CN100350048C - 一种重组卡介苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域和结核疫苗领域。近十几年来由于结核耐药株增多和HIV/AIDS的蔓延，结核病发病率增高，成为继HIV之后人类的第二大杀手。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是BCG。本发明将结核分枝杆菌ag85b、esat-6和IFN-γ基因序列插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒形成重组质粒，并将其转化入BCG中形成重组结核疫苗。本发明的重组疫苗应用于结核病的防治，将会产生比BCG更理想的免疫效果。

Description

一种重组卡介苗及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程疫苗领域，具体的说，本发明提供了一种新型的结核杆菌的重组疫苗，即将结核杆菌ag85b、esat-6及小鼠/人的IFN-γ基因克隆入BCG。

背景技术

结核病仍对人类构成巨大的威胁。目前全球接近32％的人口已感染了结核杆菌。每年约有270万人死于结核病，平均每天死亡超过7000人。世界卫生组织已于1993年宣布结核病为全球健康紧急状态。

我国结核病疫情较严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居世界第二位。2000年我国第四次全国结核病流行病学抽样调查结果分析，受感染人数超过4亿。在未来的十年内可能有3000万人发生结核病。调查显示，我国结核病疫情仍相当严重，且部分地区有蔓延趋势。

结核病流行难以遏制主要与多重耐药结核菌株增多以及艾滋病流行有关。

卡介苗(BCG)问世已80余年，全球大多数国家将其列入计划免疫接种项目。实践表明，卡介苗是一种安全的疫苗，它的副作用轻微，人体可忍受。目前已有30亿以上的人接种了BCG，并且每年有1亿左右的新生儿接种此疫苗。它可较好的阻止年幼儿粟粒型结核及结核性脑膜炎的发生。然而，它不能保护最常见的成人肺结核的发生。有资料表明BCG对成人的保护效果有印度南部的0％到英国的80％不等。尽管发表文献综合有效值为50％，但据估计其对结核病死亡的预防效果仅占5％，因此，有必要开发更有效的疫苗取代现行BCG疫苗。

国内外对新型结核杆菌疫苗的研究方兴未艾。目前着手研究的疫苗不外乎核酸疫苗、蛋白亚单位疫苗、减毒活疫苗、重组卡介苗等。目前重组卡介苗的研究主要集中以下三方面：1.重组细胞因子如：IFN-γ，IL-2，IL-12及GM-CSF，能刺激更强的潜在免疫反应；2.重组结核杆菌的保护性抗原如：Ag85B，增加抗原性保护量；3.重组卡介苗缺失的保护性抗原如：ESAT-6，CFP-10。最近也有报道将Ag85B和ESAT-6融合后重组进卡介苗，且对结核杆菌的保护效果比单一基因重组的好。但将结核杆菌ag85b、esat-6及小鼠(人)的IFN-γ基因克隆入BCG经查新无相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供一种由上述重组质粒制备的疫苗。

本发明的再一个目的是提供一种重组疫苗的制备方法。

本发明的一个目的是提供一种新的重组质粒，即将ag85b、esat-6和IFN-γ基因序列插入同一大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒序列中，从而形成重组穿梭质粒。

上述重组质粒中，通常将ag85b、esat-6和IFN-γ都插入同一大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处，以利于插入基因的稳定表达。

在本发明的一个实施例中，将ag85b、esat-6和IFN-γ依次插入同一大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处。

本发明中，ag85b、esat-6来自结核分枝杆菌(H37RV)，IFN-γ可以是人源的，亦可以是非人源的。在本发明的一个实施例中，IFN-γ是鼠源的。

本发明的重组质粒制备过程中，可采用的大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒有pWV261、pWV361、pSD7等。在本发明的一个实施例中，所用大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒为pWV261。

在另一方面，本发明提供了一种新型的结核杆菌重组疫苗，即将上述含有ag85b、esat-6及IFN-γ基因的重组质粒转化入卡介苗，从而得到rBCG::AEI重组疫苗。

Ag85B是Ag85复合体的-个组成部分。Ag85复合体是BCG及结核杆菌培养液中的主要组成部分及保护性抗原，很容易结合于人纤维连接蛋白，结合后参与疾病的形成。它也与分支杆菌细胞壁的合成有关。Ag85B是抗原性最强的一种。Ag85B在致敏的豚鼠中可诱导强烈的迟发型超敏反应，与PPD很相似。给鼠注射编码Ag85B的质粒可诱导针对Ag85复合体的强烈的Th1样反应，可特异性升高IL-2，IFN-γ及IFN-α的水平。

在Mtuberculosis.bovis传代形成卡介苗的过程中，出现毒力降低，伴随部分抗原丢失。丢失的抗原中即包括EAST-6。结核杆菌分泌蛋白ESAT-6是一种重要的T细胞抗原，是T淋巴细胞所识别的主要抗原靶位。可被感染了结核分支杆菌的动物模型及结核病人的保护性T淋巴细胞所识别。在鼠模型亦可诱导强烈的T细胞反应；在自然感染结核分枝杆菌病例，体外实验发现T细胞有强烈的针对此抗原的IFN-γ反应。

IFN可用于治疗非病毒性感染，多数为胞内寄生菌感染。其机理并非直接杀死病原体，而是通过增强细胞免疫功能而起作用。IFN-γ治疗结核杆菌感染的机理：1.激活淋巴细胞非特异性细胞毒作用：IFN可激活自然杀伤细胞(NK细胞)，而NK细胞是淋巴因之激活的杀伤细胞(LAK细胞)的前提之一，而γ-干扰素是刺激NK细胞，活化LAK细胞的淋巴因子，这两种细胞都具有非特异性细胞毒活性。2.激活巨噬细胞：IFN-γ是巨噬细胞活化因子(MAF)，通过激活巨噬细胞而在消除结核杆菌中发挥作用。它的功能有：(1)增强巨噬细胞的粘附性、吞噬功能及胞饮活性；(2)促进巨噬细胞对葡萄糖胺的摄取；(3)通过增强胞内氧自由基活性起抑菌或杀菌作用。3.调控主要组织相容性(MHC)抗原表达：α，β干扰素能正调节I类MHC抗原(HLA-A，B，C)的表达，对II类(HLA-DR)的表达无调节作用，IFN-γ能调节某些细胞的两类(I，II)抗原表达，这些细胞包括巨噬细胞，星胶质细胞及成纤维细胞，其结果是大大增强了T细胞免疫应答功能，进而又产生IFN-γ，这样就形成正性反馈，逐步增强免疫功能。干扰素也能调节细胞膜上其它细胞因子受体表达，IL-2，TNF-α以及巨噬细胞Fc受体，间接增强免疫功能。因此，对于结核病患者，尤其是机体免疫功能低下的患者，用干扰素治疗，为一种有效的方法。

用rBCG::AEI重组疫苗(BCG即卡介苗，“::”表示重组，A即Ag85B，E即ESAT-6，I即IFN-γ)免疫C57BL/c小鼠，同时分别用卡介苗(BCG)和PBS做为对照。结果显示，所诱导的血清Ag85B抗体水平、ESAT-6抗体水平和脾细胞IFN-γ表达均有增高。这说明rBCG::AEI重组疫苗可以诱导较BCG高的体液和细胞免疫水平，具有更好的免疫效果。

在另一方面，本发明提供上述rBCG::AEI重组疫苗的制备方法。主要包括以下步骤：

(1)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；

(2)ag85b，esat-6及IFN-γ基因的扩增；

(3)ag85b、sat-6及IFN-γ基因分别插入同一个载体；

(4)用含有ag85b、sat-6及IFN-γ基因的重组子转化入卡介苗。

各种实验参数均按常规操作选择，可视具体的实验条件而定。

此疫苗具有下列优势：

1.抗原谱接近结核杆菌：重组BCG内克隆入了esat-6基因，表达抗原ESAT-6，其中ESAT-6为卡介苗丢失的保护性抗原。

2.增强了保护性抗原量：重组BCG内克隆入了ag85b基因。

3.效果优于BCG：因为重组BCG是活疫苗，可持久分泌抗原，故可维持较长期的免疫效果。DNA疫苗及蛋白亚单位疫苗效果均不优于BCG。而此新开发的疫苗由于既保留了原BCG的抗原，又增加了重要的T细胞抗原及其丢失的抗原，还融合了IFN-γ的基因，可表达IFN-γ。IFN可间接发挥抗菌作用，故效果优于BCG。

附图说明

图1为PAEI酶切鉴定图。1，DNA分子量标准；2，重组质粒；3，Ag85B双酶切；4，Esat-6双酶切；5，IFN-γ双酶切。

图2为rBCG::AEI PCR鉴定图。6，DNA分子量标准；7，Esat-6 PCR条带；8，IFN-γ PCR条带。

图3为rBCG::AEI Western blotting(蛋白质印记杂交)图。9，蛋白分子量标准；10，BCG条带；11，rBCG::AEI条带。

具体实施方式

实施例1  重组子PAEI的构建

(1)结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA的制备

结核分枝杆菌(H37Rv)在7H9 Broth液体培养基中，37℃，静置培养2周。80℃，2小时灭活。用细菌DNA(小量)抽提试剂盒抽提基因组DNA。其中因结核菌的壁厚，细菌的消化时间延长至3-5小时。

(2)结核分枝杆菌H37Rv菌株ag85b，esat-6及小鼠的IFN-γ基因的扩增

根据ag85b，esat-6及小鼠的IFN-γ基因及载体多克隆位点设计引物：

Ag85B：        5’端引物P1：ATATGGCCAATGACAGACGTGAGCC

               3’端引物P2：TATGAATTCGCCGGCGCCTAACG

Esat-6         5’端引物P1：TATTGGCCAGAATTCATGACAGAGCAGCAGTGG

               3’端引物P2：TTAGTCGACTGCGAACATCCCAGTG

小鼠的IFN-γ基因

               5’端引物P1：AATGTCGACATGCAGGACCCGTAC

               3’端引物P2：ATTGTTAACCTATTACTGAGAAGCACG

PCR反应体系：10×buffer 5μl，dNTPs 5μl，DNA模板1μl，引物各1μl，Tag酶0.25μl，水36.75μl。反应条件：94℃ 1min，66℃ 1min，72℃ 3min，共30个循环，然后72℃延伸10min。产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(3)载体pWV261、ag85b的酶切、连接及转化

载体pWV261质粒、ag85b的PCR产物使用Bal I和Ecor I双酶切，37℃，4小时。用胶回收试剂盒纯化酶切产物。T4DNA连接酶连接，16℃，过夜。

制备E.coliDH5α感受态细胞：取DH5α单菌落于3mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜，次日按1∶100转接于30mlLB培养液中，37℃振荡培养2小时，0℃冷却放置10min，5kr/min 4℃离心5min收集菌体，重悬于10ml0.1mol/LCaCl₂中。冰浴20min，5kr/min 4℃离心5min收集菌体。加预冷0.1mlmol/LCaCl₂冰浴放置1小时以上备用。

转化：将10ml连接产物加入200mlE.coliDH5α感受态细胞中，冰浴30min，37℃热休克5min，立即冰浴2min，加入LB培养液800ml，37℃振荡培养1小时，然后涂布于含50μg/ml Kana的LB平板上37℃培养过夜。挑选单菌落分别接种于3ml含50μg/ml Kana的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，离心收菌，抽提质粒DNA。用Bal I和Ecor I双酶切鉴定。选取正确的重组子(简称PA)进行下一步实验。

(4)重组子(PA)、esat-6的酶切、连接及转化

重组子(PA)、esat-6的PCR产物使用Ecor I和Sal I双酶切。然后连接，转化(同上)。选取正确的重组子(简称PAE)进行下一步实验。

(5)重组子(PAE)、小鼠的IFN-γ基因的酶切、连接及转化

重组子(PAE)、小鼠的IFN-γ的PCR产物使用Sal I和Hpa I双酶切。然后连接，转化(同上)。选取正确的重组子(简称PAEI)进行下一步实验。对最终的重组子(PAEI)进行了酶切鉴定(如图1)，也进行测序鉴定，表明所插入序列和Gene Bank中结核全基因组相应基因序列一致。

(6)重组子(PAEI)电转化入卡介苗

BCG感受态细胞的制备：BCG在100ml7H9 Broth液体培养基中，37℃，静置培养2周。然后将其冰浴2小时，8000g，4℃，15min离心收菌；加入预冷的10％的甘油5ml/管，8000g，4℃，15min离心收菌；重复上述步骤5次；最后加入预冷的10％的甘油500μl/管，冰浴1小时以上备用。

取重组子(PAEI)10μl加入400μl BCG感受态细胞中，冰浴30min，转入电转化杯中，进行电转，参数为：电压：2500V，电阻：1000Ω，电容：25μF。加入7H9 Broth液体培养基800ml，37℃振荡培养1小时，然后涂布于含50μg/ml Kana的平板上7H10培养基上，37℃培养3-4周，有菌落长出。挑选单菌落分别接种于5ml含50μg/ml Kana的7H9 Broth液体培养基中，37℃静置培养2-3周，取菌保种。

实施例2  重组BCG(rBCG::AEI)基因水平的鉴定

取上述培养的菌200ml离心收菌，加20μl水沸水煮30min，离心取上清作为模板，进行PCR。

结果显示，PCR扩增得到的条带与esat-6(306bp)和小鼠的IFN-γ基因(467bp)条带大小相符(如图2)。因BCG本身含有ag85b基因，故即使PCR扩增得到ag85b条带，也无法确定其中是否含有外源的ag85b基因。

实施例3  重组BCG(rBCG::AEI)蛋白水平的鉴定

取重组BCG(rBCG::AEI)的菌接种到100ml改良罗氏培养基中，37℃，静置培养4-6周。8000g，4℃，30min离心收上清。然后冷冻抽干，透析，再冷冻抽干。

Western-blot结果显示，所得的条带约为60KD，与预测的大小相符。(如图3)。

Claims (5)

1.一种重组质粒，其特征在于，将ag85b、esat-6和IFN-γ基因序列插入同一大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒序列中，形成重组穿梭质粒。

2.如权利要求1所述重组质粒，其特征在于，ag85b、esat-6和IFN-γ都插入同一大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处。

3.如权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所用大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒为pWV261。

4.一种结核杆菌的重组疫苗，其特征在于，将如权利要求1所述重组质粒转化入卡介苗，从而得到rBCG::AEI重组疫苗。

5.如权利要求4所述重组疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；

(2)ag85b，esat-6及IFN-γ基因的扩增；

(3)ag85b、sat-6及IFN-γ基因分别插入同一个载体；

(4)用含有ag85b、sat-6及IFN-γ基因的重组子转化入卡介苗。

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