和脱质子化LC/MS光谱(未显示)分别给出[M+H]+离子在474，[M-H]-离子在m/z 472，(3的情况也是如此，光谱未显示)，表示其为葡糖苷酸化的坦普盖特。还在4的正和负电子化模式质谱中观察到离子m/z 298和m/z 296，其被指定为坦普盖特，即失去了葡糖醛酸。此外，负离子化光谱中也检测到被指定为葡糖醛酸的在m/z 175的碎片。
也做了HPLC比较，以确证主要合成的坦普盖特的葡糖苷酸，S-葡糖苷酸4，是否与目前从上面描述的NMR和质谱结果来看被认为是S-葡糖苷酸的坦普盖特葡糖苷酸为相同的。在两种不同的流动相条件下采用五种不同类型的反相HPLC柱。这十种HPLC条件覆盖了由样品中主要和次要成分的洗脱次序的改变而证明的广泛的选择性。为了比较和匹配两个样品中的主要峰的保留时间，进行了掺加(示踪剂)实验。在所有十种HPLC条件下，发现被确定为S-葡糖苷酸4的合成葡糖苷酸与坦普盖特葡糖苷酸代谢物具有相同的保留时间。
定位坦普盖特葡糖苷酸化位点的合成化合物3和4中的关键NMR相关如下所述。在N-葡糖苷酸上具有β-立体化学端基质子(H-1′)的质子化学位移为6.31ppm，为偶合常数为9.5Hz的双重峰。端基碳(C-1′)的碳化学位移为90.2ppm。坦普盖特N-葡糖苷酸化代谢物的苯并
Figure 200580027340210000210003_2
嗪-2-硫酮的碳(C-6)的碳化学位移为188.0ppm；其可与母体分子坦普盖特上观察到的苯并
Figure 200580027340210000210003_3
嗪-2-硫酮基团的硫代羰基碳的化学位移182.8ppm相比。
在该分子的HMBC光谱(未显示)中观察到四个重要的3-键相关。它们为端基质子(H-1’)与苯并
Figure 200580027340210000210003_4
嗪-2-硫酮的碳(C-6)以及与在131.5ppm的sp2芳香碳(C-4)，以及在7.50ppm和7.57ppm观察到的质子H-7和H-9分别与C-4。与母体分子的7.13ppm相比，在N-葡糖苷酸的peri-位的质子(H-10)的质子化学位移向低场移动至7.80ppm，表明葡糖醛酸基团(可能是羧酸部分)与该质子接近。对所有要研究的化合物进行了1H-15N gHMBC实验，但是除了坦普盖特(δ144.81)之外，未在其它任何化合物中观察到来自关键氮N-5的信号，其与H-10具有HMBC交叉峰。另外预期的氮，N-15，仅在坦普盖特(δ154.99)和3(δ155.40)中观察到，且每个化合物与H-17、H-18和H-19具有gHMBC相关。
在合成S-葡糖苷酸4上具有β-立体化学端基质子(H-1′)的质子化学位移为5.11ppm，为双重峰，偶合常数为10.2Hz。端基碳(C-1′)的碳化学位移为85.0ppm。坦普盖特的该S-葡糖苷酸化代谢物的衍生的苯并
Figure 200580027340210000210003_5
嗪-2-硫酮的碳(C-6)的碳化学位移为161.3ppm，在母体分子坦普盖特中观察到的苯并嗪-2-硫酮基团的硫代羰基碳化学位移(182.8ppm)的相当高场。在该分子的HMBC光谱中观察到β-葡糖醛酸端基质子(H-1′)与衍生的苯并
Figure 200580027340210000210003_7
嗪-2-硫酮的碳(C-6)之间的3-键相关。最后，在HMBC光谱中观察到在1.59ppm和1.70ppm的偕(gem-)二甲基质子(H-11和H-12)与连接该基团的碳(C-2)之间的2-键相关，在81.5ppm。这些数据证实坦普盖特的苯并
Figure 200580027340210000210003_8
嗪-2-硫酮(N(C＝S)O)基团在S-葡糖苷酸化之前未重排为硫醇氨基甲酸酯(N(C＝O)S)基团。
得自坦普盖特葡糖苷酸和两个合成化合物3和4的1H NMR光谱和NMR数据的比较显示坦普盖特葡糖苷酸一定是坦普盖特的S-葡糖苷酸衍生物。与3的在6.31ppm的H-1′相比，坦普盖特葡糖苷酸的H1′化学位移为5.10ppm，4为5.11ppm。同样，坦普盖特葡糖苷酸与4的坦普盖特苯并
Figure 200580027340210000210003_9
嗪-2-硫酮部分的C-6同为～161ppm，但3的为188.0ppm，坦普盖特的为182.8ppm。
实施例4-坦普盖特葡糖苷酸缀合物代谢物的酶解
为了确证当给予患者时，坦普盖特葡糖苷酸衍生物为前药，在下面的测定中采用了葡糖苷酸缀合物被在人类胃肠道中天然存在的葡糖醛酸酶酶解的能力。
用Glusulase
Figure 200580027340210000210003_10
水解来自健康女性的混合尿样(4-8小时)。将混合尿样的等分试样(1mL)用0.5mL 0.6M乙酸钠缓冲液调至pH5。将该稀释的尿与Glusulase
Figure 200580027340210000210003_11
(9,000单位/mL，100μL)混合，并在37℃下轻微振摇孵育1小时。加入2mL丙酮终止反应，离心除去沉淀物。在氮气下在TurboVapTM(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中干燥上清液。残留物用1mL 60％甲醇的水溶液重新溶解，然后用HPLC和LC/MS分析，确证葡糖苷酸转化为母药坦普盖特。在相同条件下进行对照孵育，但不加入Glusulase
Figure 10003_12
，或与Glusulase和10mM葡糖二酸单内酯(β-葡糖醛酸酶抑制剂)，观察到葡糖苷酸缀合物未转化为坦普盖特。
实施例5-药理学
坦普盖特葡糖苷酸为坦普盖特的前药，是主要用于避孕的最好的(first-in-class)非甾体类孕酮受体激动剂。坦普盖特葡糖苷酸对T47D细胞中的碱性磷酸酶活性的影响测定如下。
A.试剂：
培养基：加有5％(v/v)炭吸附过的(charcoal stripped)胎牛血清(未加热灭活)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM GlutaMax(GIBCO，BRL)的DMEM：F12(1∶1)(GIBCO，BRL)。
碱性磷酸酶测定缓冲液：I.0.1M Tris-HCl，pH9.8，含有0.2％Triton X-100，II.0.1M Tris-HCl，pH9.8，含有4mM对硝基苯基磷酸酯(Sigma)。
B.细胞培养和处理
将冷冻T47D细胞在37℃的水浴中解冻，在培养基中稀释至280,000细胞/mL。在96孔板(Falcon，Becton Dickinson Labware)的每个孔中加入180μl稀释的细胞悬浮液。然后向每个孔中加入20μL在培养基中稀释的参照或试验化合物。将细胞在5％CO2增湿大气中在37℃下孵育24小时。对于高通量筛选，每个化合物的一个将被测试的浓度为0.3μg/mL。根据文献中化合物的平均分子量为300g/mol，该浓度为约1μM。然后，活性化合物将进行剂量反应测定以确定EC50。
C.碱性磷酸酶测定
在处理的最后，将培养基移出该板。向每个孔中加入50μL测定缓冲液I。将板在滴定板振摇器上振摇15min。然后向每个孔中加入150μL测定缓冲液II。在试验波长为405nM处以5分钟的间隔测量吸光度30分钟。
D.剂量反应数据分析
对于参照和试验化合物，根据剂量对酶反应速率(斜率)绘制剂量反应曲线。用平方根转换数据对激动剂和拮抗剂模式进行变量分析和非线性剂量曲线拟合。Huber权重法(weighting)用来减少异常值影响的权重。从再转化的值计算EC50值。用JMP软件(SAS Institute，Inc.)在单剂量和剂量反应研究中进行单向方差分析和非-4线性(non-4linear)剂量反应分析。
E.结果
与黄体酮相比，0.1nM的坦普盖特S-葡糖苷酸具有60％有效性。
通过酶解实验，坦普盖特可再生，如在上面的实施例4中所描述。
实施例6-另外的坦普盖特代谢物
采用实施例1中描述的获取坦普盖特葡糖苷酸代谢物的方法，用已知的技术在雄性大鼠肝微粒体标本以及雄性和雌性猴肝微粒体标本中可观察到另外的坦普盖特代谢物。
在雄性大鼠肝微粒体标本观察到代谢物M2。该代谢物在m/z 312产生[M-H]-。表明具有未改变的硫代酰胺基团的在m/z 58的来自NCS-的产物离子，在NSP-989中也能观察到。在m/z 159和195的产物离子表明吡咯环为代谢位点。因此，代谢物M2被认为是在吡咯部分具有羟基的羟基-NSP-989。
在雄性和雌性猴肝微粒体标本中观察到代谢物M3。该代谢物在m/z 312产生[M-H]-。表明具有未改变的硫代酰胺基团的在m/z 58的来自NCS-的产物离子，在NSP-989中也能观察到。在m/z 237的产物离子，在NSP-989中观察到在m/z 220，表明苯基或吡咯环的氧化。在rn/z 195和252的产物离子与苯基或吡咯环的氧化相符。因此，代谢物M3被认为是在苯基或吡咯部分具羟基的羟基-NSP-989。
在所有体外代谢样品中都观察到代谢物M4。该代谢物在m/z 280产生[M-H]-，其比NSP-989少16个原子质量单位(amu)。缺少在m/z58的产物离子以及16 amu的分子量变化表明硫代酰胺基团存在修饰。在r/z 129、220和234观察到的产物离子，在NSP-989中也存在。代谢物M4还具有与合成NSP-989-氨基甲酸酯相同的HPLC保留时间和产物离子光谱(数据未显示)。因此，代谢物M4被确证为NSP-989-氨基甲酸酯。
在犬和大鼠肝微粒体标本中观察到代谢物M6。该代谢物在m/z344产生[M-H]-。在m/z 80和81的产物离子表明存在硫酸残基(sulfategroup)。在m/z 220和234的产物离子表明NSP-989分子中的非硫代羰基部分未变化。因此，代谢物M6被确证为NSP-989-sulfate(6-(5-氰基-1-甲基-1H-吡咯-2-基)-4，4-二甲基-4H-苯并[d][1，3]
Figure 10003_14
嗪-2-磺酸)。
可采用上面描述的关于葡糖苷酸衍生物的方法对这些代谢物进行提纯。可采用常规合成技术制备这些代谢物。
本说明书中列出的所有专利、专利公开和其它公开通过引用结合到本文中。应了解对于本发明已描述的特定的实施方案，在不偏离本发明的精神的情况下可作改动。这些改动也落在所附权利要求的范围内。

Claims (14)

1.一种合成坦普盖特的S-葡糖苷酸，以下述结构为特征：
2.一种监测用坦普盖特治疗的试剂盒，所述试剂盒包含含有权利要求1中的坦普盖特的S-葡糖苷酸的标准品。
3.权利要求1中的坦普盖特的S-葡糖苷酸在制备用于检测坦普盖特的代谢物的药物中的用途。
4.一种使用权利要求1的坦普盖特的S-葡糖苷酸产生的抗体，所述抗体对坦普盖特为特异性的。
5.一种监测用坦普盖特治疗的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求4的抗体。
6.权利要求4的抗体在制备用于检测坦普盖特的代谢物的药物中的用途。
7.一种在受试者中检测坦普盖特疗法的测定中有效的组合物，所述组合物包含根据权利要求1中的坦普盖特的S-葡糖苷酸。
8.一种检测坦普盖特的代谢物的试剂盒，所述试剂盒包含包装和含有权利要求7的组合物的标准品。
9.权利要求1中的坦普盖特的S-葡糖苷酸在制备用于检测坦普盖特的代谢物的药物中的用途。
10.一种使用根据权利要求1的坦普盖特的S-葡糖苷酸产生的抗体。
11.一种监测用坦普盖特治疗的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求10的抗体。
12.权利要求10的抗体在制备用于检测坦普盖特的代谢物的药物中的用途。
13.一种组合物，包含药学可接受载体和权利要求1定义的S-坦普盖特的葡糖苷酸。
14.权利要求1定义的S-坦普盖特的葡糖苷酸或其药学可接受盐在制备在哺乳动物避孕中有效的药物中的用途。
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