JP2011067205A - 高粘度キサンタンポリマー調製物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Xanthomonas campestris培養物中で、orfXではなく、gumD〜gumGからなる群より選択される遺伝子でもないgumBおよびgumCの遺伝子産物の量を選択的に増加させることからなる。増加させる方法は、gumBおよびgumCの1つまたは複数の追加コピーを導入することからなる。
【選択図】なし
Description
本発明は微生物生産物の分野に関する。特に、様々な工業目的のために改善された特性を有する微生物生産物に関する。
キサンタンの化学構造は、主鎖の交互のグルコース残基に付着した、マンノース、グルクロン酸およびマンノースからなる三糖側鎖を有する直線セルロース(1→4)-β-D-グルコースポリマーから構成される。(Milas and Rinaudo、Carbohydrate Research、76、189-196、1979(非特許文献1))。このように、キサンタンは五糖繰り返しユニットを有する分枝鎖ポリマーとして記述することができ;通常のキサンタンは典型的には、2000〜3000の五糖繰り返しユニットを有する。キサンタンポリマーは典型的は、マンノース残基のアセチル化およびピルビル化(pyruvylation)により修飾される。
オペロンにおいて他の遺伝子に比べgumBおよびgumC遺伝子産物が過剰発現すると、1重量を基本に、より高い粘度を有するキサンタン産物が得られることは本発明者らの発見である。出願人はいずれの特別な動作理論にも縛られることは望まないが、一定の遺伝子産物の比率がシフトするとキサンタンポリマー分子のサイズ分布がシフトすると考えられる。キサンタンが野生型細胞により産生される場合に比べ、かなりの数の分子の分子長が長くなる。これらのより長い分子により、集団または調製物の粘度が高くなる。
X.カンペストリスの完全なgum遺伝子領域を保有する断片を単離するために、野生型X.カンペストリス株、NRRL B-1459(1)のゲノムライブラリを、Sau3AIにより部分的に消化した総DNAのクローニングにより、宿主範囲の広いコスミドベクターpRK311(2)を用いて構築した。このライブラリは、全体として、大腸菌(E.coli)S17-1(3)〜Gum- X.カンペストリス突然変異体2895(4)に一致した。pIZD15-261(5)と呼ばれるいくつかのムコイド接合完了体(mucoid exconjugant)から単離したコスミドの1つは、完全gum領域を包含する16kbの断片を含む。グラフ表示の図1、およびオペロンの遺伝子のリストの表1を参照のこと。
* 遺伝子位置は、da Silva、A.C.R.ら(Nature、Vol. 417、pg.459-463、2002)により記述されているように、X.カンペストリスpv.カンペストリスATCC33913(GenBank寄託:AE008922)の遺伝子配列に従う
この研究で使用した株およびプラスミドを表2に示す。大腸菌(E.coli)株は37℃のLuria-Betani培地で増殖させた。X.カンペストリス株はTY(トリプトン5g、酵母抽出物3g、およびH2O 1リットルにつきCaCl2 0.7g)またはYM培地(12)、28℃で増殖させた。Sigma(St.Louis、Mo.)からの抗生物質を、必要に応じて下記濃度(μg/mL)で補った:X.カンペストリスでは、ゲンタマイシン、30;およびテトラサイクリン、10;大腸菌では、ゲンタマイシン、10;カナマイシン、30;アンピシリン、100;およびテトラサイクリン、10。
大腸菌およびX.カンペストリス由来のプラスミドDNAを、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、ヒルデン、ドイツ)を用いて調製した。DNA制限、アガロースゲル電気泳動およびクローニング手順を、確立したプロトコル(13)に従い実施した。全ての構築物をDNA配列決定により検証した。プラスミドDNAを、Bio-Rad(リッチモンド、カリフォルニア州)により指示されているようにエレクトロポレーションにより大腸菌およびX.カンペストリス細胞に導入した(使用パラメータ:大腸菌:200Ω、25μF、2500V、およびX.カンペストリス:1000Ω、25μF、2500V)。
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、MacVector Sequence Analysis Software(Oxford Molecular Limited、ケンブリッジ、英国)を用いて分析した。
ウエスタン分析により、gumBおよびgumC遺伝子産物が、gumBおよびgumCの余分なコピーを有するX.カンペストリス株で過剰発現されることが確認された。図2を参照のこと。
gumBおよびgumC遺伝子の多重、プラスミドコードコピーを有する(XWCM1/pBBR5BC)、ならびに有さない(XWCM1)X.カンペストリス株から調製したキサンタン試料を比較した。炭素源としてブドウ糖を使用したフラスコ発酵物を振盪し、これらの株からキサンタンを得た。
精製キサンタン試料について低せん断速度粘度測定を実施した。LSRVを測定するのに使用した手順の詳細を以下に示す。対照株由来のキサンタンに比べ、gumBおよびgumCの複数コピーを有する株由来のキサンタンに対する粘度の増加が観察された。データから、鎖長の増加にはgumBおよびgumC両方の過剰発現が必要であること;gumBまたはgumCいずれかの単独の過剰発現では鎖長増加には不十分であることが示唆される。
1. 標準(合成)生水(1000ppmのNaClおよび40ppmのCa++または147ppmのCaCl2.2H2Oを含む水):適した容器に入れた20リットルの蒸留水に試薬グレードのNaCl 20gおよび試薬グレードのCaCl2.2H2O 2.94mgを溶解することにより調製する。
2. 0.01gmまで正確に測定することができる天秤。
3. Brookfield LV粘度計、スピンドル#1、およびスピンドルGuard。
4. 標準の実験室用ガラス器具。
5. 標準の実験室用撹拌ベンチ。RAE撹拌モーター(C25U)および3ブレードプロペラを備えた撹拌シャフト(5/16'')は置換してもよい。
1. 600mlのBerzelius(背の高い形態)ビーカーに秤量した合成生水299mlに、生成物0.75gm(0.001gmの位まで秤量)を、800ppmで撹拌しながら、徐々に添加する。
2. 800rpmで4時間撹拌した後、溶液を撹拌ベンチから取り出し、30分間放置する。
3. 温度を室温に調節し、3rpmでNo.1スピンドルを備えたBrookfield LV粘度計を用いて粘度を測定する。スピンドルを3分間回転させた後、粘度を記録する。
細胞溶解物をウエスタンブロットおよび免疫検出分析にかけ、プラスミドによりコードされたGumBおよびGumCレベルを明確にした。4つの独立したブロットを分析した。同じ試料に対する絶対値は各定量において再現性がなかったが、試料間の相対量は全ての測定において同じままであった。
GumCタンパク質のアミノ酸残基53-447をコードする1184bpのDNA断片を、PCR増幅により作製した。下記プライマーを使用した。
PCR産物をNdeIおよびBamHIを用いて消化し、pET22b(+)にサブクローニングし、得られたプラスミド(pET-C)を大腸菌株BL21(DE3)に導入した。
gumBおよびgumC遺伝子を含む3141bp断片を、pIZD15-261のBamHI(#318および#3459)を用いた部分消化により得、BamHIで消化したpRK404にクローニングし、プラスミドpFD5を得た。pGum02-19をEcoRI(#1979)およびBamHI(#3459)で消化して1480bp断片を単離し、同じ酵素であらかじめ消化したpBBR1MCS-5にクローニングし、pBBR-promCを得た。MCS内のHindIIIおよびEcoRI(#1979)でpGum02-19を消化して1233bp断片を得、これをpBBR1MCS-5にクローニングし、プラスミドpBBR5-Bを得た。
プラスミドをエレクトロポレーションにより親株PRM-1に導入した。得られた株を28℃、YM培地、250rpmで中間対数期まで増殖させた。遠心分離により細胞を収集し、生体重を決定した。ペレットを10mM Tris/HCl、10mM EDTA(pH 8.0)で2度洗浄しエキソポリサッカライドを除去し、同じ緩衝液中に100mg/mlの濃度で再懸濁させた。50μlの各試料に100μlの緩衝液A(10mM Tris/HCl、10mM EDTA(pH8.0)、1.5% SDS)を添加した後、混合物を室温で10分間、その後、100℃で12分間インキュベートした。細胞溶解物を14000xg(Eppendorf 5415C)で5分間遠心分離にかけ、収集した上清を総タンパク質抽出物と名付けた。各溶解物のタンパク質濃度を、SDSの存在下、標準としてBSAを使用し、Markwell法((1978)「A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples.」Anal Biochem 87(1)、206-10)により決定した。
細胞溶解物(30μg/レーン)を試料緩衝液(125mM Tris/HCl、pH 6.8;4% SDS、20mM DTT、0.05% ブロモフェノールブルー、20% グリセロール)と混合し、2分間沸騰させた。Schaggerおよびvon Jagowの方法((1987)「Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100kDa.」Analytical Biochemistry 166(2)、368-79)に従い、SDS-10%ポリアクリルアミドゲルによりタンパク質を分離した。Immobilon-P膜(PVDF、Millipore)への半乾燥転写システム(Hoefer Semiphor unit)を用いエレクトロブロッティングを実施した。転写は10mM CAPS(pH11)、10%(v/v)メタノールを含む緩衝液中で、30分間、2.5mA/cm2のゲル表面積で実施した。エレクトロトランスファー(electrotransfer)の完了後直ちに、ブロットを0.5% Ponceau-Sレッドで染色し、トランスファーの質を評価し、Milli-Q(登録商標)-グレード水で洗浄した。ブロットを一晩中、4℃で、5%の脱脂乳粉末を含むTBST(150mM NaCl、10mM Tris/HCl pH8、0.05% Tween-20)(Harlow & Lane、上記)でブロックし、その後、抗GumB(1:3000)または抗GumC(1:5000)抗体と共に3%の脱脂乳粉末を含むTBST中、室温で3時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgGまたは抗ウサギIgG(Sigma)をそれぞれ、製造者により記述されているように、検出に使用した。ブロットを3度TBSTで洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム-5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(NBT/BCIP、Promega)を含む溶液中で展開させた。市販のタンパク質マーカーMW-SDS-70L(Sigma)を使用してSDS-PAGEの較正を実施した。
GumBおよびGumCタンパク質バンドの強度を、NBT/BCIP発現フィルターをUVPデンシトメーター(Ultra Violet Products)で走査することにより決定し、GelWorks 1D Analysis software(NonLinear Dynamics Ltd)を用いて定量化した。各フィルターは、野生型細胞における染色体にコードされたGumBおよびGumCのレベルを確立するためにPRM-1(pBBR-prom)抽出物の基準レーンを含んだ。相対量のGumBおよびGumCを観察した。図2Aおよび2Bを参照のこと。
分子間力顕微鏡観察法(AFM)または走査型プローブ顕微鏡観察法(SPM)と呼ばれる直接可視化技術を使用して、gumBおよびgumCの多重コピーを有する(XWCM1/pBBR5-BC)、有さない(XWCM1)X.カンペストリス株由来のキサンタン分子の長さを画像化した。AFMを実施するために使用した手順の詳細を以下に示す。本発明者らは、gumBおよびgumCの多重コピーを有する株により産生されたキサンタン分子の平均分子輪郭長(contour length)が、親株のものよりずっと長いことを観察した。
XWCM1/pBBR5-BC株により産生されたキサンタンを、市販のキサンタン製品(Xanvis(商標))と比較し、海水粘度(SWV)に対し評価した。Xanvis(商標)キサンタン製品に対する典型的なSWVは18〜22の範囲である。
Claims (63)
- gumBおよびgumCを過剰発現する細胞に由来し、gumBおよびgumCを過剰発現しない対応株由来のキサンタンよりも少なくとも20%高い固有粘度を有する、未殺菌キサンタン組成物。
- 対応株由来のキサンタンよりも少なくとも25%高い固有粘度を有する、請求項1記載の未殺菌(unpasteurized)キサンタン組成物。
- 対応株由来のキサンタンよりも少なくとも30%高い固有粘度を有する、請求項1記載の未殺菌キサンタン組成物。
- 一定範囲の分子長を有するキサンタン分子の集団を含み、その集団の少なくとも1%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、少なくとも3umの長さを有する、キサンタン組成物。
- 集団の少なくとも5%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、少なくとも3umの長さを有する、請求項4記載の方法。
- 一定範囲の分子長を有するキサンタン分子の集団を含み、その集団の少なくとも1%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、少なくとも4umの長さを有する、キサンタン組成物。
- 集団の少なくとも1%が、少なくとも5umの長さを有する、請求項6記載のキサンタン組成物。
- 集団の少なくとも1%が、少なくとも7umの長さを有する、請求項6記載のキサンタン組成物。
- 一定範囲の分子長を有するキサンタン分子の集団を含むキサンタン組成物であって、その組成物中のキサンタン分子の総質量の少なくとも5%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、3umを超える分子長を有するキサンタン分子によるものである、組成物。
- 組成物中のキサンタン分子の総質量の少なくとも10%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、3umを超える分子長を有するキサンタン分子によるものである、請求項9記載のキサンタン組成物。
- 組成物中のキサンタン分子の総質量の少なくとも15%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、3umを超える分子長を有するキサンタン分子によるものである、請求項9記載のキサンタン組成物。
- 組成物中のキサンタン分子の総質量の少なくとも20%が、原子間力顕微鏡観察法により測定すると、3umを超える分子長を有するキサンタン分子によるものである、請求項9記載のキサンタン組成物。
- 請求項1記載のキサンタン組成物を含む食品。
- 請求項4記載のキサンタン組成物を含む食品。
- 請求項6記載のキサンタン組成物を含む食品。
- 請求項9記載のキサンタン組成物を含む食品。
- サラダドレッシング、シロップ、ジュース飲料、および冷菓からなる群より選択される、請求項1、4、6、または9のいずれか一項記載の食品。
- 請求項1記載のキサンタン組成物を含む印刷染料。
- 請求項4記載のキサンタン組成物を含む印刷染料。
- 請求項6記載のキサンタン組成物を含む印刷染料。
- 請求項9記載のキサンタン組成物を含む印刷染料。
- 請求項1記載のキサンタン組成物を含む油掘削流体。
- 請求項4記載のキサンタン組成物を含む油掘削流体。
- 請求項6記載のキサンタン組成物を含む油掘削流体。
- 請求項9記載のキサンタン組成物を含む油掘削流体。
- 請求項1記載のキサンタン組成物を含むセラミック釉薬。
- 請求項4記載のキサンタン組成物を含むセラミック釉薬。
- 請求項6記載のキサンタン組成物を含むセラミック釉薬。
- 請求項9記載のキサンタン組成物を含むセラミック釉薬。
- 請求項1記載のキサンタン組成物を含む薬学的組成物。
- 請求項4記載のキサンタン組成物を含む薬学的組成物。
- 請求項6記載のキサンタン組成物を含む薬学的組成物。
- 請求項9記載のキサンタン組成物を含む薬学的組成物。
- 放出制御製剤である、請求項30記載の薬学的組成物。
- 放出制御製剤である、請求項31記載の薬学的組成物。
- 放出制御製剤である、請求項32記載の薬学的組成物。
- 放出制御製剤である、請求項33記載の薬学的組成物。
- 放出制御製剤である、請求項34記載の薬学的組成物。
- 以下の段階を含む、野生型株により産生されるものに比べ粘度が増大しているキサンタンポリマー調製物を産生する方法:
キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)培養物中で、orfXではなく、gumD〜gumGからなる群より選択される遺伝子でもないgumBおよびgumCの遺伝子産物の量を選択的に増加させる段階であって、高粘度キサンタンポリマー調製物は培養物により産生される段階。 - 選択的に増加させる段階が、キサントモナス・カンペストリスに、gumBおよびgumCの1つまたは複数の追加のコピーを導入することにより実施される、請求項39記載の方法。
- 選択的に増加させる段階が、キサントモナス・カンペストリスに、gumD〜gumGではないgumBおよびgumCの1つまたは複数の追加のコピーを導入することにより実施される、請求項39記載の方法。
- 選択的に増加させる段階が、キサントモナス・カンペストリスに、orfXではなく、gumD〜gumGでもないgumBおよびgumCの1つまたは複数の追加のコピーを導入することにより実施される、請求項39記載の方法。
- 追加のコピーが染色体外遺伝因子上にある、請求項40記載の方法。
- 染色体外遺伝因子がプラスミドである、請求項43記載の方法。
- プラスミドが宿主範囲の広いプラスミドである、請求項44記載の方法。
- 追加のコピーがキサントモナス・カンペストリスのゲノムに組み込まれる、請求項39記載の方法。
- 選択的に増加させる段階が、誘導プロモータと、誘導プロモータからの発現を増加させる誘導物質とを使用してgumBおよびgumCの発現を誘導することにより実施される、請求項39記載の方法。
- 調製物から、より高粘度のキサンタンポリマーを回収する段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
- より高粘度のキサンタンポリマー調製物からキサンタンポリマーを沈澱させる段階をさらに含む、請求項39記載の方法。
- 以下の段階を含む、野生型株により産生されるものに比べ粘度が増大しているキサンタンポリマー調製物を産生する方法:
培地中、キサンタンポリマーを産生する条件下でキサントモナス・カンペストリス株を培養する段階であって、野生型株に比べ、株が、orfXではなく、gumD〜gu
mGからなる群より選択される遺伝子でもないgumBおよびgumCの遺伝子産物を選択的により多く産生する段階。 - 株が、gumD 1コピーあたり、1コピーを超えるgumBおよびgumCを有する、請求項50記載の方法。
- 株が、gumD〜gumG 1コピーあたり、1コピーを超えるgumBおよびgumCを有する、請求項50記載の方法。
- 株が、gumD〜gumGからなる群より選択される遺伝子1コピーあたり、1コピーを超えるgumBおよびgumCを有する、請求項50記載の方法。
- 株が、orfX 1コピーあたり、1コピーを超えるgumBおよびgumCを有する、請求項50記載の方法。
- 株が、orfXおよびgumD〜gumG 1コピーあたり、1コピーを超えるgumBおよびgumCを有する、請求項50記載の方法。
- 株が、凝集して少なくとも1コピーのgumBおよびgumCを保有する1つまたは複数のプラスミドを保有する、請求項50記載の方法。
- 培地から、より高粘度のキサンタンポリマーを回収する段階をさらに含む、請求項50記載の方法。
- 培地からキサンタンポリマーを沈澱させる段階をさらに含む、請求項50記載の方法。
- gumBおよびgumCを過剰発現する細胞に由来し、gumBおよびgumCを過剰発現しない対応株由来のキサンタンよりも少なくとも10%高い海水粘度を有する、未殺菌キサンタン組成物。
- 脱イオン水1リットルあたり海塩41.95g、キサンタン濃度0.86g/lの溶液中で海水粘度を測定すると、DR>25の海水粘度を有する、請求項59記載のキサンタン組成物。
- gumBおよびgumCを過剰発現しない対応株由来のキサンタンよりも少なくとも15%高い海水粘度を有する、請求項59記載のキサンタン組成物。
- 請求項59記載のキサンタン組成物を含む油掘削流体。
- 請求項61記載のキサンタン組成物を含む油掘削流体。
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