CN100424164C - 改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂 - Google Patents

Abstract

一种改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂，选用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和深红螺菌(Rhodospirillum rubrum)三种有益菌，采取单独与混合、有氧与厌氧相结合的方法进行科学地培养，提供了一种菌种及化学成分清楚、作用机理明确、工艺可操作性强的集有效菌与其代谢产物为一体的菌剂，含有效活菌总数≥1×10⁸个/ml。有效菌种可互利共生，在土壤根际微生物区系中可形成优势菌群，长期使用可引起农业生产环境的良性循环，使土壤变成还原状态；有益菌所产生的代谢产物和菌体本身的产物可使土壤改善团粒结构，增加有机养分，为植物或作物提供直接养分，从而为稳产高产打下良好的基础，可为生产绿色食品以至有机食品提供生产原料。

Description

改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂

技术领域

本发明属于种植农业微生物制剂技术领域，具体地说是一种改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂。

背景技术

由于滥用化肥、农药、饲料添加剂、催生剂等而导致农作物和畜禽常常超常规病态生长，并诱发出环境污染、生态恶化等一系列问题，绿色产业已引起全球范围的关注。

追求绿色已成为当今时代的主题。生产无污染、无公害、安全富营养的有机或绿色食品已成为改善环境、提高人类食物安全性和营养性、增进人体健康的有效措施。世界各国先后在生产、加工、销售及市场培养等方面采取了一系列相关措施。如美国1996年通过了该国的《食品质量保护法》，对农药的使用作了严格的限制，特别要求儿童食品不能含有任何化学农药残留物。世纪之交，在瑞典首都斯德哥尔摩举行了“农药行动网”国际会议，其主题是“农业与食品安全”，大会呼吁尽量减少农药的使用，以保证农产品的安全性，走可持续发展的道路。近年来，美国、欧洲、日本相继颁发了一系列有机食品法律、法规，由90多个国家600多家会员单位组成的国际有机农业组织明确制定了“有机农业标准”，根本的一条就是不使用人工合成肥料、农药、生长调节剂和饲料添加剂；《欧盟有机食品法》规定，没有建设与欧盟相符的有机食品保证体系，将被列入第三国，断绝其出口途径。随着WTO的加入，全球经济一体化进程进一步加快，中国经济尤其是农业经济将受到前所未有的挑战——中国农畜产品品质下降已到了刻不容缓、亟待解决的程度。从长远利益来看，市场要开放，贸易结构与数量都会发生变化，有机或绿色食品很快会占领农产品市场，这将使我国的绿色产品面临严峻的挑战与考验，形势非常紧迫。

再造秀美山川、恢复自然生态，已成人类为自身可持续生产和重塑美好生活的强烈愿望。民以食为天，随着人们生活水平的不断提高，二十一世纪的人类消费观念不再是数量上的满足，而是质量的提高，品味的提升。绿色食品不再是人们饭后闲谈的话题，而已经真正的进入了千家万户，成为了餐桌上的主食。人们需要绿色食品，这将为绿色产业的发展创造不可替代的销售市场。微生物在生态系统中的作用是不可替代的，利用有益微生物制剂来改善环境条件是当今可持续性生产中的一项主要内容。

目前，有关微生物制剂或菌肥有如雨后春笋，层出不穷，充分显示了有益微生物在生态农业生产中的显著地位。至今，投入应用的微生物制剂或肥料有许多种：在固定氮素、增加土壤肥力方面，有陕西的“麦宝”、河北的小麦要际联合固氮菌剂——“肥禾灵”等；在物质转化、增加作物吸收有效养分方面，有解磷、解钾菌肥、生物活性磷钾复合肥、“田力宝”、青海天驰公司“九菌高效复合生物肥”等；在协助作物吸收养分方面，有VA菌根菌剂、根际促生多种菌剂等；在产生生长调节物质、促进作物生长发育等方面，有“5406”菌肥等；在生产抗生素、防治作物病害、改善土壤理化性状方面，有武汉科龙技术有限公司新型复合菌肥、北京大学的“高效多功能生物肥料”、国家农科院原子能研究所研制的“301”发酵剂、EM技术等。然而，就液体菌剂而言，目前所应用的产品大都存在着菌种混杂、菌数与化学成分不清、以至作用机理不明等现象。由此给产品检验、商业生产、质量监督造成操作困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菌种及化学成分清楚、作用机理明确、工艺可操作性强的种植农业用菌剂，旨在克服上述不足，并将重点放在应用效果上，特别是改善农业生产环境从而改善农产品品质方面，以便为生产绿色食品以至有机食品提供生产原料。

上述目的是通过以下技术措施实现的：

一种改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂(以下简称：AM菌剂)，选用的有效菌种为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及深红螺菌(Rhodospirillum rubrum)，前两者由中国农业部微生物菌种保藏管理中心提供(样品编号分别为：IFFI 6047、ACCC 2038)，后一种由申请人按照常规技术自土壤分离得来，将所选用的三种有效菌根据其生理特性，相应地采取单独与混合、有氧与厌氧相结合的方法进行科学地培养，由此得到一种容有效菌种与其代谢产物为一体的发酵制剂，菌剂所含有效活菌总数≥1×10⁸个/ml。

本发明提供的AM菌剂中三种菌种的特性分别为：

保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)：细胞杆状，形态多样，从长的、细的、弯曲的、棒形杆状的至短杆状的都有，也有形成链的，通常不运动，运动者则具有周生鞭毛，无牙孢，革兰氏染色阳性，微好氧，在固体培养基上培养、通常在厌氧条件或减少氧压和充有5-10％CO₂情况下可增加表面生长物，耐酸，最适pH5.5-6.2，一般在pH5或更低的情况下可生长，在中性或初碱性条件下通常会降低生长速率。保加利亚乳杆菌发酵类型为同型发酵，所产乳酸无光学活性，生长温度30-40℃，具有较强的产酸能力，繁殖、代谢力强，能迅速地占据生长环境。

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：在麦芽汁中生长：28℃三天后，细胞圆形、亚圆形、卵形、椭圆形或圆柱形到长形。单个，成双，偶尔成短链或小簇。按细胞的宽度和大小分成三群，在三群间也有中间的或不同程度过渡类型：第一群细胞大，微米，第二群细胞小，微米，第三群为中间类群，微米，可以遇到长达30微米或更长的丝状细胞。形成沉淀，偶尔有微弱的或不完整的环。室温一个月后，有沉淀，常有环，偶尔有岛或湿润的菌膜。在麦芽汁琼脂上生长：28℃三天后，细胞圆形、亚圆形、卵形、椭圆形或圆柱形到长形。单个，成双，偶尔成短链或小簇。按细胞的宽度和大小分为三群，在三群间也有中间类型的，或不同程度过渡类型：第一群细胞大，3.5-10.0×5.0-14.5-19微米，第二群细胞小，2.5-7.0×4.5-10.5-19微米，第三群为中间类型，3.0-8.0×4.01-1.5-18.0微米，可以遇到长达30微米或更长的丝状细胞。划线培养物奶油状，很少脆，奶油色到浅奶褐色。通常微凸，偶尔相当平坦，平滑，垫状到有褶，有皱纹或皱波状，偶尔疣状，或微凹面，偶尔微扇形，特别是在接近边缘处。光亮到稍暗。边缘波状，偶尔裂片状或圆锯齿形，偶尔不整齐齿牙状，或边缘有假菌丝。室温一个月后，培养物浅奶灰色、浅奶褐色到浅褐色。有凸起，稍局限型到平坦，微扩张，平滑到垫状，稍条痕状、扇形、凹面，偶尔有雏，或皱波状到有皱纹，发亮到稍暗。全缘、波状、圆锯齿形到裂片状，边缘常有假菌丝。假菌丝：在加盖片的玉米粉琼脂上培养，假菌丝原始型，偶尔有分枝。子囊孢子的形成：通常营养细胞直接转变成子囊，每个子囊1-4个圆形到扁椭圆形的子囊孢子。应用状况：啤酒酵母除了酿造啤酒、酒精及其他饮料之外，还可发面制面包。菌体的维生素、蛋白质含量高，可做食用、药用和饲料酵母，又可提取核酸、麦角固醇、谷光甘肽、细胞色素C、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷、Ceroline(啤酒酵母所含的一种脂肪)，它的转化酶可用于转化糖和巧克力的制造。在某些甾化合物的转化中可代替一部分化学反应。在维生素的微生物测定中常用啤酒酵母测定生物素、泛酸、硫胺素、呲哆醇、肌醇等。

深红螺菌(Rhotlospirillum rubrum)：该菌属光合菌群，其细胞形态为弧形，0.8-1.0μm，螺旋状，长7-10μm，直径1.5-2.5μm，在不适合的情况下，会出现各种形状和大小不正常的细胞，革兰氏阴性，厌氧液体培养时，最初呈粉红色，后呈现深紫色，在光照下，绝对厌氧生长以光合代谢为基础，兼性好氧，在有光厌氧或黑暗微好氧条件下都能生长。通常暗红色，在乙醇培养基上特别红；含红色素，具有吸收550nm光波的能力；除简单的有机物外，加入少量酵母膏对生长是必须的，pH6-8.5，最适温度30-35℃。

上述改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的AM菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(一)试管斜面母种制备

制备保加利亚乳杆菌试管斜面母种时，采用以葡萄糖、CaCO₃及黄豆芽汁为主的培养基；制备啤酒酵母试管斜面母种时，采用以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及麦芽糖为主的培养基，二者的试管斜面母种均通过常规方法制备

制备深红螺菌试管斜面母种时，其培养基采用以NaCl、CH₃COONa、NH₄Cl、NaHCO₃、K₂HPO₄、MgSO₄.7H₂O以及生长因子液和微量元素液为主的配方，采取以液体石蜡密封的方法光照培养

(二)单种子液制备

(1)保加利亚乳杆菌种子液的制备

制备一级种子液时，其培养液选用以葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、CaCO₃以及无机盐为主的配方，或选用以葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏或酵母粉、蔗糖、乳糖、CH₂COONa、柠檬酸二铵、吐温80以及无机盐为主的配方，常规无菌操作接种，振荡培养，待培养液中活菌数≥1×10⁸个/ml、pH3.8-5.4，同时具酸牛奶香味时即可

二级种子液的制备：培养液采用以葡萄糖、黄豆/大豆芽汁为主的配方，煮沸杀菌，常规无菌操作，接入一级种子液5％，首先通气培养，然后封闭厌氧培养，期间不断放去发酵胀气，待培养液与一级种子液相似时即可

若需三级种子液，除菌种为二级种子液、接种量增加至7-10％以外，其它同二级种子液的制备

(2)啤酒酵母种子液的制备

一级种子液的制备：培养液选用以新鲜麦芽汁Bris 12或葡萄糖及黄豆芽汁为主的配方，常规无菌操作，接种，振荡培养，待培养液中的活菌数≥1×10⁷个/ml、pH4-5.8，同时具酒香味时即可

二——三级种子液的制备：仿照上述一级种子液制备方法放大，区别在于煮沸杀菌，接一级或前一级种子液10％左右，通气培养

(3)深红螺菌种子液的制备

一级种子液的制备：培养液选用以CH₃COONa、蛋白胨、NH₄Cl、NaCl、以及无机盐、生长因子液和微量元素液为主的配方，装入玻璃容器中，常规无菌操作、接种，静置，白炽灯四面照射，密闭厌氧培养，待培养液由原来的土黄色转变为深红色、所培养菌活菌数≥1×10⁹个/ml、pH接近中性，并具有浓烈的臭鸡蛋味时即可

二级种子液的制备：培养液选用以CH₃COONa、蛋白胨、黄豆芽汁、NaCl、NH₄Cl及其它一些无机盐为主的配方，煮沸杀菌，常规无菌操作接种，接入一级种子液5％，仿照一级种子液培养方法培养，待培养液与一级种子液相似时即可

若需制备三级种子液，可仿二级种子液制备，唯接种量可增加至10-15％

(三)复合种子液制备

培养基采用以口服葡萄糖、Bris 80以上的糖蜜及黄豆芽汁为主的配方；或采用以黄豆芽汁中加葡萄糖及鲜牛奶为主的配方，煮沸杀菌，分别接入保加利亚乳杆菌二级或三级种子液10％、啤酒酵母二级或三级种子液5％，通气培养，待培养液中的有效菌活菌数≥1×10⁹个/ml、pH4-4.5，并具酸甜酒香味时即可

(四)AM菌剂产品的制备或生产

培养液由下列成分组成：黄豆芽滤汁15-30％，Bris 80以上糖蜜5％，葡萄糖1.5-2％，尿素0.25％，以及CaCO₃、稀土、甘露醇、鲜牛奶，另外还加了数种微量的无机盐，煮沸杀菌，趁热装入塑料发酵桶，淋水冷却至35℃，当天分别接入复合种子液15-20％、EM原液5％，在30-35℃室温及有氧条件下培养，约3-4天后，接入深红螺菌二或三级种子液10％，即刻拧紧发酵桶盖，密封，进行厌氧培养，30-35℃下静置8-12天，期间不断松动发酵桶盖以便放出发酵胀气，至止不产气，至此，产品AM菌剂制成。

上述菌剂制备方法，具体包括以下步骤：

1试管斜面母种制备

1.1保加利亚乳杆菌试管斜面母种制备

(1)培养基配方：葡萄糖40g，CaCO₃ 20g牛奶2ml，琼脂18-20g，煮取10％黄豆芽汁定容至1000ml，分装于试管中

(2)灭菌、接种与培养：常规高压灭菌，摆斜面无菌操作，涂抹接种30-33℃培养5-7天，至菌苔长满斜面

1.2啤酒酵母试管斜面母种制备

(1)培养基配方：麦芽糖1.5g，酵母膏3g；蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15-18g，水加至1000ml，分装于试管中

(2)杀菌、接种与培养：与上述保加利亚母种制备方法相似，但28-32℃培养2-3天，待斜面上布满白色菌苔即可

1.3深红螺菌试管斜面母种制备

(1)培养基配方：NaCl 0.5-2g，NH₄Cl 1g，NaHCO₃ 1g(过滤除菌)，K₂HPO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CH₃COONa 1-5g，生长因子液^(a)1ml(过滤除菌，培养液灭菌后加入)，微量元素液^(b)1ml，琼脂15-18g，加水至1000ml，pH自然，分装于试管中

(a)生长因子液：维生素B₁ 10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素(IAA)0.01mg，水定容至1000ml

(b)微量元素液：FeCl₃ 50mg，CuSO₄ 0.5mg，H₃PO₄ 10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄ 10mg，CO(NO₃)₂ 5mg，水定容至1000ml

(2)灭菌、接种：与上述保加利亚乳杆菌母种制备相似，但以液体石蜡密封，30-35℃，光照(5000-100001x)培养14-50天，待斜面上出现红色菌苔即可

2单种子液制备

2.1保加利亚乳杆菌种子液的制备

2.1.1一级种子液的制备

(1)培养液配方

①蛋白胨2g，牛肉膏3g，酵母膏3.5g，葡萄糖40g，K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 2g，复合维生素0.01g(1片)，加水至1000ml，pH6.8

②蛋白胨10g，柠檬酸二铵2g，酵母膏或酵母粉5g，牛肉膏10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄ 0.05g，葡萄糖20g，蔗糖5g，乳糖5g，CH₂COONa5g，K₂HPO₄ 2g，吐温80 1ml，水加至1000ml，pH6.4，121℃下灭菌15分钟

(2)灭菌与接种：常规高压灭菌，冷却到35℃时无菌操作接种，每1000ml培养液接试管(18×180mm)斜面母种1支

(3)培养：35-38℃条件下，180转/分振荡培养2-3天

(4)指标：所培养菌活菌数≥1×10⁸个/ml，pH3.8-5.4，具酸牛奶香味

2.1.2二级种子液的制备

(1)培养液配方：葡萄糖50g，复合维生素50mg(50ppm)，10％黄豆(大豆)芽煮30分钟左右，取其汁液加至1000ml，pH自然

(2)杀菌接种：煮沸5-10分钟杀菌，冷却至35℃时接入一级种子液5％

(3)培养：35-40℃，通气培养2-3天，然后封闭厌氧培养2-3天，期间不断松盖放气

(4)指标：所培养菌活菌数≥1×10⁹个/ml，其它指标同一级种子液

若需三级种子液，除菌种为二级种子液、接种量增加至7-10％以外，其它同二级种子液的制备

2.2啤酒酵母种子液的制备

2.2.1一级种子液的制备

(1)培养液配方

①新鲜麦芽汁(Bris 12)，pH5-6.4

②黄豆芽100g(煮30分钟左右)取其汁液定容1000ml，其中加葡萄糖50g，pH6-7

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至30℃时无菌操作，每1000ml培养液接入试管(18×180mm)斜面母种1支

(3)培养28-32℃，180-200转/分振荡培养1-3天

(4)指标：所培养菌活菌数≥1×10⁷个/ml，pH4-5.8，具酒香味

2.2.2二——三级种子液的制备

仿照上述一级种子液制备方法放大，区别在于煮沸杀菌，接一级或前一级种子液10％左右，通气培养

2.3深红螺菌种子液的制备

2.3.1一级种子液的制备

(1)培养液配方：蛋白胨2g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，CH₃COONa 3g，MgSO4·7H₂O 0.2g，NaCl 1g，生长因子液^(a)1ml(过滤除菌，培养液灭菌后加入)，微量元素液^(b)1ml，加水至1000ml，pH自然，装入玻璃容器中

(a)生长因子液：维生素B₁ 10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素(IAA)0.01mg，水定容至1000ml

(b)微量元素液：FeCl₃ 50mg，CuSO₄ 0.5mg，H₃PO₄ 10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄ 10mg，CO(NO₃)₂ 5mg，水定容至1000ml

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至35℃左右后，每1000ml接入试管(18×180mm)斜面母种2支

(3)培养：密闭，静置，厌氧培养，40-60W白炽灯四面照射。白炽灯距离玻璃培养瓶10-15cm，36-38℃，培养10-15天

(4)指标：培养液由土黄色转变为深红色，所培养菌活菌数≥1×10⁹个/ml，pH接近中性，有浓烈的臭鸡蛋味

2.3.2二级种子液的制备

(1)培养液配方：NaCl 1g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蛋白胨1.5g，CH₃COONa 3g，10％黄豆芽(芽长4-5cm，煮30分钟左右)取汁液1000ml，pH自然

(2)杀菌接种：煮沸5-10分钟杀菌，冷却至35℃左右接入一级种子液5％

(3)培养：仿照一级种子液培养方法培养5-7天

(4)指标：与一级种子液相似，但所培养菌活菌数有所下降，≥1×10⁸个/ml，杂菌率≥5％

若制备三级种子液，可仿二级种子液制备，唯接种量可增加至10-15％

3复合种子液制备

3.1培养基配方

(1)黄豆芽100g(芽长4-5cm，煮沸约30分钟)，取其汁液1000ml，内加口服葡萄糖75g，糖蜜(Bris 80以上)40-50g

(2)黄豆芽100g(芽长4-5cm，煮沸30分钟)取其汁液1000ml，内加葡萄糖40g，CaCO₃ 20g，鲜牛奶2ml

3.2杀菌、接种和培养

煮沸杀菌，冷却至30℃，分别接入保加利亚乳杆菌二级或三级种子液10％，啤酒酵母二级或三级种子液5％，在28-33℃条件下通气培养2-3天

3.3指标：所培养菌(或有效菌)活菌数≥1×10⁹个/ml，pH4-4.5，具酸甜酒香味，杂菌率≤5％

4AM菌剂的生产

4.1培养液配方(％)

黄豆芽5-10(芽长4-5，黄豆芽/水为1/3，煮40-50分钟)，取滤汁15-30，糖蜜(Bris 80以上)5，葡萄糖1.5-2，尿素0.25，CaCO₃ 0.125-0.5，稀土0.08(800ppm)，甘露醇0.05(500ppm)，鲜牛奶0.05(500ppm)，MgSO₄·7H₂O0.02(200ppm)，NaCl 0.02(200ppm)，KH₂PO₄ 0.02(200ppm)，K₂HPO₄ 0.02(200ppm)，FeSO₄ 0.004(40ppm)，KNO₃ 0.004(40ppm)，硼酸0.004(40ppm)，钼酸铵0.001(10ppm)

4.2杀菌、接种和培养

将定量的水烧开，加入全部定量成份，pH6-7.5，趁热装入塑料发酵桶，淋水冷却至35℃，当天分别接入复合种子液15-20％，EM原液5％，30-35℃室温下有氧发酵，此时的发酵液的温度为33℃左右，每4小时搅拌通气1次，2-3分钟/次·桶。有氧发酵3-4天，此时接入深红螺菌二或三级种子液10％，立即拧紧盖，密封，进行厌氧发酵，30-35℃下静置8-12天，期间不断松动发酵桶盖放出发酵胀气，至止不产气，至此，产品AM菌剂制成

4.3指标

有效活菌数≥1×10⁸/ml，pH值2.9-4.1，杂菌率≤10％，大肠杆菌MPN/1000ml≤30，发酵液即AM菌剂呈悬浮液状，茶褐色，具醇酸味，有机酸总量1.56％，氨基酸总量380.2mg/ml，还有维生素及生理活性等物质。

5AM菌剂的使用

AM菌剂产品的使用原则：要求几种方法配合使用，以施入土壤为主，喷洒为辅，提倡早施，要求作物全生育期使用，就会取得意想不到的效果；不能与杀菌剂混合；使用城市自来水时，应放置一天，曝气；本品贮放在5℃以上，常温、干燥、阴凉、通风处避光保存；本品液体表面有白色絮状物或瓶底有沉淀物均属正常；瓶内有气体，启瓶时请注意，用后请扭紧瓶盖保存。

具体使用方法归纳如下：

5.1灌根：稀释或随水浇灌。苗定植时，用1∶500倍的稀释液灌根，每株用量400-500毫升左右。

5.2蘸根；将本产品按一定比例稀释，加入有机肥等固体粉剂，蘸于根上栽培。

5.3有机肥发酵：按本产品与有机发酵物为1∶500-1000的比例混合发酵，使发酵腐熟，作为有机肥或生物有机肥使用，每100-250kg/亩，作基肥或追肥均可，但使用后要土埋。

5.4喷施：将本产品稀释500-1000倍直接喷于作物叶面。

5.5浸种：用1∶100-200倍的AM稀释液，浸种子至发胀(8-12小时)，捞出晾干后播种。

5.6拌种；籽种、本产品、红糖、水的比例为1∶10-20∶10-20∶适量，将其拌匀，闷2小时播种(一般用于播种量大的作物)。

5.7泡根：移栽时将不带土的幼苗根部在1∶250-500倍的AM糖蜜稀释液中浸泡15分钟定植(花卉、苗木)。

产品活化液的制作：本产品原液1000ml+红糖1公斤+清洁的水10公斤，装入密闭的容器中，在25-35℃的条件下厌氧发酵3-7天，至产生酸甜酒香味、不产气即可。随制随用，不能久置。

本发明提供的上述AM菌剂产品，选择业已确定的对农作物生长发育有促进作用的有益微生物，将其混合培养于同一制剂中，保加利亚乳杆菌、啤酒酵母菌以及深红螺菌在土壤中大量繁殖可使土壤中有益微生物菌群大量增加，从而抑制腐败菌等有害菌的生长繁殖，减轻或消除作物病害；有益菌所产生的代谢产物和菌体本身的产物可使土壤改善团粒结构，增加有机养分，增强土壤综合肥力，消除腐败气味，为植物或作物提供直接养分，从而为稳产高产打下良好的基础；有效菌种可互利共生，在土壤根际微生物区系中可形成优势菌群，长期使用可引起农业生产环境的良性循环；有效菌种能够分解土壤中残留的农药及积累的毒素物质，使土壤变成还原状态。因而，本AM菌剂产品具有改善农业生产环境，提高农产品质量及产量的作用，可广泛应用于林业(包括果树等)、草业、花卉业、中草药业、经济作物(茶叶、油料、棉、麻、烟等)，以至农作物产业(稻、麦、豆、薯、玉米、蔗、蔬菜等)等大农业中。

本发明提供的上述AM菌剂的制备方法，将所选用的三种有效菌根据其生理特性，相应地采取单独与混合、有氧与厌氧相结合的方法进行科学地培养。其中：保加利亚乳杆菌和啤酒酵母均为兼性厌氧菌，采取了先有氧培养，以便使其细胞快速而大量地繁殖；然后进行厌氧培养，以便使所培养细胞进一步形成有效代谢产物。深红螺菌属绝对厌氧菌，同时需光，始终需要在厌氧和光照条件下进行培养，以便使其在繁殖细胞群体的同时，产生有效代谢产物。在同一混合培养液中，深红螺菌及啤酒酵母生长必然受阻，为了保证在产品发酵液中具有此两种菌的足够的有效代谢产物，采取了将所选用的有效菌菌液按一定比例适时混合的先进发酵技术。啤酒酵母耐酸，可在保加利亚乳杆菌的酸性培养液中生长，将此二种菌的发酵液按一定比例首先混合，有氧培养，待其进入厌氧发酵阶段前，再按一定比例加入深红螺菌培养液，进行厌氧发酵，使菌体得以最大限度地繁殖、代谢产物得以最大限度的积累，并使其稳定的共存于同一培养环境中，以便在农业环境中共同发挥有益的作用。

为此，本发明与现有技术相比具有以下积极效果：

①本菌剂产品所含有效菌株作用肯定，有效种类及其活菌数明确，与同类产品相比，明确确定了保加利亚乳杆菌和啤酒酵母为检测指标，增强了质量监督检验的可操作性。有效活菌数≥1×10⁸个/ml。同时，本产品所含有效检测菌种由中国农业部微生物菌种保藏管理中心提供，避免微生物筛选过程中的不能重现现象，增强了菌种利用和检测的可操作性。

②筛选确定了有效菌种的培养基或培养液，以及培养方法。

③采取先有氧繁殖菌体、后厌氧稳定制剂以及化学成分的培养措施，探索出了一整套生产本产品的成熟工艺，与同类产品相比，克服了有氧、厌氧、不同菌种同步培养而引起的不均衡现象。保质期1至2年。

④使用方法灵活多样，在改良土壤、促进作物生长发育、消除因生粪等有机肥原料发酵过程中产生的引起烧苗现象的有害气体等方面具有良好的作用。对提高作物品质、确保作物稳产高产具明显的功效。

⑤本产品中的化学成分较为明确，这也是区别于同类产品的优势之一。

⑥对本产品进行了毒理检验，属无毒级，这在同类产品中也不多见。

⑦本产品就地取材，材料易得，制备方法操作性强，因而成本与同类产品相比较低。

⑧本产品将致病菌作为检验杂菌率的指标，从产品卫生和产品质量指标两个方面提供了明确的检验指标。

上述AM菌剂在种植农业方面的应用效果可总结如下：

①提高农产品品质，改善农产品口感，恢复原汁原味：如在啤酒花上应用，可使其有效成分甲酸含量提高0.6％；在酿酒葡萄上应用，可使葡萄可溶性固形物含量提高2.6％。使用本菌剂后，小麦蛋白含量提高9％，花生出油率提高8％以上，甘蔗及优质甜瓜含糖量提高0.85-1.75个百分点，棉花拉力提高5.8％，白菜Vc提高24％，水果1-2级果品率提高15-22％。

②可改善经济作物生长状态：如在花椒上应用，能使其植株枝叶繁茂，叶片增厚，叶色浓绿。可使花卉延长开花时间1倍以上。在花卉蝴蝶兰上使用，3个月后，每株所结的花朵由原来的12朵增加到20朵。在红掌上使用后，从春节到年底一直连续开花，叶茂盛，叶片不仅颜色深绿，而且叶面积达30.20cm²，未使用的仅15.12cm²。

③对增加土壤疏松度，改良土壤结构有明显效果：根据庆阳镇原点试验，在陇东干旱地区用本菌剂做基肥，随水冲入，使土壤容重降低0.03-0.04g/cm³，孔隙度增加1.24-1.57％，田间持水量提高1.2％。根据兰州点试验，在兰州百合上用本菌剂发酵有机肥作种肥、追肥和底肥，能使土壤疏松度提高45.24-86.5％，且土壤质地越差，效果越明显。

④稳产高产作用显著：如在西葫芦上应用，可增产29％；在党参上应用，可增产18.2-33％；在黄瓜上应用，可增产18.9％。在小麦、玉米等粮食作物上使用，增幅分别为8.5-11.5％、11.5-23.5％；可使笋子增产10.9-21.2％，西红柿增产15.2-24.3％，最高可达33.3％，黄瓜增产18.9-27.3％，西葫芦增产15.98-28.05％，辣椒增产可达22.5％，冬油菜增产达19.1％；使用在草场上可提高干草量15％以上。根据各地试验、示范，各种作物上均有不同程度的增产；在经济作物烤烟上使用，叶长，叶宽，单叶重，有效叶数均有所增加，可增产10.4-14.6％，每亩纯增经济收入47.6-69.7元。

⑤可促使农作物产品提早上市：无论何种蔬菜，均比未使用本菌剂提前上市7-9天。可使烤烟生育期缩短5-7天。

⑥可防治害虫：在兰州安宁试验点，用本菌剂制备的防虫液喷施苹果树，对卷叶蛾的防治效率为90％，对苹果食心虫的危害降低5.3％。

⑦AM菌剂在消除异臭味、抑制杂菌、防止根部腐烂等方面具有一定的效果。在靖远县平堡乡的塑料大棚里，长期以来由于普遍使用未发酵腐熟的羊粪、鸡粪、烧炕土、油渣等有机物，烧苗现象十分严重。在这种情况下，用AM菌剂稀释液浇灌，异臭味第二天即可消失。受伤黄瓜、西兰瓜、茄子及辣椒等作物植株即刻好转，烧苗现象消失。此现象说明，烧苗乃NH₃及H₂S等刺激性气体所致，本菌剂具有除臭效果。在厕所、集体宿舍等场所使用，同样收到明显的消除异味的效果。大凡在有异味的粪便、生活垃圾等堆置场所或畜禽圈舍使用，均有消除异臭味的明显效果。

⑧具抑菌功能。在镇原县试验点，在西瓜上试验，在低温、冻害的情况下根病减少6％。在临洮试验点的结果表明，可防治鳞瓣腐烂。在兰州试验点，用本菌剂对百合鳞瓣及籽球进行浸泡处理后，对其腐烂病的防治率较对照提高了3-4倍。上述现象说明，本菌剂除了一般的作用以外，还能抑制腐败菌、预防及防止作物根部腐烂的作用。

具体实现方式

实施例1

1单种子液制备

1.1保加利亚乳杆菌种子液的制备

1.1.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：蛋白胨2g，牛肉膏3g，酵母膏3.5g，葡萄糖40g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 2g，复合维生素0.01g(1片)，加水至1000ml，pH6.8。分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)灭菌与接种：常规高压灭菌，冷却到35℃时无菌操作接种，每支试管(18×180mm)斜面母种接5个三角瓶。

(3)培养：35-38℃条件下，180转/分振荡培养3天。

(4)指标：所培养菌活菌数1.59×10⁸个/ml，pH4.5，具酸牛奶香味。

1.1.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：葡萄糖50g，复合维生素50mg(50ppm)，10％黄豆(大豆)芽(煮30分钟左右)，取其汁液加至1000ml，pH自然。分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)杀菌接种：煮沸5分钟杀菌，冷却至35℃时，每三角瓶接入一级种子液10ml(5％)。

(3)培养：35-40℃通气培养3天，然后封闭厌氧培养2天，期间不断松盖放气。

(4)指标：所培养菌活菌数1.1×10⁹个/ml，其它指标同一级种子液。

1.2啤酒酵母种子液的制备

1.2.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：新鲜麦芽汁(Bris 12)1000ml，pH6.4。分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至30℃时无菌操作，每支试管(18×180mm)斜面母种接5个三角瓶。

(3)培养28-32℃，180转/分振荡，培养3天。

(4)指标：所培养菌活菌数1.83×10⁷个/ml，pH5.8，具酒香味。

1.2.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

仿照上述一级种子液制备方法放大，区别在于煮沸杀菌，每瓶接种量增加至20ml(10％)左右，通气培养2天。

1.3深红螺菌种子液的制备

1.3.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：蛋白胨2g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，CH₃COONa 3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl lg，生长因子液^(a)1ml(过滤除菌，培养液灭菌后加入)，微量元素液^(b)1ml，加水至1000ml，pH自然，平均分装入5个300ml玻璃试剂瓶中，200ml/瓶。

(a)生长因子液：维生素B₁ 10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素(IAA)0.01mg，水定容至1000ml。

(b)微量元素液：FeCl₃ 50mg，CuSO₄ 0.5mg，H₃PO₄ 10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄10mg，CO(NO₃)₂ 5mg，水定容至1000ml。

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至35℃左右后，每1支试管(18×180mm)斜面母种接2.5个试剂瓶。

(3)培养：密闭，静置，厌氧培养，60W白炽灯四面照射。白炽灯距离玻璃培养瓶10cm，36-38℃培养10天。

(4)指标：培养液由土黄色转变为深红色，所培养菌活菌数1.36×10⁹个/ml，pH6.5，有浓烈的臭鸡蛋味。

1.3.2二级种子液的制备(以2000ml为基数)

(1)培养液配方：NaCl 2g，NH₄Cl 2g，K₂HPO₄ 0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，蛋白胨3.0g，CH₃COONa 6g，10％黄豆芽(芽长4-5cm，煮30分钟左右)取汁液2000ml，pH自然。平均分装于4个500ml试剂瓶中。

(2)杀菌接种：煮沸5-10分钟杀菌，冷却至35℃时，每个试剂瓶中接入一级种子液25ml(5％)。

(3)培养：仿照一级种子液培养方法培养7天。

(4)指标：与一级种子液相似，有效活菌数1.3×10⁸个/ml。

2复合种子液配备(以2000ml为基数)

2.1培养基配方：黄豆芽200g(芽长4-5cm，煮沸约30分钟)，取其汁液2000ml，内加口服葡萄糖150g，糖蜜(Bris 80以上)90g。分装于8个500ml三角瓶中，250ml/瓶。

2.2杀菌、接种和培养

煮沸杀菌，冷却至30℃，分别接入保加利亚乳杆菌二级种子液25ml(10％)，啤酒酵母二级种子液12.5ml(5％)。在28-33℃条件下通气培养3天。

2.3指标

有效菌活菌数≥1.83×10⁹个/ml，pH4，具酸甜酒香味。

3AM菌剂的生产

3.1培养液配方(以20L为基数)

黄豆芽汁1000g(芽长4-5，黄豆芽/水为1kg/3L，煮40分钟)，取滤汁3000ml，糖蜜(Bris 80以上)1000g，葡萄糖400g，尿素50g，CaCO₃ 100g，稀土16g，甘露醇10g，鲜牛奶10g，MgSO₄·7H₂O 8g，NaCl 8g，KH₂PO₄ 8g，K₂HPO₄8g，FeSO₄ 0.8g，KNO₃ 0.8g，硼酸0.8g，钼酸铵0.2g。用冲洗黄豆芽的水加至20L。

3.2杀菌、接种和培养

将20L水烧开，加入全部配方成份，pH7，趁热平均分装于8个300ml塑料桶中，250ml/桶。淋水冷却至35℃，当天在每个发酵桶中分别接入上述已制备的复合种子液37.5ml(15％)，EM原液12.5ml(5％)，室温控制在30-35℃，桶口以6层经0.2％新洁尔灭消毒液浸泡后拧干液体的纱布覆盖，大约每4小时间歇摇晃1次，进行有氧发酵，此时，发酵液的温度为33℃左右。有氧发酵3天，接入深红螺菌二级种子液，每瓶25ml(10％)，当即拧紧发酵桶盖，密封，进行厌氧发酵，30-35℃下静置8天，期间不断松动发酵桶盖，以便放出鼓胀气体，至止不产气。至此，产品AM菌剂可告制成。

3.3指标

有效活菌数1.6×10⁹/ml，PH 3.5，杂菌率8％，菌剂呈悬浮液状，茶褐色，具醇酸味。

4使用方法及效果

以一年生党参幼苗作栽培对象。试验田面积45m²(0.0675亩)，对照15m²(0.0225亩)，9株/m²，试验田施入经AM菌剂堆制的农家肥30.36kg(以450kg/亩计)作底肥，同时分别于苗期和开花期用AM菌剂500倍稀释液各喷洒叶面一次；对照田用同等量的农家肥(10.12kg)和清水处理。

秋后采挖党参根，结果表明：试验田(45m²)获鲜根42.46kg(折合亩产632kg)，对照田(15m²)为10.68kg(折合亩产475.1kg)，平均每15m²试验小区比同等面积对照小区多获3.53kg(折合每亩多获156.9kg)，增产33.1％。同时，试验田中的党参叶色、植株高度、茎粗等生产经济性状都明显优于对照，并与地下部分(根)的产量具有正相关关系。可见，AM菌剂具增产作用(本试验点设在甘肃武都海拔2100m的高原山区)。

实施例2

1单种子液制备

1.1保加利亚乳杆菌种子液的制备

1.1.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：蛋白胨10g，柠檬酸二铵2g，酵母膏或酵母粉5g，牛肉膏10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄ 0.05g，葡萄糖20g，蔗糖5g，乳糖5g，CH₂COONa5g，K₂HPO₄ 2g，吐温80 1ml，水加至1000ml，pH6.4。分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)灭菌与接种：常规高压灭菌，121℃下灭菌15分钟即可，冷却到35℃时，无菌操作接种，每支试管(18×180mm)斜面母种接5个培养液瓶。

(3)培养：35-38℃条件下，180转/分振荡培养2天。

(4)指标：所培养菌活菌数1.2×10⁸个/ml，pH4，具酸牛奶香味。

1.1.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：葡萄糖50g，复合维生素50mg(50ppm)，10％黄豆(大豆)芽(煮30分钟左右)，取其汁液加至1000ml，pH自然。煮沸8分钟杀菌，趁热分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)接种：冷却至35℃时，每瓶接入一级种子液10ml(5％)。

(3)培养：35-40℃，通气培养3天，然后封闭厌氧培养2天，期间不断松盖放气。

(4)指标：所培养菌活菌数≥1.32×10⁹个/ml，其它指标同一级种子液。

1.2啤酒酵母种子液的制备

1.2.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：黄豆芽100g，(煮30分钟左右)取其汁液定容1000ml，其中加葡萄糖50g，pH6.5。平均分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至30℃时无菌操作，每支试管(18×180mm)斜面母种5个培养液瓶。

(3)培养：28-32℃，190转/分振荡，培养2天。

(4)指标：所培养菌活菌数1.6×10⁷个/ml，pH5.8，具酒香味。

1.2.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

仿照上述一级种子液制备方法放大，区别在于煮沸杀菌，每个三角瓶中接一级种子液20ml(10％)，摇晃通气培养。

1.3深红螺菌种子液的制备

1.3.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：蛋白胨2g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，CH₃COONa 3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 1g，生长因子液^(a)1ml(过滤除菌，培养液灭菌后加入)，微量元素液^(b)1ml，加水至1000ml，pH自然，分装于4个300ml玻璃试剂瓶中，250ml/瓶。

(a)生长因子液：维生素B₁ 10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素(IAA)0.01mg，水定容至1000ml。

(b)微量元素液：FeCl₃ 50mg，CuSO₄ 0.5mg，H₃PO₄ 10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄ 10mg，CO(NO₃)₂5mg，水定容至1000ml。

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至35℃左右后，接入试管(18×180mm)斜面母种，每支接2瓶。

(3)培养：密闭，静置，厌氧培养，60W白炽灯四面照射。白炽灯距离玻璃培养瓶12cm，36-38℃培养13天。

(4)指标：培养液由微红色转变为深红色，所培养菌活菌数1.85×10⁹个/ml，pH7.2，有浓烈的臭鸡蛋味。

1.3.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：NaCl 1g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蛋白胨1.5g，CH₃COONa 3g，10％黄豆芽(芽长4-5cm，煮30分钟左右)取汁液1000ml，pH自然。分装于4个300ml玻璃试剂瓶中，250ml/瓶。

(2)杀菌接种：煮沸5-10分钟杀菌，冷却至35℃左右，每瓶接入一级种子液12.5ml(5％)。

(3)培养：仿照一级种子液培养方法培养6天。

(4)指标：与一级种子液相似，所培养菌活菌数1.1×10⁸个/ml。

2复合种子液配备(以1000ml为基数)

2.1培养基配方：黄豆芽100g(芽长4-5cm，煮沸30分钟左右)取其汁液1000ml，内加葡萄糖40g，CaCO₃ 20g，鲜牛奶2ml。煮沸杀菌，趁热装入5个300ml三角瓶中，200ml/瓶。

2.2接种和培养

冷却至30℃，每瓶分别接入保加利亚乳杆菌二级种子液20ml(10％)，啤酒酵母二级种子液10ml(5％)，在30℃条件下摇荡通气培养3天。

2.3指标：有效菌活菌数1.4×10⁹个/ml，pH4.5，具酸甜酒香味。

3AM菌剂的生产

3.1培养液配方(以20L为基数)

黄豆芽汁1600g(芽长4-5，黄豆芽/水为1600g/4800ml，煮45分钟)，取滤汁4800ml，糖蜜(Bris 80以上)1000g，葡萄糖360g，尿素50g，CaCO₃ 50g，稀土16g，甘露醇10g，鲜牛奶10g，MgSO₄·7H₂O 4g，NaCl 4g，KH₂PO₄ 4g，K₂HPO₄ 4g，FeSO₄ 0.8g，KNO₃ 0.8g，硼酸0.8g，钼酸铵0.2g。

3.2杀菌、接种和培养

将20L水烧开，加入全部配方成份，pH6.5，趁热平均装入10个250ml塑料桶中，淋水冷却至35℃，当天分别接入上述已制备的保加利亚乳杆菌和啤酒酵母菌复合种子液17％，EM原液5％，33℃室温下培养，拧松桶盖，每4小时搅拌1次，3分钟/次·桶，使其有氧发酵，此时，发酵液的温度控制为33℃左右。有氧发酵4天后，接入已制备好的深红螺菌二级种子液10％，桶盖内垫上大小适中的圆形橡皮垫，拧紧桶盖，密封，进行厌氧发酵，33℃下静置10天，期间不断松动发酵桶盖放出发酵胀气，至止不产气。至此，产品AM菌剂制成。

3.3指标：有效活菌数1.5×10⁸/ml，pH3.6，呈悬浮液状，茶褐色，具醇酸味。

4使用方法及效果

以500株二年生“钠盖特”啤酒花作试验材料。用AM菌剂1L，加红糖1kg，加水适量，拌入1m³牛粪中，堆积发酵20天，至臭味消除、质地松软为止，制成AM菌剂发酵生物有机肥。将此生物有机肥稀释500倍，分别于2001年5月20日和6月1日灌根1次，1000ml/次·株，同时用未经AM菌剂发酵处理的牛粪作相应对照，对照50株。9月中旬采收啤酒花花序，10月10日送至甘肃省农垦农业研究院植物营养研究所化验室采用电导滴定法进行化验。结果表明，在转换水份为8％的基础上，处理样品含α-酸(甲酸)13.40％，而对照含12.87％，处理比对照增加了0.53％。α-酸为啤酒花花序的主要有效成分，是判断啤酒花品质优劣的一个主要指标。可见，AM菌剂具改善或提高作物品质的作用(此试验点设在甘肃武威黄羊镇)。

实施例3

1单种子液制备

1.1保加利亚乳杆菌种子液的制备

1.1.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：蛋白胨2g，牛肉膏3g，酵母膏3.5g，葡萄糖40g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 2g，复合维生素0.01g(1片)，加水至1000ml，pH6.8。分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)灭菌与接种：常规高压灭菌，冷却到35℃时无菌操作接种，每支试管(18×180mm)斜面母种接5个上述培养液三角瓶。

(3)培养：35-38℃条件下，180转/分振荡，培养3天。

(4)指标：所培养菌活菌数1.5×10⁸个/ml，pH5，具酸牛奶香味。

1.1.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：葡萄糖50g，复合维生素50mg，10％黄豆(大豆)芽煮30分钟左右，取其汁液加至1000ml，pH自然。分装于5个500ml三角瓶中，200ml/瓶。

(2)杀菌接种：煮沸10分钟杀菌，冷却至35℃时，每个三角瓶接入一级种子液10ml(5％)。

(3)培养：35-40℃通气培养3天，然后封闭厌氧培养3天，期间不断松盖放气。

(4)指标：所培养菌活菌数1.6×10⁹个/ml，其它指标同一级种子液。

1.2啤酒酵母种子液的制备

1.2.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：量取新鲜麦芽汁(Bris 12)1000ml，pH6.4。分装于4个500ml三角瓶中，250ml/瓶。

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至30℃时无菌操作，每支试管(18×180mm)斜面母种接4个三角瓶。

(3)培养28-32℃，200转/分振荡，培养3天。

(4)指标：所培养菌活菌数1.9×10⁷个/ml，pH5.8，具酒香味。

1.2.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

仿照上述一级种子液制备方法放大，将1000ml培养液分装于4个500ml三角瓶中，250ml/瓶。区别在于煮沸杀菌，每瓶接一级种子液25ml(10％左右)，摇晃通气培养。

1.3深红螺菌种子液的制备

1.3.1一级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：蛋白胨2g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，CH₃COONa 3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 1g，生长因子液^(a)1ml(过滤除菌，培养液灭菌后加入)，微量元素液^(b)1ml，加水至1000ml，pH自然，装入玻璃容器中。

(a)生长因子液：维生素B₁ 10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素(IAA)0.01mg，水定容至1000ml。

(b)微量元素液：FeCl₃ 50mg，CuSO₄ 0.5mg，H₃PO₄ 10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄10mg，CO(NO₃)₂ 5mg，水定容至1000ml。分装于5个200ml透明玻璃试剂瓶中，200ml/瓶。

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至35℃左右后，每支试管(18×180mm)斜面母种接上述2.5个试剂瓶。

(3)培养：密闭，静置，厌氧培养，40W白炽灯四面照射。白炽灯距离玻璃培养瓶10cm，36-38℃培养15天。

(4)指标：培养液由土黄色转变为深红色，所培养菌活菌数1.76×10⁹个/ml，pH6.7，有浓烈的臭鸡蛋味。

1.3.2二级种子液的制备(以1000ml为基数)

(1)培养液配方：NaCl 1g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蛋白胨1.5g，CH₃COONa 3g，10％黄豆芽(芽长4-5cm，煮30分钟左右)取汁液1000ml，pH自然。煮沸10分钟杀菌，趁热分装于5个200ml透明玻璃试剂瓶中，200ml/瓶。

(2)接种：冷却至35℃左右，每瓶接入一级种子液10ml(5％)。

(3)培养：仿照一级种子液培养方法培养6天。

(4)指标：与一级种子液相似，所培养菌活菌数1.1×10⁸个/ml。

2复合种子液配备(以1000ml为基数)

2.1培养基配方：黄豆芽100g(芽长4-5cm，煮沸约30分钟)，取其汁液1000ml，内加口服葡萄糖75g，糖蜜(Bris 80以上)50g。煮沸10分钟杀菌，趁热分装于5个200ml透明玻璃试剂瓶中，200ml/瓶。

2.2接种和培养：冷却至30℃，分别接入保加利亚乳杆菌二级种子液20ml(10％)，啤酒酵母二级种子液10ml(5％)。在28-33℃条件下摇晃、通气培养3天。

2.3指标

所培养菌活菌数1.6×10⁹个/ml，pH4.5，具酸甜酒香味，杂菌率4.5％。

3AM菌剂的生产

3.1培养液配方(以20L为基数)

黄豆芽汁2000g(芽长4-5，黄豆芽/水为2000g/6000ml，煮50分钟)，取滤汁6000ml，糖蜜(Bris 80以上)1000g，葡萄糖300g，尿素50g，CaCO₃25g，稀土16g，甘露醇10g，鲜牛奶10ml，MgSO₄·7H₂O 4g，NaCl 4g，KH₂PO₄ 4g，K₂HPO₄ 4g，FeSO₄ 0.8g，KNO₃ 0.8g，硼酸0.8g，钼酸铵0.2g。用冲洗黄豆芽的水加至20L。

3.2杀菌、接种和培养

将20L水烧开，加入全部配方成份，pH6.5，趁热平均分装于8个300ml塑料桶中，250ml/桶。淋水冷却至35℃，当天在每个发酵桶中分别接入上述已制备的复合种子液37.5ml(15％)，EM原液12.5ml(5％)，室温控制在30-35℃，桶口以6层经0.2％新洁尔灭消毒液浸泡后拧干液体的纱布覆盖，大约每4小时间歇摇晃1次，进行有氧发酵，此时，发酵液的温度为33℃左右。有氧发酵3-4天，此时接入深红螺菌二级种子液，每瓶25ml(10％)，当即拧紧发酵桶盖，密封，进行厌氧发酵，30-35℃下静置12天，期间不断松动发酵桶盖，以便放出鼓胀气体，至止不产气。至此，产品AM菌剂可告制成。

3.3指标

有效活菌数1.2×10⁸个/ml，pH3.5，呈悬浮液状，茶褐色，具醇酸味。

4使用方法及效果

AM菌剂浸种栽培方法及效果试验(试验地点选在甘肃省武都地区徽县，2001年4月16日)有以下结果：

(1)处理方法：用AM菌剂加等量红糖150倍稀释液浸泡玉米种子12-14小时，液面高出玉米种子10cm，至籽粒泡胀为止。捞出阴干，当天播种。试验田面积252m²，共播90行，行距85cm，每行10株，株距33cm。

对照以红糖150倍稀释液处理，对照田面积126m²。

(2)结果：当年10月12日考种，每穗粒数和千粒重如下表(平均)

由此可见，AM菌剂浸种具明显的增产效果。

Claims (2)

1. 一种改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂，其特征在于该菌剂选用的菌种为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及深红螺菌(Rhodospirillum rubrum)，前两者由中国农业部微生物菌种保藏管理中心提供，样品编号分别为：IFFI 6047、ACCC2038，后一种由申请人按照常规技术自土壤分离得来，菌剂所含活菌总数≥1×10⁸个/ml，它是通过以下方法制备而成，其步骤为：

(一)试管斜面母种制备

制备保加利亚乳杆菌试管斜面母种时，采用包括葡萄糖、CaCO₃及黄豆芽汁的培养基；制备啤酒酵母试管斜面母种时，采用包括葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及麦芽糖的培养基，二者的试管斜面母种均通过常规方法制备

制备深红螺菌试管斜面母种时，其培养基包括NaCl、CH₃COONa、NH₄Cl、NaHCO₃、K₂HPO₄、MgSO₄.7H₂O以及生长因子液和微量元素液，采取以液体石蜡密封的方法光照培养

(二)单种子液制备

(1)保加利亚乳杆菌种子液的制备

制备一级种子液时，选用包括葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、CaCO₃以及无机盐，或选用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏或酵母粉、蔗糖、乳糖、CH₂COONa、柠檬酸二铵、吐温80以及无机盐的培养液，常规无菌操作接种，振荡培养，待培养液中活菌数≥1×10⁸个/ml、pH3.8-5.4，同时具酸牛奶香味时即可

二级种子液的制备：采用包括葡萄糖、黄豆/大豆芽汁的培养液，煮沸杀菌，常规无菌操作，接入一级种子液5％，首先通气培养，然后封闭厌氧培养，期间不断放去发酵胀气，待培养液与一级种子液相似时即可

若需三级种子液，除菌种为二级种子液、接种量增加至7-10％以外，其它同二级种子液的制备

(2)啤酒酵母种子液的制备

一级种子液的制备：选用包括新鲜麦芽汁Bris 12或葡萄糖及黄豆芽汁的培养液，常规无菌操作，接种，振荡培养，待培养液中的活菌数≥1×10⁷个/ml、pH4-5.8，同时具酒香味时即可

二——三级种子液的制备：仿照上述一级种子液制备方法放大，区别在于煮沸杀菌，接一级或前一级种子液10％左右，通气培养

(3)深红螺菌种子液的制备

一级种子液的制备：选用包括CH₃COONa、蛋白胨、NH₄Cl、NaCl、以及无机盐、生长因子液和微量元素液的培养液，装入玻璃容器中，常规无菌操作、接种，静置，白炽灯四面照射，密闭厌氧培养，待培养液由原来的土黄色转变为深红色、所培养菌活菌数≥1×10⁹个/ml、pH接近中性，并具有浓烈的臭鸡蛋味时即可

二级种子液的制备：选用包括CH₃COONa、蛋白胨、黄豆芽汁、NaCl、NH₄Cl及其它一些无机盐的培养液，煮沸杀菌，常规无菌操作接种，接入一级种子液5％，仿照一级种子液培养方法培养，待培养液与一级种子液相似时即可

若需制备三级种子液，可仿二级种子液制备，唯接种量可增加至10-15％

(三)复合种子液制备

采用包括口服葡萄糖、Bris 80以上的糖蜜及黄豆芽汁的培养基；或采用包括黄豆芽汁中加葡萄糖及鲜牛奶的培养基，煮沸杀菌，分别接入保加利亚乳杆菌二级或三级种子液10％、啤酒酵母二级或三级种子液5％，通气培养，待培养液中的有效菌活菌数≥1×10⁹个/ml、pH4-4.5，并具酸甜酒香味时即可

(四)AM菌剂产品的制备或生产

培养液由下列成分组成：黄豆芽滤汁15-30％，Bris 80以上糖蜜5％，葡萄糖1.5-2％，尿素0.25％，以及CaCO₃、稀土、甘露醇、鲜牛奶，另外还加了数种微量的无机盐，煮沸杀菌，趁热装入塑料发酵桶，淋水冷却至35℃，当天分别接入复合种子液15-20％、EM原液5％，在30-35℃室温及有氧条件下培养，约3-4天后，接入深红螺菌二或三级种子液10％，即刻拧紧发酵桶盖，密封，进行厌氧培养，30-35℃下静置8-12天，期间不断松动发酵桶盖以便放出发酵胀气，至止不产气，至此，产品AM菌剂制成。

2. 根据权利要求1所述的改善农业生产环境、提高农产品质量及产量的菌剂，其特征在于其制备方法的具体步骤如下：

1试管斜面母种制备

1.1保加利亚乳杆菌试管斜面母种制备

(1)培养基组分：葡萄糖40g，CaCO₃20g牛奶2ml，琼脂18-20g，煮取10％黄豆芽汁定容至1000ml，分装于试管中

(2)灭菌、接种与培养：常规高压灭菌，摆斜面无菌操作，涂抹接种30-33℃培养57天，至菌苔长满斜面

1.2啤酒酵母试管斜面母种制备

(1)培养基组分：麦芽糖1.5g，酵母膏3g；蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15-18g，水加至1000ml，分装于试管中

(2)杀菌、接种与培养：与上述保加利亚母种制备方法相似，但28-32℃培养2-3天，待斜面上布满白色菌苔即可

1.3深红螺菌试管斜面母种制备

(1)培养基组分：NaCl 0.5-2g，NH₄Cl 1g，NaHCO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CH₃COONa 1-5g，生长因子液^(a)1ml，微量元素液^(b)1ml，琼脂15-18g，加水至1000ml，pH自然，分装于试管中

(a)生长因子液：维生素B₁10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素IAA 0.01mg，水定容至1000ml

(b)微量元素液：FeCl₃50mg，CuSO₄0.5mg，H₃PO₄10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄10mg，CO(NO₃)₂5mg，水定容至1000ml

(2)灭菌、接种：与上述保加利亚乳杆菌母种制备相似，但以液体石蜡密封，3035℃、光照5000100001x培养14-50天，待斜面上出现红色菌苔即可

2单种子液制备

2.1保加利亚乳杆菌种子液的制备

2.1.1一级种子液的制备

(1)培养液组分

①蛋白胨2g，牛肉膏3g，酵母膏3.5g，葡萄糖40g，K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCO₃ 2g，复合维生素0.01g，加水至1000ml，pH6.8

②蛋白胨10g，柠檬酸二铵2g，酵母膏或酵母粉5g，牛肉膏10g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄0.05g，葡萄糖20g，蔗糖5g，乳糖5g，CH₂COONa5g，K₂HPO₄2g，吐温801ml，水加至1000ml，pH6.4，121℃下灭菌15分钟

(2)灭菌与接种：常规高压灭菌，冷却到35℃时无菌操作接种，每1000ml培养液接18×180mm试管斜面母种1支

(3)培养：35-38℃条件下，180转/分振荡培养2-3天

(4)指标：所培养菌活菌数≥1×10⁸个/ml，pH3.85.4，具酸牛奶香味

2.1.2二级种子液的制备

(1)培养液组分：葡萄糖50g，50ppm的复合维生素50mg，10％黄豆芽煮30分钟左右，取其汁液加至1000ml，pH自然

(2)杀菌接种：煮沸5-10分钟杀菌，冷却至35℃时接入一级种子液5％

(3)培养：35-40℃，通气培养2-3天，然后封闭厌氧培养2-3天，期间不断松盖放气

(4)指标：所培养菌活菌数≥1×10⁹个/ml，其它指标同一级种子液

若需三级种子液，除菌种为二级种子液、接种量增加至7-10％以外，其它同二级种子液的制备

2.2啤酒酵母种子液的制备

2.2.1一级种子液的制备

(1)培养液组分

①Bris 12新鲜麦芽汁，pH5-6.4

②黄豆芽100g煮30分钟左右，取其汁液定容1000ml，其中加葡萄糖50g，pH6-7

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至30℃时无菌操作，每1000ml培养液接入18×180mm试管斜面母种1支

(3)培养28-32℃，180-200转/分振荡培养1-3天

(4)指标：所培养菌活菌数≥1×10⁷个/ml，pH4-5.8，具酒香味

2.2.2二——三级种子液的制备

仿照上述一级种子液制备方法放大，区别在于煮沸杀菌，接一级或前一级种子液10％左右，通气培养

2.3深红螺菌种子液的制备

2.3.1一级种子液的制备

(1)培养液组分：蛋白胨2g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄ 0.2g，CH₃COONa 3g，MgSO4·7H₂O 0.2g，NaCl 1g，生长因子液^(a)1ml，微量元素液^(b)1ml，加水至1000ml，pH自然，装入玻璃容器中

(a)生长因子液：维生素B₁10mg，尼克丁酸1mg，对氨基苯甲酸1mg，生物素IAA0.01mg，水定容至1000ml

(b)微量元素液：FeCl₃ 50mg，CuSO₄ 0.5mg，H₃PO₄ 10ml，NaCl 20.5mg，ZnSO₄ 10mg，CO(NO₃)₂ 5mg，水定容至1000ml

(2)灭菌接种：常规高压灭菌，冷却至35℃左右后，每1000ml接入18×180mm试管斜面母种2支

(3)培养：密闭，静置，厌氧培养，40-60W白炽灯四面照射。白炽灯距离玻璃培养瓶10-15cm，36-38℃，培养10-15天

(4)指标：培养液由土黄色转变为深红色，所培养菌活菌数≥1×10⁹个/ml，pH接近中性，有浓烈的臭鸡蛋味

2.3.2二级种子液的制备

(1)培养液组分：NaCl 1g，NH₄Cl 1g，K₂HPO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蛋白胨1.5g，CH₃COONa 3g，10％黄豆芽汁液1000ml，pH自然

(2)杀菌接种：煮沸5-10分钟杀菌，冷却至35℃左右接入一级种子液5％

(3)培养：仿照一级种子液培养方法培养5-7天

(4)指标：与一级种子液相似，但所培养菌活菌数有所下降，≥1×10⁸个/ml，杂菌率≥5％

若制备三级种子液，可仿二级种子液制备，唯接种量可增加至1015％

3. 复合种子液制备

3.1培养基组分

(1)芽长4-5cm黄豆芽100g，煮沸约30分钟，取其汁液1000ml，内加口服葡萄糖75g，Bris 80以上糖蜜40-50g

(2)芽长4-5cm黄豆芽100g，煮沸30分钟，取其汁液1000ml，内加葡萄糖40g，CaCO₃20g，鲜牛奶2ml

3.2杀菌、接种和培养

煮沸杀菌，冷却至30℃，分别接入保加利亚乳杆菌二级或三级种子液10％，啤酒酵母二级或三级种子液5％，在28-33℃条件下通气培养2-3天

3.3指标：所培养菌或有效菌活菌数≥1×10⁹个/ml，pH4-4.5，具酸甜酒香味，杂菌率≤5％

4. AM菌剂的生产

4.1培养液组分

黄豆芽/水为1/3，煮40-50分钟，取滤汁15-30％，Bris 80以上糖蜜5％，葡萄糖1.5-2％，尿素0.25％，CaCO₃ 0.125-0.5％，800ppm稀土0.08％，500ppm甘露醇0.05％，500ppm鲜牛奶0.05％，200ppm MgSO₄·7H₂O 0.02％，200ppmNaCl 0.02％，200ppm KH₂PO₄ 0.02％，200ppm K₂HPO₄ 0.02％，40ppmFeSO₄ 0.004％，40ppm KNO₃ 0.004％，40ppm硼酸0.004％，10ppm钼酸铵0.001％

4.2杀菌、接种和培养

将定量的水烧开，加入全部定量成份，pH6-7.5，趁热装入塑料发酵桶，淋水冷却至35℃，当天分别接入复合种子液15-20％，EM原液5％，30-35℃室温下有氧发酵，此时的发酵液的温度为33℃左右，每4小时搅拌通气1次，2-3分钟/次·桶。有氧发酵3-4天，此时接入深红螺菌二或三级种子液10％，立即拧紧盖，密封，进行厌氧发酵，30-35℃下静置8-12天，期间不断松动发酵桶盖放出发酵胀气，至止不产气，至此，产品AM菌剂制成

4.3指标

有效活菌数≥1×10⁸/ml，pH值2.9-4.1，杂菌率≤10％，大肠杆菌MPN/1000ml≤30，发酵液即AM菌剂呈悬浮液状，茶褐色，具醇酸味，有机酸总量1.56％，氨基酸总量380.2mg/ml，还有维生素及生理活性物质。