JP4980217B2

JP4980217B2 - タナプロゲト誘導体、代謝産物、及びそれらの使用

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Publication number: JP4980217B2
Application number: JP2007525765A
Authority: JP
Inventors: シェン，リー; ケーティング，ケリー; マックコンネル，オリヴァー; デマイオ，ウィリアム; シャンドラスカラン，アパヴ
Original assignee: ワイス・エルエルシー
Priority date: 2004-08-13
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2025-08-11
Also published as: CY1112681T1; ES2380219T3; PL1778710T3; SI1778710T1; PT1778710E; JP2008509917A; JP2012121907A; CN101001863A; DK1778710T3; CN101001863B; CA2575737A1; AU2005272854B2; EP1778710B1; BRPI0514273A; MX2007001812A; US20090306000A1; US7569679B2; AU2005272854A1; US8389698B2; EP1778710A1

Description

本発明は、新規のタナプロゲト（tanaproget）の誘導体を提供する。

タナプロゲトは、現在入手可能な経口避妊薬の代替薬として避妊において使用するために開発されている途中の強力な非ステロイド性プロゲステロンレセプターアゴニストである。避妊レジメンからのステロイドプロゲスチンの排除は、経口避妊薬の一般的な副作用を低下させ得る。

（発明の要旨）
本発明は、活性化合物タナプロゲトの代謝産物を提供する。これらの化合物は、タナプロゲトによる治療をモニタリングするための方法及びキットにおいて有用である。

これらの代謝産物のうち、稀少なＳ結合型グルクロニド抱合体、Ｓ−グルクロニドタナプロゲトが単離され、ここで合成された。最初は代謝産物として同定されたが、タナプロゲトグルクロニドは、被験体に送達された場合、インビボでグルクロニダーゼによってタナプロゲトへと酵素的に切断されるプロドラッグである。従って、本発明は、タナプロゲトプロドラッグとして投与するために処方されるタナプロゲトグルクロニド誘導体を提供する。一つの実施形態において、投与は、消化管内のグルクロニダーゼ活性を最大限に活用するため、経口経路による。

本発明のその他の態様及び利点は、以下の発明の詳細な説明から明白になるであろう。

（発明の詳細な説明）
本発明の誘導体は、タナプロゲトの投与後に被験体によって生成される代謝産物に対する生物学的等価物（bioequivalent）であると考えられる独特の合成代謝産物である。従って、本発明の誘導体は、タナプロゲト治療のモニタリングのためのキットにおけるスタンダードとして、そしてタナプロゲト代謝産物に対して特異的な抗体を作製するため、有用である。そのような抗体は、タナプロゲト治療の効果をモニタリングし、そして研究するために有用である。

さらに、本発明のタナプロゲトグルクロニド誘導体は、インビボで活性型のタナプロゲトへと切断されるプロドラッグとして被験体に送達され得る。従って、本発明は、本発明のタナプロゲトグルクロニド誘導体を含有している薬学的組成物及びキット、並びにタナプロゲトを被験体に送達するためにそれらを使用する方法をさらに提供する。被験体には、ヒト及び非ヒトを含む、任意の哺乳動物、好ましくは雌が含まれ得る。

本明細書において使用される場合、「ＮＳＰ−９８９」又は「タナプロゲト」［Ｗｙｅｔｈ］と呼ばれるＰＲアゴニスト化合物は、以下のコア構造を特徴とする。
図示されたコア構造５−（４，４−ジメチル−２−チオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾキサジン−６−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボニトリルの合成のための方法は、米国特許第６，４３６，９２９号、米国特許出願第１１／１１３，７９４号（２００５年４月２５日出願）、並びに米国仮特許出願第６０／６７５，５５０号（２００５年４月２８日出願）；同第６０／６７５，５５１号（２００５年４月２８日出願）；同第６０／６７５，５９９号（２００５年４月２８日出願）；同第６０／６７５，７３７号（２００５年４月２８日出願）；及び同第６０／６７５，７３８号（２００５年４月２８日出願）に記載されており、この化合物の使用もこれらに記載されている。タナプロゲトを入手するためのその他の適切な合成法は、当業者には容易に明白になるであろう。本発明は、タナプロゲトを作製するための手段により制限されない。

本発明は、上記コア構造のグルクロニド誘導体を提供する。本発明の誘導体は、１又はそれ以上の不斉中心を含有していてもよく、従って、光学異性体及びジアステレオ異性体が生じ得る。以下には原子の空間的配置を顧慮せずに示されたが、本発明には、そのような光学異性体及びジアステレオ異性体が含まれ；ラセミ化合物及び分離されたエナンチオマー的（enantiomerically）に純粋なＲ立体異性体及びＳ立体異性体も含まれ；その他のＲ立体異性体及びＳ立体異性体の混合物、並びにそれらの薬学的に許容される塩も含まれる。

一つの実施形態において、グルクロニド部分は、オキシンドール環内のＮ原子を通して付着している。この誘導体は、以下の構造を特徴とし得る。

もう一つの実施形態において、グルクロニド部分は、オキシンドール環に結合したＳ原子を通して付着している。一つの実施形態において、この誘導体は、以下の構造を特徴とし得る。

他の実施形態において、これらの化合物は、以下の原子の空間的配置を有する。

本発明のタナプロゲトグルクロニド誘導体は、従来の技術を使用して、合成により作製され得る。例えば、無水中性溶媒（例えば、ＤＭＦ）中のタナプロゲトの溶液を、溶媒で希釈した強塩基（例えば、水酸化ナトリウム）の溶液へと、窒素雰囲気下で滴下にて添加し、次いで、ドライアイスを使用して冷却する。混合した後、アセトブロモ−α−Ｄ−グルクロン酸エステルの溶液を添加する。次いで、反応溶液を室温にまで加温し、撹拌する。約８〜２４時間後、反応溶液を、水と有機溶媒（例えば、酢酸エチル）との間に分配する。水層を抽出する。合わせた有機層を、飽和塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、溶媒を真空で除去する。

又は、本発明のグルクロニド誘導体は、適切な方法を使用して酵素系において作製され得る。

従来の技術が、精製された粗タナプロゲト誘導体を回収するために使用され得る。一つの実施形態において、タナプロゲト誘導体は、本明細書において参考として援用される米国仮特許出願第６０／６７５，７３８号（２００５年４月２８日出願）に記載された手段により精製され得る。もう一つの実施形態において、粗抽出物を、溶媒の勾配を用いてＨＰＬＣ逆相カラムに通過させ、粗生成物から未反応のタナプロゲト並びに出発材料及び試薬を除去することができる。カラムの勾配において使用するための適切な溶媒は、当業者によって容易に選択され得る。本明細書の実施例においては、アセトニトリル／メタノール及びアセトニトリル／酢酸アンモニウムが、溶媒として使用された。タナプロゲト誘導体を含有している画分が合わせられ、タナプロゲト誘導体混合物を提供するため、精製された溶媒が蒸発させられる。薄層クロマトグラフィ又は当該分野において公知のその他のクロマトグラフィ法も、精製のために使用され得る。

個々の誘導体を単離するため、精製された混合物は、クロマトグラフィ技術を使用したさらなる分離に供され得る。例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が使用され得る。分離のための適切なカラム及び条件は、本発明の開示があれば、当業者には容易に明白になるであろう。

もう一つの態様において、本発明は、薬学的に有効な量の１又はそれ以上の上記のようなタナプロゲトのグルクロニド誘導体を含む薬学的組成物、及びプロゲステロンレセプターのアゴニストとして薬学的に有効な量の１又はそれ以上の上記のようなタナプロゲトのグルクロニド誘導体を被験体（例えば、避妊目的の場合、出産適齢期の雌、又は治療目的の場合、他の哺乳動物）に投与することを含む処置を含む。

単独で又は組み合わせて使用される、本発明のタナプロゲトグルクロニド化合物は、避妊の方法、閉経前、閉経期前後、及び／又は閉経後のホルモン補充療法、並びに皮膚障害、不正出血、発情期同期化（estrus synchronization）、子宮平滑筋腫、子宮内膜症、多嚢胞性卵巣症候群、並びに子宮内膜、卵巣、乳房、結腸、及び前立腺の癌及び腺癌の処置及び／又は予防において利用され得る。本発明の付加的な使用には、摂食の刺激が含まれる。

「皮膚」という用語は、非制限的に、表皮、真皮、及び皮下の組織を含む、哺乳動物の体の外皮を説明することを意味する。代表的には、皮膚には、毛包及び汗腺のようなその他の成分が含まれ得る。皮膚障害には、例えば、ざ瘡及び多毛症が含まれる。

「ざ瘡」という用語は、汗孔が塞がり、かつ／又はそれにより炎症を起こした任意の皮膚障害を含むことを意味する。ざ瘡という用語には、面皰、炎症性（inflamed）丘疹、表在性（superficial）嚢胞、及び膿ほうを含む表在性ざ瘡；並びに深在性（deep）炎症性モジュール（modules）及び膿充満性（pus-filled）嚢胞を含む深在性ざ瘡が含まれるが、これらに限定されない。特定のざ瘡状態には、尋常性ざ瘡、ざ瘡面皰（acne comedo）、丘疹性ざ瘡、月経前ざ瘡、思春期前ざ瘡、毒物性ざ瘡、化粧品ざ瘡、ポマードざ瘡、アクネデターギカンス（acne detergicans）、アクネエクスコリー（acne excoriee）、グラム陰性（gram negative）ざ瘡、しゅさ性ざ瘡、偽性毛嚢炎（pseudofolliculitis barbae）、毛包炎、口周囲皮膚炎、及び汗腺膿瘍（hiddradenitis suppurativa）が含まれるが、これらに限定されない。「多毛症」という用語は、通常は過剰な発毛が起こらない身体の区域において発毛の過成長が観察される皮膚障害を説明することを意味する。

毛包及び皮脂腺の皮膚障害を含む多数の皮膚障害が、本発明の化合物により処置され得る。一つの実施形態において、ざ瘡及び多毛症のような皮膚障害が、とりわけ、本発明により処置され得る。

皮膚の乾燥／ひび割れ、脂漏症（seboria）、乾癬、又は脱毛症を含むその他の皮膚障害も、本発明の化合物及び組成物を使用して処置され得る。本発明は、環境条件の影響に対して皮膚を処置するのにも有用である。

本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と場合により組み合わせられた、本発明の化合物を利用した薬学的組成物も含む。その化合物が上記の用途のために利用される場合、それらは、１又はそれ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤（例えば、溶媒、希釈剤等）と組み合わせることができ、錠剤、カプセル、分散可能粉末、顆粒、例えば約０．０５〜５％の懸濁化剤を含有している懸濁物、例えば約１０〜５０％の糖を含有しているシロップ、及び例えば約２０〜５０％のエタノールを含有しているエリキシル等のような形態で経口投与されてもよいし、又は等張媒体中の無菌の注射可能な溶液もしくは約０．０５〜５％の懸濁化剤を含有している懸濁物の形態で非経口投与されてもよい。そのような薬学的調製物は、例えば、より一般的には約５重量％と６０重量％との間で担体と組み合わせられた約２５〜約９０％のタナプロゲト誘導体を含有し得る。

利用されるタナプロゲト誘導体の有効投薬量は、利用される特定のタナプロゲトグルクロニド誘導体、投与の様式、及び処置される状態の重症度に依って変動し得る。しかしながら、一般には、本発明の化合物が、必要に応じて１日１〜４回分割された用量で与えられるか、又は徐放性の形態で与えられるような、動物の体重１ｋｇ当たり約０．５〜約５００ｍｇの１日投薬量で投与される場合に、充分な結果が入手される。大部分の大型哺乳動物にとって、全１日投薬量は、約１〜１００ｍｇ、又は約２〜８０ｍｇである。内用のための適切な投薬形態は、固形又は液状の薬学的に許容される担体と完全に混和された約０．５〜５００ｍｇのタナプロゲト誘導体を含む。この投薬レジメンは、最適な治療的応答を提供するために調整され得る。例えば、治療状況の必要性により示されるように、いくつかの分割された用量が１日に投与されてもよいし、又は用量が比例して低下してもよい。

これらのタナプロゲトグルクロニド誘導体は、経口投与されてもよいし、静脈内、筋肉内、又は皮下の経路により投与されてもよい。タナプロゲト誘導体の性質及び所望の特定の投与形態にとって適当であるように、固形担体には、デンプン、乳糖、リン酸二カルシウム、微晶質セルロース、ショ糖、及びカオリンが含まれ、液状担体には、滅菌水、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、並びにトウモロコシ油、ピーナッツ油、及びゴマ油のような食用油が含まれる。風味剤、着色剤、保存剤、並びに抗酸化剤、例えば、ビタミンＥ、アスコルビン酸、ＢＨＴ、及びＢＨＡのような薬学的組成物の調製において慣習的に利用されているアジュバントが、有利には含まれ得る。

調製及び投与の容易さの見地から好ましい薬学的組成物は、固形組成物、特に、錠剤及び硬充填カプセル又は液体充填カプセルである。タナプロゲトグルクロニド誘導体の経口投与が、現在のところ好ましい。

これらのタナプロゲト誘導体は、非経口的に投与されてもよいし、腹腔内に投与されてもよい。遊離の塩基又は薬理学的に許容される塩としてのこれらのタナプロゲト誘導体の溶液又は懸濁物は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水において調製され得る。分散物も、グリセロール、液体、ポリエチレングリコール、及び油中のそれらの混合物において調製され得る。保管及び使用の通常の条件の下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有している。

注射可能な使用のための適切な薬学的形態には、無菌の水性の溶液又は分散物、及び無菌の注射可能な溶液又は分散物を即時調製するための無菌の粉末が含まれる。いずれの場合にも、その形態は無菌でなければならず、容易に注射器を通過する（easy syringe ability exits）程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保管の条件の下で安定していなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適当な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒であり得る。

本発明は、本明細書に記載されたレジメンにおいて使用するために設計された薬学的処方物のキット又はパッケージを提供する。一つの実施形態において、これらのキットは、とりわけ、２１日、２８日、３０日、又は３１日の周期の間の毎日経口送達のため、そして１日１回の経口送達のために設計されている。組成物が連続的に送達される場合には、パッケージ又はキットは、各錠剤内に組成物を含み得る。この組成物が間欠的な中止を伴って送達される場合には、パッケージ又はキットは、組成物が送達されない日のプラセボを含み得る。

一つの実施形態において、キットは、周期の各日に摂取すべき一回経口処方物又は経口処方剤の組み合わせ（指定された各日に摂取すべき経口錠剤を含む）を示すために組織化され、さらなる実施形態において、１個の経口錠剤は、示された１日投薬量の組み合わせの各々を含有する。

一つの実施形態において、キットは、２１日、２８日、３０日、又は３１日の周期の間の１日投薬量の本発明の化合物の単一の相を含み得る。又は、キットは、２８日、３０日、又は３１日の周期のうちの最初の２１日の間の１日投薬量の本発明の化合物の単一の相を含んでいてもよい。キットは、３０日又は３１日の周期のうちの最初の２８日の間の１日投薬量の本発明の化合物の単一の相も含み得る。

さらなる実施形態において、キットは、２１日、２８日、３０日、又は３１日の周期の間の１日投薬量の本発明の化合物及びエストロゲンの単一の組み合わせ相を含み得る。又は、キットは、２８日、３０日、又は３１日の周期のうちの最初の２１日の間の１日投薬量の本発明の化合物及びエストロゲンの単一の組み合わせ相を含んでいてもよい。キットは、３０日又は３１日の周期のうちの最初の２８日の間の１日投薬量の本発明の化合物及びエストロゲンの単一の組み合わせ相も含み得る。

もう一つの実施形態において、２８日キットは、１日投薬量単位の本発明の化合物の第１相（１４日目〜２８日目）；１日投薬量単位のエストロゲンの第２相（１日目〜１１日目）を含むことができ；場合によって、周期の残りの日のための経口的かつ薬学的に許容されるプラセボの第３相を含んでいてもよい。

さらなる実施形態において、２８日キットは、１日投薬量単位の本発明の化合物の第１相（１４日目〜２１日目）；１日投薬量単位のエストロゲンの第２相（１日目〜１１日目）を含むことができ；場合によって、周期の残りの日のための経口的かつ薬学的に許容されるプラセボの第３相を含んでいてもよい。もう一つの実施形態において、２８日キットは、１日投薬量単位の本発明の化合物の第１相（１８日目〜２１日目）；１日投薬量単位のエストロゲンの第２相（１日目〜７日目）を含むことができ；場合によって、２８日周期のうちの残りの０〜９日の各々のための経口的かつ薬学的に許容されるプラセボの第３相を含んでいてもよい。

もう一つの実施形態において、２８日キットは、１日投薬量単位の本発明の化合物の第１相（２１日目）；２２〜２４日目のための３日間の１日投薬量単位のエストロゲンの第２相を含むことができ；場合によって、２５〜２８日目の各々のための４日間の１日投薬量単位の経口的かつ薬学的に許容されるプラセボの第３相を含んでいてもよい。

さらにもう一つの実施形態において、上記レジメンの薬学的に活性な各成分の１日投薬量は、それが送達される特定の各相において固定され続ける。記載された１日用量単位が、記載された順序で、第１相に続いて第２相及び第３相が順番に送達されることがさらに好ましい。各レジメンの遵守の促進を補助するために、キットは、周期の最終日のための記載されたプラセボを含有していてもよい。

経口使用のための薬学的薬剤の投薬において使用するための多数のパッケージ又はキットが、当該分野において公知である。一つの実施形態において、パッケージは、２８日周期の各日のための表示（indicator）を有し、ラベル付きブリスターパッケージ（labeled blister package）、ダイヤルディスペンサー（dial dispenser）パッケージ、又はボトル（bottle）であり得る。

（代謝産物及びその使用）
本発明のタナプロゲトグルクロニド誘導体は、被験体におけるタナプロゲト又はタナプロゲトプロドラッグ（例えば、Ｓ−グルクロニドタナプロゲト化合物）による治療をモニタリングするのに有用である。さらに、本発明は、タナプロゲト及びそのプロドラッグによる治療をモニタリングするのに有用なその他のタナプロゲト代謝産物を提供する。試薬及び／又はスタンダードとして使用される場合、上記タナプロゲト代謝産物化合物は、例えば、放射タグ、蛍光タグ、又は比色タグにより標識され得る。

一つの実施形態において、本発明は、さらに、酵素的又は合成的に作製され得る、単離されたタナプロゲト代謝産物を提供する。そのような代謝産物は、タナプロゲトグルクロニド誘導体の中から選択され得る。その他の適切な代謝産物は、タナプロゲトコア構造および任意の置換を含んでおり、例えば、チオカルボニル基上に位置するスルフェート部分を有するタナプロゲト；ピロール環上に位置するヒドロキシ基を有するタナプロゲト；フェニルピロール環上に位置するヒドロキシ基を有するタナプロゲト；及びチオカルボニル基の代わりのカルバメートを有するタナプロゲトを含む。

１又はそれ以上のこれらのタナプロゲト代謝産物は、試料中のタナプロゲト代謝産物の存在を検出するための方法において、スタンダードとして、即ち比較目的のために役立ち得る。「試料」とは、本明細書において使用される場合、例えば、個体から単離された組織もしくは液体（血漿、血清、脳脊髄液、尿、リンパ液、涙、唾液、及び組織切片が挙げられるがこれらに限定されない）、又はインビトロ細胞培養物構成要素から単離された組織もしくは液体のような生物学的試料、並びに環境からの試料をさす。

もう一つの実施形態において、１又はそれ以上のタナプロゲト代謝産物は、試料中のタナプロゲト代謝産物の存在を検出するために使用される抗体を作製するために使用され得る。適切には、抗体は、タナプロゲト誘導体に対して特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナルの抗体である。一つの望ましい実施形態において、そのような抗体は、本発明のタナプロゲト誘導体に選択的に結合し、その代謝産物をタナプロゲト及びその他の代謝産物から区別する。

「抗体」という用語には、本明細書において使用される場合、タナプロゲト及び／又はその代謝産物と特異的に反応性であるそれらの断片、例えば、Ｆｖ断片及びＦ（ａｂ）２断片が含まれることが意図される。

本発明のタナプロゲト誘導体に対して特異的な抗体は、本発明の誘導体を抗原として標準的な技術を使用して調製され得る。例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと。

タナプロゲト代謝産物の特異的な部位に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、イムノアッセイ又は治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）キットの開発のために使用され得る。そのようなアッセイには、直接型、阻害型、競合型、もしくはサンドイッチ型のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡもしくはその他のアッセイ系）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、固相型もしくは液相型のアッセイ、又は自動化されたアッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。

競合型アッセイが使用される場合、抗体のための競合剤は、アッセイプレートに結合した本発明のタナプロゲト誘導体、又は標識された誘導体、例えば、蛍光標識された誘導体、放射標識された誘導体、もしくはトリチウム標識された誘導体であり得る。

望まれる場合、キットは、本発明の方法を促進するために使用され得る。本発明のキットは、適当に標識されたトレーサー、抗体、スタンダード、使用説明書、及びパッケージングを含み得る。トレーサーのための標識は、任意の適切な標識、例えば、放射標識、蛍光標識、又は比色（calorimetric）標識であり得る。便利である場合、キットの成分は、凍結乾燥形態であり得る。

本発明のアッセイ手順は、正確かつ再現性のある結果を与えるために、標準的な生物学的分析（bioanalytical）装置を使用して迅速かつ単純に実施され得るという利点を有する。また、全血が、抽出の必要なしに使用され得る。

本発明は、試料（例えば、血液又は尿）中のタナプロゲト代謝産物の量を検出するのに適したアッセイキットも提供する。一つの実施形態において、キットは、試料中のタナプロゲト代謝産物から医薬品（pharmaceutical）を置換する結合競合剤；及びその医薬品と結合するが、結合競合剤とは有意に結合しない抗体を含む。

以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、その範囲を制限するものではない。特定の試薬及び条件が以下の実施例において概説されるが、改変がなされてもよく、それらも、本発明の趣旨及び範囲に包含されるものであることを、当業者であれば認識するであろう。

以下の実施例は、本発明の化合物を作製するための方法を例示するものである。

（ラット肝臓ミクロソームからのタナプロゲトＳ−グルクロニドの調製）
タナプロゲトのグルクロニドを、雄ラット肝臓ミクロソームにおいて調製し、その構造を、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）／質量分析（ＭＳ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によりＳ−グルクロニド抱合体として同定した。この代謝産物を、雄及び雌両方のラット、イヌ、及びヒトの肝臓ミクロソームにおいても主要な代謝産物として同定し、この代謝産物は、ラット、イヌ、及びヒトの血漿中に見出された主要な薬物関連成分でもあった。このＳ−グルクロニドは、Ｎ−グルクロニドと同時に、合成によっても調製され得る。２つの合成グルクロニドは、ＨＰＬＣによって分離することが可能であり、それらの構造は、全て、ＬＣ／ＭＳ及びＮＭＲ分光法により特徴決定した。以下のスキームにおいては、ＮＳＰ−９８９という用語を、タナプロゲトの代わりに使用する。

（Ａ．タナプロゲトのインキュベーション及びタナプロゲトグルクロニドの抽出）
スプラーグ・ドーリーラットからの肝臓ミクロソームを、レーク（Lake）［Lake, B. In Biochemical Toxicology: A Practical Approach, Snell, K, Mullock, B(eds),IRL Press: England, 1987, 183-215］により記載された分画超遠心法（differential ultracentrifugation method）をわずかに改変したものを使用して、組織内で調製した。ミクロソームタンパク質及びシトクロムＰ４５０含有量は、それぞれ、ブラッドフォード（Bradford）［Bradford, MM Anal. Biochem. 1976; 72:248-254］並びにオオムラ（Omura）及びサトウ（Sato）［Omura, T, Sato, R J. Biol. Chem. 1964; 238: 2370-2378］の方法により決定した。タンパク質濃度及びＰ４５０含有量は、それぞれ、５０．９ｍｇ／ｍＬ及び０．４２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、及びウリジンジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Company）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。抽出及びクロマトグラフィ分析のために使用した溶媒は、ＨＰＬＣグレード又はＡＣＳ試薬グレード（Mallinckrodt Baker,Phillipsburg,NJ）であった。

インキュベーション（１００ｍＬ）は、３７℃で、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）において、タナプロゲト（４０μＭ）、ＵＤＰＧＡ（５ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、及び雄ラット肝臓ミクロソーム（１．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて実施した。試料を３７℃で１分間プレインキュベートし、ＵＤＰＧＡの添加により反応を開始させた。３時間後に反応を中止するため、氷浴を使用して試料を冷却した。未反応のタナプロゲトを、ジエチルエーテルによる２回の抽出（２００ｍＬ×２）により試料から除去した。

タナプロゲトグルクロニド及び残存している未反応のタナプロゲトを、Ｃ−１８カートリッジを使用した固相抽出及びメタノール（１０ｍＬ）による溶出により抽出した。メタノール溶出剤を、室温で真空下で回転式蒸発により乾燥させた。残渣を、５０％アセトニトリルを含む水（５ｍＬ）で抽出し、１５分間３５００ｒｐｍで遠心分離した。上清の一定分量（８００μＬ）を、半調製用カラムを用いたウォーターズ（Waters）２６９０（登録商標）ＨＰＬＣシステムにより分析した。タナプロゲト代謝産物の分離は、フェノメネックスルナ（Phenomenex Luna）^TMカラム（Ｃ１８、２５０×１０ｍｍＩＤ、５μｍ粒子サイズ）（Phenomenex,Torrance,CA）で達成し、代謝産物は、３１０ｎｍでＵＶ吸光度をモニタリングすることにより検出した。オートサンプラーの温度は６℃、カラムは室温に設定した。酢酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ４．５）及びアセトニトリルを、それぞれ移動相Ａ及びＢとして使用した。５分のポストラン再平衡化（post run re-equilibration）と共に、２ｍＬ／分の流速で、以下の勾配を利用した：０分の２０％Ｂ、１分の２０％Ｂ、１０分の４０％Ｂ、２０分の７０％Ｂ、２５分の９５％Ｂ、２８分の９５％Ｂ、３０分の２０％Ｂ。これらの条件下で、１５．５分目のタナプロゲトグルクロニドピーク（Ｍ１）を、ＮＭＲ分光分析のために収集した。グルクロニド抱合体ピークを含有している画分を、清潔なチューブへと収集し、収集直後にドライアイスで凍結させた。全てのグルクロニド画分を合わせ、アセトニトリルを回転式蒸発により除去した。グルクロニドは、Ｃ−１８カートリッジを使用した固相抽出により水性溶出液から抽出した。水（２ｍＬ）を使用して、残留バッファーを洗浄し、５０％メタノールを含む水を使用してグルクロニド抱合体を溶出させた。メタノール／水溶出液を、室温で真空下で回転式蒸発により乾燥させた。残存している水性溶液を、凍結乾燥により水を除去するため、５ｍＬコニカルバイアルに移した。固体残渣の乾燥を一晩続けて、さらに水分を除去した後、ＮＭＲ分光分析を行った。

（Ｂ．ＨＰＬＣ／ＭＳ分析条件）
この研究においては、マイクロマスクワトロウルティマ（Micromass Quattro Ultima）^TM三連四重極質量分析計（Waters Corp.,Milford,MA）を使用した。それは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースが装備されており、正イオン化モード及び負イオン化モードの両方で運転された。質量分析計の設定は以下の通りであった：ＥＳＩスプレー２．５ＫＶ、コーン（cone）５０Ｖ、質量分解能０．７Ｄａ±０．２Ｄａ半分の高さにおける幅（width at half height）、脱溶媒和ガスフロー（desolvation gas flow）９００〜１０００Ｌ／ｈ、コーンガスフロー（cone gas flow）５０〜８０Ｌ／ｈ、ソースブロック（source block）温度８０℃、脱溶媒和ガス（desolvation gas）温度２５０℃。ＬＣ／ＭＳデータは、マイクロマスマスリンクス（Micromass MassLynx）ソフトウェア（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ．、バージョン３．５及び４．０）により分析した。

ラット肝臓ミクロソームから単離したタナプロゲトグルクロニドのクロマトグラフィ分析のために使用した溶媒は、ＨＰＬＣグレード又はＡＣＳ試薬グレード(Mallinkrodt Baker, Phillipsburg, NJ and EMD Chemicals, Gibbstown, NJ)であった。質量分析計と連結されたＨＰＬＣシステムは、ウォーターズアライアンス（Alliance）モデル２６９５^TMＨＰＬＣシステムであった。それには、組み込み型のオートサンプラー及び２１０〜３５０ｎｍをモニタリングするために設定されたモデル９９６ダイオードアレイＵＶ検出器が装備されていた。デルタボンド（Deltabond）^TMＣ１８ガード（guard）カラム（１０×２ｍｍ）（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎＣｏｒｐ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）と共に、フェノメネックスルナＣ１８（２）カラム（１５０×２ｍｍ、５μｍ）（Phenomenex,Torrance,CA）を用いて分離を達成した。流速は、０．３ｍＬ／分であった。ＬＣ／ＭＳ試料分析において、最初の１０分までの流れは質量分析計外にそらした後、代謝産物の評価を行った。移動相Ａは、（等モル量の酢酸アンモニウム及び酢酸の０．５Ｍストック溶液から希釈した）１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む水（ｐＨ４．５）であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。使用した直線移動相勾配は、以下のとおりであった：０分の１０％Ｂ、１分の１０％Ｂ、１０分の１５％Ｂ、３５分の１７．５％Ｂ、３６分の２５％Ｂ、５０分の３０％Ｂ、５５分の５０％Ｂ、６０分の９０％Ｂ、６２分の９０％Ｂ、６５分の１０％Ｂ、７５分の１０％Ｂ。

（Ｃ．ＬＣ／ＭＳ結果）
タナプロゲトグルクロニドからは、プロトン化分子イオン及び脱プロトン化分子イオン（それぞれ、ｍ／ｚ４７４及び４７２の［Ｍ＋Ｈ］⁺及び［Ｍ−Ｈ］^-）が生成し、、４７３という分子量が示された。これは、タナプロゲトより１７６Ｄａ大きかった。正イオン化質量スペクトルにおけるｍ／ｚ４７４からの１７６Ｄａの欠損、及び負イオン化質量スペクトルにおけるｍ／ｚ４７２からの１７６Ｄａの欠損により、タナプロゲトとしてアサインされるフラグメントイオンが、正イオン化モードにおいてはｍ／ｚ２９８、負イオン化モードにおいてはｍ／ｚ２９６に生じた。グルクロン酸イオンフラグメントは、負イオン化モードでｍ／ｚ１７５に観察された。ｍ／ｚ３３９フラグメントイオンは、グルクロン酸環のフラグメント化によるものであるようである。これらのデータは、タナプロゲトのグルクロン酸抱合と一致していた。

（Ｄ．ＮＭＲ分光法）
重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ₆）を、全てのＮＭＲ試料のために使用した。ラット肝臓ミクロソームから単離された代謝産物試料のための溶解は、大気中の水の吸収を低下させるため、アルゴン下でグローブバッグにおいて行った。代表的には、全部で２００μＬのＤＭＳＯ−ｄ₆のうちの一定分量５０μＬを使用して、真空乾燥した試料を含有しているバイアルを濯ぎ、次いで、３ｍｍＮＭＲチューブへと移した。ＮＭＲスペクトルは、５００（バリアンイノバ（Varian Inova）^TM装置）及び６００（ブルカーアバンス（Bruker Avance）^TM装置）ＭＨｚで入手した。実験ＮＭＲ研究の大部分は、バリアン^TM３ｍｍ ¹Ｈオブザーブ（observe）間接検出プローブが装備されたバリアンイノバ５００^TMＭＨｚ装置で実施した。¹Ｈ及び¹³Ｃについての化学シフトδ（ｐｐｍ）は、内部ＴＭＳ（δ０．０）に対して報告される。ＤＭＳＯ−ｄ₆において、¹Ｈ化学シフトは、δ２．４９の残留プロトン化ＤＭＳＯを基準とし、¹³Ｃ化学シフトは、δ３９．５の内部ＤＭＳＯ−ｄ₆を基準とする。¹⁵Ｎについての化学シフトは、液体アンモニア（δ０．０）に対して報告され、δ１１２．０の外部ホルムアミドを基準とする。プロトン多重度は、ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｄｄ＝二重線の二重線、及びｍ＝多重線として報告される。Ｊ値は、Ｈｚ単位で¹Ｈ−¹Ｈ結合定数として与えられる。

¹Ｈ−ＮＭＲ実験のための一般的なパラメーターには、５０００Ｈｚスペクトル幅、３２Ｋデータポイント、４５°パルス幅、１秒リラクゼーションディレイ（relaxation delay）、及び試料濃度に依る３２〜＞１０００スキャンの平均化が含まれる。ラインブロードニング（Line broadening）（およそ０．５Ｈｚ）又はガウスプロセシング（gaussian processing）ルーチンを、信号雑音比（Ｓ／Ｎ）を増加させるために使用した。¹³Ｃ−ＮＭＲ実験のための一般的なパラメーターには、２５，０００Ｈｚスペクトル幅、６４Ｋデータポイント、４５°パルス幅、１秒リラクゼーションディレイ、及び最適なＳ／Ｎを達成するための少なくとも１０，０００スキャンの平均化が含まれる。さらに、２Ｈｚのラインブロードニングを、Ｓ／Ｎを増加させるために適用した。全てのスペクトルを、２５℃で取得した。

いくつかの型の２ＤＮＭＲ実験を、¹Ｈ−¹Ｈ及び¹Ｈ−¹³Ｃの化学結合（connectivities）を決定するために利用した。これらには、結合を３個隔てた（three-bond）¹Ｈ−¹Ｈ化学結合の決定のためのｇＣＯＳＹ実験、結合１個、結合２個、結合３個、及び結合４個を隔てた¹Ｈ−¹³Ｃ化学結合の決定のためのｇＨＳＱＣ実験及びｇＨＭＢＣ実験、並びにスルースペース（through-space）化学結合の決定のためのＮＯＥＳＹ実験又はＲＯＥＳＹ実験が含まれた。

新鮮に単離されたタナプロゲトグルクロニド試料を使用して数回試みたにも関わらず、代表的には試料の純度及び濃度は低く（純度＜７０％、及び推定された溶液中の全量＜２０μｇ）、そのため、完全な２ＤＮＭＲデータセットの取得が妨げられた。さらに、ミクロソームインキュベーション及びその後の単離工程の過程において、溶液は、（タナプロゲトの硫黄が酸素に交換された）タナプロゲトのカルバメートアナログを迅速に生成させる傾向があった。にも関わらず、ラット肝臓ミクロソームから単離されたタナプロゲトグルクロニドのほぼ完全な¹Ｈ及び¹³Ｃアサインメントを作成するために十分な化学シフト、カップリング、及び２ＤＮＭＲ相関が入手された。しかしながら、グルクロニド付着の位置を、ミクロソームに由来する試料単独からは決定することができなかった。Ｈ−１’（５．１０ｐｐｍ）からＣ−６（１６１．６３ｐｐｍ）への、唯一の鍵となるプロトン−炭素ヘテロ核相関を、ラット肝臓ミクロソームインキュベーション試料のｇＨＭＢＣＮＭＲスペクトルにおいて観察した。しかしながら、代謝産物が、Ｎ−グルクロニドであったとしても、又はＳ−グルクロニドであったとしても、この同一のクロスピークが予想された（即ち、いずれの場合にも結合３個を隔てたカップリング）。

（合成タナプロゲトグルクロニド抱合体の調製）
（Ａ．ＨＰＬＣ／ＭＳ及びＮＭＲ分析条件）
合成化合物のためのＨＰＬＣ／ＭＳデータを、ウォーターズＺＱ^TM質量分析計に連結したウォーターズアライアンス２６９５^TMＨＰＬＣを使用して取得した。一般に、以前に記載されたようなオープンアクセス（open-access）ＬＣ／ＭＳ法［Mallis,LM,Sarkahian,AB,Kulishoff,JM,Jr.,Watts,WL,Jr.J.Mass Spectrom.2002;37:889-896］を使用して試料を分析した。

ＣＤＣｌ₃（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩからの重水素化溶媒）に溶解した２を除き、全てのＮＭＲ試料のために重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ₆）を使用した。ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚ（ブルカーＤＰＸ^TM装置）、４００ＭＨｚ（バリアンイノバ^TM装置）、５００ＭＨｚ（バリアンイノバ^TM装置）、及び６００ＭＨｚ（ブルカーアバンス^TM装置）で入手した。実験ＮＭＲ研究の大部分を、バリアン^TM３ｍｍ ¹Ｈオブザーブ間接検出プローブが装備されたバリアンイノバ５００^TMＭＨｚの装置で実施した。ＤＭＳＯ−ｄ₆における化学シフトδ（ｐｐｍ）は、タナプロゲトグルクロニドについて既に記載されたように報告する。ＣＤＣｌ₃において、¹Ｈ化学シフトは、δ７．２７の残留プロトン化ＣＨＣｌ₃を基準とし、¹³Ｃ化学シフトは、δ７７．７の内部ＣＤＣｌ₃を基準とする。¹⁵Ｎについての化学シフトは、タナプロゲトグルクロニドについて既に記載したようにして報告する。

¹Ｈ−ＮＭＲ及び¹³Ｃ−ＮＭＲ実験のための一般的なパラメーターは、タナプロゲトグルクロニドについて既に記載したようなものである。全てのスペクトルを２５℃で取得した。¹Ｈ−¹Ｈ及び¹Ｈ−¹³Ｃの化学結合を決定するために使用した２ＤＮＭＲ実験は、ｇＣＯＳＹ、ｇＨＳＱＣ、ｇＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ、及びＲＯＥＳＹであった。

（Ｂ．タナプロゲトの保護されたＳ−グルクロニド酸（２）の調製）
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）中のタナプロゲト（０．２９２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を、およそ−７０℃（ドライアイス）に冷却したＤＭＦ（５０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（ＮａＨ）（０．０５２ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で滴下にて添加した。１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のアセトブロモ−α−Ｄ−グルクロン酸メチルエステル（０．３９６ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下にて添加した。次いで、反応溶液を室温にまで加温し、全部で２４時間攪拌した。２４時間後、反応溶液を、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）との間で分配した。水層を、酢酸エチル（１００ｍＬ）で再び抽出した。合わせた有機層を、飽和塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（硫酸マグネシウム、ＭｇＳＯ₄）、溶媒を真空で除去した。粗材料の一定分量を、５０〜９５％アセトニトリル／水の勾配による低圧逆相Ｃ１８（ＲｅｄｉＳｅｐ／ＩＳＣＯ、１２５×２５ｍｍＩＤ、４０μｍ粒子サイズ）の条件下でクロマトグラフィに供した。７５〜８０％アセトニトリル／水で溶出した画分が、タナプロゲトのＳ−保護された（Ｄ）−グルクロン酸誘導体（２）を含有していた。全部でおよそ２００ｍｇの（２）を、ＮＭＲ分光分析に基づき９５％の純度で入手した（単離収率３２％）。全ての化学物質を、アルドリッチ（Aldrich）（Milwaukee,WI）より購入し、さらなる精製又は乾燥なしに使用した。

（Ｃ．タナプロゲトのＮ−グルクロン酸誘導体（３）及びＳ−グルクロン酸誘導体（４）の調製）
別々の反応において、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中のタナプロゲト（０．１４６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、およそ−７０℃（ドライアイス）に冷却したＤＭＦ（２５ｍＬ）中のＮａＨ（０．０２７ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で滴下にて添加した。次いで、１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のアセトブロモ−α−Ｄ−グルクロン酸メチルエステル（０．１９８ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下にて添加した。次いで、反応溶液を室温にまで加温し、全部で８時間攪拌した。反応溶液を、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）との間で分配した。水層を、酢酸エチル（１００ｍＬ）で再び抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を真空で除去して、０．３５０ｇの粗反応材料を得た。この材料（０．２１０ｇ）の一部に、ＭｅＯＨ／ヒューニッヒ（Hunig's）塩基（（ｉｓｏ−Ｐｒ）₂ＮＥｔ）／Ｈ₂Ｏ（５ｍＬ／２ｍＬ／２ｍＬ）の溶液を添加し、その溶液を室温で８．５時間撹拌した。次いで、ＨＣｌ（濃、およそ１．５ｍＬ）を使用して、反応溶液のｐＨを２．５に調整し、１０ｍＭ（水性）酢酸アンモニウム中の１５〜３５％アセトニトリルの勾配によるＹＭＣ−パック（Pack）ＣＮ１５０×２０ｍｍ、Ｓ−５μｍカラムを使用した半調製用逆相ＨＰＬＣによるクロマトグラフィに供した。反復的に注入して、およそ５ｍｇのＮ−（Ｄ）−グルクロン酸誘導体（３）（タナプロゲトからの単離収率３％）及び１５ｍｇのＳ−（Ｄ）−グルクロン酸誘導体（４）（タナプロゲトからの単離収率１０％）を、ＮＭＲ分析及びＬＣ／ＭＳ分析及び比較のため、＞９８％の純度へと精製した。

（合成化合物のＭ１との比較）
ミクロソームに由来する代謝産物及び合成化合物のスペクトルデータ及びクロマトグラフィデータの詳細な比較から、上記代謝産物を、タナプロゲトのＳ−（β）−Ｄ−グルクロニドであると決定した。

タナプロゲトの保護されたＳ−グルクロニドである合成化合物２の正イオン化モードＬＣ／ＭＳスペクトル（示さず）は、６１４にプロトン化分子イオン［Ｍ＋Ｈ］⁺を与え、従って、６１３という分子量が示された。２９７Ｄａの欠損は、［Ｍ＋Ｈ−タナプロゲト］⁺にアサインされるｍ／ｚ３１７を与えた。ｍ／ｚ２５７のイオンシグナルは、ｍ／ｚ３１７−酢酸（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ₂）にアサインされ、ｍ／ｚ１９７に観察されたイオンは、ｍ／ｚ２５７−酢酸（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ₂）にアサインされる。また、ｍ／ｚ１５５のイオンは、ｍ／ｚ１９７−アセチル（Ｃ₂Ｈ₃Ｏ）＋Ｈにアサインされる。Ｓ−グルクロニド４のプロトン化及び脱プロトン化ＬＣ／ＭＳスペクトル（示さず）は、それぞれ、４７４の［Ｍ＋Ｈ］⁺イオン及びｍ／ｚ４７２の［Ｍ−Ｈ］^-イオンを与え（３の場合と同様であった。スペクトルは示さず）、従って、タナプロゲトのグルクロニド化が示された。４については、正イオン化モード及び負イオン化モードの質量スペクトルにおいて、タナプロゲト、即ち、グルクロン酸の欠損としてアサインされるイオンｍ／ｚ２９８及びｍ／ｚ２９６も観察される。さらに、グルクロン酸としてアサインされるｍ／ｚ１７５のフラグメントも、負イオン化スペクトルにおいて検出された。

タナプロゲトの主要な合成グルクロニド、Ｓ−グルクロニド４が、上記のＮＭＲ及び質量スペクトルの結果からＳ−グルクロニドであることがここで提唱されたタナプロゲトグルクロニドと同一であるか否かを確認するため、ＨＰＬＣ比較も行った。異なる５つの型の逆相ＨＰＬＣカラムを、２つの異なる移動相条件の下で使用した。これらの１０のＨＰＬＣ条件は、試料中の主要成分及び微量成分の溶出順序の変化により証明されるような広範囲の選択性をカバーした。２つの試料における主要ピークの保持時間を比較し、マッチさせるため、スパイキング（spiking）実験を実施した。Ｓ−グルクロニド４であることが決定された合成グルクロニドは、１０のＨＰＬＣ条件全てにおいてタナプロゲトグルクロニド代謝産物と同一の保持時間を有することを見出した。

タナプロゲト内のグルクロニド化の部位を突き止めた、合成化合物３及び４における鍵となるＮＭＲ相関を、以下に記載する。Ｎ−グルクロニド上のβ−立体化学を有するアノマープロトン（Ｈ−１’）についてのプロトン化学シフト及び結合定数は、６．３１ｐｐｍであり、９．５Ｈｚの結合定数を有する二重線である。アノマー炭素（Ｃ−１’）の炭素化学シフトは、９０．２ｐｐｍである。タナプロゲトのＮ−グルクロニド化代謝産物のベンゾオキサジン−２−チオン炭素（Ｃ−６）の炭素化学シフトは、１８８．０ｐｐｍであり；これは、１８２．８ｐｐｍの親分子タナプロゲトにおいて観察されたベンゾオキサジン−２−チオン基のチオカルボニル炭素に匹敵した。

この分子のＨＭＢＣスペクトル（示さず）においては、４つの重要な結合３個を隔てた相関が観察される。それらは、アノマープロトン（Ｈ−１’）からベンゾオキサジン−２−チオン炭素（Ｃ−６）及び１３１．５ｐｐｍのｓｐ²芳香族炭素（Ｃ−４）へ、並びにそれぞれ７．５０ｐｐｍ及び７．５７ｐｐｍに観察されたプロトンＨ−７及びＨ−９からＣ−４へ、である。Ｎ−グルクロニドに対してペリ位にあるプロトン（Ｈ−１０）のプロトン化学シフトは、親分子における７．１３ｐｐｍと比較して、７．８０ｐｐｍへと低磁場移動し（move downfwield）、従って、グルクロン酸基（及び、恐らく、カルボン酸部分）のこのプロトンとの近接が示された。¹Ｈ−¹⁵ＮｇＨＭＢＣ実験を、研究された全ての化合物に対して実行したが、鍵となる窒素Ｎ−５からのシグナルは、Ｈ−１０とのＨＭＢＣクロスピークを有していたタナプロゲト（δ１４４．８１）以外の化合物については観察されなかった。予想された他の窒素Ｎ−１５は、タナプロゲト（δ１５４．９９）及び３（δ１５５．４０）にのみ観察され、各化合物において、Ｈ−１７、Ｈ−１８、及びＨ−１９とのｇＨＭＢＣ相関を有していた。

合成Ｓ−グルクロニド４上のβ−立体化学を有するアノマープロトン（Ｈ−１’）についてのプロトン化学シフト及び結合定数は、５．１１ｐｐｍであり、１０．２Ｈｚという結合定数を有する二重線である。アノマー炭素（Ｃ−１’）の炭素化学シフトは、８５．０ｐｐｍである。このタナプロゲトのＳ−グルクロニド化代謝産物の誘導体化されたベンゾオキサジン−２−チオン炭素（Ｃ−６）の炭素化学シフトは、親分子タナプロゲトにおいて観察されたベンゾオキサジン−２−チオン基の観察されたチオカルボニル炭素化学シフト（１８２．８ｐｐｍ）から、かなり高磁場シフトした１６１．３ｐｐｍに観察される。この分子のＨＭＢＣスペクトルにおいては、β−グルクロン酸のアノマープロトン（Ｈ−１’）と、誘導体化されたベンゾオキサジン−２−チオン炭素（Ｃ−６）との間に結合３個を隔てた相関が観察される。最後に、ＨＭＢＣスペクトルにおいては、１．５９ｐｐｍ及び１．７０ｐｐｍに観察されたジェム−ジメチルプロトン（Ｈ−１１及びＨ−１２）と、８１．５ｐｐｍに観察されたこの基が付着している炭素（Ｃ−２）との間に結合２個を隔てた相関が観察される。これらのデータは、タナプロゲトのベンゾオキサジン−２−チオン（Ｎ（Ｃ＝Ｓ）Ｏ）基が、Ｓ−グルクロニド化の前にチオールカルバメート（Ｎ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ）基へと再編成されなかったことを確認する。

タナプロゲトグルクロニド並びに２つの合成化合物３及び４から得られた¹ＨＮＭＲスペクトル及びＮＭＲデータの比較は、タナプロゲトグルクロニドがタナプロゲトのＳグルクロニド誘導体であるに違いないことを明らかにした。３について観察された６．３１ｐｐｍのＨ−１’と比較して、タナプロゲトグルクロニドについてのＨ１’化学シフトは５．１０ｐｐｍであり、４については５．１１ｐｐｍである。また、タナプロゲトのベンゾオキサジン−２−チオン部分のＣ−６は、タナプロゲトグルクロニド及び４の両方と約１６１ｐｐｍで共鳴するが、３とは１８８．０ｐｐｍで、タナプロゲトとは１８２．８ｐｐｍで共鳴する。

（タナプロゲトグルクロニド抱合体代謝産物の酵素加水分解）
タナプロゲトグルクロニド誘導体が、患者に送達された場合、プロドラッグであることを確認するために、ヒトの胃腸管に固有のグルクロニダーゼにより酵素的に切断されるグルクロニド抱合体の能力を、以下のアッセイにおいて使用した。

健康な女性からプールされた尿試料（４〜８ｈｒ）を、グルスラーゼ（Glusulase）（登録商標）により加水分解した。プールされた尿の一定分量（１ｍＬ）を、０．５ｍＬの０．６Ｍ酢酸ナトリウムバッファーにより、ｐＨ５へと調整した。希釈した尿を、グルスラーゼ（登録商標）（９，０００単位／ｍＬ、１００μＬ）と混合し、温和に振とうしながら、３７℃で１時間インキュベートした。２ｍＬのアセトンの添加によりその反応を中止させ、沈殿物を遠心分離により除去した。上清を、ターボバップ（TurboVap）^TM（Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA）において窒素下で乾燥させた。残渣を、１ｍＬの６０％メタノールを含む水で再構成し、その後、ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳにより分析したところ、グルクロニドの親薬物タナプロゲトへの変換が確認された。グルスラーゼ（登録商標）を添加せずに、又はグルスラーゼ（登録商標）及び１０ｍＭのサッカロラクトン（saccharolactone）（β−グルクロニダーゼ阻害剤）を用いて、同一の条件下で、コントロールインキュベーションを実施したところ、グルクロニド抱合体のタナプロゲトへの変換は観察されなかった。

（薬理学）
タナプロゲトグルクロニドは、主として避妊において使用するためのファーストインクラス（first-in-class）の非ステロイド性プロゲステロンレセプターアゴニストであるタナプロゲトのプロドラッグである。Ｔ４７Ｄ細胞におけるアルカリホスファターゼ（phosphase）活性に対するタナプロゲトグルクロニドの効果を、以下のように分析する。

（Ａ．試薬）
培養培地：５％（ｖ／ｖ）チャコール処理（charkoal stripped）胎仔ウシ血清（非熱不活化）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタマックス（GlutaMax）（ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）が補足されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）（ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）。

アルカリホスファターゼアッセイバッファー：Ｉ．０．２％トリトンＸ−１００を含有している０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．８）、４ｍＭｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を含有している０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．８）。

（Ｂ．細胞培養及び処置）
凍結Ｔ４７Ｄ細胞を、３７℃の水浴で解凍し、培養培地で２８０，０００細胞／ｍＬに希釈する。９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ）の各ウェルへ、１８０μｌの希釈された細胞懸濁物を添加する。次いで、２０μｌの培養培地で希釈した参照化合物又は試験化合物を、各ウェルへ添加する。細胞を、５％ＣＯ₂加湿雰囲気において３７℃で２４時間インキュベートする。ハイスループットスクリーニングのため、各化合物の一つの濃度を、０．３μｇ／ｍＬで試験する。ライブラリー中の化合物の３００ｇ／ｍｏｌという平均分子量に基づき、その濃度はおよそ１μＭである。その後、活性化合物を、ＥＣ５０を決定するために用量応答アッセイにおいて試験する。

（Ｃ．アルカリホスファターゼ酵素アッセイ）
処理の終了時に、培地をプレートから除去する。５０μｌのアッセイバッファーＩを各ウェルに添加する。プレートを、１５分間、タイタープレートシェーカーで振とうする。次いで、１５０μｌのアッセイバッファーＩＩを各ウェルに添加する。光学濃度測定を、４０５ｎＭの試験波長で、３０分間、５分間隔で行う。

（Ｄ．用量−応答データの分析）
参照化合物及び試験化合物について、用量対酵素反応速度（勾配）に関する用量応答曲線を作製する。平方根変換されたデータを、分散分析、並びにアゴニストモード及びアンタゴニストモードの両方についての非直線用量応答曲線フィッティングのために使用する。フーバー加重（Huber weighting）を使用して、外れ値の効果を下方加重（down-weight）する。ＥＣ₅₀値を、再変換された値から計算する。単回投与研究及び用量応答研究の両方において、一元配置の分散分析及び非４直線（non-4 linear）用量応答分析の両方のため、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を使用する。

（Ｅ．結果）
タナプロゲトＳ−グルクロニドは０．１ｎＭであり、その効力はプロゲステロンと比較して６０％であった。

タナプロゲトは、上記実施例４に記載したような酵素加水分解実験により再生することが可能である。

（付加的なタナプロゲト代謝産物）
タナプロゲトグルクロニド代謝産物を入手するための実施例１に記載した方法を使用して、既知の技術を使用して、付加的なタナプロゲト代謝産物が、雄ラット肝臓ミクロソーム調製物、並びに雄及び雌のサルの肝臓ミクロソーム調製物において観察された。

代謝産物Ｍ２は、雄ラット肝臓ミクロソーム調製物において観察された。この代謝産物からは、ｍ／ｚ３１２の［Ｍ−Ｈ］−が生成した。不変のチオアミド基を示す、ＮＣＳ−からのｍ／ｚ５８の生成物イオンは、ＮＳＰ−９８９についても観察された。ｍ／ｚ１５９及び１９５の生成物イオンは、代謝の部位としてのピロール環を示した。従って、代謝産物Ｍ２は、ピロール部分にヒドロキシ基を有するヒドロキシ−ＮＳＰ−９８９であることが提唱された。

代謝産物Ｍ３は、雄ラット並びに雄及び雌のサルの肝臓ミクロソーム調製物において観察された。この代謝産物からは、ｍ／ｚ３１２の［Ｍ−Ｈ］−が生成した。不変のチオアミド基を示す、ＮＣＳ−からのｍ／ｚ５８の生成物イオンは、ＮＳＰ−９８９についても観察された。ＮＳＰ−９８９についてはｍ／ｚ２２０に観察された、ｍ／ｚ２３７の生成物イオンは、フェニル環又はピロール環いずれかの酸化を示した。ｍ／ｚ１９５及び２５２の生成物イオンは、フェニル環又はピロール環の酸化と一致していた。従って、代謝産物Ｍ３は、フェニル部分又はピロール部分にヒドロキシ基を有するヒドロキシ−ＮＳＰ−９８９であることが提唱された。

代謝産物Ｍ４は、全てのインビトロ代謝試料において観察された。この代謝産物からは、ｍ／ｚ２８０の［Ｍ−Ｈ］−が生成し、それは、ＮＳＰ−９８９より１６原子質量単位（ａｍｕ）小さかった。ｍ／ｚ５８の生成物イオンの欠如及び分子量の１６ａｍｕのシフトは、修飾されたチオアミド基を示した。ｍ／ｚ１２９、ｍ／ｚ２２０、及びｍ／ｚ２３４に観察された生成物イオンは、ＮＳＰ−９８９についても存在した。代謝産物Ｍ４は、合成ＮＳＰ−９８９−カルバメートと同一のＨＰＬＣ保持時間及び生成物イオンスペクトル（データは示さず）も有していた。従って、代謝産物Ｍ４はＮＳＰ−９８９−カルバメートとして同定された。

代謝産物Ｍ６は、イヌ及びラットの肝臓ミクロソーム調製物において観察された。この代謝産物からは、ｍ／ｚ３４４の［Ｍ−Ｈ］−が生成した。ｍ／ｚ８０及びｍ／ｚ８１の生成物イオンは、スルフェート基の存在を示した。ｍ／ｚ２２０及び２３４の生成物イオンは、ＮＳＰ−９８９分子の非チオカルボニル部分が不変であることを示した。従って、代謝産物Ｍ６は、ＮＳＰ−９８９スルフェート（６−（５−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−４，４−ジメチル−４Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２−スルホン酸）として同定された。

これらの代謝産物は、グルクロニド誘導体について記載した上記の方法を使用して、ミクロソーム調製物から精製され得る。又は、これらの代謝産物は、慣習的な合成技術を使用して作製されてもよい。

この明細書において言及された特許、特許公開、及びその他の刊行物は、全て、本明細書において参考として援用される。本発明は特定の実施形態に関して記載されたが、本発明の精神から逸脱することなく改変がなされ得ることが、認識されるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。

Claims

タナプロゲトのＳ−グルクロニドまたはＮ−グルクロニドである、タナプロゲトの合成グルクロニド。
タナプロゲトのＳ−β−（Ｄ）−グルクロニドである、請求項１に記載のタナプロゲトの合成グルクロニド。
以下の構造を特徴とする、請求項１に記載のタナプロゲトの合成グルクロニド。
以下の構造を特徴とする、請求項１に記載のタナプロゲトの合成グルクロニド。
請求項１から４のいずれか一項に記載のタナプロゲトの合成グルクロニドを含むスタンダードを含む、タナプロゲトによる治療をモニタリングするためのキット。
単離された試料を請求項１から４のいずれか一項に記載のタナプロゲトの合成グルクロニドと比較することを含む、タナプロゲトの代謝産物を検出するための方法。
単離された試料においてタナプロゲト又はその合成グルクロニドに対して特異的である、請求項１に記載のタナプロゲトの合成グルクロニドを使用して作製された抗体。
請求項７に記載の抗体を含む、タナプロゲトによる治療をモニタリングするためのキット。
単離された試料において請求項７に記載の抗体との結合を検出することを含む、タナプロゲトの代謝産物を検出するための方法。
薬学的に許容される担体及び請求項１から４のいずれか一項に記載のタナプロゲトの合成グルクロニドを含む避妊用組成物。
哺乳動物の避妊用医薬品の調製における、請求項１から４のいずれか一項に記載のタナプロゲトの合成グルクロニド又はその薬学的に許容される塩の使用。