CN100482207C - 用于合成性表面活性剂的新颖的脂质混合物 - Google Patents
用于合成性表面活性剂的新颖的脂质混合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于合成性表面活性剂的新颖的脂质混合物。特别的是，本发明提供了用于制备合成性表面活性剂的包含特定量的多不饱和磷脂的特定脂质混合物。所述的表面活性剂及其药物组合物能用于治疗表面活性剂不足，如呼吸窘迫综合征(RDS)。
Description
发明背景
内源性肺表面活性剂降低了肺泡表面上气液界面的表面张力，这防止了肺在呼气末的塌陷。表面活性剂不足是早产儿的一种常见疾病，并会引起呼吸窘迫综合征(RDS)，其能被制剂有效地治疗，该制剂是切碎的哺乳动物肺的脂质提取物或肺灌洗液。所述的制剂是已知的改良的天然表面活性剂，它们主要由磷脂(PLs)例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)和疏水性表面活性剂蛋白B和C(SP-B和SP-C)组成。
为清楚起见，以下是本专利申请中引用的一列PLs：
- 磷脂酰胆碱：PC，
- 磷脂酰乙醇胺：PE，
- 磷脂酰甘油：PG，
- 磷脂酰肌醇：PI，
- 磷脂酰丝氨酸：PS，
- 鞘磷脂：SM，
- 1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油，通常已知为二棕榈酰基-磷脂酰甘油：DPPG，
- 1，2--二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，通常已知为二棕榈酰基-磷脂酰胆碱：DPPC，
- 1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油，通常已知为棕榈酰基-油基-磷脂酰甘油：POPG，
- 1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，通常已知为棕榈酰基-油基-磷脂酰胆碱：POPC，
- 1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸甘油，通常已知为二油基-磷脂酰甘油：DOPG，
- 1-棕榈酰基-2-亚油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，通常已知为棕榈酰基-亚油基-磷脂酰胆碱：PLPC，
- 1-硬脂酰基-2-花生四烯基(arachidonoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱，通常已知为硬脂酰基-花生四烯酰基-磷酸胆碱(SAPC)，
- 1-棕榈酰基-2-花生四烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PAPC)，
- 1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，通常已知为二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺：DPPE，
- 1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，通常已知为二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺：DSPE，
- 1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸，通常已知为二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸：DPPS。
磷脂的甘油部分主要用长链脂肪酸(C14-C20)酯化，脂肪酸依次能是饱和(例如肉豆蔻、棕榈和硬脂酸)、单不饱和(例如油酸)或多不饱和的(例如亚油酸和花生四烯酸)。
包含作为特征残基的中性或两性离子部分例如甘油(PG)、纤维醇(PI)和丝氨酸(PS)的磷脂是已知的酸性磷脂。酸性磷脂的其它实例有DPPG、POPG和DPPS。
表面活性剂通常以水混悬液的形式通过气管滴入到肺而用于早产儿。它们也能给予被各种病状，包括严重的肺功能不全例如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)侵袭的成人。
从生物物理学和药理学/治疗学观点来说，为了具有最佳的性质，表面活性剂制剂应该：
i)有效降低表面张力；ii)具有良好的扩散速度；iii)具有低粘度以便在通过气管内滴入给予微量时能使在水性介质中的浓缩混悬液制剂在肺泡水平上具有最佳的输送和分布性质。
表面活性剂降低表面张力的能力以及其它参数例如扩散速度能在体外使用几种方法来测定，例如Schurch，S.，Bachofen，H.Goerke，J.，Possmayer，H.(1989)＂俘获肺泡法再现原位肺表面活性剂单层的行为。＂J.Appl.Physio.，67：2389-2396记载的“俘获肺泡法”。
表面活性剂制剂的一个最重要的脂质成分是1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，因为在压缩期间它在气-液界面形成了单分子膜，在表面压缩期间能经受相转变(固化)，因此稳定了具有不同大小的肺泡系统。
一般公认的是，为了获得良好的活性，酸性磷脂是最重要的，因为它们能促进DPPC的扩散。
另一方面，高浓度的饱和PL例如DPPC能影响脂质混悬液的其它性质，例如制剂的粘度。
制备小量浓缩混悬液的可能性是通过气管内滴入施用表面活性剂给予低体重新生儿的特别重要的特征。
可作为治疗用的改良天然表面活性剂具有一般包括在25到50mg/ml之间的浓度。它们中仅有一个，“固尔
，是可在较高浓度，即80mg/ml使用的。
从动物组织获得的表面活性剂制剂总之是有一些缺点的，例如它们在有限量中的可用性、生产和灭菌过程的复杂性和有关的生产成本：后果是，已经作出了许多努力来制备合成性表面活性剂。
根据Wilson(Expert Opin Pharmacother 2001，2，1479-1493)，合成性表面活性剂的优越性在于：
没有表面活性剂蛋白的“人造”表面活性剂，仅包括合成性化合物的混合物，主要是磷脂及模仿脂质组合物和天然表面活性剂性能制备的其它脂类；和
“重构”表面活性剂是人造表面活性剂，其中已经加入了分离自动物或通过重组技术制备的表面活性剂蛋白，例如WO95/32992记载的物质，或是合成性表面活性剂蛋白类似物例如WO89/06657、WO92/22315和WO00/47623记载的物质。
重构表面活性剂的开发在很大程度上集中在表面活性剂蛋白类似物上，而对脂质组合物的观注较少。
有关在开发中的合成性表面活性剂的组合物和脂质混合物浓度的信息没有多少。
在III期、关键的、隐蔽的、多国的随机试验中，给予5.8ml/kg或175ml/kg 
用以比较它与
在防止RDS方面的性质(Moya F.等Abstract n.2643 of the Annual Meeting of thePaediatric Academy Societies，San Francisco，May 1-4，2004)。从这些值中能推断出，
的是以30mg/ml的浓度给予的。
在先前的研究中还使用了两个浓度：26.6mg/ml和35mg/ml，以磷脂浓度表示(Am J Respir Crit Care Med 1996，vol153，第404-410页)。
现有技术
在现有技术中，下列文献报道了有关人造和/或重构表面活性剂脂质组合物的数据。
Suzuki等(Eur J Respir Dis 1986，69，336-345)描述了由低分子量表面活性剂蛋白和由DPPC以及1，2-二棕榈酰基sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPG)以80:20重量比组成的磷脂混合物构成的表面活性剂的体外和体内的性质。尽管据报道不饱和的磷脂促进了在气液界面的有效扩散，但是发现DPPG在与小载脂蛋白重组的DPPC系统中优于不饱和的PG。
在Notter等(Clin Perinatology 1987，14，433-479)中，综述了脂质或磷脂例如二油基-PC、PE、胆固醇、短链饱和-PC、脂肪酸和甘油对DPPC再分散性的作用。一般的结果是与单用DPPC相比已经提高了动态再分散。在文章中还报道了由DPPC：卵-PG以7:3的比例构成的人造表面活性剂已经在文献中被使用了。
在Darfler FJ(In Vitro Cell Dev Biol.1990，26(8)，779-83)中，从纯化的合成性脂质中制备了适合用在组织培养中的不含蛋白的脂质微乳液以生成能被过滤灭菌的均匀、水溶性的、稳定性混悬液。观察对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长的作用发现，微乳液组合物是最优的。表2中报道的制备的微乳液包含α-生育酚和至少为16.3％的胆固醇醋酸酯。
在Scripps名义下的WO 89/06657和WO 92/22315是针对SP-B的多肽类似物，尽管在说明书中一般性地报道了(表面活性剂组合物的，编者注释)脂质部分有优选约50到约90，更优选约50到约75重量百分比的DPPC，剩余的是不饱和PC、PG、三酰基甘油、棕榈酸、鞘磷脂或其混合物，然而在这两个申请的实施例中，评价了包含4或10mg/ml的DPPC:PG为3:1(75:25)重量比的混合物的表面活性剂实例的体外性质。为了研究体内性质，使用了20mg/ml浓度的相同混合物，在一些例子中还包含棕榈酸。
在Cochrane等(Science，1991，254,566-568)中，研究了由DPPC和PG 3:1、DPPC和1-棕榈酰基-2-油基PG(POPG)3:1、DPPC和1-棕榈酰基-2-油基PC(POPC)3:1构成的简单肽例如KL4和PL的体外特性。KL4以3％的浓度被检测，而其它肽的浓度为3-5％。还检测了3％ KL4在3:1比例的DPPC:POPG(单不饱和磷脂)和15％棕榈酸的脂质混合物中的体内性质。作者一般性地推断，这些简单肽和DPPC∶POPG的组合物在27天龄胎兔和130龄胎恒河猴中提供了良好的表面活性剂。
在Yu等(Biochimica and Biophysica Acta 1992，1126，26-34)中，使用搏动起泡技术来研究二元磷脂混合物的表面活性，其中混合物包含结合了1％ SP-B的7:3w/w比例的DPPC和不饱和酸性PLs例如卵-PG、POPG或卵-磷脂酸。
在Byk Gulden名义下的针对SP-C多肽类似物的专利申请WO95/32992中，一般性地报道了，磷脂部分能包含DPPC、POPG(或PG)和盐例如氯化Ca或Mg或Na以降低粘度。在实施例中，已经使用了DPPC:POPG:棕榈酸 7:3:0.25+CaCl2的混合物。
Curstedt等(9th International Workshop on SurfactantReplacement，Jerusalem，May 22-25，1994)报道了与下列脂质混合物重组的SP-C类似物的体外活性：DPPC:POPC:DOPG 55:35:10，其中POPG和DOPG是单不饱和磷脂；DPPC:PG 7:3；DPPC:PG:棕榈酸 68:22:9，有或没有CaCl2。与其它脂质混合物相比，包含DPPC:PG:棕榈酸 68:22:9的制剂具有更快的吸收速率和更低的平衡表面张力。
Krill等(Chemistry and Physics of Lipids 71，47-59，1994)得到了同样的结论，在针对评价表面活性剂组合物体外性质的研究中，其中组合物由合成性蛋白B片段、DPPC和POPG构成，他们暗示了存在棕榈酸有助于建立DPPC的稳定脂膜，这能达到低表面张力值。没有报道指出这些成分的比例。
在本申请人名义下的WO00/47623中，针对SP-C类似物肽，一般性地报道了适宜的脂质/磷脂可以选自PC(优选DPPC)、PG、棕榈酸、三酰基甘油、鞘磷脂。在实施例中，已经在体外检测了由一个主张的肽例如SP-C(LKS)构成的并结合了DPPC:PG 7:3w/w或DPPC:PG:棕榈酸 68:22:9w/w/w的表面活性剂制剂。
在Palmblad等(Biochem J 1999，339,381-386)中，报道了与WO00/47623相同的数据。在文章中，还陈述了最佳的体外特性来自包含SP-C(LKS)、SP-DPPC和PG的制剂，即当从脂质混合物省略了棕榈酸时。
Diemel等(J Biol Chem，2002，227，21179-21188)报道了由SP-B和DPPC:DPPG 80:20或DPPC:POPG 80:20或DPPC:POPC:DPPG60:20:20构成的表面活性剂混合物的结构性质。
在较后的混合物中，使用了饱和(DPPG)和单不饱和(POPC)磷脂。
WO 02/06301涉及治疗与脂质氧化或微生物增殖有关的疾病的方法，包括给予含有药理学有效量的抗氧化剂或抗菌性肺表面活性剂蛋白化合物例如蛋白A和D及其衍生物的组合物。在文章中一般性地陈述了与本申请一致的方法，包括给予结合了其可以是有机溶剂、磷脂酰胆碱、胆固醇或表面活性剂磷脂的载体的所述化合物。在实施例中，使用了由卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇和1-油基-2-亚油基-sn-甘油-3磷酸胆碱(分别为1:1:0.15:0.15，w/w)组成的表面活性剂脂质混合物作为底物来检查肺表面活性剂蛋白预防脂质氧化的能力。在这个混合物中，卵-PC和DPPC，以43％的量存在，而1-油基-2-亚油-sn-甘油基-3磷酸胆碱和胆固醇以7％的量存在，分别相对于混合物总重。该混合物不包含酸性磷脂。
US 2002/0072540是针对含有肺表面活性剂的肺表面活性剂组合物，当在室温下在0.9％ w/w氯化钠中以10％的浓度作为粉末或颗粒分散时，在溶胀过程中，通过偏振显微镜方法观察，其在约0.5分钟到约120分钟内能形成气液固界面的双折射网或细管。在文章中一般性地陈述了根据本发明的肺表面活性剂组合物含有磷脂例如饱和和不饱和磷脂或其混合物。磷脂可以包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
Evans等(Lipids 15，524-535)报道大多数完全饱和磷脂的表面粘度是非常高的，某些不饱和磷脂的表面粘度是非常低的。他们还报道了胆固醇降低了DPPC单分子层的表面粘度。然而他们没有教导如何调节表面活性剂制剂磷脂混合物的组合物，以便降低其粘度而在膜压缩期间保持有效降低较低表面张力的能力。
在大多数涉及脂质混合物作为用于肺表面活性剂载体的现有技术文献中，含有饱和PLs尤其是等于或大于70％重量的DPPC并结合了PG或POPG的脂质组合物已经被使用了或建议作为优选，尤其是用于降低表面张力到较低的值。
然而，相对高含量的饱和PLs可以通过提高制剂粘度而影响流变学性质，尤其是当需要浓缩的，即等于或大于约30mg/ml，优选大于40mg/ml，更优选大于50mg/ml的合成表面活性剂组合物时。高粘度确实能负面地影响表面活性剂的扩散以及其由此向肺支气管肺泡部分的分布(King等AmJPhysiol Lung Cell Mol Physiol 2002，282，L277-L284)。此外，为了制备含有具有可接受的粘度并较高含量饱和PLs的脂质混合物的浓缩混悬液，需要采取加热和强力搅拌的操作。
考虑到这些缺点，提供能用在合成性表面活性剂制备中的脂质混合物将是非常有利的，其中的合成表面活性剂当达到体外和体内良好的性质时，其能保持浓缩表面活性剂制剂的较低粘度，以在给予后有利其输送和分布到肺支气管肺泡部分。
发明概述
本发明针对的是脂质混合物，其用于制备含有至少为95％重量磷脂的合成性表面活性剂，所述磷脂含有：
至少为40％重量，优选含有40％到65％重量，更优选含有45％到60重量％，特别是包含在45％到55％重量之间的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)；
大于10％重量，优选大于20％重量，更优选包含在20％到45％重量之间，特别是在30％到40％重量之间的多不饱和磷脂；和
大于10％重量，优选包含在10％到30％重量之间更优选包含15％到30％重量的饱和或单不饱和酸性磷脂，所有的量都基于脂质混合物的总量来计算；
任选还含有至多5％重量的中性脂质。
已经真正发现通过使用具有这种组合的脂质混合物能制备表现良好体外性质特征，即在膜压缩期间的低表面张力和快速分散速率以及良好的生物活性的表面活性剂制剂。在未成熟新生兔中进行的体内实验已经确实证明了包含本发明脂质混合物的重构表面活性剂产生了高潮气量和肺气体量值。
尤其是已经发现包含大于30％重量的不饱和PLs和大于10％重量的酸性磷脂的重构表面活性剂，在肺气体量值方面与那些包含较低量的相比能产生更好的性能。
包含本发明脂质混合物的合成性表面活性剂具有能使浓缩水性混悬液制剂有等于或大于30mg/ml，优选大于40mg/ml，更优选大于50mg/ml到80mg/ml的磷脂混合物的技术特性，其特征在于低粘度，有利的是包含在5到20厘泊之间，优选6到15厘泊之间，从而有利其在给药后输送和分布到肺。
发明详述
本发明脂质混合物和相应的合成性表面活性剂制剂的特性将在以下详述中描述。
有利的是脂质混合物含有至少95％重量，优选至少98％重量的磷脂。磷脂部分包含至少为40％重量，优选包含在40％到65％重量之间，更优选包含在45％到60％重量之间且尤其是包含在45％到55％重量的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，以脂质混合物总重计算。
DPPC能通过合成途径制备或由天然资源获得。
有利的是磷脂部分包含大于10％重量，优选大于20％重量，更优选包含在20％到45％重量之间尤其是在30％到40％重量之间的多不饱和磷脂，以脂质混合物总重计算。
对于多不饱和磷脂，我们意指以前定义的磷脂(PLs)，其中至少一个酯化脂肪酸残基在脂链中包含不止一个双键。典型的多不饱和脂肪酸残基是亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸。这个类型的多不饱和磷脂有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和鞘磷脂(SM)。
优选的多不饱和磷脂是1-棕榈酰基-2-亚油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PLPC)、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PAPC)和1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SAPC)。
多不饱和磷脂通常是商业上可得到的，并且能通过合成途径制备或从自然资源，例如哺乳动物的组织获得。
在本发明的一个实施方案中，作为多不饱和磷脂的来源，可使用天然提取物。例如，分离自卵(卵-PE)的磷脂酰乙醇胺或包含从肝(肝-PL)分离得到的多不饱和脂肪酸的磷脂混合物也是能被使用的。卵-PE包含不同的酯化酸，其中有多不饱和亚油酸和花生四烯酸。肝-PL通常具有平均重量百分比为约50％ PC、25％ PE、10％鞘磷脂、15％酸性磷脂的组成，其中一些PL类被多不饱和酸酯化。本领域技术人员应该使用能使脂质混合物的最终组合物满足本发明脂质混合物需要的这样一种量的卵-PE和/或肝-PL。
有利的是，磷脂部分包含大于10％重量，优选包含在10％到30％重量之间，更优选包含在15％到30％重量之间的饱和或单不饱和酸性磷脂，以脂质混合物的总量计算。
对于饱和的酸性磷脂，我们意指磷脂例如磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸，其中酯化的脂肪酸是饱和的，而对于单不饱和酸性磷脂，我们意指那些至少一个酯化脂肪酸是单不饱和的物质。饱和PLs的典型实施例有1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)和1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(DOPG)和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DPPS)。单不饱和PLs的实例有1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)和1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)。优选的是，本发明脂质混合物中的酸性磷脂将是1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)及其混合物。
除了DPPC、多不饱和磷脂和饱和或单不饱和酸性磷脂外，本发明脂质混合物的磷脂部分还能包含其它的磷脂，其中酯化脂肪酸是饱和或单不饱和的。所述类别的典型磷脂有1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
有利的是，在本发明的脂质混合物中，饱和和不饱和(单不饱和和多不饱和)磷脂的比例将包含在65:35到40:60重量之间，优选在55:45和45:55重量之间，酸性磷脂和其它磷脂的比例将包含在10:90到30:70重量之间，优选在15:85到25:75重量之间。
任选的是，本发明的脂质混合物包含至多5％重量，优选等于或小于2％重量的中性脂质。中性脂质包含三酰基甘油、胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸例如棕榈酸。
优选的中性脂质是胆固醇，因为它可以有助于降低脂质混合物的粘度。
作为本发明脂质混合物的实施例，已经使用的是DPPC:PLPC:SAPC:DPPG:POPG重量比为45:30:10:5:10和DPPC:肝PL:POPG重量比为50:40:10。
本发明的脂质混合物在重构表面活性剂制备中是特别有用的。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及含有前述脂质混合物并结合了表面活性剂蛋白(分离自动物或通过重组技术例如WO95/32992记载的技术生成)，或结合了表面活性剂蛋白SP-B或SP-C的合成性类似物(例如WO89/06657、WO92/22315和WO00/47623记载的物质)或其混合物的重构表面活性剂。
蛋白能是任意的表面活性剂蛋白，其选自SP-A、SP-B、SP-C、SP-D或其合成或重组的类似物。
本发明的重构表面活性剂也能含有多粘菌素，优选多粘菌素B，作为表面活性剂蛋白SP-B的官能取代基。
对于SP-C的合成类似物，优选的是，将使用根据单字母氨基酸编码的通式(I)肽：
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XCB)mXdGALLΩGL (I)
其中：
X是选自I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；
B是选自K、I、W、F、Y和鸟氨酸的氨基酸；
Z是S，任选被通过酯键与侧链相连的包含12-22个碳原子的酰基取代；
Ω是选自M、I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；
a是从1到19的整数，优选1到11；
b是从1到19的整数，优选1到8；
c是从1到21的整数，优选1到5；
d是从0到20的整数，优选1到11；
e是0或1；
f是0或1；
n是0或1；
m是0或1；
其中，优选的是：
-n+m≥0；
-f≥e，
-(XaB)n(XbB)n(XCB)mXd是具有最大22个氨基酸，优选10到22的序列。
甚至更优选的是使用式(II)的肽
IPSSPVHLKRLBLLLLLLLLILLLILGALLΩGL (II)
其中：
B是选自K、W、F、Y和鸟氨酸的氨基酸；
Ω是选自M、I、L和nL(正亮氨酸)的氨基酸；
其中丝氨酸能任选被酰化，例如被棕榈酰基酰化。
下文中报道的非酰化形式的肽(SP-C33)是本发明最优选的：
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP-C33)
所述的肽能根据WO00/47623报道的方法制备。
重构表面活性剂中的表面活性剂蛋白或肽的量将在为混合物总重0.1％到5％之间，优选0.5％到3％，更优选在1％到2％之间的范围内变化。
主张的重构表面活性剂将通过在有机溶剂中混合带有肽或蛋白的脂质混合物溶液，随后干燥该制剂直至获得干燥的粉末来制备。
本发明还涉及含有包含本发明脂质混合物的合成表面活性剂的药物制剂，用于给予需要表面活性剂不足治疗性治疗的受治者。
所述的药物制剂将通过气管内给予或通过在水性介质中的混悬液形式的喷雾剂或通过在适宜推进剂的气溶胶中给予。优选的是，它们将作为在0.9％氯化钠水溶液中的混悬液经气管内给予。有利的是，表面活性剂的浓度(以磷脂的含量表示)将大于30mg/ml，优选大于40mg/ml，更优选大于50mg/ml，甚至更加优选在50到80mg/ml之间。
在包含于50到80mg/ml之间的表面活性剂浓度下，在250°C时使用在100到500s-1范围内的切变率测定的表面活性剂粘度将有利地包含在2到30厘泊之间，优选在5到20厘泊之间，更优选包含在6到15厘泊之间，甚至更加优选在6到10厘泊之间。
含有本发明脂质混合物的表面活性剂能够被用于治疗所有的表面活性剂不足病例，典型的是治疗新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)、成人急性窘迫综合征(ARDS)、胎便吸入综合征(MAS)、几类肺炎和支气管肺发育不良。
本发明的优点将通过以下实施例进行说明。
实施例1-重构表面活性剂的制备
材料
磷脂1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1-棕榈酰基-2-亚油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PLPC)、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SAPC)和从肝(肝-PL)中分离得到的磷脂混合物已经用于制备脂质混合物并且是商业上可得到的。
肽SP-C33根据WO00/47623报道的方法合成。
重构表面活性剂的制备
将溶解在氯仿/甲醇 98:2(v/v)中的脂质，分别与重量比为45:30:10:5:10和50:40:10的DPPC:PLPC:SAPC:DPPG:POPG和DPPC:肝PL:POPG混合，以便获得根据本发明所教导的脂质混合物(脂质混合物A和B)。相应的重构表面活性剂制剂(表面活性剂A和B)通过向脂质混合物中加入2％重量的SP-C33来制备。表面活性剂A在氮气下蒸发，并分别以10mg/ml和80mg/ml的脂质浓度重新混悬在150mmol/1 NaCl中，而表面活性剂B则以80mg/ml的脂质浓度重新混悬。
表面活性剂的B肝-PL磷脂组合物的特征如下：磷脂酰胆碱(PC)50％、磷脂酰乙醇胺(PE)25％、鞘磷脂(SM)10％、酸性磷脂15％。
实施例2-体外活性
在俘获性气泡表面活性剂计(surfactometer)中测定表面性质。室中充满了蔗糖溶液并注入了2μl表面活性剂A(10mg/ml)；然后吹入10微升空气产生气泡。从膜吸收和随后的准静态循环面积压缩期间气泡的形状来测定气液界面的表面张力。
表面活性剂A证明了其在要求达到最小表面张力的表面面积压缩方面中具有良好的性能。
实施例3-表面活性剂A的体内活性
在27天孕龄时通过剖宫产术分娩不足月的(足月＝31天)兔胎儿(n＝34)。分娩时，在腹膜内用戊巴比妥钠(0.1ml；6mg/ml)麻醉，切开气管，在腹膜内用泮库溴铵(0.1-0.5ml；0.2mg/ml)使其麻痹并在37°C下保存在体积描记器系统中。对它们进行机械通风(ventilated)并行输送100％氧的改良伺服操纵电子呼吸器。滴注表面活性剂后，首先将峰压力升高到35cmH2O 1分钟，以促进表面活性剂在肺中的分布，然后降低到25cmH2O。然后在25cmH2O的峰压力下对动物进行通风15分钟，降低到20cmH2O 5分钟，进一步在15cmH2O下进行5分钟，然后再次升高到25cmH2O进行5分钟。每隔5分钟通过连接了体积描记器盒的呼吸速率计记录潮气量。
频率是每分钟40，吸气：呼气时间比为1:1。没有使用呼气末正压。
将不成熟的新生兔在出生时随机化以通过气管插管接受2.5ml/kg体重的表面活性剂A(80mg/ml)。在对照动物中，不向气道中滴入物质。所有的动物都通风30分钟。
用Sun等，Eur Respir J 1991，4，364-370记载的体积描记器系统测定潮气量(VT)，呼气末肺气体量(LGV)由肺体积和肺净重之间的差异评价(Scherle等Mikroscopie 1970，26，57)。
在这些实验中，我们发现表面活性剂A具有较高的潮气量。肺气体量值也显著增加。
实施例4-表面活性剂B的体内活性
在与实施例3相同的动物模型中比较表面活性剂B(80mg/ml)和商业上可得到的改良天然表面活性剂(固尔苏)(80mg/ml)导致的潮气量和肺气体量：根据本发明制备的重构表面活性剂B显示了能与改良的天然表面活性剂相比的活性。
Claims (16)
1.用于制备合成性表面活性剂的脂质混合物，所述的脂质混合物主要由至少95％重量的磷脂组成，所述的磷脂含有：
i)至少为40％重量的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；
ii)大于10％重量的多不饱和磷脂，其中多不饱和磷脂选自1-棕榈酰基-2-亚油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和分离自卵的磷脂酰乙醇胺；和
iii)大于10％重量的饱和或单不饱和酸性磷脂，其中酸性磷脂选自1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油、1，2-二油基-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸；
所有的量都基于脂质混合物的总重量计算。
2.根据权利要求1的脂质混合物，其中所述酸性磷脂选自1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰基-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油或它们的混合物。
3.根据权利要求1或2的脂质混合物，进一步包含占脂质混合物总重至多5％重量的中性脂质，所述中性脂质选自三酰基甘油、胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸。
4.根据权利要求1或2的脂质混合物，其中1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的量在40％到65％重量之间。
5.根据权利要求1或2的脂质混合物，其中所述多不饱和磷脂的量在10％-40％重量之间。
6.根据权利要求5的脂质混合物，其中所述量在15％到30％重量之间。
7.含有权利要求1到6任一项的脂质混合物的合成性表面活性剂，进一步包括一种或多种表面活性剂蛋白。
8.根据权利要求7的合成性表面活性剂，其中所述表面活性剂蛋白选自SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。
9.根据权利要求7的合成性表面活性剂，其中所述表面活性剂蛋白是根据氨基酸单字母编码的通式(I)的SP-C的类似物：
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLΩGL (I)
其特征在于：
X是选自I、L和nL的氨基酸；
B是选自K、I、W、F、Y和鸟氨酸的氨基酸；
Z是S，任选被通过酯键与侧链相连的包含12-22个碳原子的酰基取代；
Ω是选自M、I、L和nL的氨基酸；
a是从1到19的整数；
b是从1到19的整数；
c是从1到21的整数；
d是从0到20的整数；
e是0或1；
f是0或1；
n是0或1；
m是0或1；
其中：
-n+m≥0；
-f>e，
-(XaB)n(XbB)n(XCB)mXd是最大具有22个氨基酸的序列。
10.根据权利要求9的合成性表面活性剂，其中(XaB)n(XbB)n(XCB)mXd是具有10至22个氨基酸的序列。
11.根据权利要求9的合成性表面活性剂，其中SP-C类似物具
有式(II)：
IPSSPVHLKRLBLLLLLLLLILLLILGALLΩGL (II)
其中：
B是选自K、W、F、Y和鸟氨酸的氨基酸；和
Ω是选自M、I、L和nL的氨基酸。
12.根据权利要求7-11任一项的合成性表面活性剂，其为在水溶液中的混悬液形式。
13.根据权利要求12的合成性表面活性剂，其中以磷脂含量表示的表面活性剂的浓度为30-80mg/ml。
14.根据权利要求1-6任一项的脂质混合物制备用于治疗与表面活性剂不足有关的疾病的药物的用途。
15.根据权利要求14的用途，其中所述疾病选自新生儿呼吸窘迫综合征、成人急性窘迫综合征、胎便吸入综合征、肺炎和支气管肺发育不良。
16.根据权利要求15的用途，其中所述疾病是新生儿呼吸窘迫综合征。
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