CN100351247C

CN100351247C - 一种快速制备高纯度藁本内酯的方法

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Publication number: CN100351247C
Application number: CNB2005100212612A
Authority: CN
Inventors: 钱忠明; 汪程远; 杜俊蓉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2007-11-28
Anticipated expiration: 2025-07-08
Also published as: CN1778799A

Abstract

本发明公开一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，是采用减压柱层析的方法从藁本内酯粗油中分离出所需的高纯度藁本内酯。本发明的优点在于：分离快速、操作简便、设备简单、所用分离材料少而可回收再利用。本发明为我国自行生产高纯度的藁本内酯提供了一条简便途径，其生产快、成本低、耗能低、毒性小，而产品收率高、纯度高，并具有工艺流程短、操作简单方便、所需设备简单等特点，适应于工业化大生产的要求。

Description

一种快速制备高纯度藁本内酯的方法

技术领域

本发明涉及一种提取药用有效成分的方法，特别是涉及一种快速制备高纯度的藁本内酯的方法。

背景技术

1960年日本学者Mitsuhashi，H首次从伞形科藁本属植物Ligusticum acutilobum中分离出藁本内酯，并命名为Ligustilide，其是具淡黄色带香味的油状液体，沸点为168-169℃/6mmHg，不溶于水，可溶于乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、正己烷等有机溶剂，分子式为C₁₂H₁₄O₂，分子量为190.24，化学结构式如下图：

CA索引名为1(3H)-Isobenzofuranone，3-butylidene-4，5-dihydro-(9CI)

三个化学名分别为：

①1，5-Cyclohexadiene-1-carboxylic acid，2-(1-hydroxy-1-pentenyl)-，-lactone(7CI)；

②、Phthalide，3-butylidene-4，5-dihydro-(8CI)；

③、3-Butylidene-4，5-dihydrophthalide

因藁本内酯结构中有环外不对称双键，可分为顺反两种异构体，由于其自身结构的特殊性，顺式结构为空间优势构象，比反式更稳定，因而(Z)-藁本内酯在药材中含量为(E)-藁本内酯的10倍左右。因而从植物分离得到的藁本内酯大多为单一的顺式藁本内酯，也有顺反势都有的混合型藁本内酯。

藁本内酯广泛存在于川芎、当归、茶芎、藁本、日本川芎、日本当归等伞形科药用植物中，其对心脑血管系统、循环系统及免疫系统等有较强的药理作用，均为各药材中的主要有效成分，但其稳定性较差。含藁本内酯的植物几乎全为伞形科植物，在亚洲、北美洲和欧洲都有广泛分布，其中亚洲较多，中国常用的中药就有当归、川芎、茶芎、藁本等。而中国植物中藁本内酯含量最高，远高于国外其他植物。有文献报道在甘肃岷县的当归中藁本内酯含量高达1％以上，在四川、云南、陕西的当归中藁本内酯含量也有0.5％左右，比生长在日本(含藁本内酯约0.1-0.15％)和韩国(含藁本内酯约0.3％)的同属植物的藁本内酯含量均高出很多(Zhao，Kui J.；Dong，Tina T.X.；Tu，Peng F.；Song，Zong H.；Lo，Chun K.；Tsim，Karl W.K.Molecular Genetic and ChemicalAssessment of Radix Angelica(Danggui)in China.Journal of Agricultural and FoodChemistry (2003)，51(9)，2576-2583.)。在本发明人的硕士论文(汪程远，川芎及×××复方药材成分的研究，四川大学硕士论文，2003)中，也报道了四川都江堰的川芎中藁本内酯含量在1％左右，有的还接近2％，而同属的日本川芎中藁本内酯的含量要低很多。这充分说明了在我国藁本内酯有充足的植物来源，可以为藁本内酯的开发利用提供有力的保障。

由于在我国常用中药中藁本内酯的含量可以高达1％以上，这为从其中制备出高纯度的藁本内酯作为医用原料成为了可能。目前从植物中提取分离藁本内酯的方法有如下几种：

专利CN1583735A报道“一种富集藁本内酯的工艺及制剂”，用川芎药材，提取得到川芎油，石油醚稀释后，上于硅胶柱，用石油醚1-2倍石油醚洗柱后，再用12-16倍冲洗并收集洗脱液，浓缩即得，藁本内酯纯度50-60％。此法分离速度慢，而得到的藁本内酯纯度也很低，不能大规模运用于生产。

专利CN1552702A报道“顺式藁本内酯的提取方法及其药用用途”，用川芎药材用乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂在高剪切仪器中剪切提取得挥发油后，直接上样于硅胶柱，用石油醚和乙酸乙酯的混合液洗脱，收集第二色带，浓缩，得到顺式藁本内酯。此法分离得到纯度约90％以上。此方法是用常规的常压或加压柱层析来分离的，其分离速度慢，操作也复杂，而在川芎油中有很多与藁本内酯性质相似的成分，其藁本内酯的纯度判断仅通过观察层析柱的色带来从判定，要得到高纯度的藁本内酯是很困难的，并且制备高纯度的藁本内酯的时间长，吸附剂用量大，从而使其实际的分离操作难以达到公开的理想效果，不能大规模运用于生产。

文献报道(胡长鹰，丁霄霖，当归中藁本内酯的提取、分离与结构鉴定，无锡轻工大学学报，2003(22)，5：69-71)，从当归中提取出挥发油后，用常规柱层析方法，上硅胶柱，用正己烷与丙酮混合液，梯度洗脱，分段收集后，用GC-MS检测，得到纯藁本内酯流份，挥去溶剂，即得纯度大于97％顺式藁本内酯。此法操作也较复杂，而检测手段不常用，吸附剂用量大，实施较为困难，不能大规模运用于生产。

上述已报道的藁本内酯分离方法，都是用常规的层析方法(如：常压或加压柱层析)进行分离的，其最大的特点是在分离洗脱时层析柱中必须一直保持有足够量的洗脱剂，而常规柱层析有下列缺点：操作复杂，分离速度慢，分离步骤较多且繁琐，分离所花时间长，在分离过程中不能随意停止与调整，而且所用的吸附剂和有机溶剂的量很大，吸附剂的再生利用困难，不利于生产成本的控制和环保。并且上述方法中都没有提供十分方便快捷的流份检测方法，将不能在分离后快速判断流份中藁本内酯的纯度，也导致生产效率低下，极大限制其在工业化生产中的运用。

并且由于藁本内酯本身性质的不稳定性，其在稍高温度下时间一长极易发生异构化，因而在工业化生产中，生产速度是制备高纯度藁本内酯的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的就是为了解决以上问题，提供一种快速简单、节约成本的工业化制备高纯度藁本内酯的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，该方法是利用减压柱层析的方法从藁本内酯粗油中分离所需的高纯度藁本内酯，所述高纯度藁本内酯是指纯度为90～99％的藁本内酯；具体的，所述减压柱层析的方法依次包括如下步骤：

a)装柱：在适当的分离装置中，用吸附剂干法装柱，并减压抽滤使之紧实平整，所述用于装柱的吸附剂量为上样粗油量的重量的3～15倍，并且柱直径与高度比范围为1∶0.3至1∶3；

b)上样：将粗油用洗脱剂适当溶解后直接液体上样，或用吸附剂吸附后固体上样；

c)洗脱：采用分次洗脱，每次使用0.1～0.5柱体积的洗脱剂，减压抽滤洗脱至干后，再进行下一次洗脱，分别收集每次洗脱液；

d)鉴别与定性：将各份洗脱液用适当方法鉴别纯度，合并经纯度鉴定符合要求的组分；而将含有其他杂质的藁本内酯组分混合后浓缩；

e)再分离：将步骤d)中含有其他杂质的藁本内酯组分混合后浓缩得到组分重复上述a)～d)步骤2～3次，或者每次将层析柱再生后重复上述b)～d)步骤2～3次；

f)浓缩：合并步骤d)中得到的经纯度鉴定符合要求的藁本内酯组分，减压浓缩至溶剂尽，即得到高纯度的藁本内酯。

所述藁本内酯粗油可以是从含藁本内酯的药材中提取得到的天然的含藁本内酯的粗油，也可以是化学合成的藁本内酯粗油。

所述含藁本内酯的药材包括当归、川芎、茶芎、藁本、日本川芎、日本当归。

优选的，所述含藁本内酯的药材选自当归、川芎、茶芎。

所述从含藁本内酯的药材中提取含藁本内酯的粗油的方法包括乙醇浸提法、乙醇回流提取法、CO₂超临界萃取法。

步骤a、b)中所述吸附剂为硅胶或中性氧化铝。优选的，所述吸附剂为硅胶。

步骤a)中所述用于装柱的吸附剂量优选为上样粗油的重量份的5～10倍。

步骤a)中所述适当的分离装置可以为短粗柱、砂芯漏斗或布氏漏斗。

所述洗脱剂为添加或不添加乙酸乙酯或丙酮的石油醚或正己烷，并且石油醚∶乙酸乙酯、石油醚∶丙酮、正己烷∶乙酸乙酯或正己烷∶丙酮的体积比均为200∶(0～40)。

步骤c)中洗脱可以为等度洗脱或者洗脱剂极性由小到大变化的梯度洗脱。

步骤d)中鉴别纯度所用的方法为薄层色谱法；薄层色谱条件为使用HF₂₅₄硅胶板，并以体积比为10∶(0.3-3)的正己烷或石油醚∶乙酸乙酯为展开剂；纯度鉴定的判断标准是：藁本内酯的特征斑点为在紫外365nm下显蓝色荧光且Rf值最大的斑点，并且判断其无其他杂质的标准是在紫外254nm和365nm下均无其他明显的杂质斑点。

所述层析柱的再生过程为：除去最上层用于上样的吸附剂后，先用乙酸乙酯或丙酮减压洗脱3-5个柱体积，再用正己烷或石油醚减压洗脱3-5个柱体积即可。

由于藁本内酯本身性质的不稳定性，其在较高温度下极易发生异构化，因此应将制备得到的高纯度藁本内酯采用保持真空或充入CO₂、氮气、氩气等方法隔绝空气，低温保存。

本发明的快速制备高纯度藁本内酯的方法可用于制备包括顺势、反式或者顺势与反式混合的藁本内酯。

我国盛产含藁本内酯的药材，但由于现有技术的缺点所限，严重制约了藁本内酯的开发利用。本发明的目的提供一种快速简单的制备高纯度藁本内酯的方法，而纯度可达90-99％，可作为含藁本内酯的医用原料，其纯度大于98％的则可作为藁本内酯对照品使用，填补国内未有此对照品生产的空白。本发明的方法采用减压层析方法，完全避免了常规柱层析的缺点，并提供了准确的薄层层析鉴别藁本内酯纯度的方法和藁本内酯的保存方法。本发明制备快速、操作简便，生产效率高；用最少量的吸附剂和溶剂即可完成分离，成本低；用低毒的有机溶剂，生产安全；其完全可以放大，适用于工业化大生产。

本发明的药材提取方法包括乙醇浸提、乙醇回流提取、CO₂超临界萃取等三种常规的方法，三种提取方法最后得到藁本内酯的量和收率并无显著的差别，说明在实际生产中三种方法可根据生产的实际条件和需要选用。而含藁本内酯的药材选用了常用中药，如：当归、川芎、茶芎、藁本、日本川芎、日本当归等，其中具体实施了当归、川芎、茶芎等三种药材的提取分离，结果均制备得到了大量高纯度的藁本内酯。

由于藁本内酯本身性质的不稳定性，其在较高温度下极易发生异构化，因而在工业化生产中，生产速度是制备藁本内酯的一个瓶颈。快速的制备一是可以提高生产效率、节约成本，二是可以在制备中减少其异构化得到更高纯度的产品。本发明在分离中运用真空减压抽滤而快速洗脱的原理，因而其分离制备的速度极快。而用常规的柱层析完成一次分离，最少也要1-2天，有的还可能要5-10天。而运用本发明完成一次不管多大规模的分离，只要1-2小时。可见本发明大大提高了高达20倍以上的生产效率，这可以极大节约时间、节省生产成本。

在柱层析分离中，装柱是分离成败的关键，由于本发明采用边抽气边干装，并且还可以用正己烷或石油醚润湿并压紧，使装成的柱子即均匀又紧密，从而保证了分离的效果，而且操作简单易行。吸附剂可以用硅胶和中性氧化铝，由于中性氧化铝价格较贵，因而在生产中一般均选用硅胶，硅胶的用量为上样粗油3-15倍量，一般为5-10倍，这大大低于常规柱层析20-100倍的硅胶量。本发明所用的硅胶规格采用一般层析所用到的硅胶的规格，目数为80-600目。

在上样时，可将粗油用约1倍体积的石油醚或正己烷适当溶解后直接液体上样，也可使粗油先吸附于约1倍体积的粗硅胶或氧化铝上再固体上样。固体上样比液体更易操作，而上样效果更好。洗脱的洗脱剂为石油醚或正己烷∶乙酸乙酯或丙酮(200∶0-40)，洗脱时极性由小到大，可梯度或等度洗脱，每次收集洗脱流份的溶液体积为0.1-0.5柱体积。洗脱液收集时，真空抽吸让每个洗脱流分在色谱柱中流干，再进行下一次洗脱，这样每次洗脱相当于独立完成一次展开、分离、干燥，因而在很短的柱上样品分离效果很好。由于每次洗脱完毕，柱子是相对干燥的，因而在分离过程中可以随时停止，柱子上样品不会发生扩散，而常规的柱层析在分离中一旦暂停时间稍长，则各组分将发生扩散，其分离效果将明显降低。本发明的这种可以随时暂停而不影响分离效果的分离方法，明显增加了分离的实用性和可操作性。虽然本方法分离效果较好，但由于中药中成分复杂，要完全分离出上样样品中的藁本内酯一般需要重复分离2-3次，并且每次重复分离时需要重新装柱或者将层析柱经过再生后再利用。

本发明提供了一种快速准确鉴别各流份中藁本内酯有无杂质和纯度高低的方法。各流分的鉴别与定性采用薄层色谱法(TLC)，薄层色谱条件为HF₂₅₄硅胶板，以正己烷或石油醚∶乙酸乙酯(10∶0.3～3)为展开剂。藁本内酯的特征斑点为在紫外365nm下显蓝色荧光而R_f值最大的斑点，而判断其无其他杂质的标准是在紫外254nm和365nm下均无其他明显的杂质斑点。此TLC鉴别方法方便准确，用于流分中藁本内酯的鉴别与纯度判定，其有很强的科学性与专属性，并且操作简单快速。

由于藁本内酯的不稳定性，在空气中较高温度下极易发生异构化，本发明还提供一种保存藁本内酯的方法，就是让其隔绝空气，在低温下保存。隔绝空气的方法可以抽真空抽掉空气，也可以充惰性气体如CO₂、氮气、氩气等，并保存于低于4℃的低温环境中。

虽然本发明在分离中所用的吸附剂降到了最少，但本着在生产中节约成本的原则，本发明还提供了一种操作简便的吸附剂再生的简便方法，是将最上层用于上样的吸附剂除去后，先用乙酸乙酯或丙酮真空快速抽吸洗脱3-5个柱体积，再用正己烷或石油醚洗脱3-5个柱体积即可再次重复，其中无任何残留物质。而所用过的溶剂经分馏或精馏再生后即可再次使用。

由于采用了以上的方案，本发明的方法与现有技术的方法相比，有以下优点：

1、效率高、分离速度快，很短时间就可完成一次完整的分离。

2、所需设备简单、工艺流程短，且收率高。

3、所用分离材料和溶剂降到最低，而均可再生后回收利用，所用的溶剂毒性很小，有利于节约成本和环保。

4、可操作性强、操作简便。不像常规柱分离，其装柱、上样、洗脱等都有很高要求。

5、分离不受时间限制，可以随时中断而分离不受影响，而常规柱层析随意中断后，其分离效果将大大降低，还可能导致分离失败。

6、分离规模完全可以放大，大规模生产不受限制。

附图说明

图1是本发明实施例1的TLC方法的薄层色谱结果图。

图2是本发明实施例1的GC法测定的色谱图。

图3是本发明实施例1的HPLC法测定的色谱图。

图4是本发明实施例1的MS图。

图5是本发明实施例1的核磁共振氢谱图。

图6是本发明实施例1的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明作进一步详细的描述。

在本发明的技术方案中，以硅胶作为分离吸附剂，是本发明的优选条件。

为更好地说明本发明的技术方案，特给出以下实施例，但本发明并不仅限于此。

实施例1：

(1)提取分离：

用乙醇回流提取法提取藁本内酯粗油：称取当归生药20kg适当切碎后，加入8倍量95％乙醇于提取罐中浸泡过夜后，加热回流提取2小时，过滤，药渣再分别加入6倍、6倍量95％乙醇，分别加热回流提取2小时，过滤并合并滤液，滤液减压浓缩回收尽乙醇，得到深褐色浓稠液体约800ml的粗油。

用0.6kg硅胶(100-200目)拌样。用一短粗柱(直径25cm)取6kg层析硅胶(200-300目)用水泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高约30cm。将拌样硅胶上样于已经装好的短粗柱上，用水泵进行抽吸，先加总量约为10L的石油醚冲洗，再加总量约85L的石油醚-乙酸乙酯(100∶5)的冲洗，半个柱体积收集一份，用TLC(HF₂₅₄板，石油醚-乙酸乙酯(10∶1)展开)检测各份洗脱液，收集合并在254nm和365nm下显明显无其他杂质Rf值最大显蓝色荧光的流份，减压回收洗脱液。另将有Rf值最大显蓝色荧光同时也含有其他杂质的流份，也减压回收后，按上述硅胶减压层析方法在经过再生的硅胶柱上反复分离3次，也得到只含蓝色荧光的流分，减压回收溶剂后，在高真空下减压除去残留的溶剂，得到162g淡黄色液体样品，充CO₂气体，于-20℃冰箱中保存，并按下方法进行纯度检测及结果鉴定。

硅胶的再生是去掉最上层用于上样的拌样硅胶后，先用乙酸乙酯减压洗脱4个柱体积，再用石油醚减压洗脱3个柱体积即可再次使用。而所用过的溶剂经精馏后也再次使用。

(2)纯度检测

①、TLC方法：

取上制得的样品，在同一硅胶HF₂₅₄板上点高低浓度差别约5-10倍的两点，用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)展开，取出在紫外254nm、365nm下及碘蒸气显色后观察，其薄层色谱图见图1(从左到右依次为紫外254nm、365nm、碘蒸气显色后)。

从浓度高低两个点的TLC图中可以看到，在三种不同的显色条件下均为单一斑点。从而可以初步证明制备得到的产品是一个单一化合物。

②、GC法测定

色谱条件仪器：Agilent 6890型气相色谱仪；色谱柱：HP-5(5％苯基甲基聚硅氧烷，30m×320um×0.25um)；进样口温度：250℃；柱温：210℃(8min)程序升温(10℃/min)至250℃；检测器：FID，温度250℃；进样方式：分流进样，分流比50∶1

测定取上制得的样品，进样，按色谱条件进行测定，记录色谱图。记录色谱图的时间为主峰保留时间的两倍或更长。测得主峰的保留时间(t_R)为4.6min，按面积归一法计算其的含量为98.3％。

色谱图如图2所示。

③、HPLC法测定

色谱条件仪器：Agilent 1100型液相色谱仪(四元泵、自动进样器、DAD检测器)；色谱柱：Hypersil ODS(4.6×150mm，5um)；流动相：甲醇-5％异丙醇(60∶40)；检测波长：280nm；流速：1ml.min^-1；柱温：25℃。

测定取上制得的样品5mg用甲醇定容至25ml，进样10ul，测定，记录色谱图。记录色谱图的时间为主峰保留时间的两倍或更长。测得主峰的保留时间(t_R)为8.6min，按面积归一法计算其的含量为98.6％。色谱图如图3所示。

(3)结构鉴定：将上制得的样品做其核磁共振、质谱，得到其图谱和数据如下。

①、MS图：如图4所示。

②、核磁共振氢谱图：如图5所示。

③、核磁共振碳谱：如图6所示。

对以上图谱的解析：

MS m/z：190(M⁺)，161(M⁺-C₂H₅)，148，133(M⁺-C₂H₅-CO)，106，76，55，27

¹H-NMR(CDCl₃)δ：0.96(t，J＝8，3H)，1.52(m，J＝8，2H)，2.35-2.69(m，6H)，5.25(t，J＝8，1H)，6.01(m，J＝8，1H)，6.28(d，J＝8，1H)

¹³C-NMR(CDCl₃)δ：13.8(-CH₃)，18.5(-CH₂-)，22.4(-CH₂-)，22.6(-CH₂-)，28.1(-CH₂-)，113.0(C＝)，117.0(C＝)，124.0(C＝)，130.0(C＝)，147.2(C＝)，148.6(O-C＝)，167.6(O-C＝O)

以上EI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR的谱图数据与顺势藁本内酯文献值一致，说明分离得到的就是顺式藁本内酯。

实施例2：

用300-400目的硅胶，分别取相同的当归挥发油50ml(藁本内酯含量约为30％)3份，各加50g硅胶(80-100目)拌样后，分别用减压柱层析、常压柱层析和加压柱层析等3种不同的分离方法，用相同的石油醚-乙酸乙酯洗脱系统，完成一次分离。具体试验如下：

减压柱层析分离：用一砂芯漏斗上(直径12.5cm)取250g层析硅胶(300-400目)用水泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高5cm。将拌样好的样品上样于柱顶，用水泵抽吸，先加1L石油醚冲洗，后用4L石油醚-乙酸乙酯(30∶1)的冲洗，200ml(约1/3个柱体积)收集一份，按实施例1的TLC方法进行检测，收集含藁本内酯的流份，减压回收洗脱液。得到藁本内酯8ml，GC测定纯度为98.2％。完成整个分离操作花了2小时。

常压柱层析分离：用一玻璃柱(直径10cm，高80cm)，取1.5kg层析硅胶(300-400目)加石油醚适量稀释后，加入柱中，硅胶充分沉降后，将拌样好的样品上样于柱顶，用20L石油醚-乙酸乙酯(30∶1)洗脱，250ml收集一份，按实施例1的TLC方法进行检测，收集含藁本内酯的流份，减压回收洗脱液。得到藁本内酯5ml，GC测定纯度为88.2％。完成整个分离操作花了140小时。

加压柱层析分离：用一玻璃柱(直径9cm，高80cm)，取1kg层析硅胶(300-400目)加入柱中，再加入石油醚，用氮气加压，尽量排除硅胶中的空气并使硅胶充分湿润后(硅胶面高40cm)。将拌样好的样品上样于柱顶，用18L石油醚-乙酸乙酯(30∶1)在氮气加压下冲洗，250ml收集一份，按实施例1的TLC方法进行检测，收集含藁本内酯的流份，减压回收洗脱液。得到藁本内酯8ml，GC测定纯度为93.5％。完成整个分离操作花了40小时。

将上三种方法的分离效果进行全面的比较，结果如下表。

分离方法	硅胶用量(kg)	洗脱剂用量(L)	分离完成的时间(h)	分得的藁本内酯量(ml)	藁本内酯纯度(％)
分离方法	硅胶用量(kg)	洗脱剂用量(L)	分离完成的时间(h)	分得的藁本内酯量(ml)	藁本内酯纯度(％)	常压柱层析	1.5	20	140	5	88.2
加压柱层析	1.0	18	40	8	93.5	常压柱层析	1.5	20	140	5	88.2
加压柱层析	1.0	18	40	8	93.5	减压柱层析	0.25	5	2	8	98.2

由上表可以看出，减压柱层析在硅胶和洗脱剂用量上，大大低于常压及加压柱层析，分离得到的藁本内酯的量和纯度均比常规柱层析相当或要好，而分离完成的时间只有常压柱层析的1/70、加压柱层析的1/20，说明减压柱层析分离藁本内酯其生产效率大大提高，而成本也降低了几倍。

通过对比上面3种的分离效能，发现减压分离有如下优势：分离时间大大缩短，溶剂消耗明显减少，而得到藁本内酯的量和纯度也较高，而吸附剂经处理后还可重复使用6-8次。

实施例3

乙醇浸提法提取粗油：称取当归生药10kg适当切碎后，加入1倍量95％乙醇湿润后，加入渗漉灌中，续加入2倍量的95％乙醇，浸渍过夜，再续加入15倍量的95％乙醇以1ml/kg.min的滴速渗漉，收集渗滤液，减压浓缩，得到深褐色浓稠液体约380ml的粗油。

用400ml正己烷适当稀释所得到的粗油。用一砂芯漏斗上(直径25cm)取3kg层析硅胶(100-200目)用水泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高12cm。将稀释后样品上样子已经装好的硅胶柱上，用水泵抽吸，先加5L正己烷冲洗，后加15L正己烷-丙酮(50∶3)的冲洗，再加15L正己烷-丙酮(50∶8)的冲洗，1/3个柱体积收集一份，用TLC(HF₂₅₄板，正己烷-乙酸乙酯(9∶1)展开)，检测各份洗脱液，收集合并在254nm和365nm下显明显无其他杂质Rf值最大显蓝色荧光的流份，减压回收洗脱液。另将有Rf值最大显蓝色荧光同时也含有其他杂质的流份，也减压回收后，在经过再生的硅胶柱上按上述硅胶减压层析方法反复分离2次，也得到只含的蓝色荧光的流分，减压回收溶剂后，在高真空下减压除去残留的溶剂，得到88g淡黄色液体样品，抽真空后于-20℃冰箱保存。并按实施例1方法进行纯度检测及结构分析，结果证明制得的是藁本内酯，GC纯度检测为91.8％。

硅胶的再生是去掉最上层上样污染了的硅胶后，先用正己烷减压洗脱4个柱体积，再用正己烷减压洗脱3个柱体积即可再次使用。而所用过的溶剂经分馏后再次使用。

实施例4：

称取川芎生药100kg适当切碎后，加入10倍量95％乙醇于提取罐中浸泡过夜后，加热回流提取2小时，过滤，药渣再分别加入6倍、4倍量95％乙醇，分别加热回流提取2小时，过滤并合并滤液，滤液减压浓缩回收尽乙醇，得到黄褐色浓稠液体4200ml，用3kg硅胶(80-100目)拌样后，用一短粗柱(直径35cm)取30kg层析硅胶(300-400目)用油泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高75cm，再直接加20L石油醚使硅胶湿润并抽紧，将拌样好的样品上样于已经装好的硅胶柱上，用真空油泵抽吸，先加100L石油醚-丙酮(50∶1)的冲洗，再加150L石油醚-丙酮(50∶5)的冲洗，1/4个柱体积收集一份，用TLC(HF₂₅₄板，石油醚-乙酸乙酯(10∶0.3)展开)，检测各份洗脱液，收集合并在254nm和365nm下显明显无其他杂质而Rf值最大显蓝色荧光的流份，减压回收洗脱液。另将有Rf值最大显蓝色荧光同时也含有其他杂质的流份，也减压回收后，在经过再生的硅胶柱上按上述硅胶减压层析方法反复分离2次，也得到只含的蓝色荧光的流分，减压回收溶剂后，在高真空下减压除去残留的溶剂，得到910g淡黄色液体样品，抽真空后于4℃冰箱保存。按实施例1方法进行纯度检测及结构分析，结果证明制得的是藁本内酯，GC纯度检测为94.6％。

硅胶的再生是去掉最上层用于上样的拌样硅藻土后，先用丙酮减压洗脱3个柱体积，再用石油醚减压洗脱3个柱体积即可再次使用。而所用过的溶剂经分馏后再次使用。

实施例5：

称取川芎生药50kg适当切碎后，加入1倍量95％乙醇湿润后，加入渗漉灌中，续加入2倍量的95％乙醇，浸渍过夜，再续加入15倍量的95％乙醇以1ml/kg.min的滴速渗漉，收集渗滤液，减压浓缩，得到黄褐色浓稠液体1800ml，用2kg硅胶(100-200目)拌样。用一短粗柱(直径35cm)取13kg薄层层析硅胶H(500-600目)用油泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高33cm。再将拌样好的样品上样于已经装好的硅胶柱上，先加20L石油醚冲洗，再加180L石油醚-乙酸乙酯(50∶5)的冲洗，1/3个柱体积收集一份，用TLC(HF₂₅₄板，石油醚-乙酸乙酯(9∶2)展开)，检测各份洗脱液，收集合并在254nm和365nm下显明显无其他杂质而Rf值最大显蓝色荧光的流份，减压回收洗脱液。另将有Rf值最大显蓝色荧光同时也含有其他杂质的流份，也减压回收后，在经过再生的硅胶柱上按上述硅胶减压层析方法反复分离3次，也得到只含的蓝色荧光的流分，减压回收溶剂后，在高真空下减压除去残留的溶剂，得到495g淡黄色液体样品，充氩气后，于-20℃冰箱中保存，按实施例1方法进行纯度检测及结构分析，结果证明制得的是顺式藁本内酯，GC纯度检测为98.1％。

硅胶的再生是去掉最上层用于上样的拌样硅胶后，先用乙酸乙酯减压洗脱5个柱体积，再用石油醚减压洗脱3个柱体积即可再次使用。而所用过的溶剂经精馏后再次使用。

实施例6：

称取茶芎生药20kg适当切碎后，置于超临界萃取设备中，进行CO₂超临界萃取，萃取压力为10Mpa，萃取温度为50℃，改性剂乙醇，萃取时间为6小时，得到褐色浓稠液体750ml，用750ml石油醚稀释，用一布氏漏斗上(直径25cm)取3kg层析硅胶(80-100目)用水泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高11cm。将稀释后样品上样于已经装好的硅胶柱上，用水泵抽吸，先加5L石油醚冲洗，后加15L石油醚-丙酮(50∶5)的冲洗，再用15L石油醚-丙酮(50∶10)的冲洗，1/3个柱体积收集一份，用TLC(HF₂₅₄板，石油醚-乙酸乙酯(8∶1)展开)，检测各份洗脱液，收集合并在254nm和365nm下显明显无其他杂质Rf值最大显蓝色荧光的流份，减压回收洗脱液。另将有Rf值最大显蓝色荧光同时也含有其他杂质的流份，也减压回收后，在经过再生的硅胶柱上按上述硅胶减压层析方法反复分离2次，也得到只含的蓝色荧光的流分，减压回收溶剂后，在高真空下减压除去残留的溶剂，得到63g淡黄色液体样品，充氮气后，于-20℃冰箱中保存，按实施例1方法进行纯度检测及结构分析，结果证明制得的是藁本内酯，GC纯度检测为90.5％。

硅胶的再生是去掉最上层用于上样污染了的硅胶后，先用丙酮减压洗脱4个柱体积，再用石油醚减压洗脱3个柱体积即可再次使用。而所用过的溶剂经分馏后再次使用。

实施例7：

称取茶芎生药80kg适当切碎后，加入10倍量95％乙醇于提取罐中浸泡过夜后，加热回流提取2小时，过滤，药渣再分别加入6倍、4倍量95％乙醇，分别加热回流提取1小时，过滤并合并滤液，滤液减压浓缩回收尽乙醇，得到黄褐色浓稠液体3800ml，用3kg硅胶(80-100目)拌样，用一短粗柱(直径35cm取25kg层析硅胶(300-400目)用油泵边抽吸边加入硅胶，并使之充分抽紧而顶端面平整，硅胶面高62cm，再直接加20L石油醚使硅胶湿润并抽紧，将拌样好的样品上样于已经装好的硅胶柱上，用油泵抽吸，加230L正己烷-乙酸乙酯(50∶1)的冲洗，1/4个柱体积收集一份，用TLC(HF₂₅₄板，正己烷-乙酸乙酯(10∶0.5)展开)，检测各份洗脱液，收集合并在254nm和365nm下显明显无其他杂质Rf值最大显蓝色荧光的流份，减压回收洗脱液。另将有Rf值最大显蓝色荧光同时也含有其他杂质的流份，也减压回收后，在经过再生的硅胶柱上按上述硅胶减压层析方法反复分离3次，也得到只含的蓝色荧光的流分，减压回收溶剂后，在高真空下减压除去残留的溶剂，得到320g淡黄色液体样品，按实施例1方法进行纯度检测及结构分析，结果证明制得的是藁本内酯，GC纯度检测为93.6％。

硅胶的再生是去掉最上层用于上样的拌样硅硅胶后，先用乙酸乙酯减压洗脱5个柱体积，再用正己烷减压洗脱4个柱体积即可再次使用。而所用过的溶剂经精馏后再次使用。

Claims

1、一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，是采用减压柱层析的方法从藁本内酯粗油中分离出所需的高纯度藁本内酯，所述高纯度藁本内酯是指纯度为90～99％的藁本内酯；所述减压柱层析的方法依次包括如下步骤：

a)装柱：在适当的分离装置中，用吸附剂干法装柱，并减压抽滤使之紧实平整，所述用于装柱的吸附剂量为上样粗油量的重量份的3～15倍，并且柱直径与高度比范围为1∶0.3至1∶3；

e)再分离：将步骤d)中含有其他杂质的藁本内酯组分混合后浓缩得到的组分重复上述a)～d)步骤2～3次，或者每次将层析柱再生后重复上述b)～d)步骤2～3次；

f)浓缩：合并步骤d)中得到的符合要求的藁本内酯组分，减压浓缩至溶剂尽，即得到高纯度的藁本内酯。

2、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：所述藁本内酯粗油是指从当归、川芎或茶芎中提取得到的含藁本内酯的粗油或者是化学合成的藁本内酯粗油。

3、如权利要求2所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：所述从当归、川芎或茶芎中提取含藁本内酯的粗油的方法包括乙醇浸提法、乙醇回流提取法、CO2超临界萃取法。

4、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：所述吸附剂为硅胶或中性氧化铝。

5、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：步骤a)中，所述用于装柱的吸附剂量为上样粗油量的重量份的5～10倍。

6、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：所述洗脱剂为添加或不添加乙酸乙酯或丙酮的石油醚或正己烷，并且体积比如下：

200份石油醚中添加0～40份乙酸乙酯；或

200份石油醚中添加0～40份丙酮；或

200份正己烷中添加0～40份乙酸乙酯；或

200份正己烷中添加0～40份内酮。

7、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：步骤d)中鉴别纯度所用的方法为薄层色谱法；

薄层色谱的条件为使用HF254硅胶板，并且展开剂为在10份正己烷或石油醚中添加有0.3～3份乙酸乙酯所得到的混合物，所述为其体积比；

纯度鉴定的判断标准是：藁本内酯的特征斑点为在紫外365nm下显蓝色荧光且Rf值最大的斑点，并且判断藁本内酯中无其他杂质的标准是在紫外254nm和365nm下均无其他明显的杂质斑点。

8、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：所述层析柱的再生过程为：除去最上层用于上样的吸附剂后，先用乙酸乙酯或丙酮减压洗脱3-5个柱体积，再用正己烷或石油醚减压洗脱3-5个柱体积即可。

9、如权利要求1所述的一种快速制备高纯度藁本内酯的方法，其特征在于：将制备得到的高纯度藁本内酯隔绝空气，在低于4℃的低温环境中保存。