CN105954233B - 一种水相中检测d-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的制备方法 - Google Patents

一种水相中检测d-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于表面等离子体传感器芯片制备领域，具体涉及一种水相中检测D‑葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的制备方法。将表面等离子体共振传感器芯片分为五个部分，由上至下依次为玻璃基片、铬膜、金膜、单分子自组装膜、分子印迹聚合物膜层；其中铬膜和金膜是通过真空蒸发或溅射法镀在玻璃基片上，分子印迹聚合物膜是利用热聚合技术沉积在金膜表面。本发明利用分子印迹技术针制备了水溶性分子D‑葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片，该芯片可以有效的在水相中对D‑葡萄糖分子进行检测。本发明的芯片物理化学性质稳定，易于保存，可以重复使用，同时制备方法步骤少，生产成本低，更适合工业化生产。

Description

一种水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的 制备方法
技术领域
本发明属于表面等离子体传感器芯片制备领域，具体涉及一种水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)传感器芯片的制备方法。
背景技术
分子印迹聚合物是通过化学方法，以目标检测物为模板分子，将它与适当的单体、交联剂、引发剂在溶液中进行聚合制备得到的。通过化学或物理手段将模板分子清除，得到具有一定分子空间和特殊识别位点的分子印迹聚合物。分子印迹物主要存在两种方法制备，一是共价法，在此方法中模板分子与单体形成可逆的共价键，形成模板分子-单体复合物，聚合后通过化学手段打开共价键除去模板分子；二是，非共价法。模板分子与功能单体依靠氢键、疏水作用、静电力、金属配位键等作用形成模板分子-单体复合物，其形成过程是在溶液中自发进行的。因此在选择溶剂的过程中就要考虑到溶剂分子与模板分子及功能单体之间的作用。一般来讲，所用的溶剂对模板分子有较高的溶解度，最好能够促进模板分子与单体分子间的相互作用。极性强的溶剂会降低模板分子与单体间的结合，特别是干扰氢键的形成。研究过程中人们发现有些模板分子只在极性溶剂溶解性好，而在其它非极性的有机溶剂中不溶解或者难溶解，如D-葡萄糖分子。针对这类分子制备分子印迹物制备亟需筛选出合适的反应体系，从而制备相应的印迹物。
另外，分子印迹物在水环境中的使用，特别是小分子物质的印迹物在水环境中的应用，也是目前该领域亟待解决的问题之一。传统的印迹物通常在有机溶剂中制备，在水环境中检测过程中，其位点与模板分子间的氢键常常受到水分子的影响，从而减弱分子印迹物的识别能力。
SPR传感器是通过某种耦合方式利用入射光在金属和电介质的界面上激发表面等离子体波(Surface Plasmon Wave,即SPW)来实现信息转换的。当样品与界面接触时，由于存在吸附或化学反应，界面处介质折射率将会发生变化。基于此原理可以通过探测表面等离子体波的状态而高灵敏度地了解界面的物理和化学吸附过程。由此可以实现待测分子的识别、分子浓度以及分子反应动力学参数的测定等。
SPR传感器芯片的金膜本身没有选择性，因此要对其表面进行适当的物理化学修饰，使其具备一定的检测功能。分子印迹物作为一种理想的合成材料，被科研人员引入SPR传感器领域。常用的印迹膜制备方法包括：旋涂、电化学沉积法、光聚合、热沉积、溶胶-凝胶等方法。分子印迹物薄膜具有三维立体结构，在空间上保留了针对目标分子的空穴和识别位点，表现出良好的选择性和识别能力，同时还提高了传感器芯片的重复使用率。分子印迹与SPR传感器技术结合能够充分发挥二者优势，实现针对目标物的实时、快速、高灵敏度检测。
目前，基于分子印迹技术对SPR芯片进行化学修饰，在水相环境中对小分子目标进行有效检测是实际应用中的一个瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的制备D-葡萄糖印迹物薄膜修饰的SPR芯片，并实现在水环境中检测。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供一种基于分子印迹技术的表面等离子体共振仪芯片，包括一玻璃基片和其上的铬膜层，金膜层，在所述的金膜层上以自组装的方法引入单分子含不饱和双键的分子层，以及和单分子层结合的功能化的分子印迹膜层。
一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，该芯片包括玻璃片，玻璃片上镀有铬膜和金膜层；在所述金膜层上以自组装的方法引入含不饱和键的单分子层，利用热聚合的方法在单分子层上接枝分子印迹聚合物薄膜，含不饱和键的单分子层为单分子烯烃层；该方法包括如下步骤：
1)采用高真空蒸镀的方法在玻璃基片上镀一层1.5～2nm的铬膜，之后蒸镀一层40～60nm的金膜；
2)制备自组装单分子烯烃层，将步骤1)中新蒸镀的镀金膜玻璃片浸入自组装溶液中，自组装20～30小时后，将其用乙醇冲洗2～5遍，氮气吹干后备用，该玻璃片金膜层上自组装一层致密的单分子烯烃层，所述自组装溶液浓度为1～100mmol/L；
3)在金膜层表面制备分子印迹膜：将模板分子、功能单体、交联剂、引发剂及致孔剂按比例超声混合溶解，得到预聚合反应溶液A，其中模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比例为1：(2～5)：(3～18)，引发剂的加入量为功能单体总质量的0.5％～3％，致孔剂为有机溶剂，模板分子在混合溶液中的摩尔浓度为0.01～0.1mol/L，功能单体在混合溶液中的摩尔浓度为0.02～0.5mol/L，交联剂在混合溶液中的摩尔浓度为0.03～1.8mol/L；
4)在硅烷化的玻璃片表面制备反应池，其中硅烷化玻璃由载玻片裁制而成，采用浓度为1×10-4mol/L三甲基氯硅烷浸泡5～10h得到硅烷化载玻片；将帕拉胶膜拉伸后覆盖在载玻片上，压紧，之后裁制得到反应池；
5)将预聚合反应溶液A加入到反应池，溶液与金膜表面单分子烯烃层接触，氮气保护下加热50～70℃，反应1～12h；
6)热聚合结束后，以体积比为9：1～7：3的蒸馏水和乙酸的洗脱液洗脱模板分子，在分子印迹膜上留下具有选择性的空穴和结合位点。
所述的单分子烯烃层为N,N-二烯丙基硫脲、二甲基二硫代氨基甲酸烯酯、烯丙基硫醇、1-甲代烯丙基-3-甲基-2-硫脲中的一种。
功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、4-乙烯基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、3-丙烯酰胺基苯硼酸中的一种或两种。
交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种。
致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇、1，4-丁二醇中的一种或两种。
自组装溶液为N,N-二烯丙基硫脲、二甲基二硫代氨基甲酸烯酯、烯丙基硫醇、1-甲代烯丙基-3-甲基-2-硫脲中的一种的溶液，溶液中溶剂为乙醇，甲醇，氯仿中的一种。
模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比例为1：4：(5～10)；引发剂的加入量为功能单体总质量的0.5％～3％，模板分子在混合溶液中的摩尔浓度为0.05mol/L，功能单体在混合溶液中的摩尔浓度为0.2mol/L，交联剂在混合溶液中的摩尔浓度为1.0mol/L。
热聚合的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、2,2’-偶氮二(2-甲基-4-羧基丁腈)、2,2’-偶氮二(2-氰丙烷-1-磺酸盐)、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过氧化苯甲酰、过硫酸铵、过硫酸钾中的一种。
洗脱液为蒸馏水和乙酸混合溶液，混合体积比为8：1～7：4。
有益效果
本专利制备SPR芯片的方法具有以下优点：
(1)可以方便、快速地在金膜表面制备出纳米尺寸厚度的分子印迹薄膜；
(2)操作步骤简单，对试验条件要求不是很苛刻；
(3)容易实现在金膜表面制备阵列式的分子印迹膜结构单元，每个单元可以是不同的模板分子，实现多通道，多目标分子的检测；
(4)芯片体积小，可以在反应容器中同批次进行大量制备；
(5)薄膜的厚度及通透性由功能单体、交联剂的浓度、反应的温度、聚合的时间、致孔剂的选择和配制来控制等条件来决定。
附图说明
图1为本发明的表面等离子体共振仪芯片结构示意图；
图2为反应池示意图；
图3为本发明具体实施例中水相中洗脱前后SPR共振角度图；
图4为本发明具体实施例中水相中吸附样品SPR动力学曲线图；
图中标号：1-光学玻璃片；2-铬膜；3-金膜；4-自组装单分子层；5-分子印迹膜；6-帕拉胶膜制备的反应池；7-硅烷化的载玻片。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明的内容进一步说明。
实施例
如图1所示，本实施例提供一种基于分子印迹技术的表面等离子体共振仪芯片，包括一玻璃基片1和其上的铬膜层2，金膜层3，在所述的金膜层上以自组装的方法引入单分子含不饱和双键的分子层4，以及和单分子层结合的功能化的分子印迹膜层5。
一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，包括如下步骤：
1)采用真空蒸镀的方法在玻璃基片1上分别蒸镀一层金属铬膜和一层金膜；具体蒸镀方法为：将洁净的玻璃基片1在真空度≧1×10-5Pa条件下进行真空蒸镀99.99％铬，铬膜厚度为1.5～2nm；在金属铬膜上蒸镀99.99％的金，所镀金膜厚度为45nm；此时得到芯片为3层芯片；其中，所述玻璃基片1为2.5cm×3.0cm LaSFN9玻璃基片；
2)采用自组装单层技术，将新鲜蒸镀的3层芯片立即浸入自组装溶液中，24小时后，该玻璃片上的金膜层上自组装一层致密的不饱和单分子层；其中自组装溶液采用1mmol/L的烯丙基硫醇；浸泡完毕后在金膜层3上自组装一层含不饱和双键的单分子层，将其用乙醇冲洗3遍，氮气吹干后备用，得到4层芯片；其中，烯丙基硫醇化学式为：SHCH2CHCH2；
3)将模板分子D-葡萄糖0.0199g溶于0.5mL二甲基亚砜和3.5mL乙腈混合溶液中，超声至全部溶解；加入功能单体丙烯酰胺0.0284g和0.03g 3-丙烯酰氨基苯硼酸于上述溶液，超声至全部溶解，静止3h；再加入10μL乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈0.005g，超声混合5min，然后通氮气10min，得到预聚合反应溶液A；
4)在硅烷化的玻璃片表面制备反应池，如图2所示。其中硅烷化玻璃由载玻片裁制而成，尺寸为2.5cm×3.0cm，采用浓度为1×10-4mol/L三甲基氯硅烷浸泡8h得到硅烷化载玻片；将帕拉胶膜拉伸后覆盖在载玻片上，压紧；之后制备1.0cm×1.0cm尺寸的反应槽；
5)将预反应溶液A滴加到4)的反应槽中，待溶液铺满整个反应槽后，盖上含层4的芯片；两端用夹子夹紧，置于反应容器中，在氮气保护下65℃反应6h，得到5层芯片；
6)反应停止后，取出芯片。采用蒸馏水和乙酸体积比为9：1的洗脱液对带有分子印迹膜的5层芯片进行洗脱，除去分子印迹膜中的模板分子，得到本案例实施例所述的一种能在水相中检测D-葡萄糖分子的印迹膜传感器芯片；扫描洗脱前后SPR曲线，如图3所示；由图3可得，洗脱前SPR曲线共振角度为61.23度，洗脱后角度为61.06度，证明洗脱液能够洗脱掉分子印迹膜上的模板分子；
7)用制备所得的传感器芯片检测D-葡萄糖的水溶液，溶液浓度为0.1～2mmol/L，每个样品吸附时间为17min，所得到的吸附前后SPR曲线如图4所示。由图4可得，当含有目标分子的水溶液通过芯片表面时，反射率值逐渐增加，且随着样品浓度的增加反射率值变化更为明显，这是由于印迹膜中的印迹孔穴同目标分子D-葡萄糖相互作用引起的。随着目标分子与印迹膜的孔穴接触时间增加，更多的D-葡萄糖分子被吸附到印迹膜内部，进而引起芯片表面的介电常数发生变化，引起折射率随之发生相应的改变。实验结果表明本发明所制得的分子印迹传感器芯片能够对水中的D-葡萄糖样品有响应，且响应迅速。

Claims (8)

1.一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，该芯片包括玻璃片，玻璃片上镀有铬膜和金膜层，其特征在于：在所述金膜层上以自组装的方法引入含不饱和键的单分子层，利用热聚合的方法在单分子层上接枝分子印迹聚合物薄膜，含不饱和键的单分子层为单分子烯烃层；该方法包括如下步骤：
1)采用高真空蒸镀的方法在玻璃基片上镀一层1.5～2nm的铬膜，之后蒸镀一层40～60nm的金膜；
2)制备自组装单分子烯烃层，将步骤1)中新蒸镀的镀金膜玻璃片浸入自组装溶液中，自组装20～30小时后，将其用乙醇冲洗2～5遍，氮气吹干后备用，该玻璃片金膜层上自组装一层致密的单分子烯烃层，所述自组装溶液浓度为1～100mmol/L；所述的单分子烯烃层为N,N-二烯丙基硫脲、二甲基二硫代氨基甲酸烯酯、烯丙基硫醇、1-甲代烯丙基-3-甲基-2-硫脲中的一种；
3)在金膜层表面制备分子印迹膜：将模板分子、功能单体、交联剂、引发剂及致孔剂按比例超声混合溶解，得到预聚合反应溶液A，其中模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比例为1：(2～5)：(3～18)，引发剂的加入量为功能单体总质量的0.5％～3％，致孔剂为有机溶剂，模板分子在混合溶液中的摩尔浓度为0.01～0.1mol/L，功能单体在混合溶液中的摩尔浓度为0.02～0.5mol/L，交联剂在混合溶液中的摩尔浓度为0.03～1.8mol/L；
4)在硅烷化的玻璃片表面制备反应池，其中硅烷化玻璃由载玻片裁制而成，采用浓度为1×10-4mol/L三甲基氯硅烷浸泡5～10h得到硅烷化载玻片；将帕拉胶膜拉伸后覆盖在载玻片上，压紧，之后裁制得到反应池；
5)将预聚合反应溶液A加入到反应池，溶液与金膜表面单分子烯烃层接触，氮气保护下加热50～70℃，反应1～12h；
6)热聚合结束后，以体积比为9：1～7：3的蒸馏水和乙酸的洗脱液洗脱模板分子，在分子印迹膜上留下具有选择性的空穴和结合位点。
2.根据权利要求1所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、4-乙烯基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、3-丙烯酰胺基苯硼酸中的一种或两种。
3.根据权利要求2所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙二醇、1，4-丁二醇中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：自组装溶液为N,N-二烯丙基硫脲、二甲基二硫代氨基甲酸烯酯、烯丙基硫醇、1-甲代烯丙基-3-甲基-2-硫脲中的一种的溶液，溶液中溶剂为乙醇，甲醇，氯仿中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：模板分子、功能单体与交联剂的摩尔比例为1：4：(5～10)；引发剂的加入量为功能单体总质量的0.5％～3％，模板分子在混合溶液中的摩尔浓度为0.05mol/L，功能单体在混合溶液中的摩尔浓度为0.2mol/L，交联剂在混合溶液中的摩尔浓度为1.0mol/L。
7.根据权利要求5所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：热聚合的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、2,2’-偶氮二(2-甲基-4-羧基丁腈)、2,2’-偶氮二(2-氰丙烷-1-磺酸盐)、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过氧化苯甲酰、过硫酸铵、过硫酸钾中的一种。
8.根据权利要求5所述的一种制备水相中检测D-葡萄糖的表面等离子体共振传感器芯片的方法，其特征在于：洗脱液为蒸馏水和乙酸混合溶液，混合体积比为8：1～7：4。
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