CN100482077C - 一种新型低毒农作物杀菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀菌活性强且毒性低、对农作物病害具有防治作用的甲壳低聚糖金属配合物杀菌剂的制备方法。本发明通过以高分子量的壳聚糖为原料，在均相溶剂中采用微波辐射技术进行降解，在降解液中直接加入金属化合物进行配位反应，再通过沉淀、过滤、洗涤、烘干后，即得甲壳低聚糖金属配合物。本发明的配合物对农作物病原菌具有很强的抑制效果，无毒无害无副作用，制备方法简单且使用范围广，可作为植物杀菌剂应用于农作物病害的防治。

Description

一种新型低毒农作物杀菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种金属有机化合物杀菌剂，特别是涉及一种毒性低且对农作物病害具有防治作用的甲壳低聚糖金属配合物杀菌剂的制备方法。该杀菌剂对作物病原菌有显著抑制作用且具有SOD样活性作用，可提高作物的抗逆性能。

背景技术

在农用杀菌剂中开发最早，使用时间最长、应用面积最大、杀菌效果最好的品种就是铜基杀菌剂，铜制剂一般既能杀细菌又能杀真菌，具有保护和预防作用，又兼有一定的治疗和铲除作用。铜离子也是植物生长代谢所必须的微量元素，虽然过量的铜离子会造成植物药害，但适量的铜离子可以使植物生长得更健壮，使用铜制剂作为杀菌剂，除了有防治病害的作用之外，还可以起到微量元素肥料的作用。在目前铜制剂市场上，无论是国产农药还是进口农药，大多数仍以无机铜制剂为主。虽然无机铜制剂在杀菌市场中占有极其重要地位，在农作物病害的防治中功不可灭，但它的局限性也是显而易见的：不可与大多数酸性杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂混用或混配，要求单独使用；高温、高湿或低温、潮湿气候时，容易发生药害；容易诱发螨类的增殖，药效不高，需加大用药量来提高药效；对桃、李、杏、苹果等敏感作物要求严格慎用。为克服无机铜杀菌剂的上述弊端，发挥铜离子高效杀细菌杀真菌的优势，有机铜制剂的开发成为重要的发展方向。

锌在农业中的重要性在20世纪早期就已认识到，而锌在植物中的特殊作用直到20世纪60年代后期才被肯定。锌是农作物生长所必需的一种微量元素，锌的生理作用是多方面的。现已证明，锌是多种酶的组成成分或催化剂。乙醇脱氢酶、碳酸酐酶、RNA聚合酶都含有结合态锌，国内外的研究证明锌能促进蛋白质的合成。锌与生长素代谢有关，锌能促进吲哚和丝氨酸合成色氨酸，从而间接影响生长素的形成。此外，锌与光合作用、呼吸作用也有一定关系。锌可提高小麦光合强度，同时也增强呼吸强度，但净光合率仍然提高，对种子、果实的形成和发育起重要作用。锌离子还可增强植物的抗菌活性，对植物病毒病也有一定的防治作用。在与病原菌接触时，锌离子缓慢释放出来，由于锌离子具有氧化还原性，并能与有机物(硫代基、羧基、羟基)反应，能与病原菌细胞膜及膜蛋白结合，破坏其结构，进入细胞后破坏电子传递系统的酶并于DNA反应，达到杀菌目的。在农业上使用最多的是硫酸锌，主要起到锌肥作用，增加锌元素含量，其杀菌活性不高。无机锌制剂具有一定的腐蚀性，稳定性较差，药效低，作物的吸收率也较低且大量使用会产生一定药害。有机锌制剂的开发也是重要的研究方向。

壳聚糖(Chitosan)是自然界中含量仅次于纤维素的天然生物高分子，具有无毒、无污染、良好的生物相容性和生物可降解性等多种优良性能，抗菌性是其重要功能活性之一。壳聚糖能抑制多种细菌的生长和具有抗真菌活性，尤其对真菌和丝状菌类有独特的效果。因此可作为天然抗菌剂进一步开发利用。早在1979年，Allan等就提出壳聚糖具有广谱抗菌性。Lee等人研究认为，在植物病原菌与寄生植物之间，壳聚糖对植物病原菌的孢子发芽和生长有阻碍作用。国内外研究表明，壳聚糖对椒疫霉病菌、水稻恶苗病菌、苗木立枯病菌、烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌和油菜菌核病菌等多种病原真菌具有良好的抑制效果。赵蕾等人研究报道，壳聚糖除了对烟草黑胫病菌的抑制作用，还能诱导烟草植株的抗病性，提高叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PO)和多酚氧化酶(PPO)3种防御酶的活性。这几种酶活性的增强对植物抗病反应是十分有利的。

综上所述，壳聚糖不仅能抑制许多病原菌的生长，而且能诱导植物的多种抗病性反应，如几丁质酶的积累，诱导葡聚糖酶的合成等。此外，壳聚糖具有无毒、施用后可被土壤微生物完全降解，不会对土壤微环境造成不利影响等优点。但壳聚糖作为杀菌剂存在着药效不高、见效慢的缺点，影响了其进一步应用。因此，开发抗菌活性更高的壳聚糖及其衍生物产品作为新型生物杀菌剂，是提高植物对病害的抗性，减少化学农药的施用量的有效途径。壳聚糖分子中含有大量的羟基、氨基或酰氨基，是金属离子的良好配体，可与金属离子进行配位反应制备金属有机配合物，显著提高其杀菌活性，同时减少金属离子的使用量，降低其毒害作用并能大大提高作物的吸收利用率。国内外对壳聚糖金属配合物的研究大多集中在催化活性方面以及作为微量元素补剂的应用方面，但将其用于农作物病害的防治尚未见报道。

近年来随着人们对壳聚糖的深入研究，发现其抑菌活性与分子量密切相关。选择特定分子量范围的壳聚糖与金属进行反应制备配合物，对增强配合物的抑菌效果具有重要意义。总的来说，低分子量的甲壳低聚糖具有一些独特的功能性质和生理活性，其抑菌作用也最强。但分子量太小会影响其与金属的配位能力，配合物的稳定性较差，金属离子易解离出来。综合考虑以上因素，选择分子量在3,000-30,000的甲壳低聚糖作为金属离子的配体制备配合物，不但能发挥低聚糖本身较强的抑菌活性，而且有较强的金属配位能力，使得配合物中金属离子的含量较高，能充分发挥金属离子杀菌活性强的优势，二者的相互作用，将起到协同增效作用，显著增强对作物病害的防治效果。

作物生长随时可能遭受到不良环境因子诸如病菌、高温、低温、干旱、水涝以及高盐的影响，这些环境因子的变化有时非常剧烈，超过了作物正常生长所能忍受的范围，从而导致作物伤害。这些不良环境因子所构成的不良环境就是逆境。处于逆境中的作物生长发育会受到不同程度的影响，如生长抑制物质增多、光合作用下降等，轻则出现生长不良、萎焉、部分坏死等，重则导致作物死亡。生活在自然界的植物之所以能够适应一定程度的逆境是因为它们都具有一套抵御逆境伤害的机制。作为一种重要的氧自由基清除酶——超氧化物歧化酶(SOD)，其活性水平对植物抗逆性有着重要影响，国内外研究表明，在逆境条件下植物的抗性与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关，而甲壳低聚糖金属配合物具有SOD样活性作用，对氧自由基具有很强的清除能力，其模拟酶的功能对于增强作物的抗逆性具有重要作用。

近半个世纪，随着化学农药和化肥等化学物质的使用，造成有害物质在植物体内、水中及土壤中富集，一部分有害物质通过物质循环进入农作物及人畜体内，特别是近年来使用量越来越大，对农产品及生态环境造成极大威胁，从而危害人体健康，引发各种疾病。新的趋势是开发无公害，具广谱抑菌的生物农药。甲壳低聚糖金属配合物具有杀菌作用、保护作用并能促进作物生长、提高其抗逆性等多种功能活性，是一类很有开发潜力的金属有机杀菌剂。

通过降解反应制备低分子量壳聚糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法及酸降解法三大类。氧化降解法因无污染、易于工业化等有点，成为目前研究较多的方法。但传统的水浴加热方式，反应时间较长且降解不均匀。微波的热效与传统加热不同：后者是外部加热，通过表面能量吸收再传导到内部，前者是微波进入物体内部，分子在电磁波作用下，并随电磁场的变化而变化，产生高频振荡，这样极化分子本身的热运动和分子之间的相对运动会产生类似摩擦、碰撞、振动、挤压的作用，使所在体系能量增高并快速升温。将微波辐射技术取代传统加热方式应用于化学领域，是80年代后期兴起的一项新技术，目前微波辐射已广泛应用于多种化学反应，充分显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的就是提供一种对农作物病害具有防治作用的甲壳低聚糖金属配合物杀菌剂的制备方法及其对作物病害的防治作用。利用壳聚糖结构的特殊性，含有活泼的-OH、-NH₂，在N或O上可接入杀菌活性较强的金属离子，发挥壳聚糖分子和金属离子的协同增效作用，显著增强其杀菌活性，并能减少金属离子的使用量，降低其毒害作用。同时，采用微波辐射技术降解壳聚糖，并直接在其降解液中加入金属化合物进行配位反应，通过一步法制备甲壳低聚糖金属配合物。微波技术的应用，能够降低能耗，减少污染，节省时间和原料，降低生产成本，是一项具有产业化前景和广泛市场潜力的应用技术。

本发明涉及的壳聚糖硫酸酯金属配合物是式(1)化合物。其化学一般式为：

     式(1)

其中M＝Cu或Zn，n为18.6-186，m:n为(1:4)-(1:2)，R₁为H或Ac。

本发明中，金属离子M主要是与壳聚糖C₂位的氨基(-NH₂)和C₃位羟基(-OH)配位，配位的壳聚糖单元可以是连续的也可以是不连续的。金属含量为10.02-15.16％(重量百分比)。

为实现本发明的目的所采取的技术措施如下：

1、准确称取一定量的壳聚糖原料，溶于15-20倍体积的0.5-5％盐酸或乙酸溶液中，搅拌均匀，形成均一胶体后，加入与壳聚糖一定配比的H₂O₂(过氧化氢与壳聚糖的摩尔比为0.5-3)，封盖，将反应器置于微波炉中，在微波功率340-850W下，反应2-10min(间歇操作，间隔时间为1～2min)，取出快速冷却至室温(在冰水浴中冷却)，在磁力搅拌下滴加金属化合物水溶液，在偏酸性条件下搅拌一定时间，加入3-4倍量的丙酮或乙醇(或二者等体积的混合液)生成沉淀，过滤，用70-80％乙醇洗涤至氯化钡溶液检测无白色沉淀生成；最后用无水乙醇洗涤2次，在50-80℃下烘干至恒重，粉碎机粉碎后获得甲壳低聚糖金属配合物。

2、本发明涉及的壳聚糖分子量在50-100万之间，脱乙酰度为65-100％。

3、本发明中，金属化合物为铜化合物或锌化合物，对其没有特别限定，铜化合物包括硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、醋酸铜，锌化合物包括硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、醋酸锌。壳聚糖与金属化合物的摩尔比为1:1。反应在室温下进行，反应时间为2-12小时，反应溶液pH为4-6，用稀氨水调pH。

4、本发明制备的甲壳低聚糖铜配合物为蓝色粉末状固体，甲壳低聚糖锌配合物为白色粉末状固体。

5、本发明的甲壳低聚糖金属配合物不溶于水，易溶于稀盐酸。

6、本发明的甲壳低聚糖金属配合物可以用一般的化学分析手段进行表征。例如，红外光谱，紫外光谱、核磁共振、元素分析等。

7、本发明中甲壳低聚糖金属配合物中的金属含量采用络合滴定法测定，其中甲壳低聚糖铜配合物中铜含量为12.25-15.16％，甲壳低聚糖锌配合物中锌含量为10.02-13.38％。

本发明的特点：

1、本发明采用一步法制备甲壳低聚糖金属配合物，通过以高分子量的壳聚糖为原料，在均相溶剂中采用微波辐射技术进行降解，在降解液中直接加入金属化合物进行配位反应，经沉淀、洗涤、烘干后得甲壳低聚糖金属配合物。壳聚糖采用微波均相降解法降解成甲壳低聚糖后，其生物活性功能特别是抑菌及对氧自由基清除活性有显著提高。

2、本发明中的铜、锌离子本身具有很强的杀菌活性，又能促进植物的生长，但其药效低、大量施用对某些植物易产生药害，在病害防治方面存在一定的局限性。甲壳低聚糖是一种天然高分子多糖，具有广谱的杀菌活性和多种生物活性，且能够诱导植物抗病体系产生免疫力，但其杀菌活性不是很高，也不具有特异性。二者形成配合物后可产生协同增效作用，杀菌活性显著增强，且作物吸收利用率大大提高，可扩大其应用范围，同时降低金属离子的使用量。为金属有机化合物在农用杀菌剂方面的应用开辟新途径。

3、本发明的甲壳低聚糖金属配合物对氧自由基具有很强的清除能力，具有SOD样活性作用，可维持植物体内较高的SOD活性水平，增强植物的抗逆性能，使植物体能够降低各种不良环境因子对其的影响，从而间接促进植物的生长发育。

4、本发明与传统的加热方法相比，微波辐射技术能够大大缩短反应时间，具有反应速度快，副反应少，产品质量均一，产率高，操作简单等优点。本发明采用微波辐射均相降解壳聚糖，与非均相降解相比较，反应速度快，且产物分子量分布较窄。本发明采用一步法制备甲壳低聚糖金属配合物，减少了中间环节，降低了生产成本且产率提高。

5、本发明的甲壳低聚糖金属配合物对农作物病原菌具有很强的抑制作用，无毒无害无副作用，制备方法简单，可有效抑制苹果腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌等病菌的生长，可作为高效、低毒的农用杀菌剂，用于农作物病害的防治。

附图说明

图1为甲壳低聚糖金属配合物及其配体的紫外谱图。

图2为甲壳低聚糖铜配合物的红外谱图，其特征红外(cm^-1)：3389.42；2929.93；1645.52；1379.73；1317.19；1088.88；888.55；603.26。

图3为甲壳低聚糖锌配合物的红外谱图，其特征红外(cm^-1)：3383.46；1617.21；1429.39；1397.98；1321.57；1109.695；895.43；618.41。

图4为甲壳低聚糖的红外谱图，其特征红外(cm^-1)：3447.38；2879.33；1661.11；1602.60；1420.30；1381.33；1321.89；1160.43；1075.65；891.48；664.32。

具体实施方式

实施例1

10g壳聚糖(Mw＝7.6×10⁵，脱乙酰度为84.1％)，溶于150mL1％盐酸溶液中，搅拌均匀形成均一胶体后，加入与壳聚糖等摩尔量的H₂O₂，封盖，将反应器置于微波炉中，850W微波功率下反应3min(间歇操作，每间隔1-2min，启动微波1min)，得淡黄色透明溶液，取出快速冷却至室温，然后在磁力搅拌下(磁力搅拌采用78-1型磁力搅拌器)反应液中直接滴加与壳聚糖等摩尔量的CuSO₄水溶液，在pH为6条件下搅拌4h，加入3-4倍量的丙酮形成沉淀，过滤，70-80％乙醇洗涤数次，用氯化钡溶液检测无白色沉淀生成；最后用无水乙醇洗涤2次，烘干至恒重，粉碎机粉碎后，即得蓝色粉末状固体。

该配合物采用络合滴定法测定表明铜含量为15.16％(重量百分比)。紫外光谱分析(图1)表明，甲壳低聚糖铜配合物(图1b)的最大吸收峰与甲壳低聚糖(图1a)相比，向低波长移动35nm。这是由于配合物中分子内电子跃迁所需量较高，表明配位作用的发生。红外光谱分析(图2)表明，甲壳低聚糖铜配合物与甲壳低聚糖(图4)相比，位于3447cm^-1处的吸收峰向低频分别位移58cm^-1，且吸收峰变尖，说明-NH₂和-OH参与了配位反应。位于1602cm^-1处的δ_N-H吸收峰，与Cu配位后该峰消失，进一步说明-NH₂参与了配位反应；位于1661cm^-1处的乙酰氨基吸收峰，形成铜配合物后向低频位移16cm^-1，且位于1381cm^-1处的乙酰基的δ_C-H吸收峰和位于1321cm^-1处的v_C-N吸收峰都发生一定位移，说明部分乙酰氨基参与了配位反应，位于1076cm^-1处表征仲羟基的吸收峰有一定位移，向高频位移了13cm^-1，这说明仲羟基参与了配位反应；形成配合物后，于603cm^-1处出现新的吸收峰为自由SO₄ ^2-的吸收峰。

通过紫外、红外等分析手段对其结构进行分析。从紫外光谱可知，配合物的最大吸收峰与低分子量壳聚糖相比均发生了较大的位移；红外光谱显示，形成配合物后，壳聚糖的部分特征吸收峰也发生了一定位移，证明壳聚糖金属配合物中确实存在配位键，壳聚糖中主要是-NH₂和-OH参与了与金属的配位，部分乙酰氨基也参与了配位。

实施例2

10g壳聚糖(Mw＝7.6×10⁵，脱乙酰度为84.1％)，溶于150mL1％盐酸溶液中，搅拌均匀形成均一胶体后，加入与壳聚糖等摩尔量的H₂O₂，封盖，将反应器置于微波炉中，850W微波功率下反应3min(间歇操作，每间隔1-2min，启动微波1min)，得淡黄色透明溶液，取出快速冷却至室温，然后在磁力搅拌下(磁力搅拌采用78-1型磁力搅拌器)反应液中直接滴加与壳聚糖等摩尔量的ZnSO₄水溶液，在pH为6条件下搅拌4h，加入3-4倍量的丙酮形成沉淀，过滤，70-80％乙醇洗涤数次，用氯化钡溶液检测无白色沉淀生成；最后用无水乙醇洗涤2次，烘干至恒重，粉碎机粉碎后，即得白色粉末状固体。

该配合物采用络合滴定法测定表明锌含量为13.38％(重量百分比)。紫外光谱分析(图1)表明，甲壳低聚糖锌配合物(图1c)的最大吸收峰与甲壳低聚糖(图1a)相比向低波长移动46nm。这是由于配合物中分子内电子跃迁所需量较高，表明配位作用的发生。红外光谱分析(图3)表明，甲壳低聚糖铜配合物与甲壳低聚糖(图4)相比，位于3447cm^-1处的吸收峰向低频分别位移64cm^-1，且峰形发生变化，说明-NH₂和-OH参与了配位反应。位于1602cm^-1处的δ_N-H吸收峰，与Zn配位后向高频位移了15cm^-1左右，进一步说明-NH₂参与了配位反应；位于1661cm^-1处的乙酰氨基吸收峰，形成锌配合物后该峰消失，且位于1381cm^-1处的乙酰基的δ_C-H吸收峰发生一定位移，说明部分乙酰氨基参与了配位反应；位于1076cm^-1处表征仲羟基的吸收峰有一定位移，向高频位移了34cm^-1，这说明仲羟基参与了配位反应；形成配合物后，于618cm^-1处出现新的吸收峰为自由SO₄ ^2-的吸收峰。

通过紫外、红外等分析手段对其结构进行分析。从紫外光谱可知，配合物的最大吸收峰与低分子量壳聚糖相比均发生了较大的位移；红外光谱显示，形成配合物后，壳聚糖的部分特征吸收峰也发生了一定位移，证明壳聚糖金属配合物中确实存在配位键，壳聚糖中主要是-NH₂和-OH参与了与金属的配位，部分乙酰氨基也参与了配位。

实施例3

10g壳聚糖(Mw＝7.6×10⁵，脱乙酰度为84.1％)，溶于200mL1％盐酸溶液中，搅拌均匀形成均一胶体后，加入与壳聚糖摩尔比为0.5的H₂O₂，封盖，将反应器置于微波炉中，340W微波功率下反应10min(间歇操作，每间隔1-2min，启动微波1min)，得黄棕色透明溶液，取出快速冷却至室温，然后在磁力搅拌下(磁力搅拌采用78-1型磁力搅拌器)反应液中直接滴加与壳聚糖等摩尔量的CuSO₄水溶液，在pH为4条件下搅拌12h，加入3-4倍量的丙酮/乙醇混合液(1:1)形成沉淀，过滤，70-80％乙醇洗涤数次，用氯化钡溶液检测无白色沉淀生成；最后用无水乙醇洗涤2次，烘干至恒重，粉碎机粉碎后，即得蓝色粉末状固体。

该配合物采用络合滴定法测定表明锌含量为12.25％(重量百分比)。按实施例3壳聚糖微波降解的方法，采用粘度法测定甲壳低聚糖的分子量为3,600，甲壳低聚糖收率为55.1％。

实施例4

10g壳聚糖(Mw＝7.6×10⁵，脱乙酰度为84.1％)，溶于200mL1％乙酸溶液中，搅拌均匀形成均一胶体后，加入与壳聚糖摩尔比为3的H₂O₂，封盖，将反应器置于微波炉中，680W微波功率下反应2min(间歇操作，每间隔1-2min，启动微波1min)，得黄棕色透明溶液，取出快速冷却至室温，然后在磁力搅拌下(磁力搅拌采用78-1型磁力搅拌器)反应液中直接滴加与壳聚糖等摩尔量的ZnSO₄水溶液，在pH为5条件下搅拌2h，加入3-4倍量的乙醇形成沉淀，过滤，70-80％乙醇洗涤数次，用氯化钡溶液检测无白色沉淀生成；最后用无水乙醇洗涤2次，烘干至恒重，粉碎机粉碎后，即得白色粉末状固体。

该配合物采用络合滴定法测定表明锌含量为10.02％(重量百分比)。按实施例4壳聚糖微波降解的方法，采用粘度法测定甲壳低聚糖的分子量为8,200，甲壳低聚糖收率为72.8％。

实施例5(比较例)

10g壳聚糖(Mw＝7.6×10⁵，脱乙酰度为84.1％)，溶于150mL1％盐酸溶液中，搅拌均匀形成均一胶体后，加入与壳聚糖等摩尔量的H₂O₂，封盖，将反应器置于微波炉中，850W微波功率下反应3min(间歇操作，间隔时间1-2min)，得淡黄色透明溶液，取出快速冷却至室温，用1mol/L NaOH溶液调样品液pH至中性，70-80％乙醇洗涤数次，最后用无水乙醇洗涤2次，烘干至恒重，粉碎机粉碎后，即得淡黄色粉末状甲壳低聚糖。

该配合物采用粘度法测定壳聚糖的分子量为20,000。产物收率为95.8％。

抑菌活性实验研究

采用生长速率法测定试样对四种作物病原菌的抑菌活性。样品用0.1mol/LHCl溶液溶解，配制成一定浓度的溶液。以50％多菌灵可湿性粉剂作阳性对照，以0.1mol/L HCl溶液作空白对照，测定不同浓度的样品对蕃茄早疫病菌的抑菌活性、黄瓜枯萎病菌、苹果腐烂病菌和苹果轮纹病菌4种病原菌的抑制效果。

应用例1(对苹果腐烂病菌的抑制效果)

称取实施例1合成的甲壳低聚糖铜配合物(LCTS-Cu)、实施例2合成的甲壳低聚糖锌配合物(LCTS-Zn)、甲壳低聚糖(LCTS，比较例)、壳聚糖原料(CTS，比较例)，用0.1mol/L HCl溶液溶解配制成一定浓度的溶液。以50％多菌灵可湿性粉剂为阳性对照，以0.1mol/L HCl溶液为阴性对照。测试在3个样品浓度下，即：5μg/mL，50μg/mL和500μg/mL，对苹果腐烂病菌的抑制效果。

方法：PDA培养基(1000mL水；200g马铃薯；20g蔗糖；10g琼脂粉)，培养基配制好后，装入三角瓶中，灭菌备用。将灭菌的培养基加热熔化，然后放置于水浴锅中冷却至60℃，备用。分别将2mL、200μl和20μl样品溶液加入38ml、40ml和40ml60℃的培养基中，配成含药量分别为500μg/mL、50μg/mL和5μg/mL的培养基，试验以50％多菌灵可湿性粉剂(威海韩孚生化农药有限公司)为阳性对照，以0.1mol/L HCl溶液为阴性对照。将培养基均匀倒入2个直径为9cm的培养皿中，待完全凝固后，在每个培养皿中接种3块直径为6mm的菌饼。在25℃下培养48h或72h后，测量菌落直径，计算样品的抑菌率。全部试验共有(4个样品+2个对照)×3个浓度×4种病原菌＝72个处理，每处理设置2个培养皿，每皿接种3个菌落，对每个菌落测定最大直径和最小直径。全部试验重复一次。实验结果见表1.1。

对苹果腐烂病菌的抑制作用：实验结果表明，甲壳低聚糖铜配合物(实施例1)和甲壳低聚糖锌配合物(实施例2)均对苹果腐烂病菌具有很强的抑制作用，随着样品浓度的提高，抑菌活性显著增强，高浓度组样品(500μg/mL)的抑菌效果与阳性对照多菌灵相当或接近。甲壳低聚糖金属配合物在相同样品浓度下的抑菌活性高于壳聚糖及甲壳低聚糖(实施例5)，甲壳低聚糖铜配合物对苹果腐烂病菌的抑制效果尤为显著。证明金属离子与甲壳低聚糖形成的配合物具有协同增效作用，可提高对苹果腐烂病菌的杀菌活性。

表1.1对苹果腐烂病菌的抑制作用

*“-”表示在该浓度下无抑菌活性

应用例2(对苹果轮纹病菌的抑制效果)

操作同应用例1，但测试对象为苹果轮纹病菌。测定不同浓度的样品对苹果轮纹病菌的抑制效果。实验结果见表1.2。

对苹果轮纹病菌的抑制作用：实验结果表明，甲壳低聚糖铜配合物(实施例1)和壳聚糖对苹果轮纹病菌具有较强的抑制作用，随着样品浓度的提高，抑菌活性逐渐增强。但甲壳低聚糖锌配合物对苹果轮纹病菌(实施例2)无抑制作用。阳性对照多菌灵有较好的抑制活性。

表1.2对苹果轮纹病菌的抑制作用

*“-”表示在该浓度下无抑菌活性

应用例3(对黄瓜枯萎病菌的抑制效果)

操作同应用例1，但测试对象为黄瓜枯萎病菌。测定不同浓度的样品对黄瓜枯萎病菌的抑制效果。实验结果见表1.3。

对黄瓜枯萎病菌的抑制作用：实验结果表明，甲壳低聚糖铜配合物(实施例1)和甲壳低聚糖锌配合物(实施例2)均对黄瓜枯萎病菌具有很强的抑制作用，随着样品浓度的提高，抑菌活性显著增强，高浓度组样品(500μg/mL)的抑菌效果与阳性对照多菌灵相当或接近。在相同样品浓度下，甲壳低聚糖金属配合物的抑菌活性高于壳聚糖及甲壳低聚糖(实施例5)。证明金属离子与甲壳低聚糖形成的配合物具有协同增效作用，可提高对黄瓜枯萎病菌的杀菌活性。

表1.3对黄瓜枯萎病菌的抑制作用

*“-”表示在该浓度下无抑菌活性

应用例4(对番茄早疫病菌的抑制效果)

操作同应用例1，但测试对象为番茄早疫病菌。测定不同浓度的样品对番茄早疫病菌的抑制效果。实验结果见表1.4。

对番茄早疫病菌的抑制作用：实验结果表明，甲壳低聚糖锌配合物(实施例2)高浓度组(500μg/mL)对番茄早疫病菌有一定的抑制作用，而阳性对照多菌灵对番茄早疫病菌无效。证明金属锌离子与甲壳低聚糖配位后，可提高对番茄早疫病菌的杀菌活性。

表1.4对番茄早疫病菌的抑制作用

*“-”表示在该浓度下无抑菌活性

对氧自由基的清除活性实验研究

实施例1(对超氧阴离子自由基的清除作用)

称取实施例1合成的甲壳低聚糖铜配合物(LCTS-Cu)、实施例2合成的甲壳低聚糖锌配合物(LCTS-Zn)、甲壳低聚糖(LCTS，比较例)及壳聚糖原料(CTS，比较例)，用0.1mol/L HCl溶液溶解配制成一定浓度的溶液。测试不同浓度下(0.025～1.6mg/mL)的样品液对超氧阴离子自由基(O₂ ^.-)的清除活性。

方法：采用还原型辅酶I-吩嗪硫酸甲酯-氯化硝基四氮唑蓝体系(NADH-PMS-NBT)产生超氧阴离子自由基(O₂ ^.-)。反应体系为3.0mL的Tris-HCl缓冲液(16mmol/L，pH8.0)，其中含有78μmol/L还原性辅酶I(NADH)，50μmol/L硝基四氮唑蓝(NBT)，10μmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，以及不同浓度的样品溶液(0.025～1.6mg/mL)。超氧阴离子自由基和NBT的显色反应采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度(A)。空白用Tris-HCl缓冲液替换NADH，对照用Tris-HCl缓冲液代替样品液。按以下公式计算清除率(E)：

E(％)＝(A₁-A₂)/A₁×100      (1)

式(1)中A₁为对照试验吸光度，A₂为样品吸光度

对超氧阴离子自由基的清除活性测定结果见表2.1。结果表明，甲壳低聚糖金属配合物能够有效地清除NADH-PMS-NBT系统产生的O₂ ^.-，随着样品质量浓度的增加，清除率逐渐提高。在甲壳低聚糖铜配合物(实施例1)浓度为0.4mg/mL时对O₂ ^.-清除率达96.97％，相同浓度下的甲壳低聚糖锌配合物(实施例2)为77.34％，甲壳低聚糖(实施例5)为42.14％，壳聚糖原料为21.36％。两种金属配合物对O₂ ^.-的清除活性明显高于其配体。特别值得提出的是，在极低浓度下(0.025mg/mL)，铜配合物即表现出显著的清除O₂ ^.-能力，清除率高达89.18％。证明金属离子与甲壳低聚糖结合在一起，可产生协同增效作用，具有较强的SOD样活性作用，显著增强作物的抗逆能力。

表2.1甲壳低聚糖金属配合物、甲壳低聚糖及壳聚糖对O₂ ^.-的清除作用

*“-”表示在该浓度下无清除活性。

实施例2(对羟自由基的清除作用)

具体操作同实施例1。测试不同浓度下(0.05～1.6mg/mL)的样品液对羟自由基(^·OH)的清除活性。

方法：根据Fenton反应原理，H₂O₂在Fe²⁺存在的情况下生成^·OH，^·OH可使番红花T褪色，在520nm可测出^·OH的生成情况，进而检测出样品对^·OH的清除活性。反应终体积4.5mL，其中含150mmol/L磷酸钠盐缓冲液(pH7.4)1mL，1.0mmol/L的番红花T 1mL，2mmol/L EDTANa₂.Fe(II)0.5mL(新鲜配制)，不同浓度的样品液1.0mL，w＝0.3H₂O₂ 1mL(新鲜配制)，于试管中混匀，37℃水浴中反应30min后，测定样品在520nm处的吸光度(A)，空白组以1.0mL蒸馏水替代供试样品，对照组以1.5mL蒸馏水替代供试样品和EDTANa₂.Fe(II)。按以下公式计算清除率(E)：

E％＝(A₂-A₃)/A₁×100        (2)

式(2)中A₁为对照试验吸光度，A₂为样品吸光度，A₃为样品空白对照

对羟自由基的清除活性测定结果见表2.2。结果表明，甲壳低聚糖金属配合物对^·OH有一定的清除作用，且成量效关系，但明显弱于对O₂ ^.-的抑制作用。甲壳低聚糖锌配合物对^·OH具有较强的抑制作用，明显强于其配体甲壳低聚糖，而甲壳低聚糖铜配合物对^·OH的清除活性则比其配体弱，但随着样品浓度的增加，其清除活性显著提高，在高浓度区，甲壳低聚糖铜配合物的清除率接近其配体，并有上升的趋势。当样品浓度为1.6mg/mL时甲壳低聚糖锌配合物对^·OH的清除率达72.78％，甲壳低聚糖铜配合物为53.20％，甲壳低聚糖为61.88％，壳聚糖为12.97％。证明金属离子与甲壳低聚糖结合在一起，可发挥协同作用，增强其对羟自由基的清除活性，从而提高其抗逆性。

表2.2甲壳低聚糖金属配合物、甲壳低聚糖及壳聚糖对^·OH的清除作用

Claims (1)

1、一种低毒农作物杀菌剂的制备方法，其特征在于：以高分子量壳聚糖为原料，其分子量50万-100万之间，脱乙酰度为65-100％，在均相溶剂中，壳聚糖采用微波辐射技术进行降解反应，并且在降解液中直接加入金属化合物进行配位反应，微波辐射功率为340-850W，反应时间2-10min；然后进行沉淀，沉淀物用70-80％乙醇洗涤；最后用无水乙醇洗涤，50-80℃烘干后获得甲壳低聚糖金属配合物；该甲壳低聚糖金属配合物为下列的通式(1)化合物：

式(1)

其中M＝Cu或Zn，n为18.6-186，m：n为(1：4)-(1：2)，R₁为H或Ac，甲壳低聚糖铜配合物中铜含量为12.25-15.16％，甲壳低聚糖锌配合物中锌含量为10.02-13.38％；

所述均相溶剂采用盐酸或乙酸作为溶剂，体积浓度为0.5-5％，将壳聚糖溶于15-20倍体积的上述溶剂中，形成均一胶体后，加入过氧化氢为氧化剂，过氧化氢与壳聚糖的摩尔比为0.5-3；所述金属化合物为铜化合物或锌化合物；

所述微波辐射后，将降解液取出冷却至室温，在磁力搅拌下滴加金属化合物水溶液，壳聚糖与金属化合物的摩尔比为1∶1，反应在室温下进行，反应时间为2-12小时，反应溶液pH为4-6，沉淀采用加入3-4倍量的丙酮或乙醇，或二者等体积的混合液生成沉淀。

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