CN100463969C - 一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法 - Google Patents

一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法，该方法利用大豆蛋白或大豆粕等原料生产一种具有促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽，主要包括利用两种内切蛋白酶对大豆蛋白或大豆粕进行限制性水解，使水解度达到10～12%；采用温和的灭酶方法以避免水解物中的生物活性肽发生明显的变性；通过将水解液过5000分子量的超滤膜除去大分子量多肽和蛋白质。本发明所获得的生物活性肽在200～500ppm的添加量下能显著促进乳酸菌的增殖和产酸能力，缩短发酵时间。

Description

一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法
技术领域
本发明属于生物活性肽制备技术领域，尤其涉及一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法。
背景技术
发酵乳是利用乳酸菌(如保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)对牛乳进行发酵而成的产品。与牛奶相比，发酵乳可以缓解乳糖不耐症，促进乳蛋白的消化，提高钙、磷利用率，促进铁和维生素D的吸收。从某种意义上说，发酵乳是乳品成分的预消化产物，如乳糖、蛋白质和脂肪的降解，同时可溶性钙和磷的含量提高，并合成一些B族维生素，因此其营养价值比普通乳制品高。
发酵奶中的乳酸菌是一种对人体有益的微生物，在发酵过程中，它能产生大量乳酸、醋酸和风味物质，这些产物直接或间接地对调整肠道菌群平衡、预防病菌感染和预防消化道疾病都起到重要的作用。另外，乳酸菌还能合成一些特殊的酶系和细胞表面物质，能起到降低胆固醇，阻止致病菌对肠道入侵，增加免疫功能和抗癌的作用。因此，发酵乳中乳酸菌的数量对发酵乳的营养价值、口感、质量均有重要的影响。
由于液体菌种质量稳定性差、制作复杂、容易污染等诸多缺点，目前大部分企业为保证发酵乳质量、口感和生产的标准，均采用直投式发酵剂，因直投式发酵剂比通过翻代的液体发酵剂具有更加稳定的性能和更方便的使用方式。然而，采用直投式发酵剂用量大，生产成本昂贵，与液体菌种相比，直投式发酵剂的潜伏期要长得多，其发酵时间通常比使用传统的通过翻代的液体发酵剂要延长1～3小时左右，对于大型乳品厂，这是一个不容忽视的不利因素。因此，添加能促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽，减少发酵剂使用量、降低生产成本、缩短直投式菌种的发酵时间、提高设备利用率和生产效率，具有显著的经济效益。
张蓉真等报道了大豆水解蛋白对乳酸菌增殖的促进作用，认为添加1％的大豆水解蛋白，能够使保加利亚乳杆菌的增殖速度提高，在国内首次展示了大豆水解蛋白不仅作为强化营养添加剂而且作为提高生产效率的一个发酵促进剂在发酵乳生产上的良好应用前景。赵新淮等研究了大豆蛋白水解物的乳酸发酵促进作用。他们利用自制的大豆蛋白水解物，通过对比研究了它在发酵乳中对乳酸发酵的作用情况。得出结论如下：大豆蛋白水解物(SPH)对发酵乳的乳酸发酵存在着促进作用，并在发酵的早、中期较明显；SPH既可促进酸度的增加，还可促进乳酸菌的增殖。
然而在发酵过程中添加大量(1％)含有促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的水解物不仅成本较高，而且可能导致酸奶不良风味，如低水解度的大豆水解蛋白大多有苦味以及不良的气味。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法，用此方法制备出来的生物活性肽可显著促进了乳酸菌的增殖，特别是嗜热链球菌的增殖，缩短了发酵时间和凝乳时间，提高了产酸速度，而且对发酵乳的风味无不良影响。
为实现上述目的，本发明采用的步骤如下：
第一步：对大豆蛋白或大豆粕进行预处理，以破坏蛋白质分子的三级结构；
第二步：在55℃～65℃，pH7.5～8.5下先采用木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶(AlcalaseTM)进行限制性水解，水解度达到5～6％(pH-Stat法测定)后添加胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶进行水解；
第三步：当水解度在10～12％(pH-Stat法测定)时，灭活步骤二中所用的蛋白酶来达到终止水解，以控制水解液中多肽分子量的分布和避免水解物中的生物活性肽发生明显的变性；
第四步：调整pH值至中性；
第五步：将水解液通过5000分子量的超滤膜除去大分子物质，得到生物活性肽。
所述步骤一中的预处理是采用75～90℃，加热10～20min，冷却至50～60℃。
所述步骤三中灭活蛋白酶需要采用的条件为：pH2～3.5，60～70℃，25～35min。
所述步骤三中控制水解液中多肽分子量的分布主要集中在500～2000。
采用以上技术方案获得的生物活性肽以200～500ppm(w/w)的浓度添加到酸奶中进行发酵，可显著促进了乳酸菌的增殖，特别是嗜热链球菌的增殖，缩短发酵时间和凝乳时间，提高产酸速度。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明所生产出来的生物活性肽在200～500ppm的浓度下具有显著的促进乳酸菌增殖及发酵产酸的功效；
(2)本发明制备的生物活性肽活性高，在有效添加浓度下对发酵乳的风味无不良影响；
(3)本发明以大豆为原料制备生物活性肽，蛋白质利用率高，生产成本低。
附图说明
图1为本方法制备的生物活性肽的不同添加量对发酵乳产酸速度的影响示意图；
图2为本方法制备的生物活性肽的不同添加量对发酵乳发酵时间的影响示意图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明作进一步地描述。
实施例1
将8％(w/v)的大豆蛋白分散在水中，90℃，加热20min，冷却至60℃；添加木瓜蛋白酶3000U/g蛋白，pH8.0，55℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至5％；添加胰蛋白酶2000U/g蛋白，pH8.0，55℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至10.2％；将酶解液的pH值调节至pH值为3，70℃保持30min，使蛋白酶失活；调整pH值至中性；将酶解液过5000分子量的超滤膜，除去大分子量多肽和蛋白质，获得富含促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
实施例2
将8％(w/v)的大豆蛋白分散在水中，85℃，加热15min，冷却至60℃；添加木瓜蛋白酶2000U/g蛋白，pH8.0，55℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至5.6％；添加胰凝乳蛋白酶2500U/g蛋白，pH8.0，55℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至11.8％；将酶解液的pH值调节至pH值为2，68℃保持25min，使蛋白酶失活；调整pH值至中性；将酶解液过5000分子量的超滤膜，除去大分子量多肽和蛋白质，获得富含促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
实施例3
将8％(w/v)的大豆蛋白分散在水中，80℃，加热10min，冷却至55℃；添加碱性蛋白酶(AlcalaseTM)2500U/g，pH8.5，60℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至5.5％；添加胰凝乳蛋白酶2500U/g蛋白，pH8.5，55℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至11.8％；将酶解液的pH值调节至pH值为2.5，60℃保持35min，使木瓜蛋白酶失活；调整pH值至中性；将酶解液过5000分子量的超滤膜，除去大分子量多肽和蛋白质，获得富含促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
实施例4
将8％(w/v)的酪蛋白分散在水中，75℃，加热14min，冷却至50℃；添加碱性蛋白酶(AlcalaseTM)2000U/g蛋白，pH7.5，65℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至5.8％；添加胰蛋白酶2000U/g蛋白，pH7.5，65℃下进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至11.5％；将酶解液的pH值调节至pH值为3.5，70℃保持30min，使蛋白酶失活；调整pH值至中性；将酶解液过5000分子量的超滤膜，除去大分子量多肽和蛋白质，获得富含促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
表1为低脂发酵乳空白样在发酵过程中乳酸菌的生长情况：
表1
 
发酵时   球菌数   杆菌数   总菌数   球菌百   杆菌百   球/杆比间(h)                               分比      分比      值
 
0   6.9×10<sup>5</sup>    5.2×10<sup>5</sup>    1.21×10<sup>6</sup>    57％      43％      1.331   7.8×10<sup>5</sup>    5.3×10<sup>5</sup>    1.31×10<sup>6</sup>    59.5％    40.5％    1.472   3.5×10<sup>6</sup>    2.05×10<sup>6</sup>   5.55×10<sup>6</sup>    63％      37％      1.713   1.92×10<sup>8</sup>   8.7×10<sup>6</sup>    2.00×10<sup>8</sup>    96％      4％       244   3.88×10<sup>8</sup>   2.6×10<sup>7</sup>    4.14×10<sup>8</sup>    94％      6％       15.67
表2为低脂发酵乳添加本方法制备的生物活性肽(300ppm)后在发酵过程中乳酸菌的生长情况：
表2
 
发酵时   球菌数     杆菌数      总菌数      球菌百     杆菌百     球/杆比间(h)                                        分比       分比        值
0       6.8×10<sup>5</sup>   5.1×10<sup>5</sup>    1.19×10<sup>6</sup>    57.1％    42.9％       1.331       9.9×10<sup>5</sup>   6.2×10<sup>5</sup>    1.61×10<sup>6</sup>    61.5％    38.5％       1.62       5.2×10<sup>6</sup>   2.38×10<sup>6</sup>   7.58×10<sup>6</sup>    68.6％    31.4％       2.183       3.64×10<sup>8</sup>  1.31×10<sup>7</sup>   3.77×10<sup>8</sup>    96.5％    3.5％        27.64       6.60×10<sup>8</sup>  3.44×10<sup>7</sup>   6.94×10<sup>8</sup>    94.0％    6.0％        15.7
从表1和表2可以看出：添加300ppm生物活性肽后，发酵酸奶中球菌和杆菌总数是为添加样的1.5倍。
图1为本方法制备的生物活性肽的不同添加量对发酵乳产酸速度的影响示意图；图2为本方法制备的生物活性肽的不同添加量对发酵乳发酵时间的影响示意图。从图1和图2可以看出：随着生物活性肽添加量增大，乳酸菌产酸的速度明显增加，酸奶pH值降低到4.5所需的时间明显缩短。

Claims (1)

1.一种促进乳酸菌增殖及发酵产酸的生物活性肽的制备方法，其特征在于步骤如下：
第一步：对大豆蛋白或大豆粕进行预处理，在75～90℃下，加热10～20min，冷却至50～60℃以破坏蛋白质分子的三级结构；
第二步：在55℃～65℃，pH7.5～8.5下先采用木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶进行限制性水解，水解度达到5～6％后添加胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶进行水解；
第三步：当水解度在10～12％时，在pH2～3.5，60～70℃下灭活步骤二中所用的蛋白酶25～35min来达到终止水解，以控制水解液中多肽分子量的分布在500～2000和避免水解物中的生物活性肽发生明显的变性；
第四步：调整pH值至中性；
第五步：将水解液通过5000分子量的超滤膜除去大分子物质，得到生物活性肽。
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