CN100512746C - 用于体内检测分析物的光学传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

用于体内检测葡萄糖的传感器，包括：葡萄糖分析组分和生物可降解材料的壳，所述分析组分的读出信息是可检测光学信号，当传感器植入体内时可以通过外部光学设备经皮询问该光学信号，所述壳包封所述分析组分同时允许分析物接触所述分析组分，其中生物可降解材料包含具有疏水和亲水单元的共聚物。适当地利用这种传感器来检测葡萄糖的方法，包括将传感器植入哺乳动物的皮肤中、利用外部光学设备经皮检测或测量葡萄糖以及使生物可降解材料降解。

Description

用于体内检测分析物的光学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及传感器、制备该传感器的方法以及使用该传感器的方法。所述传感器可用于利用光学技术测量或监测体液中的葡萄糖。所述传感器特别适合用于必须通过反复进行葡萄糖测量来密切监测葡萄糖水平的情况中，例如在糖尿病管理中。

背景技术

在糖尿病的管理中，为了保证正确的胰岛素剂量，规则地测量血中葡萄糖是重要的。此外，已经证实，在长期治疗的糖尿病患者中，血糖水平的更好控制可以延迟视网膜病、循环系统问题以及通常与糖尿病相关的其他变性疾病的发作，如果不能防止的话。因此需要由糖尿病患者来可靠并准确地自身监测血糖水平。

当前，血糖是糖尿病患者利用市购的比色试条或电化学生物传感器(例如酶电极)来监测的，每一次进行测量时，比色试条或电化学生物传感器均需要规则使用刺血针类(lancet-type)器具来抽取适量的血。平均而言，大多数糖尿病患者将使用这种器具来测量血糖，一天两次。但是，美国国家卫生研究所(US National Institutes ofHealth)建议血糖检测应该一天进行至少四次，该建议已经被美国糖尿病协会(American Diabetes Association)所认可。血糖检测频率的增加给糖尿病患者施加了相当的负担，无论是在资金方面还是在疼痛和不舒适方面，特别是对于必须规则使用刺血针从指尖取血的长期糖尿病患者。因此，显然存在对更好的长期葡萄糖监测系统的需求，该系统不涉及从患者身上抽血。

已经有许多关于不需要从患者身上抽血的葡萄糖测量技术的建议。已经做了许多尝试以构建装置，在这些装置中，酶电极生物传感器被置于插入血管中的针或导管的末端上(Wilkins，E.and Atanasov，P，Med.Eng.Phys(1996)18：273-288)。虽然传感装置本身位于血管内，但是针或导管保持与外部环境连接。实际上，这种装置不适用于人患者，首先是因为针或导管插入血管中造成感染的风险并且还使患者觉得不舒服，因此不适于长期连续使用。第二，这种装置还没有获得用于患者的许可，因为已经有暗示，在针或导管的末端，该装置本身可能是造成血栓流入患者循环系统的原因。这明显地给患者的健康造成非常严重的风险。

Mansouri和Schultz(Biotechnology 1984)、Meadows和Schultz(Anal.Chim.Acta.(1993)280：pp21-30)以及US专利No.4,344,438均描述了用于通过光学设备原位监测血中低分子量化合物的装置。这些装置被设计为插入血管中或被置于皮下，但是需要光纤连接外部光源和外部检测器。而且，这些装置在血管中的定位具有促进血栓形成的相关风险，另外，在一个实施方案中，需要保持光纤与外部环境连接，这对于长期使用是不切实际的并且带有感染风险。

在微创葡萄糖监测技术的研究中，一些注意还集中在利用红外光谱直接测量诸如耳垂或指尖的组织中血管中的血糖浓度，所述组织相对“光透明”并且具有位于接近皮肤表面处的血管(Jaremko，J.and Rorstad，O.Diabetes Care 1998 21：444-450and Fogt，E.J.Clin.Chem.(1990)36：，1573-80)。这种方法显然是微创的，但是由于以下事实而被证明为实用价值很小：血中葡萄糖的红外光谱类似于周围组织的红外光谱，以至于实践中实际不可能分辨这两种光谱。

已经发现，皮下流体中分析物的浓度与血液中所述分析物的浓度相关，因此已有一些利用位于皮下位置处的葡萄糖监测装置的报道。具体地，Atanasov等人(Med.Eng.Phys.(1996)18：pp632-640)描述了使用可植入葡萄糖传感装置(尺寸5.0 x 7.0 x1.5cm)来监测狗的皮下流体中的葡萄糖。该装置由电流葡萄糖传感器、微型稳压器、FM信号发送器和电源组成，并且可以经与基于计算机的数据收集系统连接的天线和接收器来远程询问，而不需要与外部环境连接。但是，大尺寸的这种装置用于人患者明显不切实际。

Ryan J.Russell et al，Analytical Chemistry，Vol.71，Number 15，3126-3132描述了一种基于聚乙二醇的可植入水凝胶，其含有与水凝胶网络化学偶联的异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-葡聚糖)以及四甲基若丹明异硫氰酸酯刀豆素A(concavalin A)，用于皮肤植入。所植入的水凝胶球体将被经皮询问。

R.Ballerstadt et al，Analytica Chemica Acta，345(1997)，203-212公开了一种分析系统，其中两种聚合物(葡聚糖)分子分别用第一和第二荧光团来标记，并通过多价凝集素分子结合在一起，产生猝灭。葡萄糖使凝集素的结合位点饱和，引起两种聚合物的分离，导致荧光的增加。

Joseph R.Lakowicz et al，Analytica Chimica Acta，271，(1993)，155-164描述了调相荧光计的用途。其用基于荧光寿命的测量来取代先前所述技术中教导的基于荧光强度的测量。

荧光寿命可以通过相位和调制技术来测量，通过利用在1～200MHz调制强度的光来激发荧光并测量发射光相对于入射光的相位移和(解)调制。

在WO91/09312中，描述了利用葡萄糖亲和分析的皮下方法和装置，其通过光学设备来远程询问。在WO97/19188中，描述了葡萄糖的可植入分析系统的另一实例，该系统产生可以远程读出的光学信号。在WO91/09312和WO97/19188中所描述的装置在分析化学未能正确进行之后将长时期保持于体内，这对于长期应用来说是主要的缺点。该装置的移除将需要外科方法。

WO03/006992通过提供传感器微粒中的分析来解决该问题，所述传感器微粒足够小，以至于当传感器用完时由巨噬细胞从植入位置除去。WO02/30275提供了用于将传感器微粒注入到上层皮肤中的设备，它们将随着皮肤的生长而从上层皮肤上脱落。

WO 00/02048通过利用生物可降解材料包含分析试剂来解决该问题。公开了多种生物可降解材料。这些材料包括Jeong et al.，Nature 388：pp.860-862的生物可降解嵌段共聚物，其由聚(环氧乙烷)和聚(L-乳酸)的嵌段组成。公开的其他材料是交联蛋白、多糖、聚酸酐、脂肪酸/胆固醇混合物以及红细胞影。

发明内容

本发明人已经确定，为了获得最佳性能，生物可降解材料除了生物可降解之外还应该满足一定的要求：

1.生物可降解材料应该允许快速渗透，使得传感器具有短的响应时间。如果生物可降解材料具有对葡萄糖的高渗透性，则这可以实现。

2.生物可降解材料应该具有分子量截留特性，使得葡萄糖可以扩散通过生物可降解材料以接触分析组分，但是分析组分不能扩散通过生物可降解材料以在身体内自由地到处移动。

WO00/02048中公开的材料不一定提供这些特性。

表现出明显分子量截留特性的聚合物包括衍生纤维素、再生纤维素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、乙烯-乙烯醇共聚物、碳酸酯-醚共聚物、聚丙烯腈和聚砜。但是这些聚合物是生物不可降解的。

生物可降解聚合物通常是疏水材料，例如乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸和聚己内酯。这些材料不允许葡萄糖扩散。

本发明人现已确定，一些具有疏水和亲水单元的共聚物满足上文所提出的全部要求。

因此，在本发明的第一方面，提供用于葡萄糖的体内检测的传感器，包含：

用于葡萄糖分析的组分，分析组分的读出信息是可检测光学信号，当传感器植入体内时可以通过外部光学设备经皮询问该光学信号；和

包封分析组分同时允许分析物接触分析组分的生物可降解材料的壳，其中生物可降解材料包含具有疏水和亲水单元的共聚物。

生物可降解材料形成壳是重要的。共聚物壳优选具有1～100μm的厚度，更优选为1～50μm。

优选的是，共聚物是无规共聚物。使用嵌段共聚物不是优选的，因为这种聚合物通常不具有适当的分子量截留特性。但是，具有下文中提出的分子量限值内的嵌段的嵌段共聚物适合用于本发明。

优选的是，共聚物具有至少5.0×10^-10cm²/s的渗透率。

术语“渗透率”用于指分析物(葡萄糖)通过水合共聚物的总体渗透率，其可以通过实验测量。渗透率与分析物在浸浴传感器的流体和分析物接触分析组分的传感器内部之间达到平衡所花费的时间负相关。因此，渗透率越高，传感器的响应时间越快。在达到95％平衡的过程中，小于5分钟的延迟是理想的。

优选的是，当植入体内时，共聚物在一周到一年的时期内降解，例如30天。对于5μm的典型聚合物厚度，这对应于0.17μm/天的降解速率。降解速率取决于水渗透性(溶胀)以及聚合物的分子量。溶胀越高(对应于高含量的亲水域)，降解越快，并且分子量越大，降解越慢。

优选的是，对于葡萄糖的移动性，生物可降解材料具有不超过25000道尔顿的分子量截留限值。更优选的是，生物可降解材料具有不超过10000道尔顿的分子量截留限值。分析组分具有高分子量，例如蛋白质或聚合物，以防止它们扩散通过共聚物而从传感器中损失。在优选实施方案中，其中共聚物的亲水单元包含聚乙二醇(PEG)和二酸的酯，分子量截留限值受PEG链长度、聚合物的分子量和亲水单元的重量分数的影响。PEG链越长，分子量截留限值越高，聚合物分子量越大，分子量截留限值越小，并且亲水单元的重量分数越低，分子量截留限值越小。

优选的是，疏水单元的重量分数为共聚物的10～90％，更优选为共聚物的10～50％。

优选的是，每个亲水单元的分子量为200～10000道尔顿，更优选为400～4000道尔顿。如果亲水单元的分子量太小，葡萄糖的渗透性将很低。

优选的是，共聚物的亲水单元各自包含聚乙二醇和二酸的酯。作为聚乙二醇的替代方案，可以使用乙二醇和丙二醇的混合聚合物，和/或聚醚骨架可以用疏水和/或亲水基团来取代。作为聚乙二醇的又一种替代方案，可以使用聚四氢呋喃(聚THF)。

优选的是，亲水单元包含对苯二酸和/或琥珀酸作为二酸。其他合适的二酸是草酸、酒石酸、苯二甲酸、天冬氨酸、丙二酸和低聚或多聚二酸，例如聚(二聚酸-癸二酸)。在一个优选实施方案中，二酸仅是对苯二酸。在作为替代的优选实施方案中，对苯二酸与琥珀酸的摩尔比为1:2～2:1，适合的是1:1。

作为替代方案，共聚物的亲水单元可包含低聚物。适合的低聚物是甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、乙烯吡咯烷酮、乙烯醇、碳水化合物、环氧乙烷和/或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸的低聚物。当亲水单元包含HEMA时，在聚合物内提供生物可降解键(例如酯键，如对苯二酸酯键)，以增加生物可降解性。

优选的是，各疏水单元的分子量是400～5000道尔顿。如果疏水单元的分子量太大，葡萄糖渗透性将很低。如果疏水单元的分子量太小，聚合物将具有低的机械强度。

优选的是，共聚物的疏水单元包含丁-1，4-二醇和二酸的酯。作为丁-1，4-二醇的替代，可以使用戊-1，5-二醇或己-1，6-二醇。

优选的是，疏水单元包含对苯二酸和/或琥珀酸作为二酸。在优选实施方案中，对苯二酸与琥珀酸的摩尔比为1:2～2:1，适合的是1:1。作为替代方案，疏水单元仅包含对苯二酸作为二酸。其他合适的二酸在上文中给出。

作为替代方案，共聚物的疏水单元可以包含甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚氨酯和/或酰胺的低聚物(例如尼龙-6、低聚-N-叔丁基丙烯酰胺或低聚-N-异丙基丙烯酰胺)。当疏水单元包含MMA时，在聚合物内提供生物可降解键(例如酯键，如对苯二酸酯键)，以增加生物可降解性。

优选的聚合物具有通式aPEG(T/S)bPB(T/S)c，其中“a”表示PEG链的分子量，“b”表示在所得聚合物中PEG(T/S)(聚乙二醇对苯二酸酯/琥珀酸酯)的重量分数，“c”表示在所得聚合物中PB(T/S)(聚丁二醇对苯二酸酯/琥珀酸酯)的重量分数。这种聚合物的实例是600PEGT80PBT20、1000PEGT80PBT20、2000PEGT80PBT20、4000PEGT80PBT20，1000PEGT50PBT50和1000PEG(T/S)60PB(T/S)40(T/S50％)。所述聚合物是生物可降解的，具有高的葡萄糖渗透率，并且具有约25000道尔顿的分子量截留特性。

在US6383220和EP1247522中公开了这些聚合物中的一些。

分析组分被共聚物的壳包封。在壳内可存在一个或多个分析组分腔室。

适当地，分析组分在壳内是水溶液。

另一种选择是分析组分布置在另一种材料的基体内，该基体被共聚物的壳包封。

第三种选择是分析组分布置在另一种材料的芯和共聚物的包壳之间。这三种传感器令人感兴趣。

首先，可以使用在使用中溶解的芯材料。这种芯材料包括乳糖球(例如来自Meggle的FlowLac^TM)、甘露醇球(例如来自Roquette的Pearlitol^TM)、蔗糖/淀粉球(例如来自Werners的Pharm-a-spheres^TM)、PVA和PVP。根据芯材料的特性，它可以扩散穿过共聚物的包壳，以和周围流体中的芯材料平衡，或者可以被捕集在传感器内。例如，甘露醇芯会溶解并扩散穿过包壳，以在传感器内部产生几个μM浓度的甘露醇。甘露醇完全溶解所花费的典型时间是10～15分钟。PVA和PVP不能扩散穿过包壳。

第二，可以使用在使用中溶胀形成基体的芯材料，分析组分可以扩散到该基体中。这种芯材料包括具有丙烯酰基的交联PEG、PEGA聚合物和琼脂糖。

第三，可以使用在使用中既不溶解也不溶胀的芯材料。这种芯材料包括玻璃。在这种情况下，分析组分可以在芯材料和共聚物包壳之间的空间的薄壳内移动。

适当地，传感器是一个或多个纤维或珠粒的形式。圆盘也是传感器的适当形式，但是它们不是优选的。

传感器可以通过注射来引入到皮肤内，优选利用注射器，或者通过其他的方法，特别是通过在WO 00/02048中所描述的任意方法。传感器优选具有适合于通过小规格针注射的尺寸，以使患者的不舒适感最小化。优选的是，传感器具有20μm～1mm的最大尺寸。但是，可以使用具有更大的最大尺寸的杆状传感器。

传感器可以引入在真皮的厚度之内，或者真皮下引入，或者可以引入到表皮，但是在引入到表皮的情况下，可能在生物可降解材料，如果存在的话，降解之前，通过表皮层的长出将传感器从皮肤排出。

由于传感器位于皮肤内，因此传感器中产生的光学信号可以经皮检测(即，通过皮肤的较高层)，因此避免了对传感器和外部环境之间任意直接接触的需要。当传感器适当地位于皮肤部位中时，可以根据需要经常进行葡萄糖测量，而没有不利影响。这对于糖尿病患者的长期护理特别有利，因为如果葡萄糖测量进行越频繁，就可以对血中葡萄糖水平上维持更紧密的控制，并且将减少与血糖调节不良相关的病况发展的风险，例如视网膜病、肾病、神经病、普通微血管和大血管损害以及血液循环不良。

由于本发明的传感器本身不含有任何询问分析读出信息所需要的光学组分(这些单独提供并位于体外)，因此传感器可容易地以可注射的形式来提供，并且使患者的不舒适感最小化。

适用于传感器的分析包括各种反应，例如导致可检测的光学变化的水解和氧化，即可以经皮观测的荧光增强或猝灭。用于本发明的传感器中的优选分析是结合分析，其读出信息是可检测的或可测量的光学信号，利用光学设备可以经皮询问该信号。产生光学信号的结合分析应优选是可逆的，这样可以实现葡萄糖的变动水平的连续监测。这种可逆性对于结合分析形式的利用是特别有利的，在这种结合分析形式中分析组分没有被消耗。结合分析还出于安全原因优选用于本发明的传感器中，因为它们不能产生可能由酶或电化学反应所产生的任意所不需要的产物。

用于本发明传感器中的优选结合分析配置包括可逆竞争的、反应物受限的结合分析，其组分包括葡萄糖类似物和能够可逆结合葡萄糖和葡萄糖类似物的葡萄糖结合剂。葡萄糖和葡萄糖类似物竞争结合葡萄糖结合剂上的相同结合位点。这种竞争结合分析配置在临床诊断技术中是公知的，并且例如在The Immunoassay Handbook，ed.David Wild，Macmillan Press 1994中有说明。用于分析中的适当的分析物结合剂将包括抗体或保留葡萄糖结合位点的抗体片段(例如Fab片段)、凝集素(例如刀豆素A)、激素受体、药物受体、适体和分子印迹聚合物。

根据本发明可用作分析读出信息的适当光学信号包括可由邻近分析产生的任意光学信号，例如由荧光共振能量转移、荧光偏振、荧光猝灭、磷光技术、发光增强、发光猝灭、衍射或等离子体共振所产生的那些。

本发明传感器的最优选实施方案结合了竞争的、反应物受限的结合分析，其利用荧光共振能量转移产生光学读出信息。在这种分析形式中，葡萄糖类似物用第一发色团来标记，葡萄糖结合剂用第二发色团来标记。第一和第二发色团中的一个作为供体发色团，另一个作为受体发色团。

供体发色团的荧光发射光谱必须与受体发色团的吸收光谱重叠，使得当供体和受体发色团通过结合剂而相互紧密邻近时，部分能量将非辐射性地转移到邻近的受体发色团，该过程被称为荧光共振能量转移，其中所述部分能量通常将产生由供体发射的荧光(在辐射由供体发色团吸收的波长的入射辐射之后)。这导致了由供体发色团发射的部分荧光信号猝灭，荧光寿命被改变，并且在一些情况下受体发色团发射荧光。但是受体发色团可以是非荧光染料。

当通过将葡萄糖类似物结合至葡萄糖结合剂而使供体和受体发色团紧密邻近时，将仅仅发生荧光共振能量转移。因此，在与葡萄糖类似物竞争结合葡萄糖结合剂的葡萄糖存在下，猝灭的量减少(导致由供体发色团发射的荧光信号强度的可测增加或者由受体发色团发射的信号强度的下降)，这是由于标记的葡萄糖类似物被从结合葡萄糖结合剂处置换下来。因此，由供体发色团发射的荧光信号的强度或寿命与浸浴传感器的皮下流体中葡萄糖浓度相关。

荧光共振能量转移分析形式的其他有利特征源于以下事实：在利用受体发色团的吸收光谱范围内波长的入射辐射光束来激发之后，由受体发色团发射的任意荧光信号均不受荧光共振能量转移过程的影响。因此，可利用由受体发色团发射的荧光信号的强度作为中间基准信号，例如在传感器的连续标定中或用于监测传感器降解的程度，并由此指示需要植入或注射新的传感器。这种信号下降到低于可接受基线水平时，指示需要植入或注射新的传感器。

能够适用于本发明传感器的利用荧光共振能量转移技术的竞争结合分析在本技术领域中是已知的。US 3996345描述了利用抗体和荧光剂-猝灭剂发色团对之间的荧光共振能量转移的免疫测定。Meadows和Schultz(Anal.Chim.Acta(1993 280：pp21-30)描述了一种基于标记的葡萄糖类似物(FITC标记的葡聚糖)和标记的葡萄糖结合剂(若丹明标记的刀豆素A)之间的荧光共振能量转移的葡萄糖测量的均相测定法。在所有的这些配置中，受体和供体发色团/猝灭剂可以结合到结合剂或葡萄糖类似物。

可以使用在本文件的引言中所引用的背景技术中描述的各种FRET化学。

可以进行荧光寿命或荧光强度测量。如Lakowicz等人的文献中所描述，可以通过调相技术来测量荧光寿命。

对荧光共振能量转移的一种替代方案是荧光猝灭技术。在这种情况下，具有荧光猝灭能力的化合物被用来替代特异性受体发色团，在竞争结合分析中的光学信号将随着葡萄糖的增加而增加。作用强且非特异性的荧光猝灭剂的实例由Tyagi et al.Nature Biotechnology(1998)18：p49给出。

适当的葡萄糖类似物是葡聚糖。适当的葡萄糖结合剂是凝集素，例如刀豆素A。

在依赖荧光猝灭或荧光共振能量转移的分析中，当荧光团和猝灭剂分子相互不结合时，生物可降解材料的壳结构为荧光团和猝灭剂分子分离提供足够的空间，这样荧光团的猝灭可以停止。

在第二方面，本发明涉及制备本文中上述传感器的方法。

传感器可以如下制备：形成共聚物的开放中空壳、用分析组分填充所述壳并密封该壳以形成传感器。

可以使用挤出或模塑法。PEGT-PBT-类似聚合物(Arnitel^TM(DSM)和Hytrel^TM(聚丁二醇-对苯二酸酯-聚链烷-对苯二酸酯；Dupont)被广泛地用于注塑、挤出和吹塑(制膜)。

制备聚合物微胶囊的化学方法包括相分离(凝聚)、溶剂蒸发和/或萃取。

凝聚技术依赖于当将第三非溶剂组分加入聚合物溶液中时包衣聚合物的溶解性降低。非溶剂不溶解聚合物。在加入第三组分过程中，形成两种液相：富含聚合物的凝聚层以及上层液体。如果分析化学品是以小滴分散在聚合物溶液中，它们可以被凝聚层包覆，这样形成具有聚合物壳的水填充芯。所述壳通过聚合物溶剂的蒸发或萃取而硬化。凝聚过程中的重要参数是溶剂与第三组分之比、聚合物浓度、聚合物与分析化学品之比、非溶剂添加速率、表面活性剂的特性和表面活性剂浓度。作为用溶液进行的一种替代方案，分析组分可以作为干微粉化粉末而分散。

相分离的实验表明利用这种方法来制备PEGT-PBT微胶囊的可能性。适当的聚合物溶剂是二氯甲烷。用于诱导相分离的第三组分可以是例如硅油、芝麻油或棉花子油以及少量的表面活性剂(例如Span 85^TM)。硬化剂适当地是庚烷。

在溶剂蒸发技术中，聚合物溶于适当溶剂中(例如二氯甲烷)并分散在与聚合物不混溶的外部水相中。所述水相含有一种或多种稳定剂(例如聚乙烯醇)，以防止颗粒的团聚。蒸发有机溶剂，以产生硬化的颗粒。分析组分可以作为微粉化粉末或作为溶液分散在有机溶液中。为了在分析组分为溶解状态时获得微胶囊而不是致密微球体，必须小心选择初始乳液(油包水)的组成。乳液由水溶液中的分析组分和溶于有机溶剂中的PEGT-PBT聚合物组成。

当用于PEGT-PBT聚合物的溶剂萃取时，水混溶性比二氯甲烷更好的适当溶剂是乙酸乙酯、NMP、DMSO和二甲基异山梨醇。DMF和γ-丁内酯也是适合的溶剂。可以使用这些溶剂的组合。

制备聚合物微胶囊的适当物理方法包括喷雾干燥、喷雾包衣、喷雾冷却、旋转盘雾化、流化床包衣、共挤出(例如固定喷嘴共挤出、离心转头共挤出或浸没式喷嘴共挤出)和锅包衣。

用于胶囊的喷雾干燥法通常使用双喷嘴，其中芯材料(与分析组分混合)和壳材料(溶解态)结合。通过超声或震动可以形成小滴，接着通过在硬化浴中干燥(溶剂蒸发)来硬化小滴，其中所述硬化浴可以是空气。微胶囊的尺寸以及壳的厚度可以通过改变喷嘴尺寸、溶液和硬化溶剂的浓度来定制。对于这种方法，如果不能用水则必须选择适当的芯材料(例如琼脂糖、PVP和PVA)。

在流化床包衣中，利用溶解态的壳材料来包覆预形成的芯材料微球体(与分析组分混合或者用分析组分包覆，例如通过预先喷雾包衣或流化床包衣步骤)。溶剂的随后蒸发产生薄壳层。当实施流化床包衣时，优选使用顶部喷雾流化床涂布器(例如Combi Coata^TM流化床系统)以获得平滑的产物，但是也可使用底部喷雾流化床涂布器。

在喷雾包衣中，通过喷涂溶解态的壳材料来包覆预形成的芯材料微球体(与分析组分混合或者用分析组分包覆，例如通过预先喷雾包衣或流化床包衣步骤)。溶剂的随后蒸发产生薄壳层。

适当的包衣程序例如是使芯通过几个包衣材料幕帘(US5246636)、收集喷雾干燥和盘干燥的颗粒(US4764317)、包覆液滴(US4675140)。US2003/0013783 A1描述了使用双喷嘴系统制作胶囊。

在第三方面，本发明涉及利用本文所述传感器来检测葡萄糖的方法，包括将传感器植入哺乳动物的皮肤中、利用外部光学设备经皮检测或测量葡萄糖和使生物可降解材料降解。

利用光学设备经皮询问传感器，即传感器和光学设备之间不需要物理连接。当传感器结合了利用荧光能量转移技术的竞争性、反应物受限的结合分析时，光学设备应该提供在供体发色团吸收光谱范围内波长的第一束入射辐射以及优选的在受体发色团吸收光谱范围内波长的第二束入射辐射。另外，光学设备应该优选能够测量在传感器中产生的两个不同波长的光学信号：供体发色团的发射光谱范围内的波长1(与葡萄糖测量相关所产生的信号)和受体发色团的发射光谱中的波长2(其可能是葡萄糖信号或内部基准或标定信号)。

适用于远程询问本发明的装置的光学设备包括简单的高通量荧光计，该荧光计包含激发光源例如发光二极管(蓝、绿或红色)、激发光滤光器(二色性或染料滤光器)以及荧光检测器(PIN二极管构造)。具有这些特征的荧光计可表现出皮摩尔和飞摩尔荧光团浓度之间的灵敏度。

适当的荧光计设置示于附图2中并在本文所包括的实施例中进行说明。荧光计单独测量下列参数：

在波长1(供体发色团)

激发光强度，I(1，0)

环境光强度，I(1，1)

结合的荧光和环境光的强度I(1，2)

在波长2(受体发色团)

激发光强度，I(2，0)

环境光强度，I(21，1)

结合的荧光和环境光的强度I(2，2)

通过保持荧光计靠近皮肤并与传感器对准来进行测量。当进行由传感器产生的荧光信号的经皮测量时，必需考虑皮肤对信号的吸收，通过实验发现，人皮肤的吸收率在400nm-900nm范围内最小。提供的最终输出是两种荧光团的荧光强度之间的归一化比值，由下列关系来定义(等式1)：

最终输出＝(I(1，2)—I(1，1))*I(2，0)/(I(2，2)—I(2，1))*I(1，0)    (1)

如上文等式1给出的光学设备(例如荧光计)的最终输出被转化为分析物浓度，优选通过利用标定数据的计算机来进行，所述标定数据可基于下文中给出的原理来获得。

可以根据经验通过测量相对于葡萄糖浓度的响应来建立生理相关范围的葡萄糖浓度的标定曲线。优选的是，这在体外进行，作为生产传感器装置的一部分。在竞争性亲和传感器中，标定程序可以利用响应和葡萄糖浓度之间的数学关系而显著简化，其推导如下：

竞争性亲和传感器的响应由下列反应控制：

$\mathrm{RC}\↔R+C$

$\mathrm{RL}\↔R+L$

表示复合物RC和RL的离解，复合物RC和RL通过分析物结合剂(R)与分析物(L)或分析物类似物(C)的结合而形成。

对应的离解平衡常数是：

$K_1=\frac{C_r{C}_c}{C_{\mathrm{rc}}}$

和

$K_2=\frac{C_r{C}_L}{C_{\mathrm{RL}}}$

其中C表示传感器中物质的摩尔数除以传感器体积。利用这种浓度测量，对固定化物质和溶解态物质类似处理。

总分析物类似物浓度的质量平衡方程是：

T_C＝C_C+C_RC

总分析物结合剂浓度的质量平衡方程是：

T_R＝C_R+C_RC+C_RL

利用上述表达式，推导出响应和分析物浓度之间的关系：

$\frac{T_C-C_C}{C_C}{K}_1=\frac{T_R-(T_C-C_C)}{1+(C_L/K_2)}$

(2)

利用该关系，标定所必需的数据量可以减少到两个关键参数：总分析物结合剂浓度和总分析物类似物浓度。标定曲线因此由曲线上的两点来确定。

附图说明

参考下文中非限定性实施例以及附图将进一步理解本发明，其中：

图1是用于实施例1的渗透性试验中的渗透性单元图；

图2是光纤荧光计的光学部件的示意图(实施例3)；

图3是用于连接光纤荧光计的光学部件的驱动器/放大器电路的示意图(实施例3)；

图4表示实施例5中试验的一组珠粒暴露于PBS缓冲液(0mM葡萄糖)和含有24mM葡萄糖的PBS缓冲液中两天内的相位测量；

图5表示实施例6的置于皮肤内的珠粒的相位测量；

图6表示在实施例8中制备的纤维；

图7表示在实施例8中试验的含有AF594-ConA和HMCV1-葡聚糖的一组纤维暴露于10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中的2.5mM、5mM、25mM和50mM葡萄糖的葡萄糖浓度下一天内的相位测量；

图8表示在实施例8中试验的含有AF594-ConA和HMCV1-葡聚糖的一组纤维暴露于10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中的2.5mM、5mM、25mM和50mM葡萄糖的葡萄糖浓度下15天内的相位测量；

图9表示实施例9的置于皮肤内的纤维的葡萄糖测量；

图10表示用于实施例10中的顶部喷雾流化床系统；

图11表示用来自氯仿溶液的荧光化学品和聚合物水溶液包覆的甘露醇芯(实施例10)。在整个甘露醇芯溶解之前，经过两次包衣的颗粒示于缓冲液中。

具体实施方式

实施例1

实施渗透性试验，以确定用于本发明传感器中的各种材料的适合性。如在S.Fakirov and T.Gogeva，Macromol.Chem.191(1990)603-614中所述利用80wt％亲水链段和20wt％的疏水链段的靶来制备聚合物。

试验在具有供体室和受体室的渗透性单元(图1)中进行。所述各室各自具有5mL的容量(或在不同的渗透性单元中30mL)。待测试材料膜在室温下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中溶胀30分钟。然后利用橡胶O型圈(未示出)将该膜固定在所述室之间，以保证单元室之间的紧密连接。膜置于一个室之上，非常小心地将单元的第二部分置于第一部分之上，以保证不以任何方式切割或损害膜。利用插入室中的金属网来保护膜免受搅拌棒的损害，这是由于搅拌棒和膜之间的任何物理接触将破坏膜。

将500mM葡萄糖(PBS中)引入到供体室中并将PBS引入到受体室中。作为时间的函数来测量受体室中葡萄糖浓度。利用来自Bayer的Glucometer Elite^TM试条来进行测量。试条被标定用于PBS缓冲液中。可使用任意的葡萄糖测量装置，但是应该在所使用的介质中进行标定。

校正的葡萄糖值被用于计算扩散系数。

表1表示如实施例1中所述来制作的聚合物的扩散结果。

表1

 

膜说明	厚度(μm)	D<sub>glu</sub>(cm<sup>2</sup>/g)	相对于透析膜	检测偶联物的时间(天)<sup>1)</sup>	抵抗时间(天/μm)<sup>2)</sup>
						I000PEGT80PBT20(Mw≈58kDa)	11	1.1×10<sup>-7</sup>	0.22	>91	>8.3
1000PEGT80PBT20(Mw≈35kDa)	26	1.6×10<sup>-7</sup>	0.33	36	1.4
						2000PEGT80PBT20	28	3.4×10<sup>-7</sup>	0.67	>53	>1.9
4000PEGT80PBT20	46	5.9×10<sup>-7</sup>	1.18	>46	>1.0
						4000PEGT80PBT20	25	4.4×10<sup>-7</sup>	0.89	>46	>1.8
透析膜再生纤维素(MwCO14000)	16	5.0×10<sup>-7</sup>	1.00	N/A	N/A

1)在扩散单元的受体室中得到试验偶联物存在的某种指示所花费的天数。

2)抵抗时间计算为检测每单位厚度的偶联物的时间。

表2表示在PEGT-PBT膜上实施的葡萄糖扩散的集中结果。

表2

 

膜说明	厚度(μm)	±SD(μm)	Dglu(cm<sup>2</sup>/g)	相对于透析膜
					600PEGT80PBT20	44	7	5.0×10<sup>-8</sup>	0.11
1000PEGT80PBT20	50	5	1.3×10<sup>-7</sup>	0.28
					2000PEGT80PBT20	78	10	4.5×10<sup>-7</sup>	0.98
1000PEGT80PBT20	90	5	1.8×10<sup>-7</sup>	0.39
					1000PEGT80PBT20	45	4	1.9×10<sup>-7</sup>	0.41
再生纤维素MwCO 14kDa	60	10	4.6×10<sup>-7</sup>	1.00

表3表示葡聚糖偶联物扩散实验的结果。

表3

 

膜说明	厚度(μm)	±SD(μm)	检测偶联物的时间(天)<sup>2)</sup>	抵抗时间(天/μm)<sup>2)</sup>
					600PEGT80PBT20	44	7	>107	>2.4
1000PEGT80PBT20	50	5	90	1.8
					2000PEGT80PBT20	78	10	95	1.2
600PEGT80PBT20	8	3	>64	>8.0
					1000PEGT80PBT20	8	3	42	5.3
2000PEGT80PBT20	8	3	41	5.1
					再生纤维素MwCO 14kDa	60	10	>300	-

1)在扩散单元的受体室中得到试验偶联物存在的某种指示所花费的天数。

2)抵抗时间计算为检测每单位厚度的偶联物的时间。

进行分析化学品渗透通过膜的试验。将2μM～10μM浓度的CFSE-葡聚糖引入到供体室中，并且利用半微量试管通过稳态荧光计来测量作为时间函数的受体室中CFSE-葡聚糖浓度。

实施例2

根据Meadows和Schultz(Talanta，35，145-150，1988)所述，利用刀豆素A-若丹明和葡聚糖-FITC(均来自Molecular Probes Inc.，Oregan，USA)发展了葡萄糖分析。该分析的原理是当两个荧光团紧密接近时在所述两个荧光团之间的荧光共振能量转移；在葡萄糖存在时，共振能量转移受抑制并且来自FITC(荧光素)的荧光信号增加。因此，增加荧光与增加葡萄糖相关。如Schultz所报道，发现葡萄糖分析对具有在20mg/dL葡萄糖时约50％回收的荧光素荧光信号的葡萄糖作出响应。在利用吸吮装置改变适应于流通测量的Perkin Elmer荧光计中测量荧光。

实施例3

如下组装光纤荧光计。

在微型工作台上由标准元件来制作光纤荧光计的光学部件。该装备包括作为光源的红色LED、透镜、二色性分光器和滤光器以及二极管检测器，如图2所示。简单地说，荧光计包括提供激发光束的发光二极管(1)，激发光束通过含有激发滤光器(3)的聚光器(2)并且入射到分光器(4)上。部分激发光束由此被反射到发射光学装置(5)中并进入光纤(6)。当使用荧光计来询问皮肤端的位于皮肤内的传感器时，与皮肤传感器对准，使得激发光束入射到传感器上，由激发后传感器发射的光学信号的一部分进入光纤(6)并由此被传送到荧光计中，在此它通过阻塞二极管(7)。荧光计还含有基准二极管检测器(9)，其提供由LED(1)发射的激发光的基准测量。利用金刚石研膏在玻璃糊上将直径为0.5mm、数值孔径为0.65、1m长的EnsignBeckford光纤的末端研磨成镜面抛光。所述纤维的一端安装在20×显微镜物镜前面的X Y Z支架中。二极管(LED(1)和二极管检测器(7)和(9))连接到如图3所示的定制驱动器/放大器电路。所述电路包含发送器(10)、电流放大器(11)和(12)、多路转换器(13)和(14)、积分器(15)和(16)以及模拟除法器(17)。设置驱动器电路以在238Hz下驱动LED(1)，来自二极管检测器(7)和(9)的信号在地面和储能电容器(1秒的恒定时间积分器)之间转换，与驱动信号同步。两种积分信号对应于背景校准荧光信号和背景校准激发光水平(LED强度)。前者除以后者，由模拟除法器来支持，如图3]中所示。为了试验目的，光纤(6)的远端浸入若丹明的稀释溶液中，并且调整光学装置以获得来自模拟除法器的最大信号。

荧光计利用电池工作(典型的功率消耗为150mA、9V)，并且为了方便，荧光计可以构造成笔的形状和尺寸。

实施例4

通过复乳溶剂蒸发技术(double emulsion solvent evaporation technique)以下列方式来制作含有分析化学品的珠粒。

将在PBS中的1.0ml HMCVI-葡聚糖110千道尔顿(30μM)和AF594-ConA-succ(30μM)的分析化学品混合物与1wt％ Span85^TM表面活性剂一起在二氯甲烷中的5ml 10％聚合物(1000PEGT80PBT20)溶液中乳化，以形成油包水乳液。随后，将该乳液加入到100ml烧瓶中的40ml 10％聚乙烯吡咯烷酮中，以形成水包油包水的乳液。对该乳液施加真空以快速蒸发二氯甲烷。5小时之后，通过过滤并用PBS缓冲液(pH7.4，50mM)洗涤几次，收集深蓝色的微胶囊。在葡萄糖响应试验之前将获得的珠粒储存在冰箱中(4℃)。

实施例5

在开始频域测量之前，将在实施例4中制作的珠粒在PBS缓冲液中洗涤三次，并留在前面的试管中沉淀。在KOALA(ISS，Champaign IL，USA)中实施这些测量。激发正弦波和发射正弦波之间的相位移可以转变为荧光寿命，但是使用测量时的原始数据，而不需要数学处理。对PBS缓冲液本身和含有25mM葡萄糖的PBS缓冲液进行测量。当改变溶液时，利用待测溶液彻底洗涤珠粒。

图4表示当该组珠粒暴露于PBS缓冲液(0mM葡萄糖)和含有25mM葡萄糖的PBS缓冲液中时对该组珠粒的相位测量。实验进行两天。

实施例6

将在实施例4中制备的珠粒置于麻醉的猪的皮肤中的真皮内。相位读出信息在图5中示出。由于注射葡萄糖而导致630分钟之后相位快速增大。该增大对应于动脉血中约10mM的葡萄糖增加。

实施例7

通过注射器将在实施例4中制备的珠粒注射到人志愿者的手背中。

光纤荧光计(参见实施例4)对准皮肤，获得若丹明荧光寿命信号并且该荧光寿命信号与常规血糖测量相关，这表明可以对植入的传感器进行经皮测量。

实施例8

可通过下面的方法制成含分析化学品的中空纤维。

通过将直径为0.4mm、长度为10cm的杆状金属模板浸入到氯仿中的10％ w/v的1000PEGT80PBT20聚合物溶液中五次来制备纤维，每次浸没之间有30秒的干燥时间。通过使聚合物在水中溶胀来从模板中移除纤维。干燥之后，纤维被切成所需的长度(通常约4mm)并通过加热在一端封闭。利用细针将由偶联Alexa Fluor^TM 594的刀豆素A(AF594-ConA)和偶联六甲氧基结晶紫的氨基葡聚糖(150千道尔顿)(HMCV1-葡聚糖)制备的分析化学品引入到纤维中。填充后，通过加热封闭纤维的另一端。这样得到类似于图6中所示的纤维(长2mm)。

将纤维置于含有在三羟甲基氨基甲烷缓冲液(盐水)中下列不同浓度的葡萄糖的试管中：2.5mM、5mM、25mM和50mM。利用相位荧光计来连续询问该纤维。图7表示该试验的第一天相位测量，图8表示15天全部试验的相位测量。

实施例9

将在实施例8中制备的纤维置于麻醉的猪的皮肤中的真皮内并利用相位荧光计通过皮肤询问。相位读出信息在图9中示出。由于注射了葡萄糖而导致在6.5小时之后快速增大。该增大对应于血中达到35mM的葡萄糖增加。

实施例10

以下列方式来制备含有甘露醇芯的颗粒，所述甘露醇芯装载有分析化学品并涂覆有聚合物。

在Combi Coata^TM顶部喷雾流化床系统(图10)中，在35℃的温度下利用30mLAF594-ConA/HMCVl-葡聚糖水溶液来包覆筛选至粒径为315μm～350μm的50g甘露醇(例如Pearlitol^TM 300SD)球体。以1mL/min的速度将水溶液加入到床/甘露醇球体中。

床中的温度降低至28℃并以1.5mL/min的速度加入聚合物溶液(氯仿中，5％ w/w1000PEGT80PBT20)。为了得到约20μm的包衣厚度，应该用约3小时加入20g的聚合物，即400g的聚合物溶液。在干燥之后，将颗粒浸没在三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中。图11表示在颗粒内部的聚合物溶胀壳以及部分溶解的甘露醇芯。甘露醇芯在10～15分钟之后完全溶解。

实施例11

通过注射器将在实施例10中制备的传感器注射到人志愿者的手背中。

光纤荧光计(参见实施例3)对准皮肤，获得若丹明荧光寿命信号并且该荧光寿命信号与常规血糖测量相关，这表明可以对植入的传感器进行经皮测量。

Claims (24)

1.一种用于体内检测葡萄糖的传感器，包括：

葡萄糖分析组分，所述分析组分的读出信息是可检测光学信号，当传感器植入体内时可以通过外部光学设备经皮询问所述光学信号；和

包封所述分析组分同时允许分析物接触所述分析组分的生物可降解材料的壳，其中生物可降解材料包含具有疏水单元和亲水单元的共聚物，每个所述亲水单元都包含聚乙二醇和二酸的酯。

2.如权利要求1所述的传感器，其中所述共聚物是无规共聚物。

3.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述共聚物具有不超过25000道尔顿的分子量截留限值。

4.如权利要求3所述的传感器，其中所述共聚物具有不超过10000道尔顿的分子量截留限值。

5.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述共聚物对葡萄糖具有至少5.0×10^-10cm²/s的渗透率。

6.如权利要求1或2所述的传感器，其中疏水单元的重量分数为所述共聚物的10～90％。

7.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述亲水单元包含对苯二酸和/或琥珀酸作为二酸。

8.如权利要求7所述的传感器，其中亲水单元仅包含对苯二酸作为二酸。

9.如权利要求7所述的传感器，其中亲水单元中对苯二酸与琥珀酸之比为1∶2～2∶1。

10.如权利要求1或2所述的传感器，其中每一个亲水单元的分子量为400～4000道尔顿。

11.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述共聚物的疏水单元包含丁-1，4-二醇和二酸的酯。

12.如权利要求11所述的传感器，其中所述疏水单元包含对苯二酸和/或琥珀酸作为二酸。

13.如权利要求12所述的传感器，其中所述疏水单元仅包含对苯二酸作为二酸。

14.如权利要求12所述的传感器，其中对苯二酸与琥珀酸之比为1:2～2:1。

15.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述分析是结合分析。

16.如权利要求15所述的传感器，其中所述结合分析是竞争结合分析，所述竞争结合分析的组分包括葡萄糖结合剂和葡萄糖类似物。

17.如权利要求16所述的传感器，其中所述葡萄糖类似物是葡聚糖。

18.如权利要求16所述的传感器，其中所述葡萄糖类似物用第一发色团来标记，葡萄糖结合剂用第二发色团来标记，第一发色团的发射光谱与第二发色团的吸收光谱重叠，或者第二发色团的发射光谱与第一发色团的吸收光谱重叠。

19.如权利要求16所述的传感器，其中所述葡萄糖结合剂是抗体、Fab片段、凝集素、激素受体、适体或分子印迹聚合物。

20.如权利要求16所述的传感器，其中所述葡萄糖结合剂是药物受体。

21.如权利要求1或2所述的传感器，其中所述可检测的光学信号是由荧光共振能量转移、荧光偏振、磷光、发光增强、发光猝灭、衍射或等离子体共振所产生。

22.如权利要求21所述的传感器，其中所述可检测的光学信号是由荧光猝灭所产生。

23.制备如权利要求1～22中任一项所述的传感器的方法，所述方法包括：形成共聚物的开放中空壳、用分析组分填充所述壳并密封该壳以形成传感器。

24.制备如权利要求1～22中任一项所述的传感器的方法，所述方法包括以下方法之一：凝聚；溶剂蒸发和/或萃取；喷雾干燥；喷雾包衣；喷雾冷却；旋转盘雾化；流化床包衣；共挤出；锅包衣。

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