CN100540558C

CN100540558C - 高粘度黄原胶聚合物制备物

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Publication number: CN100540558C
Application number: CNB2004800056020A
Authority: CN
Inventors: Y·帕特尔; L·耶尔皮; J·C·施奈德; M·V·耶尔米尼
Original assignee: Leloir Research Institute Foundation; CP Kelco US Inc
Current assignee: Leloir Research Institute Foundation; CP Kelco US Inc
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2004-03-18
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2024-03-18
Also published as: EP1606297A2; JP2011067205A; ES2359017T1; WO2004084814A3; US20090093626A1; US20040259839A1; US8034604B2; CA2516163C; EP2345735A1; US7439044B2; DK1606297T3; DE10177593T8; AU2004224393A1; CN1829727A; WO2004084814A2; EP1606297B1; EP2272970A1; DE10177593T1; US7868168B2; CA2516163A1

Abstract

增加黄原胶聚合物的分子长度，制备得到高粘度的黄原胶组合物。在食品、工业和油田应用中，具有高的比粘度特性的黄原胶在等量浓度下提供更大的粘度。增加黄原胶粘度的方法包括诱导特定的关键基因，和增加特定的关键基因的拷贝数。

Description

高粘度黄原胶聚合物制备物

[01]本申请要求2003年3月21日提交的序列号为60/456,245的美国临时申请的权益。

技术领域

[03]本发明涉及微生物产品领域。特别地，它涉及对于各种工业用途具有改良性质的微生物产品。

背景技术

[04]黄原胶(xanthan)的化学结构由具有三糖侧链的线形纤维质(1→4)-β-D-葡萄糖聚合物组成，所述三糖侧链由甘露糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成，它们交替地结合到骨架中的葡萄糖残基上。(Milas and Rinaudo，Carbohydrate Research，76，189-196，1979)。因此，黄原胶可以描述为具有五糖重复单元的带支链的聚合物；通常的黄原胶一般具有2000-3000个五糖重复单元。黄原胶聚合物通常通过对甘露糖残基进行乙酰化作用和丙酮基化作用(pyruvylation)而被修饰。

[05]通过黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌的作用，由碳水化合物发酵产生生物合成的水溶性多糖黄原胶是公知的。最早的工作是由美国农业部开展的，并描述于美国专利3,000,790中。黄单胞菌属亲水性胶体(“黄原胶”)是胞外杂多糖。

[06]黄原胶由黄单胞菌属的细菌通过需氧深层发酵(aerobic submergedfermentation)产生。发酵培养基通常含有碳水化合物(诸如糖)、微量元素和其他营养物。发酵完成后，通常对所得到的发酵肉汤(溶液)加热处理。众所周知，在转变温度(T_M)或转变温度以上对黄原胶发酵肉汤和溶液进行热处理，导致天然黄原胶的构象发生变化，产生高粘度的黄原胶。热处理也具有破坏黄原胶中存活的微生物和不想要的酶活性的有益效果。热处理之后，利用乙醇沉淀回收黄原胶。然而，对黄原胶发酵肉汤进行热处理也有其不利之处，诸如引起黄原胶的热降解。将黄原胶溶液或肉汤加热至超过T_M，或将它们保持在T_M之上的温度若干秒时间以上，会导致黄原胶发生热降解。黄原胶的热降解不可挽回地降低它的粘度。因此，热处理是控制黄原胶的质量或稠度的重要技术。

[07]黄原胶的质量主要通过两种粘度测试来测定：低剪切率粘度(Low Shear RateViscosity)(″LSRV″)，这在自来水溶液中进行的；和海水粘度(Sea Water Viscosity)(″SWV″)，这在高盐水溶液中进行。已经发现，对黄原胶发酵肉汤在T_M温度或高于T_M温度下进行巴氏消毒产生更高粘度的黄原胶，这通过更高的LSRV和SWV值显示出。

[08]黄原胶聚合物用于许多场合中。黄原胶有广泛的工业应用，包括用在油井钻探泥浆(oil well drilling muds)中，其作为通过注水二次回收石油时的粘度控制添加剂，它还用作食品增稠剂，用作稳定剂，用作乳化剂、悬浮剂和胶黏剂(Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，2nd Edition，Editors John Wiley& Sons，901-918，1989)。黄原胶也可以用于化妆品制剂、药物载体(pharmaceuticalvehicles)和类似的组合物。

[09]在本领域中需要产生在未经巴氏消毒的状态中具有更高的比粘度特性的黄原胶聚合物。例如在食品、工业和油田应用中，此种具有更高的比粘度的黄原胶聚合物在等同的黄原胶浓度下可以提供更多的粘度。

发明概述

[10]在第一种实施方案中，提供了未经巴氏消毒的黄原胶组合物。该组合物可以由过量表达gumB和gumC的细胞产生。它的特性粘度(intrinsic viscosity)比由不过量表达gumB和gumC的相应菌株产生的黄原胶高至少20％。

[11]在第二种实施方案中，提供了黄原胶组合物。它包含一群(population)分子，其具有各种分子长度。该群中至少1％的黄原胶的长度大于3μm，这由原子力显微术测定得到。

[12]在本发明的第三种实施方案中，提供了生产黄原胶聚合物制剂的方法，与由野生型菌株产生的黄原胶聚合物制剂相比，该制剂具有增加的粘度。在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)培养物中，gumB和gumC基因产物的数量选择性地增加。orfX基因产物的数量未被选择性地增加。选自gumD-gumG的基因产物的数量也未选择性地增加。更高粘度的黄原胶聚合物制剂由此由培养物产生。

[13]在本发明的第四种实施方案中，提供了生产黄原胶聚合物制剂的方法，与由野生型菌株产生的黄原胶聚合物制剂相比，该制剂具有增加的粘度。野油菜黄单胞菌菌株在其可产生黄原胶聚合物的条件下，被培养在培养基中。相比起野生型菌株，该菌株选择性地产生更多的gumB和gumC基因产物，而orfX或选自gumD-gumG.的基因的基因产物没有被选择性地增加。

[14]在本发明的第五种实施方案中，提供了未经巴氏消毒的黄原胶组合物。该组合物由过量表达gumB和gumC的细胞产生。该组合物的海水粘度比由不过量表达gumB和gumC的相应菌株产生的黄原胶高至少10％。

[15]因此，本发明为本领域提供了黄原胶组合物，其相比起由相应野生型菌株类似地产生的黄原胶组合物，具有增加的粘度。

附图简述

[16]图1示出了涉及gumB-M操纵子的遗传图谱的遗传结构，gumB-M操纵子也称为xpsB-M(黄原胶多糖合成)操纵子。

[17]图2A和2B分别示出了gumB和gumC蛋白质产物表达的蛋白质印迹分析。

[18]图3示出了黄原胶样品的特性粘度(intrinsic viscosity)图，因存在携带有过量拷贝的基因的质粒的缘故，其中一个样品过量表达gumB和gumC基因产物。

发明详述

[19]本发明的发现是，相比起它们的操纵子中的其他基因，gumB和gumC基因产物的过量表达，产生具有更高粘度的黄原胶产物，基于重量单位来计算(on a perweight basis)。尽管申请人不希望受到任何特定的操作理论的限制，似乎是某些基因产物的比率的变化，导致黄原胶聚合物分子的尺寸分布的变化。相当数量的分子的分子长度比由野生型细胞产生的黄原胶更长。这些更长的分子产生更高粘度的群体或制剂。

[20]在本领域中已知，粘度的增加可以通过对黄原胶制剂进行巴氏消毒而实现。参见Talashek等的美国专利6,391,596。然而，观察到，即使不进行巴氏消毒，gumB和gumC的过量表达也能够导致粘度的增加。尽管如此，随后对本发明的产物进行巴氏消毒，将产生更具粘性的制剂。

[21]看来，gumB和gumC的过量表达是实现增加的粘度所必需的。当对任一基因单独测试时，则未观察到粘度增加。通过与gumB-M操纵子中的其他基因相比较，可以评价gumB和gumC的过量表达。尽管相对于那些基因中的任何一个的过量表达都可足以取得该效果，但相对于orfX和gumD的过量表达是特别显著的。orfX是之前作为该基因组的片段公布的小型开放阅读框，命名为gumA，就在gumB的上游。最近在先前的gumA区域发现了两个开放阅读框，ihf和orfX。相对于gumD-gumM中的所有基因的过量表达可以被期望。

[22]通过本领域任何已知的方法，可以实现所期望的基因产物的过量表达，方法包括但不限于：将编码期望的基因产物的基因的更多拷贝导入野油菜黄单胞菌细胞或产生黄原胶的其他细菌中，和使用如诱导型启动子来诱导期望的基因产物。产生黄原胶的其他细菌包括那些已经经过遗传工程处理而含有黄原胶生物合成基因的细菌。gumB和gumC基因可以被导入一个或多个载体，即它们是联合的或单独的。

[23]根据本发明，可以使用的诱导型启动子包括本领域任何已知的启动子，包括lac启动子、ara启动子启动子、tet启动子和tac启动子。用于这些启动子的天然和人造诱导剂是本领域已知的，且可以方便地使用。例如，额外拷贝数的基因可以被导入到质粒或病毒载体上。被期望的基因的额外拷贝可以保持在染色体外，或可以整合入基因组中。

[24]从培养肉汤中回收黄原胶通常涉及一个或多个操作步骤。黄原胶可以进行热处理。黄原胶可以用醇沉淀，诸如异丙醇、乙醇或丙醇沉淀。通常，细胞不特别地从培养肉汤中除去。

[25]生物合成产生的黄原胶分子通常具有尺寸分布。通过增加长度比平均长度长得多的分子的数量，或通过将长度比平均长度长一些的分子的数量增加到更大的程度，可以实现本发明的粘度增加。具有增加的长度的分子的数量不必是极为巨大的。至少1％、3％、5％、7％、9％或11％的分子具有增加的长度，可以是足够的。长度增加的分子可以大于3、4、5、6、7、8或9μm，这用原子力显微术测定。长度大于3、4、5、6、7、8或9μm的分子对整个黄原胶群体的质量所贡献的百分比，大于它们在群中的数量比例。因此，黄原胶分子总质量的至少1％、3％、5％、10％、15％、20％或25％，由长度大于3μm的分子构成。

[26]特性粘度测定是表征本发明的制剂的另一种方法。使用这种测定方法，观察到的特性粘度相比起由野生型菌株产生的要增加5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。用于比较目的的合适的对照是那些与正被测试的菌株最为相关的对应菌株。因此，如果测试菌株具有过量拷贝的gumB和gumC，最好的对照将具有同样的遗传组成，但不存在过量拷贝的gumB和gumC。如果测试培养物已由诱导剂诱导以产生更多的gumB和gumC基因产物，那么最好的对照将是未被诱导的同样的菌株的培养物。海水粘度也可以被用于表征本发明的制剂。使用这种类型的测定，观察到的粘度比由野生型菌株产生的要增加达5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。

[27]黄原胶作为组成成分而被用于许多产品中，以改善产品特性。举例来说，特性可以包括粘度、颗粒悬浮性、口感、大小。其他的特性包括水结合性(water-binding)、增稠性、乳剂稳定性、增泡性和剪切弱化。此类产品包括食品、诸如色拉调味剂、糖浆、果汁饮料和冷冻甜点。此类产品也包括印刷染料、石油钻井液、陶瓷釉和药物组合物。在后一种情况中，黄原胶可以用作载体和受控释放(controlled release)基质。其他可以使用黄原胶的产品包括，清洗液、油漆和墨水、墙纸粘合剂、杀虫剂、牙膏以及酶和细胞固定剂。

[28]尽管本发明通过具体的实施例-包括目前实施本发明的优选方式-来描述，但本领域技术人员将认识到，对上述系统和技术可以有大量的变化和置换，它们落入权利要求书所描述的发明精神和范围内。

实施例

实施例1-菌株构建

[29]为了分离出携带野油菜黄单胞菌的完整gum基因区域的片段，野油菜黄单胞菌野生型菌株，NRRL B-1459(1)的基因组文库，用广宿主范围的柯斯质粒载体pRK311(2)构建，其通过克隆用Sau3AI部分消化的总DNA来实现。该文库整个地由大肠杆菌S17-1(3)交配到Gum-野油菜黄单胞菌突变株2895(4)。从若干粘液样接合后体分离出的柯斯质粒中的一个，称为pIZD15-261(5)，含有包括了整个gum区域的16kb片段。参见图1的图解说明和表1的操纵子基因列表。

表1

在编码黄原胶杂多糖合成的染色体区域中的基因名称列表

野油菜黄单胞菌ATCC 13951(NRRL B-1459)	野油菜黄单胞菌野油菜变种ATCC 33913	染色体位置*	功能
野油菜黄单胞菌ATCC 13951(NRRL B-1459)	野油菜黄单胞菌野油菜变种ATCC 33913	染色体位置*	功能	inf	himA(XCC2457)	2918744-2918448	整合宿主因子，α链
orfX	(XCC2456)	2918464-2918111	转录调节基因	inf	himA(XCC2457)	2918744-2918448	整合宿主因子，α链
orfX	(XCC2456)	2918464-2918111	转录调节基因	xpsB	gumB(XCC2454)	2917444-2916806	黄原胶输出
xpsC	gumC(XCC2453)	2916731-2915385	黄原胶输出	xpsB	gumB(XCC2454)	2917444-2916806	黄原胶输出
xpsC	gumC(XCC2453)	2916731-2915385	黄原胶输出	xpsD	gumD(XCC2452)	2916139-2913688	葡糖基转移酶
xpsE	gumE(XCC2451)	2913602-2912307	黄原胶聚合	xpsD	gumD(XCC2452)	2916139-2913688	葡糖基转移酶
xpsE	gumE(XCC2451)	2913602-2912307	黄原胶聚合	xpsF	gumF(XCC2450)	2912307-2911216	乙酰基转移酶
xpsG	gumG(XCC2449)	2911216-2910149	乙酰基转移酶	xpsF	gumF(XCC2450)	2912307-2911216	乙酰基转移酶

xpsH	gumH(XCC2448)	2910078-2908939	甘露糖基转移酶
xpsH	gumH(XCC2448)	2910078-2908939	甘露糖基转移酶	xpsI	gumI(XCC2447)	2908939-2907893	甘露糖基转移酶
xpsJ	gumJ(XCC2446)	2907893-2906397	黄原胶输出	xpsI	gumI(XCC2447)	2908939-2907893	甘露糖基转移酶
xpsJ	gumJ(XCC2446)	2907893-2906397	黄原胶输出	xpsK	gumK(XCC2445)	2906014-2905130	葡糖醛酸转移酶
xpsL	gumL(XCC2444)	2905086-2904295	丙酮酰基转移酶	xpsK	gumK(XCC2445)	2906014-2905130	葡糖醛酸转移酶
xpsL	gumL(XCC2444)	2905086-2904295	丙酮酰基转移酶	xpsM	gumM(XCC2443)	2904284-2903496	葡糖基转移酶
orf165	(XCC2442)	2903458-2902964	未知的保守的假想	xpsM	gumM(XCC2443)	2904284-2903496	葡糖基转移酶

*基因位置依据野油菜黄单胞菌野油菜变种(X.campestris pv.campestris)ATCC33913(GenBank保存：AE008922)的基因组序列，如da Silva，A.C.R.，et al.，(Nature，Vol.417，pg.459-463，2002)描述。

[30]为了构建pBBR5-BC质粒，用SpeI-BglII对pIZD15-261进行消化，将所得的4026bp的片段克隆在pKmob19(8)的XbaI和BamHI位点之间，产生pGum02-19S(5)。用SphI对质粒pGum02-19S进行消化，得到2855bp的片段。将该片段克隆入pUC18(9)，其之前用SphI消化，形成pUC18-BCAS。

[31]通过将含有gum启动子以及gumB和gumC基因的HindIII-XbaI片段克隆入用HindIII-XbaI消化的pBBR1-MCS5(10)(GenBank编号U25061)，构建得到最终质粒(pBBR5-BC)。

[32]所得到的pBBR5-BC质粒的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1中。(对gumB和gumC预测的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：2和3中)。该广宿主范围的、中等拷贝数的质粒为7.6kb长，并与IncP、IncQ和IncW组的质粒以及基于ColEl和P15a的复制子相容。当RK2转移功能以反式方式(in trans)提供时，转移起始点(mobRK2)的存在使得它能够通过与广范围的细菌接合而发生转移。它也携带庆大霉素抗性基因，且它含有位于编码LacZα肽的基因内的pBluescript II KS多克隆位点(pBluescript II KS，来自Stratagene，La Jolla，Ca，USA)。

[33]为了确证来自pBBR5-BC的GumB和GumC蛋白质的表达，将质粒导入野油菜黄单胞菌突变株1231，野油菜黄单胞菌突变株1231中的整个gum(xps)基因簇被剔除掉。两种蛋白质在突变菌株中用蛋白质印迹法检测到。

表2.在本工作中使用或构建的细菌菌株和质粒

^a对应于gum区域的核苷酸序列中的位置的编号(GenBank，编号U22511)

[34]细菌菌株、质粒和生长条件。本研究中所使用的菌株和质粒列于表2中。大肠杆菌菌株于37℃，培养于Luria-Bertani培养基中。野油菜黄单胞菌菌株于28℃，培养于TY(每升H₂O，含5g胰蛋白胨、3g酵母提取物，和0.7g CaCl₂)或YM培养基中(12)。依需要补充Sigma(St.Louis，Mo.)的抗生素，浓度如下(按每毫升微克数计算)：对于野油菜黄单胞菌，庆大霉素30；和四环素10；对于大肠杆菌，庆大霉素10；卡那霉素30；氨苄青霉素100；和四环素10。

[35]DNA生物化学。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Hilden，Germany)，制备来自大肠杆菌和野油菜黄单胞菌的质粒DNA。DNA限制性内切、琼脂糖凝胶电泳和克隆程序，根据已有的方法(13)实施。所有结构由DNA测序确认。利用Bio-Rad(Richmond，Calif.)(所使用的参数：大肠杆菌：200Ω、25μF、2500V和野油菜黄单胞菌：1000Ω、25μF、2500V)教导的电穿孔法，将质粒DNA导入大肠杆菌和野油菜黄单胞菌细胞中。

[36]核苷酸和蛋白质序列分析。使用MacVector Sequence Analysis Software(OxfordMolecular Limited，Cambridge，UK)，对核苷酸和氨基酸序列进行分析。

实施例2-gumB和gumC表达的蛋白质印迹分析

[37]蛋白质印迹分析证实，gumB和gumC基因产物在携带额外拷贝的gumB和gumC的野油菜黄单胞菌菌株中是被过量表达的。参见图2。

实施例3-特性粘度测定

[38]将由携带(XWCM1/pBBR5BC)或不携带(XWCM1)多个gumB和gumC基因的质粒编码拷贝的野油菜黄单胞菌菌株制备的黄原胶样品进行比较。使用葡萄糖作为碳源，进行摇瓶发酵，从这些菌株获得黄原胶。

[39]通过测量纯化的和未纯化的黄原胶样品的粘度，确定特性粘度。观察到，具有多拷贝gumB和gumC的野油菜黄单胞菌菌株产生的黄原胶的特性粘度增加。当在相同的溶剂和温度条件下测量时，特性粘度与给定的聚合物类型的分子量成正比。因此，相比起来自对照菌株的黄原胶，具有多拷贝的gumB和gumC的野油菜黄单胞菌菌株产生的黄原胶具有更高的分子量。

[40]方法：对于这两种肉汤中的每一种，均有5个摇瓶被测量。将每一种类型的肉汤合在一起，测定总体积。然后将肉汤在异丙醇中沉淀。(注意：估计培养液含有约3％的胶。测量总肉汤体积，并乘以3％，得到近似的干胶重量。该近似值用于计算产生大约0.5％胶溶液所需要的水量)。湿的纤维沉淀物然后立即混合在0.01MNaCl中，再次进行水合，以产生近似0.5％的胶溶液。通过使用3叶的2英寸直径螺旋桨搅拌器，以良好的剪切，将该纤维混合3小时，然后，使其保持过夜。下面的步骤用于制备样品，该样品用于特性粘度测定。

[41]使用Gelman Science 293mm加压过虑装置，过滤上面制备的～0.5％的胶溶液。该溶液首先过滤通过20μMagna尼龙过滤器(N22SP29325)。将过滤器加压到～60psi，将溶液收集于干净的烧杯中。(注意：当流速降低到每分钟～5滴时，更换过滤器)。

[42]第一次过滤步骤之后，使用上面的过滤装置将样品再过滤两次。首先，通过Millipore 8.0μ过滤器(SCWP 293 25)，然后通过Gelman Versapor

293mm 1.2μ过滤器(66397)。每一过滤步骤之后，将过滤的样品回收在干净的烧杯中。

[43]过滤之后，将～600ml的胶溶液置于Spectra/Por

透析管，28.6mm直径Spectrum#S732706(MWCO 12,000至14,000)。将管切割成～18-20英寸的长度，并在一端打结。将溶液加入到管中，将其充满至距离端部的2英寸内。将管打第二个结，这样，尽可能少的空气留于管中。继续直到所有的胶溶液都置于透析管中。

[44]用去离子水冲洗含有胶溶液的管的外部约1分钟，然后，将管置于含0.01MNaCl的容器中。盐溶液应该全部覆盖透析管。

[45]将管保持在0.01M NaCl溶液中4天，每天更换NaCl溶液。4天后，切开管的一端，并小心地将胶溶液转移到干净的烧杯中。

[46]使用下述程序，计算过滤透析溶液中的固体：

[47]使用能够称量±0.0002g的分析天平，称量并记录干净的铝称重盘VWR Cat#25433-008的重量。(A)

[48]使用干净的移液管，将近似10ml的胶溶液加到铝盘上，并记录盘和胶溶液的精确的总重量。(B)

[49]将盘连同溶液置于105℃干燥炉中，并保持24小时。

[50]24小时后，将盘从炉中拿出，冷却并重新称重。记录下盘和剩余干胶的总重量(C)。

[51]将铝盘和胶溶液的重量(B)减去铝盘的重量(A)。将干胶和盘的重量(C)减去铝盘的重量(A)。将第一个值(B-A)除以第二个值(C-A)。并将该值乘以100，得到％固体。

[52]注意：使用上述程序，对每一过滤透析溶液中固体的计算分三次重复进行。然后将每一样品的计算得到的％固体进行平均，并使用所得到的平均值。

[53]基于对每一溶液的固体的测定，使用0.01M NaCl将样品稀释至0.25％的总胶浓度。

[54]特性粘度测定通过使用Vilastic Viscoelasticity Analyzer(Vilastic Scientific，Inc.，Austin，TX，配置有半径0.0537cm、长度6.137cm的管)来进行。该仪器在进行测定之前用水校准，并在测定完成之后进行校验。使用该仪器的TIMET软件实验方案进行测定，设置频率为2.0Hz，恒应变为1.0，积分时间(integration time)为10秒。温度维持在23.5℃。通过稀释0.25％的胶溶液，制备样品。将每一稀释液混合20分钟，并在测定之前将其冷藏过夜。将每一稀释液进行6次测定，并算出平均值。下表3示出了稀释过程和每一制备得到的样品所测得的平均粘度。

表3

[55]根据η_sp＝((η_c-η_o)/η_o)，其中η_c＝胶溶液的粘度，将比浓粘度(η_sp/c)对胶浓度作图，测定特性粘度。截距为特性粘度。参见图3。

[56]相信，XWCM1/pBBR5-BC变体的特性粘度的增加，是由于分子量增加的缘故。当在与该实验进行时相同的溶剂和温度条件下测量时，特性粘度与给定的聚合物类型的分子量成正比。[η]和分子量之间的关系由Mark-Houwink方程式[η]＝kM^a给出，其中，k和a在特定的溶剂中和特定的温度下，对于特定的聚合物类型是恒定的。因为常数“a”是正数，只有分子量(M)增加时，[η]才增加，除非样品具有不同的分子构型，在这时，Mark-Houwink方程不适用。

实施例4-程序-低剪切率粘度测定

[57]低剪切率粘度测定以纯化的黄原胶为对象来实施。用于测定LSRV的程序在下面有详细描述。观察到，相比起由对照菌株产生的黄原胶，由具有多拷贝的gumB和gumC的菌株产生的黄原胶的粘度增加。数据显示，gumB和gumC的过量表达是链长度的增加所需要的；gumB或者gumC的单独过量表达不足以增加链长度。

[58]材料和设备：

1.标准(合成)自来水(含有1000ppm NaCl和40ppm Ca⁺⁺或147ppmCaCl₂·2H₂O的水)：通过将20gm的试剂级NaCl和2.94gm的试剂级CaCl₂·2H₂O溶解于合适容器中的20升蒸馏水中来制备。

2.能够精确测量至0.01gm的天平。

3.Brookfield LV粘度计，心轴#1和心轴保护装置。

4.标准实验室玻璃器皿。

5.标准实验室搅拌台(stirring bench)。RAE搅拌动力器(stirring motor)(C25U)和搅拌轴(stirring shaft)(5/16”)，带有3叶螺旋桨，可以被替换。

[59]程序：

1.用600ml Berzelius(高式)量杯称量299ml的合成自来水，向其中缓慢加入0.75gm(称量至最接近的0.01gm)的产物，同时以800rpm的转速搅拌。

2.在800rpm搅拌4小时后，将溶液从搅拌台移去，使之保持30分钟。

3.将温度调节到室温，并使用Brookfield LV粘度计，1#心轴在3rpm转速时测量粘度。在将心轴旋转3分钟之后，记录粘度。

实施例5-蛋白质表达的定量

[60]将细胞裂解物进行蛋白质印迹和免疫检测分析，以确定质粒编码的gumB和gumC的水平。四次独立的印迹被分析。尽管在每一次定量分析中，同一样品的绝对值不能被重复，但是在所有测定中，样品之间的相对数量保持相同。

[61]针对GumB和GumC产生的抗体的制备。利用PCR扩增，产生编码GumC蛋白氨基酸残基53-447的、长为1184bp的DNA片段。使用下述引物：F2135：5′GGAATTCCATATGTTGATGCCCGAGAAGTAC-3’(SEQ ID NO：4)和B3319：5′CGGGATCCTCAAAAGATCAGGCCCAACGCGAGG-3’(SEQ ID NO：5)。PCR产物用NdeI和BamHI消化，并亚克隆入pET22b(+)，将所得到的质粒(pET-C)导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

[62]将大肠杆菌BL21(pET-C)培养在含50μg羧苄青霉素/ml的L-培养液中，培养至OD600为0.6，然后用1mM IPTG诱导3小时。通过在37℃，用裂解缓冲液(50mMTris/HCl pH8，1mM EDTApH8，100mM NaCl，1mM PMSF，0.1mg DNase ml^-1，0.5％Triton X-100)中的1mg/ml的溶菌酶处理30分钟，再在冰上超声处理，制备总细胞裂解物。通过低速离心(Eppendof，4000×g，5分钟)，去除细胞碎片，通过在14000×g离心10分钟，上清液被分离为可溶组分和沉淀(包涵体)组分。沉淀组分用裂解缓冲液洗涤2次，所用裂解缓冲液的体积与原细胞裂解物的体积相同，用含2mg/ml的DOC的裂解缓冲液洗涤1次，然后用水洗涤3次。处理完之后，蛋白质用SDS-PAGE分离，切下含有过量产生的GumC蛋白质的主要条带，并洗涤以用于对兔子进行免疫。

[63]将大肠杆菌JM109(pQE-Xps#6，pREP4)培养在含50μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的L-培养液中，培养至OD600为0.6，然后用1mM IPTG诱导3小时。通过在37℃，用裂解缓冲液(50mM Tris/HCl pH8，1mM EDTApH8，100mM NaCl，1mM PMSF，0.1mg DNase ml^-1，0.5％Triton X-100)中的1mg/ml的溶菌酶处理30分钟，再在冰上超声处理，制备总细胞裂解物。通过低速离心(Eppendof，4000×g，5分钟)，去除细胞碎片，通过在14000×g离心10分钟，上清液被分离为可溶组分和沉淀(包涵体)组分。沉淀组分用裂解缓冲液洗涤2次，并重新悬浮于含6M盐酸胍的100mM磷酸缓冲液(pH7)，5mM DTT，5mM EDTA中，包涵体在用缓冲液D(4MGdnHCl，50mM磷酸缓冲液(pH7)，150mM NaCl)进行预平衡的FPLC SuperdexHR200(Pharmacia Biotech)上进行色谱分析，收集含有GumB的级分并用于免疫小鼠。

[64]质粒pFD5、pBBR-promC和pBBR5-B的构建。通过用BamHI(#318和#3459)部分消化pIZD15-261，获得含有gumB和gumC基因的3141bp的片段，并将其克隆入BamHI消化的pRK404，产生质粒pFD5。通过用EcoRI(#1979)和BamHI(#3459)消化pGum02-19，分离出1480bp的片段，并将其克隆入之前用同样的酶消化的pBBR1MCS-5中，产生pBBR-promC。用MCS中的HindIII和EcoRI(#1979)消化pGum02-19，产生1233bp的片段，将其克隆入pBBR1MCS-5，产生质粒pBBR5-B。

[65]用上面制备的GumC来免疫新西兰白雌兔。初次给兔注射500μg蛋白质和弗氏完全佐剂(complete Freund′s adjuvant)，然后每隔一周注射250μg的蛋白质和不完全佐剂，共3次。用上面制备的GumB来免疫BALB/c雌鼠。初次给小鼠注射100μg蛋白质和弗氏完全佐剂，然后每周一次注射50μg的蛋白质和不完全佐剂，共3次。按照Harlow & Lane((1999)Using antibodies：a laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)中描述的方法制备多克隆抗体，并将抗血清保存在-70℃。为了获得GumC特异性抗体，血清用大肠杆菌BL21(pET22b+)和Xc1231丙酮粉来吸附(Harlow&Lane，supra)。

[66]蛋白质提取物。通过电穿孔法将质粒导入亲代菌株PRM-1。将所得的菌株在28℃，培养在YM培养基中，250rpm振荡培养至对数中期。离心收集细胞，并测定湿重。用10mMTris/HCl，10mMEDTA(pH 8.0)洗涤沉淀两次，以去除外多糖，并以100mg/ml的浓度重新悬浮于同样的缓冲液中。将100μl缓冲液A(10mM Tris/HCl，10mM EDTA(pH 8.0)，1.5％SDS)加入到50μl的每一样品中后，将混合物在室温温育10分钟，然后在100℃温育12分钟。将细胞裂解物在14000×g(Eppendorf5415C)离心5分钟，收集得到的上清液称为总蛋白质提取物。在SDS存在下，使用BSA作为标准，通过Markwell((1978)A modification of the Lowry procedure to simplifyprotein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal Biochena 87(1)，206-10)描述的方法，测定每一裂解物的蛋白质浓度。

[67]SDS-PAGE和免疫检测。将细胞裂解物(每泳道30μg)与样品缓冲液(125mMTris/HCl，pH6.8；4％SDS；20mM DTT；0.05％溴酚兰；20％甘油)混合，并煮沸2分钟。蛋白质用

and von Jagow((1987)Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to100kDa.Analytical Biochemistry 166(2)，368-79)中描述的SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶分离。使用半干转移系统(semi-dry transfer system)进行电印迹(Hoefer Semiphorunit)，将蛋白质转移到Immobilon-P膜(PVDF，Millipore)上。转移在含有10mMCAPS(pH11)，10％(v/v)甲醇的缓冲液中进行30分钟，2.5mA/cm²凝胶表面积。电转移完成之后，印迹用0.5％丽春红染色，以评价转移质量，并用Milli-Q-级水洗涤。印迹用含有5％脱脂奶粉的TBST(150mM NaCl，10mM Tris/HCl pH8，0.05％Tween-20)(Harlow & Lane，supra)在4℃封闭过夜，然后用含抗-GumB(1∶3000)或抗-GumC(1∶5000)抗体的、含有3％脱脂奶粉的TBST在室温下温育3h。碱性磷酸酯酶结合的羊抗鼠IgG或抗兔IgG(Sigma)分别用于检测，如制造商所述。印迹用TBST洗涤三次，然后在含氮蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(NBT/BCIP，Promega)的溶液中显影。可以使用商业上可获得的蛋白质标记MW-SDS-70L(Sigma)来校准SDS-PAGE。

[68]印迹定量分析。GumB和GumC蛋白质条带的强度通过用UVP摄像密度仪(Densitometer)(Ultra Violet Products)扫描用NBT/BCIP显影的滤膜，而得以确定，并用GelWorks 1D分析软件(NonLinear Dynamics Ltd)进行量化。每一滤膜含有PRM-1(pBBR-prom)提取物的参考泳道，以确定野生型细胞中染色体编码的GumB和GumC的水平。观察到GumB和GumC的相对数量。参见图2A和2B。

实施例6-程序-使用原子力显微术测定分子长度或分子量

[69]使用称为原子力显微术(AFM)或扫描探针显微术(SPM)的直接观察技术(direct visualization technique)，对野油菜黄单胞菌菌株产生的黄原胶分子的长度进行成像，这些野油菜黄单胞菌菌株携带(XWCM1/pBBR5-BC)或不携带(XWCM1)多拷贝的gumB和gumC。用于进行AFM的程序将在下面详细描述。观察到，由携带多拷贝的gumB和gumC的菌株产生的黄原胶分子的平均分子轮廓(contour)长度比亲代菌株产生的要长得多。

[70]通过将0.1g的胶混合在100g的蒸馏水中大约3小时，制备0.1wt％的胶溶液。通过将20μl的0.1wt％溶液稀释入20g 0.1M醋酸铵溶液，制备1ppm的贮存液。将20μl的1ppm贮存液喷洒到新鲜切割的云母片上(～1cm²)。这些云母片然后置于加热的(～60℃)真空室中～1小时，以去除过量的水。干燥的云母片然后用AFM的轻叩模式(Tapping Mode)进行扫描。用Digital Instruments提供的软件测量所有AFM图像的分子轮廓长度。

[71]测量一群黄原胶分子的轮廓长度。该研究的结果总结于表4中。(每一尺寸级别的分子小于或等于示出的长度；尺寸级别中示出的分子数量不包括纳入在更小尺寸级别中的分子)。这些结果显示，由具有多拷贝的gumB和gumC的野油菜黄单胞菌菌株产生的黄原胶分子明显大于由对照菌株产生的黄原胶分子。原子力显微术(AFM)或扫描探针显微术(SPM)利用商业可获得的仪器(Nanoscope IIIa，DigitalInstruments，Santa Barbara，CA)，使用氮化硅悬臂尖(cantilever tip)进行。

表4黄原胶分子轮廓长度的AFM测定

实施例7-耐海水粘度评价

[72]评测由XWCM-1/pBBR5-BC菌株产生的黄原胶的耐海水粘度(SWV)，将之与商业渠道获得的黄原胶产品(Xanvis^TM)进行比较。Xanvis^TM黄原胶产品的典型的SWV在18至22范围内。

[73]使用下述程序测定耐海水粘度。将41.95g的海盐(ASTMD1141-52，来自LakeProducts Co.，Inc.Maryland Heights，Missouri)溶解于1升的去离子水中，制备海水溶液。将300ml的海水溶液转移到混合杯，该混合杯连接有Hamilton-Beach 936-2混合器(Hamilton-Beach Div.，Washington，D.C.)。混合器速度控制被设置于低速，并将单槽纹盘(single fluted disk)附着到混合轴(mixing shaft)。在低速设置时，混合轴以近似4,000-6,000rpm的速度旋转。将0.86g的生物胶(biogum)在15-30秒的时间里缓慢加入到混合杯，并允许混合5分钟。将混合器速度控制设置至高速(11,000±1,000rpm)，允许测试溶液混合近似5分钟。从加入生物胶产品的时间算起，混合物允许混合共45分钟。45分钟的混合时间结束时，加入2-3滴Bara Defoam(NL Baroid/NL industries，Inc.，Houston，TX)，并继续再搅拌30秒。

[74]将混合杯从混合器移去，并浸入冷却水，以将液体的温度降至25±0.5℃。为了确保溶液的均匀，冷却之后，在11,000±1,000rpm转速下，将溶液再次混合5秒钟。将溶液从混合杯移至400ml的Pyrex烧杯，并测量Fann粘度(Fann Viscometer，Model35A)。这通过在低速(约3rpm)下混合而完成。稳定读数，然后从表盘读出剪应力值，作为3rpm转速时的SWV值记录下来。

表5.XWCM-1/pBBR5-BC黄原胶和Xanvis^TM黄原胶的品质

样品	SWVDR<sup>a</sup>
样品	SWVDR<sup>a</sup>	XWCM-1/pBBR5-BC	2930
Xanvis<sup>TM</sup>黄原胶	22	XWCM-1/pBBR5-BC	2930

^a表盘读数

参考文献

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13.Sambrook，J.，and Russell，D.W.(2001)Molecular cloning：a laboratory manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor，NY Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

序列表

<110>Y·帕特尔

L·耶尔皮

J·C·施奈德

M·V·耶尔米尼

<120>高粘度黄原胶聚合物制备物

<130>012047.00047

<150>60/456，245

<151>2003-03-21

<160>5

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>7604

<212>DNA

<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<220>

<221>CDS

<222>(2715)...(4133)

<223>gumC

<221>CDS

<222>(2014)...(2712)

<223>gumB

<221>misc_feature

<222>(1915)...(1915)

<223>+1

<221>misc_feature

<222>(5812)...(5150)

<223>REP(互补链)

<221>misc_feature

<222>(794)...(261)

<223>genatmicin乙酰基转移酶(互补链)

<221>-35_信号

<222>(1840)...(1845)

<400>1

accttcggga gcgcctgaag cccgttctgg acgccctggg gccgttgaat cgggatatgc 60

aggccaaggc cgccgcgatc atcaaggccg tgggcgaaaa gctgctgacg gaacagcggg 120

aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg 180

aaaagtgcca cctggcggcg ttgtgacaatttaccgaaca actccgcggc cgggaagccg 240

atctcggctt gaacgaattg ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 300

tcttcccgta tgcccaactt tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaatctgct 360

tgcacgtaga tcacataagc accaagcgcg ttggcctcat gcttgaggag attgatgagc 420

gcggtggcaa tgccctgcct ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 480

tcactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc aacaaccgct 540

tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt cccgaggtaa 600

tcggagtccg gctgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 660

tcaagagcag cccgcatgga tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt gcgaatgatg 720

cccatacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg 780

ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 840

ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa 900

aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg ttcggtcaag gttctggacc agttgcgtga 960

gcgcatacgc tacttgcatt acagtttacg aaccgaacag gcttatgtca actgggttcg 1020

tgccttcatc cgtttccacg gtgtgcgtcc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag 1080

gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc 1140

agaatgctta atgaattaca acagttttta tgcatgcgcc caatacgcaa accgcctctc 1200

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 1260

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 1320

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 1380

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 1440

aagctgggta ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttgc atgcctgcag 1500

gtcgactcta gtggtcgtcg gttcgaatcc ggctaccccg accaaacaac aggcctacgt 1560

cgcaagacgt gggccttttt gttgcgtcgc aacatgtcag ttcgatggca ttccaggcta 1620

tgccactatg cgcaacggca tattgcaagg cggcatatgc aagtcctgta cgcaattatt 1680

tcgcggttca ggctgctaca agtcgggatc agcaggcgtc cgtaagtgcc cggaaacgct 1740

agagttcgta tgctgagaat gacgacccag gtcacgttct cttaacgtcg aggcgacgaa 1800

cttgaatcaa taggccaacg ccgtcaaaaa aatggcgtgt tgtgccttgc gatgtgttcg 1860

ttctatgcca tagtgcactg caacacgcga ttcaacgttg gtcccggcac gcgtcgggat 1920

gcaacttcct gtcgtacgtt cgtgctggcg cctgagccgg ttgaatgctg cgcgaggtcc 1980

tgtcccaccc aacagaggca gccagctaca cgc atg aag aaa ctg atc gga cga 2034

Met Lys Lys Leu Ile Gly Arg

1 5

ctc tgc caa ggc ctc agc ctg gct ctg ctc tgc tcg atg tcg ctg ggc 2082

Leu Cys Gln Gly Leu Ser Leu Ala Leu Leu cys Ser Met Ser Leu Gly

10 15 20

gct tgc agc acc ggc ccg gag atg gcg tct tcg ctg ccg cat ccg gac 2130

Ala Cys Ser Thr Gly Pro Glu Met Ala Ser Ser Leu Pro His Pro Asp

25 30 35

ccg ctg gca atg tcc acg gtg cag ccc gaa tac cgt ctt gcg ccg ggc 2178

Pro Leu Ala Met Ser Thr Val Gln Pro Glu Tyr Arg Leu Ala Pro Gly

40 45 50 55

gat ctg ttg ctg gtg aag gtg ttt cag atc gac gat ctg gag cgg cag 2226

Asp Leu Leu Leu Val Lys Val Phe Gln Ile Asp Asp Leu Glu Arg Gln

60 65 70

gtc cgc atc gac cag aac ggt cac atc tca ctg ccg ttg att ggc gac 2274

Val Arg Ile Asp Gln Asn Gly His Ile Ser Leu Pro Leu Ile Gly Asp

75 80 85

gtc aag gcc gcc ggt ctg ggc gtt ggc gaa ctg gaa aag ctg gtc gcc 2322

Val Lys Ala Ala Gly Leu Gly Val Gly Glu Leu Glu Lys Leu Val Ala

90 95 100

gat cgg tat cgc gca ggc tac ctg cag cag ccg cag att tcg gta ttc 2370

Asp Arg Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Gln Gln Pro Gln Ile Ser Val Phe

105 110 115

gtg cag gag tcc aac ggg cgt cgc gtc acg gtc act ggt gcg gta gac 2418

Val Gln Glu Ser Asn Gly Arg Arg Val Thr Val Thr Gly Ala Val Asp

120 125 130 135

gag ccg ggc atc tac ccg gtg atc ggc gcc aac ctc acc ttg cag cag 2466

Glu Pro Gly Ile Tyr Pro Val Ile Gly Ala Asn Leu Thr Leu Gln Gln

140 145 150

gcg atc gcg cag gcc aag ggt gtc agc acg gtg gca agc cgc ggc aac 2514

Ala Ile Ala Gln Ala Lys Gly Val Ser Thr Val Ala Ser Arg Gly Asn

155 160 165

gtg atc gtg ttc cgc atg gtc aac ggg caa aaa atg att gcg cgg ttc 2562

Val Ile Val Phe Arg Met Val Asn Gly Gln Lys Met Ile Ala Arg Phe

170 175 180

gac ctg acc gag atc gag aag ggg gcc aat ccg gat cct gag att tat 2610

Asp Leu Thr Glu Ile Glu Lys Gly Ala Asn Pro Asp Pro Glu Ile Tyr

185 190 195

ggc ggc gac att gtc gtg gtg tat cgc tcg gatgcg cgc gtg tgg ttg 2658

Gly Gly Asp Ile Val Val Val Tyr Arg Ser Asp Ala Arg Val Trp Leu

200 205 210 215

cgc acc atg ctg gaa ctg acc ccc ttg gtg atg gtg tgg cgc gct tac 2706

Arg Thr Met Leu Glu Leu Thr Pro Leu Val Met Val Trp Arg Ala Tyr

220 225 230

cga tga gt atg aat tca gac aat cgt tcc tct tcg tcg cag cgt cat 2753

Arg ＊ Met Asn Ser Asp Asn Arg Ser Ser Ser Ser Gln Arg His

235 240 245

ggt cat ctg gaa ctg gca gat gtc gac ttg atg gac tac tgg cgc gcc 2801

Gly His Leu Glu Leu Ala Asp Val Asp Leu Met Asp Tyr Trp Arg Ala

250 255 260

ctg gtc tcg cag ctc tgg ctg atc atc ctg atc gcc gtc ggc gcg ctg 2849

Leu Val Ser Gln Leu Trp Leu Ile Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala Leu

265 270 275

ttg ctg gca ttc ggc atc acg atg ttg atg ccc gag aag tac cgc gcc 2897

Leu Leu Ala Phe Gly Ile Thr Met Leu Met Pro Glu Lys Tyr Arg Ala

280 285 290

acc agc acc ctg cag atc gaa cgt gac tcg ctc aat gtg gtg aac gtc 2945

Thr Ser Thr Leu Gln Ile Glu Arg Asp Ser Leu Asn Val Val Asn Val

295 300 305

gac aac ctg atg ccg gtg gaa tcg ccg cag gat cgc gat ttc tac cag 2993

Asp Asn Leu Met Pro Val Glu Ser Pro Gln Asp Arg Asp Phe Tyr Gln

310 315 320 325

acc cag tac cag ttg ctg cag agc cgt tcg ctg gcg cgt gcg gtg atc 3041

Thr Gln Tyr Gln Leu Leu Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Ala Val Ile

330 335 340

cgg gaa gcc aag ctc gat cag gag ccg gcg ttc aag gag cag gtg gag 3089

Arg Glu Ala Lys Leu Asp Gln Glu Pro Ala Phe Lys Glu Gln Val Glu

345 350 355

gag gcg ctg gcc aaa gcc gcc gaa aag aat ccc gag gcg ggt aag tcg 3137

Glu Ala Leu Ala Lys Ala Ala Glu Lys Asn Pro Glu Ala Gly Lys Ser

360 365 370

ctc gat tcg cgg cag gcg atc gtc gag cgc agc ctc acc gat acg ttg 3185

Leu Asp Ser Arg Gln Ala Ile Val Glu Arg Ser Leu Thr Asp Thr Leu

375 380 385

ctc gcc ggg ctg gtg gtc gag ccg atc ctc aac tcg cgc ctg gtg tac 3233

Leu Ala Gly Leu Val Val Glu Pro Ile Leu Asn Ser Arg Leu Val Tyr

390 395 400 405

gtc aat tac gat tcg cca gac ccg gtg ctg gcc gcc aag atc gcc aat 3281

Val Asn Tyr Asp Ser Pro Asp Pro Val Leu Ala Ala Lys Ile Ala Asn

410 415 420

acg tac ccg aag gtg ttc atc gtc agc acc cag gaa cgc cgc atg aag 3329

Thr Tyr Pro Lys Val Phe Ile Val Ser Thr Gln Glu Arg Arg Met Lys

425 430 435

gcg tct tcg ttt gcg aca cag ttt ctg gct gag cgc ctg aag cag ttg 3377

Ala Ser Ser Phe Ala Thr Gln Phe Leu Ala Glu Arg Leu Lys Gln Leu

440 445 450

cgc gag aag gtc gaa gac tct gaa aag gat ctg gtc tcg tat tcg acc 3425

Arg Glu Lys Val Glu Asp Ser Glu Lys Asp Leu Val Ser Tyr Ser Thr

455 460 465

gaa gag cag atc gtg tcg gtt ggc gat gac aag ccc tcg ctg cct gcg 3473

Glu Glu Gln Ile Val Ser Val Gly Asp Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ala

470 475 480 485

cag aat ctg acc gat ctc aat gcg ttg ctg gca tcc gca cag gac gcc 3521

Gln Asn Leu Thr Asp Leu Asn Ala Leu Leu Ala Ser Ala Gln Asp Ala

490 495 500

cgg atc aag gcc gag tca gct tgg cgg cag gct tcc agt ggc gat ggc 3569

Arg Ile Lys Ala Glu Ser Ala Trp Arg Gln Ala Ser Ser Gly Asp Gly

505 510 515

atg tca ttg ccg cag gtg ttg agc agc ccg ctg att caa agc ctg cgc 3617

Met Ser Leu Pro Gln Val Leu Ser Ser Pro Leu Ile Gln Ser Leu Arg

520 525 530

agc gag cag gtg cgt ctg acc agc gag tac cag cag aaa ctg tcg acc 3665

Ser Glu Gln Val Arg Leu Thr Ser Glu Tyr Gln Gln Lys Leu Ser Thr

535 540 545

ttc aag ccg gat tac ccg gag atg cag cgc ctc aag gcg cag atc gaa 3713

Phe Lys Pro Asp Tyr Pro Glu Met Gln Arg Leu Lys Ala Gln Ile Glu

550 555 560 565

gag tcg cgt cgt cag atc aatggc gaa gtc atc aat atc cgt cag tcg 3761

Glu Ser Arg Arg Gln Ile Asn Gly Glu Val Ile Asn Ile Arg Gln Ser

570 575 580

ctg aag gcg acc tac gac gcc tcc gtg cat cag gag cag ctg ctc aac 3809

Leu Lys Ala Thr Tyr Asp Ala Ser Val His Gln Glu Gln Leu Leu Asn

585 590 595

gac cgc atc gcc ggt ctg cgg tcc aac gag ctg gat ctg cag agc cgc 3857

Asp Arg Ile Ala Gly Leu Arg Ser Asn Glu Leu Asp Leu Gln Ser Arg

600 605 610

agc atc cgc tac aac atg ctc aag cgc gac gtc gac acc aac cgc cag 3905

Ser Ile Arg Tyr Asn Met Leu Lys Arg Asp Val Asp Thr Asn Arg Gln

615 620 625

ctc tac gat gcg ctc ctg cag cgc tac aag gaa atc ggc gtg gcg agc 3953

Leu Tyr Asp Ala Leu Leu Gln Arg Tyr Lys Glu Ile Gly Val Ala Ser

630 635 640 645

aac gtg ggc gcc aac aac gtg acc atc gtc gat acc gca gac gtg cct 4001

Asn Val Gly Ala Asn Asn Val Thr Ile Val Asp Thr Ala Asp Val Pro

650 655 660

acg tct aag act tcg ccg aaa ctc aaa ttg aac ctc gcg ttg ggc ctg 4049

Thr Ser Lys Thr Ser Pro Lys Leu Lys Leu Asn Leu Ala Leu Gly Leu

665 670 675

atc ttt ggc gta ttc ctg ggc gtg gct gtg gct ctg gtt cgc tac ttc 4097

Ile Phe Gly Val Phe Leu Gly Val Ala Val Ala Leu Val Arg Tyr Phe

680 685 690

ctg cgt ggg cct tct ccg agg tcg cgg ttg aac tga catcgtgatg 4143

Leu Arg Gly Pro Ser Pro Arg Ser Arg Leu Asn ＊

695 700

ttgcaaaacg atggttaatt gaagtgacaa ctgattcagc gtggaaaagg tgggatcccg 4203

taaggtgcgg gctccctcgt ttgaaggttt gtctctgttg aaacaaaggg ctgtcgtgcg 4263

atctggggtc ggtaggtatt accgcggtga tcggacgaca ggatgattga aagctcgcgt 4323

gcgattcgta tgttcccccg catgcctgca ggtcgactct agagcggccg ccaccgcggt 4383

ggagctccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac 4443

aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 4503

ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 4563

gcagcctgaa tggcgaatgg aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa 4623

tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgac tgcgatgagt ggcagggcgg 4683

ggcgtaattt ttttaaggca gttattggtg cccttaaacg cctggtgcta cgcctgaata 4743

agtgataata agcggatgaa tggcagaaattcgaaagcaa attcgacccg gtcgtcggtt 4803

cagggcaggg tcgttaaata gccgcttatg tctattgctg gtttaccggt ttattgacta 4863

ccggaagcag tgtgaccgtg tgcttctcaa atgcctgagg ccagtttgct caggctctcc 4923

ccgtggaggt aataattgac gatatgatca tttattctgc ctcccagagc ctgataaaaa 4983

cggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca 5043

tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg gcggcgaggc ggctacagcc 5103

gatagtctgg aacagcgcac ttacgggttg ctgcgcaacc caagtgctac cggcgcggca 5163

gcgtgacccg tgtcggcggc tccaacggct cgccatcgtc cagaaaacac ggctcatcgg 5223

gcatcggcag gcgctgctgc ccgcgccgtt cccattcctc cgtttcggtc aaggctggca 5283

ggtctggttc catgcccgga atgccgggct ggctgggcgg ctcctcgccg gggccggtcg 5343

gtagttgctg ctcgcccgga tacagggtcg ggatgcggcg caggtcgcca tgccccaaca 5403

gcgattcgtc ctggtcgtcg tgatcaacca ccacggcggc actgaacacc gacaggcgca 5463

actggtcgcg gggctggccc cacgccacgc ggtcattgac cacgtaggcc gacacggtgc 5523

cggggccgtt gagcttcacg acggagatcc agcgctcggc caccaagtcc ttgactgcgt 5583

attggaccgt ccgcaaagaa cgtccgatga gcttggaaag tgtGttctgg ctgaccacca 5643

cggcgttctg gtggcccatc tgcgccacga ggtgatgcag cagcattgcc gccgtgggtt 5703

tcctcgcaat aagcccggcc cacgcctcat gcgctttgcg ttccgtttgc acccagtgac 5763

cgggcttgtt cttggcttga atgccgattt ctctggactg cgtggccatg cttatctcca 5823

tgcggtaggg tgccgcacgg ttgcggcacc atgcgcaatc agctgcaact tttcggcagc 5883

gcgacaacaa ttatgcgttg cgtaaaagtg gcagtcaatt acagattttc tttaacctac 5943

gcaatgagct attgcggggg gtgccgcaat gagctgttgc gtacccccct tttttaagtt 6003

gttgattttt aagtctttcg catttcgccc tatatctagt tctttggtgc ccaaagaagg 6063

gcacccctgc ggggttcccc cacgccttcg gcgcggctcc ccctccggca aaaagtggcc 6123

cctccggggc ttgttgatcg actgcgcggc cttcggcctt gcccaaggtg gcgctgcccc 6183

cttggaaccc ccgcactcgc cgccgtgagg ctcggggggc aggcgggcgg gcttcgcctt 6243

cgactgcccc cactcgcata ggcttgggtc gttccaggcg cgtcaaggcc aagccgctgc 6303

gcggtcgctg cgcgagcctt gacccgcctt ccacttggtg tccaaccggc aagcgaagcg 6363

cgcaggccgc aggccggagg cttttcccca gagaaaatta aaaaaattga tggggcaagg 6423

ccgcaggccg cgcagttgga gccggtgggt atgtggtcga aggctgggta gccggtgggc 6483

aatccctgtg gtcaagctcg tgggcaggcg cagcctgtcc atcagcttgt ccagcagggt 6543

tgtccacggg ccgagcgaag cgagccagcc ggtggccgct cgcggccatc gtccacatat 6603

ccacgggctg gcaagggagc gcagcgaccg cgcagggcga agcccggaga gcaagcccgt 6663

agggcgccgc agccgccgta ggcggtcacg actttgcgaa gcaaagtcta gtgagtatac 6723

tcaagcattg agtggcccgc cggaggcacc gccttgcgct gcccccgtcg agccggttgg 6783

acaccaaaag ggaggggcag gcatggcggc atacgcgatc atgcgatgca agaagctggc 6843

gaaaatgggc aacgtggcgg ccagtctcaa gcacgcctac cgcgagcgcg agacgcccaa 6903

cgctgacgcc agcaggacgc cagagaacga gcactgggcg gccagcagca ccgatgaagc 6963

gatgggccga ctgcgcgagt tgctgccaga gaagcggcgc aaggacgctg tgttggcggt 7023

cgagtacgtc atgacggcca gcccggaatg gtggaagtcg gccagccaag aacagcaggc 7083

ggcgttcttc gagaaggcgc acaagtggct ggcggacaag tacggggcgg atcgcatcgt 7143

gacggccagc atccaccgtg acgaaaccag cccgcacatg accgcgttcg tggtgccgct 7203

gacgcaggac ggcaggctgt cggccaagga gttcatcggc aacaaagcgc agatgacccg 7263

cgaccagacc acgtttgcgg ccgctgtggc cgatctaggg ctgcaacggg gcatcgaggg 7323

cagcaaggca cgtcacacgc gcattcaggc gttctacgag gccctggagc ggccaccagt 7383

gggccacgtc accatcagcc cgcaagcggt cgagccacgc gcctatgcac cgcagggatt 7443

ggccgaaaag ctgggaatct caaagcgcgt tgagacgccg gaagccgtgg ccgaccggct 7503

gacaaaagcg gttcggcagg ggtatgagcc tgccctacag gccgccgcag gagcgcgtga 7563

gatgcgcaag aaggccgatc aagcccaaga gacggcccga g 7604

<210>2

<211>232

<212>PRT

<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<400>2

Met Lys Lys Leu Ile Gly Arg Leu Cys Gln Gly Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Cys Ser Met Ser Leu Gly Ala Cys Ser Thr Gly Pro Glu Met Ala

20 25 30

Ser Ser Leu Pro His Pro Asp Pro Leu Ala Met Ser Thr Val Gln Pro

35 40 45

Glu Tyr Arg Leu Ala Pro Gly Asp Leu Leu Leu Val Lys Val Phe Gln

50 55 60

Ile Asp Asp Leu Glu Arg Gln Val Arg Ile Asp Gln Asn Gly His Ile

65 70 75 80

Ser Leu Pro Leu Ile Gly Asp Val Lys Ala Ala Gly Leu Gly Val Gly

85 90 95

Glu Leu Glu Lys Leu Val Ala Asp Arg Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Gln

100 105 110

Gln Pro Gln Ile Ser Val Phe Val Gln Glu Ser Asn Gly Arg Arg Val

115 120 125

Thr Val Thr Gly Ala Val Asp Glu Pro Gly Ile Tyr Pro Val Ile Gly

130 135 140

Ala Asn Leu Thr Leu Gln Gln Ala Ile Ala Gln Ala Lys Gly Val Ser

145 150 155 160

Thr Val Ala Ser Arg Gly Asn Val Ile Val Phe Arg Met Val Asn Gly

165 170 175

Gln Lys Met Ile Ala Arg Phe Asp Leu Thr Glu Ile Glu Lys Gly Ala

180 185 190

Asn Pro Asp Pro Glu Ile Tyr Gly Gly Asp Ile Val Val Val Tyr Arg

195 200 205

Ser Asp Ala Arg Val Trp Leu Arg Thr Met Leu Glu Leu Thr Pro Leu

210 215 220

Val Met Val Trp Arg Ala Tyr Arg

225 230

<210>3

<211>472

<212>PRT

<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<400>3

Met Asn Ser Asp Asn Arg Ser Ser Ser Ser Gln Arg His Gly His Leu

1 5 10 15

Glu Leu Ala Asp Val Asp Leu Met Asp Tyr Trp Arg Ala Leu Val Ser

20 25 30

Gln Leu Trp Leu Ile Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala Leu Leu Leu Ala

35 40 45

Phe Gly Ile Thr Met Leu Met Pro Glu Lys Tyr Arg Ala Thr Ser Thr

50 55 60

Leu Gln Ile Glu Arg Asp Ser Leu Asn Val Val Asn Val Asp Asn Leu

65 70 75 80

Met Pro Val Glu Ser Pro Gln Asp Arg Asp Phe Tyr Gln Thr Gln Tyr

85 90 95

Gln Leu Leu Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Ala Val Ile Arg Glu Ala

100 105 110

Lys Leu Asp Gln Glu Pro Ala Phe Lys Glu Gln Val Glu Glu Ala Leu

115 120 125

Ala Lys Ala Ala Glu Lys Asn Pro Glu Ala Gly Lys Ser Leu Asp Ser

130 135 140

Arg Gln Ala Ile Val Glu Arg Ser Leu Thr Asp Thr Leu Leu Ala Gly

145 150 155 160

Leu Val Val Glu Pro Ile Leu Asn Ser Arg Leu Val Tyr Val Asn Tyr

165 170 175

Asp Ser Pro Asp Pro Val Leu Ala Ala Lys Ile Ala Asn Thr Tyr Pro

180 185 190

Lys Val Phe Ile Val Ser Thr Gln Glu Arg Arg Met Lys Ala Ser Ser

195 200 205

Phe Ala Thr Gln Phe Leu Ala Glu Arg Leu Lys Gln Leu Arg Glu Lys

210 215 220

Val Glu Asp Ser Glu Lys Asp Leu Val Ser Tyr Ser Thr Glu Glu Gln

225 230 235 240

Ile Val Ser Val Gly Asp Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ala Gln Asn Leu

245 250 255

Thr Asp Leu Asn Ala Leu Leu Ala Ser Ala Gln Asp Ala Arg Ile Lys

260 265 270

Ala Glu Ser Ala Trp Arg Gln Ala Ser Ser Gly Asp Gly Met Ser Leu

275 280 285

Pro Gln Val Leu Ser Ser Pro Leu Ile Gln Ser Leu Arg Ser Glu Gln

290 295 300

Val Arg Leu Thr Ser Glu Tyr Gln Gln Lys Leu Ser Thr Phe Lys Pro

305 310 315 320

Asp Tyr Pro Glu Met Gln Arg Leu Lys Ala Gln Ile Glu Glu Ser Arg

325 330 335

Arg Gln Ile Asn Gly Glu Val Ile Asn Ile Arg Gln Ser Leu Lys Ala

340 345 350

Thr Tyr Asp Ala Ser Val His Gln Glu Gln Leu Leu Asn Asp Arg Ile

355 360 365

Ala Gly Leu Arg Ser Asn Glu Leu Asp Leu Gln Ser Arg Ser Ile Arg

370 375 380

Tyr Asn Met Leu Lys Arg Asp Val Asp Thr Asn Arg Gln Leu Tyr Asp

385 390 395 400

Ala Leu Leu Gln Arg Tyr Lys Glu Ile Gly Val Ala Ser Asn Val Gly

405 410 415

Ala Asn Asn Val Thr Ile Val Asp Thr Ala Asp Val Pro Thr Ser Lys

420 425 430

Thr Ser Pro Lys Leu Lys Leu Asn Leu Ala Leu Gly Leu Ile Phe Gly

435 440 445

Val Phe Leu Gly Val Ala Val Ala Leu Val Arg Tyr Phe Leu Arg Gly

450 455 460

Pro Ser Pro Arg Ser Arg Leu Asn

465 470

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<400>4

ggaattccat atgttgatgc ccgagaagta c 31

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)

<400>5

cgggatcctc aaaagatcag gcccaacgcg agg

Claims

1.未经巴氏消毒的黄原胶组合物，其来自于过量表达gumB和gumC的细胞，其中，所述组合物包含一群具有3μm以上的分子长度的黄原胶分子，其中，所述的组合物的特性粘度比由不过量表达gumB和gumC的相应菌株产生的黄原胶高至少20％。

2.如权利要求1所述的未经巴氏消毒的黄原胶组合物，其特性粘度比由所述的相应菌株产生的黄原胶高至少25％。

3.如权利要求1所述的未经巴氏消毒的黄原胶组合物，其特性粘度比由所述的相应菌株产生的黄原胶高至少30％。

4.黄原胶组合物，其包含一群具有分子长度范围的黄原胶分子，其中，所述群中至少1％的黄原胶分子具有至少3μm的长度，所述长度用原子力显微术测定。

5.如权利要求4所述的黄原胶组合物，其中所述群中至少5％的黄原胶分子具有至少3μm的长度，所述长度用原子力显微术测定。

6.黄原胶组合物，其包含一群具有分子长度范围的黄原胶分子，其中，所述群中至少1％的黄原胶分子具有至少4μm的长度，所述长度用原子力显微术测定。

7.如权利要求6所述的黄原胶组合物，其中所述群中至少1％的黄原胶分子具有至少5μm的长度。

8.如权利要求6所述的黄原胶组合物，其中所述群中至少1％的黄原胶分子具有至少7μm的长度。

9.黄原胶组合物，其包含一群具有分子长度范围的黄原胶分子，其中，所述组合物中黄原胶分子的总质量的至少5％是归因于分子长度大于3μm的黄原胶分子，所述长度用原子力显微术测定。

10.如权利要求9所述的黄原胶组合物，其中，所述组合物中黄原胶分子的总质量的至少10％是归因于分子长度大于3μm的黄原胶分子，所述长度用原子力显微术测定。

11.如权利要求9所述的黄原胶组合物，其中，所述组合物中黄原胶分子的总质量的至少15％是归因于分子长度大于3μm的黄原胶分子，所述长度用原子力显微术测定。

12.如权利要求9所述的黄原胶组合物，其中，所述组合物中黄原胶分子的总质量的至少20％是归因于分子长度大于3μm的黄原胶分子，所述长度用原子力显微术测定。

13.食物产品，其包含权利要求1所述的黄原胶组合物。

14.食物产品，其包含权利要求4所述的黄原胶组合物。

15.食物产品，其包含权利要求6所述的黄原胶组合物。

16.食物产品，其包含权利要求9所述的黄原胶组合物。

17.权利要求13、14、15或16所述的食物产品，其中所述食物选自色拉调味剂、糖浆、果汁饮料和冷冻甜点。

18.印刷染料，其包含权利要求1所述的黄原胶组合物。

19.印刷染料，其包含权利要求4所述的黄原胶组合物。

20.印刷染料，其包含权利要求6所述的黄原胶组合物。

21.印刷染料，其包含权利要求9所述的黄原胶组合物。

22.石油钻井液，其包含权利要求1所述的黄原胶组合物。

23.石油钻井液，其包含权利要求4所述的黄原胶组合物。

24.石油钻井液，其包含权利要求6所述的黄原胶组合物。

25.石油钻井液，其包含权利要求9所述的黄原胶组合物。

26.陶瓷釉，其包含权利要求1所述的黄原胶组合物。

27.陶瓷釉，其包含权利要求4所述的黄原胶组合物。

28.陶瓷釉，其包含权利要求6所述的黄原胶组合物。

29.陶瓷釉，其包含权利要求9所述的黄原胶组合物。

30.药物组合物，其包含权利要求1所述的黄原胶组合物。

31.药物组合物，其包含权利要求4所述的黄原胶组合物。

32.药物组合物，其包含权利要求6所述的黄原胶组合物。

33.药物组合物，其包含权利要求9所述的黄原胶组合物。

34.如权利要求30所述的药物组合物，其是受控释放制剂。

35.如权利要求31所述的药物组合物，其是受控释放制剂。

36.如权利要求32所述的药物组合物，其是受控释放制剂。

37.如权利要求33所述的药物组合物，其是受控释放制剂。

38.如权利要求34所述的药物组合物，其是受控释放制剂。

39.生产黄原胶聚合物制备物的方法，所述的黄原胶聚合物制备物相比起由野生型菌株产生的黄原胶聚合物制备物具有增加的粘度，所述方法包括：

在野油菜黄单胞菌培养物中，选择性增加gumB和gumC基因产物的数量，而不增加orfX的基因产物的数量，也不增加选自gumD-gumG的基因的基因产物的数量，从而由所述培养物产生更高粘度的黄原胶聚合物制备物。

40.如权利要求39所述的方法，其中，所述选择性增加的步骤，是通过将一个或多个额外的gumB和gumC拷贝导入野油菜黄单胞菌来完成的。

41.如权利要求39所述的方法，其中，所述选择性增加的步骤，是通过将一个或多个额外的gumB和gumC拷贝导入野油菜黄单胞菌，而不导入gumD-gumG的额外拷贝来完成的。

42.如权利要求39所述的方法，其中，所述选择性增加的步骤，是通过将一个或多个额外的gumB和gumC拷贝导入野油菜黄单胞菌，而不导入orfX和gumD-gumG的额外拷贝来完成的。

43.如权利要求40所述的方法，其中，所述的额外拷贝位于染色体外遗传元件上。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述的染色体外遗传元件是质粒。

45.如权利要求44所述的方法，其中，所述质粒是广宿主范围的质粒。

46.如权利要求40到42中任一项所述的方法，其中，额外的gumB和gumC拷贝被整合到野油菜黄单胞菌的基因组中。

47.如权利要求39所述的方法，其中，所述选择性增加的步骤，是通过使用诱导型启动子和诱导剂来诱导gumB和gumC表达而完成的，所述诱导剂增加所述诱导型启动子指导的表达。

48.如权利要求39所述的方法，进一步包括从所述制备物中回收更高粘度的黄原胶聚合物的步骤。

49.如权利要求39所述的方法，进一步包括从所述的更高粘度的黄原胶聚合物制备物中沉淀出黄原胶聚合物的步骤。

50.生产黄原胶聚合物制备物的方法，所述黄原胶聚合物制备物相比起由野生型菌株产生的黄原胶聚合物制备物具有增加的粘度，所述方法包括：

将野油菜黄单胞菌菌株在产生黄原胶聚合物的条件下，培养在培养基中，其中，所述菌株相比起野生型菌株选择性地产生更多的gumB和gumC基因产物，而不产生更多的orfX和选自gumD-gumG的基因产物。

51.如权利要求50所述的方法，其中，对于每一拷贝的gumD，所述菌株具有一个以上拷贝的gumB和gumC。

52.如权利要求50所述的方法，其中，对于每一拷贝的gumD-gumG，所述菌株具有一个以上拷贝的gumB和gumC。

53.如权利要求50所述的方法，其中，对于选自gumD-gumG的基因的每一拷贝，所述菌株具有一个以上拷贝的gumB和gumC。

54.如权利要求50所述的方法，其中，对于每一拷贝的orfX，所述菌株具有一个以上拷贝的gumB和gumC。

55.如权利要求50所述的方法，其中，对于每一拷贝的orfX和gumD-gumG，所述菌株具有一个以上拷贝的gumB和gumC。

56.如权利要求50所述的方法，其中，所述菌株携带一个或多个质粒，所述质粒总共携带至少一个拷贝的gumB和gumC。

57.如权利要求50所述的方法，进一步包括从培养基中回收更高粘度的黄原胶聚合物的步骤。

58.如权利要求50所述的方法，进一步包括从培养基中沉淀黄原胶聚合物的步骤。

59.未经巴氏消毒的黄原胶组合物，其来自于过量表达gumB和gumC的细胞，其中，所述组合物包含一群具有3μm以上的分子长度的黄原胶分子，其中，所述的组合物的耐海水粘度比由不过量表达gumB和gumC的相应菌株产生的黄原胶高至少10％。

60.如权利要求59所述的黄原胶组合物，当所述的耐海水粘度是在每1升去离子水含41.95g海盐的溶液中，在0.86g黄原胶/升的浓度下进行测量时，所述耐海水粘度DR＞25。

61.如权利要求59所述的黄原胶组合物，其耐海水粘度比由不过量表达gumB和gumC的相应菌株产生的黄原胶高至少15％。

62.石油钻井液，其包含权利要求59所述的黄原胶组合物。

63.石油钻井液，其包含权利要求61所述的黄原胶组合物。