CN100536939C - 含有培养的软骨细胞的植入物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

为了再生人和动物体的关节缺陷，本发明提供一种可置于关节区中的植入物。该植入物由一种支持体组成，更确切地说由来自人或动物的松质骨制成，该植入物具有渗透通道，并且在一部分区域被一种(软骨)细胞悬浮液所浸渗。该悬浮液渗入到支持体的空腔中，该空腔的数量最好附加地通过除去脂肪、细胞、结缔组织、血通道等而被增加，并且软骨细胞在空腔中繁殖，由此形成一种新的软骨组织。

Description

含有培养的软骨细胞的植入物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于再生人或动物体中关节缺陷(Gelenksdefekt)的新型植入物或这种类型的植入体，该植入物或植入体由一个支持体构成，该支持体由一种与身体相容的、具有孔结构、细胞结构或海绵结构的材料制成，尤其是由来自人或动物的松质骨制成，并且至少一部分是可被组织细胞悬浮液浸渗的或已被其浸渗；本发明还涉及该新型植入物的制备方法，以及其用于上述目的的应用。
背景技术
已知由自身细胞培养软骨组织用于再生关节缺陷。这可通过来自健康软骨切片的活组织检查进行，但也可由间叶细胞的干细胞(例如来自骨髓)分化得到。所述培养通常在液态培养基中进行。植入通常以加入细胞悬浮液的形式进行，这带来很大的技术问题，也损失掉软骨细胞，并使结果恶化。
在此，现在对植入物或移植物领域的背景技术作简短描述：
DE 40 40 872 A1公开了一种可植入牙床中的组织载体，其中为了再生牙周韧带(Desmodont)，在其上涂覆人工繁殖的结缔组织类细胞，该细胞具有牙周韧带特性。作为组织载体，在此可使用内生(enossal)植入物(一种平的、特别是膜状的载体)、骨或骨替代材料、或者这些材料的一种复合物。所述涂覆的细胞来自患者自己的组织、捐献者的组织或自培养的细胞系(Zelllinie)，其中，包括牙周韧带细胞或细胞，在植入组织载体后，这些细胞分化为具有牙周韧带性质的组织。
关于引入相应的细胞悬浮液的问题，如已知的该问题在实际中一再出现，不过此问题在该文献中没有报道，因此也不可能开始解决这样的问题。
根据DE 961 654 A，用于预制适合移植的骨的方法基本上也适合于此，其中用细胞浸渗骨组织并不很重要，而是更在于在除去自身内部和外部的软组织、脂肪物质和血色素的情况下预制骨材料，其中按如下方法进行：用去蛋白剂、例如至少10％的H2O2溶液或胰蛋白酶溶液对骨进行处理。
DE 41 21 043 A1涉及一种骨替代材料，该材料是在一种多孔的基质上含有一种或多种具有成纤维细胞生长因子的生物活性的多肽。其中描述的治愈行为相应于自骨移植物。
以上提出的在骨替代材料中引入细胞材料的类似问题以及解决该问题的途经在该文中同样没有提及。
最后，US 4,553,272涉及一种基于植入物的用于人体组织的修复材料，其中提供一种孔状的或由细胞构成的该材料的内部结构，其中从表面开始孔或细胞的尺寸逐渐增大。该US-A也没有提出类似本发明的对细胞的、多孔的或海绵状材料的浸渗问题的解决方案。
发明内容
本发明的任务是提供一种植入物，该植入物具有尽可能类似人体性质的天然组织，并确保与周围的组织、特别是软骨下(也叫位于软骨下)的骨良好地结合。
为实现该任务，本发明使用一种支持体，该支持体由一种与身体相容的、具有孔状结构或海绵状结构的材料制成、尤其是由一种来自人或动物的松质骨制成，该松质骨至少一部分被软骨细胞悬浮液所浸渗。
因此，本发明提供了一种用于再生人或动物体中的关节缺陷的植入物，该植入物构造成具有支持体，该支持体由一种与身体相容的、具有孔结构或海绵结构的材料制成，并且至少一部分可被组织细胞的悬浮液浸渗、或已被其浸渗，其特征在于，该支持体具有一个至少从其表面的一个部分区域开始并在其内部结束的通道，用于渗透为再生而准备的组织细胞悬浮液。
根据本发明的一个优选实施例，用软骨组织的悬浮液来浸渗支持体。
这种支持体具有以下优点，其易于获得并具有三维结构，为细胞繁殖提供理想的形态学条件。借助这种预制的支持体，可将植入物或移植物准确地植入关节区域需治疗的缺陷处，并且在肯定不改变位置或不损失细胞的情况下进行固定。
为了保证用细胞悬浮液理想地浸渗支持体，在由其开始有治疗缺陷作用的那个区域、也就是支持体表面的一个相应部分区域带有从那开始的通道，用于渗透细胞悬浮液。
根据一个优选实施例，伸入到所述新型植入物中的渗透通道的直径优选为约300至500μm。可通过简单方式机械地借助钻孔或铣削、借助激光束或借助高压水射束进行制备。
有利的是，支持体只在部分区域、即在形成或再制得软骨的地方用细胞悬浮液、优选用软骨细胞悬浮液所浸渗。
特别优选的是，植入体中的尖圆锥状的渗透通道。已经发现，通过该结构可实现：在用软骨组织细胞悬浮液渗透支持体时在其表面附近区域中海绵状骨材料的浸渍比渗透通道逐渐变细的下端部区域中浸渍得更强。由于该通道的圆锥状设计，因此可以保证悬浮液浸渗的强度连续渐变，致使在表面区域中形成的软骨组织比通道末端区域中的要多，并且在植入物中向其内部所述软骨组织的份额呈梯度地连续减少，因此，实现从“占优势的软骨组织”向“占优势的骨组织”的连续过渡，这与自然的比例相应，或者与该自然比例特别接近。
渗透通道的尖圆锥状结构还有一个优点：在以下描述的本发明其它特别优选的实施方案中，有针对地且在本发明的构思内特别有利地对骨组织进行部分脱矿质处理，表面附近的骨材料的脱矿质程度比深度中的骨材料的要强，这同样导致，在植入体表面区域中骨硬质材料的分解要比在渗透通道深度中的更强烈，因此表面区域中的支持体比深度区域中的更具“骨性质”，其中所述“软骨性”朝向支持体内部连续地减小，并且类骨性相应增加，这与关节的真实情况相对应。
这同样适于随后要描述的对培养溶液等的渗透。
根据一个优选实施例，渗透通道的深度只在支持体的一部分厚度或材料厚度上延伸。特别是当渗透通道朝向支持体内部逐渐变细时，则具有以下优点：保证从植入物的软骨份额向骨份额平滑过渡。
根据本发明的另一优选实施方案：所述支持体或植入体呈圆柱体形状，并且渗透通道最好从其顶面或基面开始或者从其端面中的一个开始。
根据一个优选实施例，植入物圆柱体的具有渗透通道的顶面或基面呈凸出状。因此，可以简单且理想地将其固定在相应的圆柱状的骨凹槽中，该凹槽总是与相应于待再生关节几何情况的凸出端面相对应，这样关节的形状是最佳的，并允许以此方式迅速治愈。显然可以证实，支持体的形状还可以分别匹配于待治疗缺陷的其它形状或局部解剖形状。
为了改善软骨生长的条件，特别有利的并且本发明一个特别优选的实施方案的是，无论如何将需用(软骨-)细胞悬浮液浸渗或已浸渗的植入体区域至少部分地进行脱矿质处理，其中尤其在渗透通道呈尖圆锥形的情况下得到的优点是，脱矿质处理随深度而逐渐减小。
本发明另一主题涉及用于使用培养的软骨细胞至少部分地浸渗的如上所述的用于再生人或动物体中的关节缺陷的植入物的制备方法，其特征在于，在支持体中，从其表面的至少一部分区域出发、借助机械钻孔、激光束或加压水射束掏制或深挖出渗透通道，之后支持体至少利用所述部分区域加入到或渗入到含有培养出的软骨细胞的悬浮液中，其中当支持体装入到软骨细胞悬浮液中之后，用低于环境压力的压力或用真空对其进行加载。
渗透通道有助于悬浮液进入到支持体的细胞孔或海绵结构内，并保证在植入体的各个为此设置的部分区域中的完全浸渗。
优选地另外通过以下方式促进细胞悬浮液的进入：将带有渗透通道的支持体浸入细胞悬浮液之后，将支持体置于低压或真空中。
有利的是，在浸渗前至少对支持体的待浸渗的区域进行纯化和/或脱矿质处理。通过所述纯化处理，骨髓组分—如脂肪、不同的其它细胞、结缔组织、血管等被除去，由此增加孔和空腔的数量，其中，例如在加入相应的培养基的情况下，繁殖由细胞悬浮液引入的细胞、特别是软骨细胞。
此外还具有以下优点：借助脱矿质处理，载体的力学性质变成“类软骨的”，同时还改善了软骨细胞生长的条件。
为了预先进行脱矿质处理，至少将支持体的待浸渗的区域放入或浸入到一种脱矿质-介质中，例如盐酸、特别是浓度为约0.5Mol/L的盐酸，其中，优选将支持体置于低压或真空中，由此确保用细胞悬浮液进行特别完全的浸渗。然后通过冲洗而除去脱矿质-介质和其中含有的、从骨排出的盐。
根据一个优选实施例，为了促进各细胞(特别是软骨细胞)附着在支持体中或生长，根据本发明，可以用一种培养基、例如用透明质酸或骨胶原来浸渍所述支持体的待浸渗的区域。在这种情况下，可在浸渗支持体前使用(软骨)细胞悬浮液进行浸渍。
可选择的是：用由一种细胞悬浮液或软骨细胞悬浮液以及一种有利于形成并繁殖细胞的介质(例如透明质酸或骨胶原)组成的一种混合物同时浸渗所述支持体。
本发明的另一基本主题是按本发明制得的植入物的应用。
根据一个优选实施例，在此优选的是渗透通道的布置。
附图说明
在本发明说明性的附图中，示例性地表示出一个本发明的植入物。
具体实施方式
该植入物基于一个支持体1，在图示情况下，该支持体是由来自人或动物的松质骨形成的。在此该支持体呈圆柱体状，其中所述圆柱体状支持体1的端面或顶面2隆起地凸出。渗透通道3从所述凸出的端面2彼此平行地伸向支持体1内部的方向，彼此间的间隔约大于直径尺寸，该渗透通道从支持体1凸出的顶面2开始，朝向支持体1内部的方向尖圆锥状地逐渐变细。通道3的平均直径dm约在300至500μm之间，通道3的彼此间隔例如约为1至3mm。如此选择通道3的深度，使得在植入位置处总能形成所希望的软骨厚度。
通道3的制备可借助一个机械钻孔进行，但也可借助激光束或水射束钻孔。
制得渗透通道后，特别是用0.5mol/l的盐酸对由一种松质骨材料制成的支持体进行纯化和脱矿质处理。
借助一系列的浴槽进行纯化，优选在脱脂溶液中进行，由此将脂肪、各种细胞、结缔组织和血管从骨材料中除去，这样可形成附加的空腔，用于通过所述待渗透的(软骨)细胞进行繁殖。
为了进行脱矿质处理，使支持体1以其具有通道3的端部区域进入到一个盐酸浴槽中，将支持体1置于真空中，由此促进盐酸溶液进入到支持体的细胞结构、孔结构或海绵结构中。选择真空以及脱矿质处理的持续时间，便可得到最佳的、类软骨坚固度的骨。
紧接着，用利一个有利于形成软骨细胞的培养基、例如用透明质酸或骨胶原对这样预处理的支持体1进行浸渍。
所述预处理之后，用利(软骨)细胞悬浮液浸渗支持体1。对于支持体中要形成软骨组织的每个区域都应进行浸渗，将其浸入常用的软骨细胞悬浮液中，该悬浮液含有事先通过活组织检查提取的软骨细胞。在使用相应的培养基时，也可使用间叶细胞的干细胞，例如来自骨髓或来自脐带血的干细胞。
通过采用低压或真空，保证使细胞悬浮液沿着渗透通道进入到小梁-中间腔中。或者可替换的是，也可将同样的细胞悬浮液与各选定的培养基混合，混合物在真空促进下进入支持体。
随后等候支持体的海绵结构吸收悬浮液以及在孔表面上附着。之后确保细胞通过培养基进一步扩大，或者刺激软骨基质的形成和繁殖。不久，所希望的支持体段被软骨组织所充满，所述制备结束。
繁殖过程可以通过附有胶原酶或类似的细胞溶解酶，将小梁结构逐步溶解，使得支持体整个替代部分的最后空间被由细胞形成的软骨基质代替。
这样得到的植入物可在以后植入到缺陷的关节区域中，其中，首先把为了使用植入物而设置的骨加进圆柱状凹槽中，其中装入一个带有滑合座的相应植入体。通过相应地确定骨中支持体圆柱体的尺寸(约0.5至1mm较小的直径)，制得一种具有植入物骨质部分的滑合座。植入物的软骨部分最后准确地装入关节平面中。
本发明的优点再次总结如下：
本发明的基本方面在于，通过该新型方法，首次制得了适合移植目的的自生软骨，其实际上几乎完全相当于自然的。关键在于，在安装时，移植物自身形式就已尽可能具有如自然的关节膜。理所当然的，软骨与其下面的骨固定结合或啮合。用新方法可实现类似的啮合。得到一种移植物，其在安装时已经具有骨-软骨-部分之间自然的比例。新的植入物或移植物在关节表面上是软骨性柔软的，沿深度方向流畅地逐渐过渡到硬骨的材料，这如同自然环境中的情况一样。该流畅的过渡可通过不同程度的脱矿质处理实现，还可通过盐酸的不同强度侵蚀来实现。同样与不同程度地装入细胞悬浮液一样，以上措施也可通过所述的逐渐变细的钻孔通道而实现。

Claims (14)

1.用于再生人或动物体中的关节缺陷的植入物，该植入物构造成具有支持体(1)，该支持体由一种与身体相容的、具有孔结构或海绵结构的材料制成，并且至少一部分可被组织细胞的悬浮液浸渗、或已被其浸渗，其特征在于，该支持体(1)具有一个至少从其表面(2)的一个部分区域开始并在其内部结束的通道(3)，用于渗透为再生而准备的组织细胞悬浮液。
2.根据权利要求1所述的植入物，其特征在于，用一种软骨细胞悬浮液来浸渗所述支持体。
3.根据权利要求1或2所述的植入物，其特征在于，渗透通道(3)为直径为300至500μm的空心圆柱状，或者，渗透通道(3)从支持体(1)的表面(2)开始、向支持体内部的方向是逐渐变细的尖锥体形的或尖截锥状的，并且其平均直径为200至500μm。
4.根据权利要求3所述的植入物，其特征在于，渗透通道(3)的深度是其直径或平均直径的3至10倍。
5.根据权利要求4所述的植入物，其特征在于，渗透通道(3)的深度是其直径或平均直径的5至10倍。
6.根据权利要求1或2所述的植入物，其特征在于，支持体(1)为圆柱状，其中渗透通道(3)至少从其基面和/或顶面开始。
7.根据权利要求6所述的植入物，其特征在于，所述基面和/或顶面凸出式地弯曲。
8.根据权利要求2所述的植入物，其特征在于，该支持体由骨材料制成，并且对所述利用软骨细胞悬浮液浸渗的支持体(1)区域至少部分地进行脱矿质处理。
9.根据权利要求1所述的植入物，其特征在于，所述材料为一种来自人或动物的松质骨。
10。用于使用培养的软骨细胞至少部分地浸渗的根据权利要求1至9之一所述的、用于再生人或动物体中的关节缺陷的植入物的制备方法，其特征在于，在支持体(1)中，从其表面的至少一部分区域出发、借助机械钻孔、激光束或加压水射束掏制或深挖出渗透通道(3)，之后，支持体(1)至少利用所述部分区域加入到或渗入到含有培养出的软骨细胞的悬浮液中，其中当支持体(1)装入到软骨细胞悬浮液中之后，用低于环境压力的压力或用真空对其进行加载。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在浸渗前至少对所述支持体(1)的软骨细胞悬浮液浸渗的区域进行纯化过程处理和/或脱矿质过程处理，其中至少将支持体(1)的待浸渗区域放入到一种含酸的脱矿质介质中，并用一种低于环境压力的压力或用真空进行加载，然后通过冲洗来除去所述脱矿质介质和存在于其中的、由脱矿质处理从支持体材料中排出的盐。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脱矿质介质是0.5N的盐酸。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，在用软骨细胞悬浮液进行浸渗前，至少用一种有利于形成软骨细胞的培养基对于支持体(1)的待浸渗区域进行浸渍；或者，利用由一种软骨细胞悬浮液和一种有利于形成软骨细胞的介质形成的混合物对支持体进行浸渗。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述有利于形成软骨细胞的培养基或介质是透明质酸或骨胶原。
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两种自制支架材料对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响. 戴刚等.第三军医大学学报，第24卷第5期. 2002
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