CN100354413C - 犬类精液超低温冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种犬类精液超低温冷冻保存方法，属于动物繁殖技术领域。将果糖、柠檬酸、三羟甲基胺基甲烷依次溶解于蒸馏水中，制得防冻液的缓冲液；将N-乙酰基-D-葡萄糖胺溶解于蒸馏水中，再加入氨基—钠—十二烷基硫酸酯和卵黄，混合均匀后在20～30℃下放置24～48小时，然后离心取上清液，加入到缓冲液中，并加入甘油或二甲基亚砜、杀菌剂，蒸馏水定容配制成防冻液；再利用防冻液将犬类精液稀释，降温平衡后进行包装冷冻，制成细管冻精放入液氮中保存。使用时再进行精子复苏解冻。本发明能够有效延长犬精子超低温冷冻保存的存活时间，提高犬冻融精子的活力、质膜完整性及顶体完整性，提高冻精人工输精的受孕率。

Description

犬类精液超低温冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及一种犬类精液超低温冷冻保存方法，用于犬精子超低温冷冻保存以及利用冻精进行人工授精繁殖育种，属于动物繁殖技术领域。

背景技术

自从Polge等(1949)用甘油作为防冻剂冷冻保存精子成功以来，精子低温冷冻保存研究在家畜、一些野生动物和人类中都取得了很大的发展，并逐渐成为生物多样性、遗传资源迁地保护的一个重要手段。对优良家畜如猪、马、牛、羊和犬的育种繁殖，挽救濒危动物都有着极其重要的实践意义。犬作为最早驯养的家畜动物，在人类生产生活中发挥着特有的作用，优良种犬的社会需求更是与日俱增。在世界宠物犬市场中可以发现，名贵犬种正以其独特的身价、良好的开发前景逐渐被人们所接受，优质宠物犬将以它高品质受到更多人的青睐。随着人类饲养技术、繁殖水平的提高，宠物饲养种类越来越多。

我国犬的品种不仅以特有的使用和观赏价值著称于世界，而且对世界著名品种的形成产生过重要的影响，如西藏的马士迪夫(獒)、西施犬、北京犬、西藏拉萨犬(埃普索犬)等，作为珍贵犬的品种资源，已经成为世界人民的共同财富。我国城乡居民随着经济条件的改善，饲养宠物的人越来越多，人们已经意识到饲养宠物犬所带来的巨大经济效益，已把人工饲养宠物犬作为一种新兴饲养业来发展，宠物犬除了进入人类的物质生活外，逐渐进入人类的精神生活。目前国内各地区已经广泛开展了犬的人工养殖，现有宠物犬上亿只。同我国饲养的犬相比，国外犬品种繁多、质量较高，尤其是新型品种价格昂贵。其主要原因是人工繁殖技术的应用，通过人工授精技术杂交改良原有犬品种，既能克服不同品种间自然交配难题，又能通过杂交优势培育出新型品系，产生良好的经济效益。然而我国犬的繁殖育种仍然采用传统的自然繁殖方法，这不仅影响繁殖率及育种进程，而且在自然交配繁育过程中产生大量的近交系，导致犬品种质量退化，严重制约着我国宠物业的发展，进行宠物犬品系改良、种质更新等繁育研究成为当务之急。如何进一步保存、利用、开发我国的犬种资源，是一项非常重要的研究课题。深入开展此宠物犬精液冷冻保存技术研究，建立优质宠物犬冷冻精子库，并利用犬冷冻精液进行人工授精繁殖，能够大大加快犬的繁殖育种进程，提高其品系质量，必将对我国的社会、经济、生活产生难以估量的积极作用。同时对于促进我国养犬业的发展，提高我国宠物犬品种在国际市场的竞争力起到巨大推动作用。

人工授精繁殖技术包括利用稀释后的鲜精液和解冻后的冻精输精两种方式，冷冻精液及其人工输精，将会大大提高良种公犬的利用率和利用价值，其中涉及到的关键性技术就是稀释液、防冻液的研制及其应用技术。研究表明，冻融精子的质量如何，例如活力、质膜完整率及顶体完整率的高低直接影响人工输精的受孕率。犬精子与其它犬科动物的精子类似，其在冻融过程中对低温损伤的抗性较弱，冷冻复苏后精子活力下降，质膜完整率及顶体完整率亦明显降低，人工授精的受孕率及胎仔数均低于自然繁殖(Farstad，等，1996，AnimalReproduction Science.42：251～260.)。因此，如何长期低温保存优质犬精液并充分利用优良种源是目前本领域亟待解决的问题。

目前，犬的人工授精尤其是精液的超低温冷冻保存及利用冻精繁殖很受人们的关注，但远未达到牛、羊等家畜动物水平，有关基础理论与技术环节尚需进一步研究探讨，其中防冻液的配制及其相关冷冻、解冻程序是亟待解决的技术难题。

氨基-钠-十二烷基硫酸酯Orvus ES Paste(OEP)是一种表面活性剂，其组成中含有十二烷基硫酸钠(SDS)复合物，是猪和犬动物精液冷冻时常用的稀释防冻成分，主要作用是防止低温对精子的损伤，对精子膜结构有保护、修补作用，能够提高冻融精子活力、存活率及质膜完整率。目前关于OEP保护作用的机理提出双重假设：一方面OEP具有乳化类脂的作用，对精子膜结构中的类脂有稳定作用，降低或者阻碍由冷冻保存所引起的似获能性变化；另一方面OEP通过分散卵黄中的类脂形成聚合体，使这些类脂物更易进入精子质膜，而不是直接作用于精子膜结构，即OEP发挥作用的前提必须有卵黄存在。N-乙酰基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)是几丁质的主要成分，存在于昆虫和甲壳动物的外骨骼中，属于多糖同聚物，在细胞外表层、细胞间隙及结缔组织形成时提供主要的结构成分，使动植物组织有弹性和韧性。研究报道N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过人体腹膜细胞和成纤维细胞能有效激活体内葡萄胺聚糖的合成，并已成功应用于猪精液冷冻稀释液中(Yi等，2002，Animal Reproduction Science.74，187-194.)，但关于OEP和N-乙酰基-D-葡萄糖胺同用在犬精液防冻剂方面的研究目前还没有报道，尤其是有关N-乙酰基-D-葡萄糖胺、OEP及卵黄的应用技术亦未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种犬类精液超低温冷冻保存方法，能有效延长犬冻融精子的存活时间，有利于维持犬精子的质膜完整性及顶体完整性，提高犬冻精繁殖的受孕率。以便克服犬不同品种之间难于自然交配繁殖弊端，充分利用优质宠物犬种源，加快犬的育种繁殖进程。用于建立优质宠物犬的冷冻精子库，长期保存优质宠物犬的种质基因，为新品系的繁育研究提供基础材料。

为实现这样的目的，本发明采用一种表面活性剂氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)及细胞培养液成分N-乙酰基-D-葡萄糖胺，同时添加果糖、柠檬酸、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、卵黄、甘油或二甲基亚砜、杀菌剂等各种成分，用蒸馏水配制成犬精子冷冻防冻液，并利用防冻液将犬类精液稀释，降温平衡后进行包装冷冻，制成细管冻精放入液氮中保存，以此提高对犬精子超低温冷冻保存的效能。使用时再进行精子复苏解冻。

本发明的犬类精液超低温冷冻保存方法包括如下步骤：

1)将果糖0.45～3.10g、柠檬酸0.50～2.30g、三羟甲基胺基甲烷1.10～3.90g依次溶解于50mL蒸馏水中，制得防冻液的缓冲液；

2)将0.01～0.10g N-乙酰基-D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸馏水中，溶解温度为20～30℃，完全溶解后依次加入0.05～2.50mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯和15.0～30.0mL卵黄，混合均匀后在20～30℃下放置24～48小时，然后以1000g～5000g的速率离心5～10分钟，取上清液；

3)将上清液加入到防冻液的缓冲液中，并加入甘油或二甲基亚砜2.0～8.0mL、杀菌剂1000IU/mL，蒸馏水定容100mL配制成防冻液；

4)在18～25℃条件下，将犬类精液与防冻液按体积比1∶3混合，得到稀释的精液，在4～8℃条件下降温平衡1.5～3.5小时，然后进行包装冷冻，包装的体积为0.20mL～0.75mL，冷冻速率为25.0～40.0℃/分钟，制成细管冻精放入液氮中保存；

5)使用时，精子复苏的解冻速率为20.0～50.0℃/分钟。

本发明所述杀菌剂为青霉素或庆大霉素。犬精液的采集、精液采集后的预处理均按本领域的常规方法进行。

本发明的N-乙酰基-D-葡萄糖胺、氨基-钠-十二烷基硫酸酯和卵黄等成分配制时的温度条件均能影响防冻液对犬冻融精子的保护效果，尤其是防冻液使用时的温度条件，对提高犬冻融精子的活力、复苏率及质膜和顶体的完整率有显著效果；N-乙酰基-D-葡萄糖胺、氨基-钠-十二烷基硫酸酯和卵黄相互作用的时间亦影响防冻液的使用效果，在本发明中三者相互作用的时间条件下，能够增强OEP对卵黄的乳化作用，使大量微小乳脂颗粒释放出来，再经过一定速率的离心后，收集含有大量微小乳脂颗粒的上清液添加到防冻液缓冲液中，同时在N-乙酰基-D-葡萄糖胺的协同作用下，显著提高对犬冻融精子的保护效果；精液包装体积的大小、冷冻速率及精子复苏的解冻速率大小亦是影响该防冻液应用效果的关键条件。

本发明方法简单，取材容易且成本价格低廉，易于推广。实验研究结果表明，本发明的方法，能有效延长犬冻融精子的存活时间、保护冻融精子膜结构的完整性，表现出了良好的精子保护作用和防冻效果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例的作用应被理解为是对本发明的诠释而非对本发明任何方式的限制。

实施例1

称量一定量1.35g果糖、1.85g柠檬酸、1.85g三羟甲基胺基甲烷依次融于50mL蒸馏水中，作为犬精子超低温冷冻保存防冻液的缓冲液；称量0.06gN-乙酰基-D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸馏水中，溶解温度为25℃，完全溶解后依次加入0.50mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯和20.0mL卵黄；三者均匀混合后25℃放置30小时，然后以2000g的速率离心8分钟，取上清液加入到果糖等其它成分配制的防冻液的缓冲液中，然后加入3mL甘油及10万单位青霉素或庆大霉素，蒸馏水定容100mL配制成防冻液；在22℃条件下，将犬类精液与防冻液按体积比1∶3混合，得到稀释的精液，在5℃条件下降温平衡2.5小时，然后进行包装冷冻，包装的体积为0.25mL，冷冻速率为32.0℃/分钟，制成细管冻精放入液氮中保存；使用时，精子复苏的解冻速率为30.0℃/分钟。

按实施例1的方法进行犬精液超低温冷冻保存后，实验测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明：22℃条件下冻融精子的存活时间为70小时、保存4小时后冻融精子活力为0.30、精子质膜完整率平均为41％，顶体完整率为62％；利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人工输精繁殖母犬受孕率为88.6％。与常规的使用技术方法相比较，本发明的超低温冷冻保存方法能够有效延长犬精子超低温冷冻保存的存活时间，提高犬冻融精子的活力、质膜完整性及顶体完整性，显著提高了犬冻融精子的质量，进而提高了冻精人工输精的受孕率。

实施例2

称量2.45g果糖、1.25g柠檬酸、1.55g三羟甲基胺基甲烷依次融于50mL蒸馏水中，作为犬精子超低温冷冻保存防冻液的缓冲液；称量0.08gN-乙酰基-D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸馏水中，溶解温度为28℃，完全溶解后依次加入0.70mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯和20.0mL卵黄；三者均匀混合后20℃放置45小时，然后以2500g的速率离心6分钟，取上清液加入到防冻液的缓冲液中，然后加入4mL甘油及10万单位青霉素或庆大霉素，蒸馏水定容100mL配制成防冻液；在28℃条件下，将犬类精液与防冻液按体积比1∶3混合，得到稀释的精液，在4℃条件下降温平衡3.5小时，然后进行包装冷冻，包装的体积为0.50mL，冷冻速率为40.0℃/分钟，制成细管冻精放入液氮中保存；使用时，精子复苏的解冻速率为35.0℃/分钟。

按实施例2的方法进行犬精液超低温冷冻保存后，实验测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明：22℃条件下冻融精子的存活时间为68小时、冻融精子活力为0.54、精子质膜完整率平均为61％，顶体完整率为66％。本发明方法显著提高了犬冻融精子的质量。

实施例3：

称量1.25g果糖、2.75g柠檬酸、3.05g三羟甲基胺基甲烷依次融于50mL蒸馏水中，作为犬精子超低温冷冻保存防冻液的缓冲液；称量0.02gN-乙酰基-D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸馏水中，溶解温度为22℃，完全溶解后依次加入0.80mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯和20.0mL卵黄；三者均匀混合后22℃放置45小时，然后以2500g的速率离心6分钟，取上清液加入到防冻液的缓冲液中，然后加入6mL二甲基亚砜及10万单位青霉素或庆大霉素，蒸馏水定容100mL配制成防冻液；在22℃条件下，将犬类精液与防冻液按体积比1∶3混合，得到稀释的精液，在6℃条件下降温平衡3.0小时，然后进行包装冷冻，包装的体积为0.50mL，冷冻速率为38.0℃/分钟，制成细管冻精放入液氮中保存；使用时，精子复苏的解冻速率为36.0℃/分钟。

按实施例3的方法进行犬精液超低温冷冻保存后，实验测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明：22℃条件下冻融精子的存活时间为55小时、保存4小时后冻融精子活力为0.20、精子质膜完整率平均为32％，顶体完整率为51％；利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人工输精繁殖母犬受孕率为83.4％。

Claims (1)

1、一种犬类精液冷冻保存方法，其特征在于按如下步骤进行：

1)将果糖0.45～3.10g、柠檬酸0.50～2.30g、三羟甲基胺基甲烷1.10～3.90g依次溶解于50mL蒸馏水中，制得防冻液的缓冲液；

2)将0.01～0.10gN-乙酰基-D-葡萄糖胺溶解于20mL蒸馏水中，溶解温度为20～30℃，完全溶解后依次加入0.05～2.50mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯和15.0～30.0mL卵黄，混合均匀后在20～30℃下放置24～48小时，然后以1000g～5000g的速率离心5～10分钟，取上清液；

3)将上清液加入到防冻液的缓冲液中，并加入甘油或二甲基亚砜2.0～8.0mL、青霉素或庆大霉素1000IU/mL，蒸馏水定容100mL配制成防冻液；

4)在18～25℃条件下，将犬类精液与防冻液按体积比1∶3混合，得到稀释的精液，在4～8℃条件下降温平衡1.5～3.5小时，然后进行包装冷冻，包装的体积为0.20mL～0.75mL，冷冻速率为25.0～40.0℃/分钟，制成细管冻精放入液氮中保存。