CN101629182B - 一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗 - Google Patents
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Abstract
一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及其使用方法，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段构成，将鸡防御素-1基因真核表达质粒用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1。本发明与已有技术相比，具有鸡防御素-1所特有的免疫增强效果的、适合与鸡DNA疫苗一起使用的优点。
Description
本发明涉及一种动物医药生物工程领域，特别是一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗。
背景技术
防御素是动物机体先天性内源免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原微生物的阳离子肽类活性物质，是生物机体免疫防卫系统的一个重要组成部分。除抗菌活性外，防御素还可中和LPS（脂多糖）、促进伤口愈合，对单核细胞的趋化性，调理作用活性，免疫增强活性。
研究发现人防御素（HNP）能增强老鼠巨噬细胞的吞噬作用功能，兔子防御素在肺泡巨噬细胞中作为具有调理素作用。兔子、豚鼠α-防御素，与人HNP2一样，可以诱导激活肥大细胞脱粒作用，导致组氨与前列腺素（PGD2）的释放。人HNP1-3能刺激气管上皮细胞增加IL-8基因的转录与产生，增加单核细胞产生TNF和IL-1，而降低IL-10的产生。人、兔的α-防御素通过竞争促肾上腺皮质激素的受体结合，具有抑制免疫抑制物糖皮质类固醇的产生能力。通过与固相或液相补体C1q的结合，体外人α-防御素能提高或抑制经典补体途径的激活。Tettito 等1989年及Murphy 等1993年的研究还证明人HNP-1-3具有对单核细胞的细胞趋化性与对上皮细胞和培养的成纤维细胞促有丝分裂活性。Yang 等人1999年和2000年研究表明，人上皮β-防御素（hBD-1和hBD-2）通过与CCR6化学激动受体的结合对未成熟树状突细胞和记忆性T-细胞具有趋化性；在毫摩尔浓度，hBD-1和hBD-2可以召集未成熟树状突细胞和记忆性T-细胞到微生物侵入的皮肤或粘膜位点，因此在内源免疫与获得性免疫反应中起重要作用。Chaly 等2000年的研究还表明人中性粒细胞α防御素通过影响细胞因子和粘附分子的表达来调节炎症反应。Biragyn et al（2001）对鼠β-防御素多肽-2,3的研究也发现它们可以与鼠CCR6化学激动受体的结合，类似于炎症化学激动剂MIP3-α，可以化学吸引骨髓来源的未成熟细胞，但对成熟的树突状细胞无用。Lillard 等1999年在进行防御素诱导增强机体获得性免疫力机制研究时发现，HNPs能显著增加血清中抗原特异性IgG与IgM的水平；增强抗原特异性CD4+T细胞的增值与IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-10的分泌；体外研究发现CD4+T提高CD3ε刺激的脾脏与Peyer’s结CD4+T细胞的增值与T辅助细胞因子分泌；调节LPS或CD3ε刺激的脾脏与Peyer’s结B或T细胞群共刺激分子的表达。 Tani et al（2000）体外用人α-防御素刺激鼠脾脏细胞可以促进其增值和细胞因子的产生；体内喂给小鼠可以提高IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平。
防御素还与内源防御的其他方面作用如急性炎症有关，包括：初始裂解细胞壁释放炎症刺激物，肥大细胞脱粒导致组胺释放及随后的血管缩张；增加中性粒细胞和T-辅助性细胞的化学趋化作用，导致白细胞聚集到感染位点；促进非特异性吞噬作用；通过组织纤维蛋白溶原酶激活剂抑制纤维蛋白溶解作用，这样减少细菌的传播；通过促进成纤维细胞的趋化和生长使组织、伤口的修复；通过抑制某些蛋白酶如Furin和组织蛋白酶抑制组织的损伤。假如急性炎症反应不足产生细菌的清除，那么长期炎症和适应性免疫反应就启动。有些防御素就在这个过程起作用：作为单核细胞的趋化因子；通过趋化因子招集T细胞；增强化学趋化作用产生和T-辅助细胞扩增反应，导致增加免疫球蛋白G，不是A的产生；抑制细胞因子的产生与其它巨噬细胞对LPS，LTA和细菌CpG DNA的反应；打开特异性吞噬细胞基因；刺激吞噬细胞凋亡和激活淋巴细胞，产生潜在的驱除感染细胞。
这些研究都表明防御素能直接调控内源免疫防御体系对抗外源侵病原微生物，在机体获得性免疫体系与先天性免疫体系中具有重要。椐研究，鸡防御素-1就具有诱导机体增强特异性与非特异性免疫反应能力性。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种具有防御素所特有的免疫增强作用的、适合鸡使用的鸡防御素-1基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗。
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒是这样实现的，由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程；4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程；
1、上游引物、下游引物的设置过程：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计去掉了前导肽处开始，并加上Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点，所需要的引物序列为：
上游引物：5’-cgAAGCTT aaaccatgGGAAGGAAGTCAGATTG-3’
下游引物：5’-TTGGATCCTCAgccccatattcttttgc-3’
2、鸡防御素-1基因的PCR扩增过程：以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR buffer（10×PCR buffer 包含有0.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris·HCl，0.001%明胶），2μL 的4×dNTPs（4×dNTPs包含有浓度均为2.5mmol/L 的dATP, dTTP, dCTP, dGTP），0.5μL的上游引物（20μmol/L），0.5μL的下游引物（20μmol/L），1μL 的pGEM-T-Gal-1质粒，40.5μL 的ddH2O（双蒸水），0.5μL 的ExTaq DNA聚合酶（5umol/L），反应过程是：a、混合物先在95℃处理3min；b、然后在94℃处理 45s，再在55℃处理 45s，再在72℃处理 1min；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，重组质粒pGEM-T-Gal-1来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-1；所获得的鸡防御素-1基因片段核苷酸序列为：
atgggaaggaagtcagattgttttcgaaagagtggcttctgtgcatttctgaagtgcccttccctcactctcatcagtgggaaatgctcaagattttacc
；
PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到约130bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；
3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程：将过程2的鸡防御素-1基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE（TE包含有10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA）溶解，TE溶解物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收约130bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，分别取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段和3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer（10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl， 0.1mol/L MgCl2， 50mmol/L DTT，5mmol/L ATP，0.25mg/mL BSA），1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时；pcDNA3.1(+)质粒为Invitrogen公司的产品
a、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的双酶切鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3.1(+)-Gal-1双酶切后产生约5.4kb和130bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；
b、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，4×dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上、下游引物（20μmol/L）各0.5μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 40.5μL，ExTaq DNA聚合酶（5umol/L）0.5μL；反应过程为：a、95℃处理3min；b、然后94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 1min；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；
4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程：从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1所制成的分子佐剂是这样实现的，将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1。然后将该鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1与DNA疫苗混合就成为可进行肌肉注射的鸡防疫用疫苗。
本发明与已有技术相比，由于是选用了鸡防御素-1基因片段与真核表达载体连接来作为免疫增强剂，因此，具有鸡防御素-1所特有的免疫增强效果的、适合与鸡DNA疫苗一起使用的优点。
具体实施方式：
现结合实施例对本发明作进一步详细描述：
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒是这样实现的，由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程；4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程；
1、上游引物、下游引物的设置过程：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计去掉了前导肽处开始，并加上Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点，所需要的引物序列为：
上游引物：5’-cgAAGCTT aaaccatgGGAAGGAAGTCAGATTG-3’
下游引物：5’-TTGGATCCTCAgccccatattcttttgc-3’
2、鸡防御素-1基因的PCR扩增过程：以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR buffer（10×PCR buffer 包含有0.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris·HCl，0.001%明胶），2μL 的4×dNTPs（4×dNTPs包含有浓度均为2.5mmol/L 的dATP, dTTP, dCTP, dGTP），0.5μL的上游引物（20μmol/L），0.5μL的下游引物（20μmol/L），1μL 的pGEM-T-Gal-1质粒，40.5μL 的ddH2O（双蒸水），0.5μL 的ExTaq DNA聚合酶（5umol/L），反应过程是：a、混合物先在95℃处理3min；b、然后在94℃处理 45s，再在55℃处理 45s，再在72℃处理 1min；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，重组质粒pGEM-T-Gal-1来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-1；所获得的鸡防御素-1基因片段核苷酸序列为：
atgggaaggaagtcagattgttttcgaaagagtggcttctgtgcatttctgaagtgcccttccctcactctcatcagtgggaaatgctcaagattttacc
；
PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到约130bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；
3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程：将过程2的鸡防御素-1基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE（TE包含有10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA）溶解，TE溶解物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收约130bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，分别取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段和3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer（10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl， 0.1mol/L MgCl2， 50mmol/L DTT，5mmol/L ATP，0.25mg/mL BSA），1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时；pcDNA3.1(+)质粒为Invitrogen公司的产品
a、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的双酶切鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3.1(+)-Gal-1双酶切后产生约5.4kb和130bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；
b、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，4×dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上、下游引物（20μmol/L）各0.5μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 40.5μL，ExTaq DNA聚合酶（5umol/L）0.5μL；反应过程为：a、95℃处理3min；b、然后94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 1min；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；
4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程：从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。
使用的限制性内切酶BamH I、Hind III、T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶等均购自广州宝泰克生物科技有限公司。
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1所制成的分子佐剂是这样实现的，将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1。然后将该鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1与DNA疫苗混合就成为可进行肌肉注射的鸡防疫用疫苗。
用该分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1与鸡法氏囊病DNA疫苗（IBD VP2 DNA疫苗）联合应用，免疫IBD VP2血清抗体阴性鸡只，通过检测血清IBD VP2特异性抗体值、CD3+、CD4＋、CD8＋百分含量来检测其对鸡法氏囊病DNA疫苗（IBD VP2 DNA疫苗）的免疫增强作用。60只14日龄的健康小鸡，随机分成3组，每组20只，免疫两次，第一次免疫后15天进行二免。第一组为PBS组（免疫剂量为0.2ml），第二组为IBD VP2 DNA疫苗组（免疫剂量为150μg），第三组为IBD VP2 DNA疫苗组（免疫剂量为150μg）＋pcDNA3.1(+)-Gal-1（免疫剂量为150μg）。分别于免疫后7、14、21、28、35d随机取5只鸡颈静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检测血清中VP2特异性抗体效价。同时采抗凝血分离淋巴细胞，用流式细胞仪进行淋巴细胞亚类CD3+、CD4+、CD8+百分含量的测定。测定结果发现，从免疫后第7天开始，IBD VP2特异性抗体值、CD3+、CD4＋、CD8＋百分含量在第二组和第三组随时间增加而增加，在21天达到最高值，然后开始下降至最低值，慢慢又恢复上升。但是加入pcDNA3.1(+)-Gal-1佐剂组即第三组鸡血清特异性VP2抗体值、CD3+、CD4+、CD8+百分含量就一直高于IBD VP2 DNA疫苗即第二组单独注射组，免疫后21天出现显著性差异(P<0.05)。实验结果表明分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1对IBD VP2 DNA疫苗具有很好的免疫增强作用。
Claims (3)
1.一种鸡防御素-1基因真核表达质粒，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段构成，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程；4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程；
（1）、上游引物、下游引物的设置过程：引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计去掉了前导肽处开始，并加上Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点，所需要的引物序列为：
上游引物：5’-cgAAGCTT aaacc atgGGAAGGAAGTCAGATTG-3’
下游引物：5’-TTGGATCC TCAgccccatattcttttgc-3’
（2）、鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程：以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR buffer，2μL 的4×dNTPs，0.5μL的浓度为20μmol/L的上游引物，0.5μL的浓度为20μmol/L的下游引物，1μL 的pGEM-T-Gal-1质粒，40.5μL 的ddH2O，0.5μL 的浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶，反应过程是：a、混合物先在95℃处理3min；b、然后在94℃处理 45s，再在55℃处理 45s，再在72℃处理 1min；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，重组质粒pGEM-T-Gal-1来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-1；所获得的鸡防御素-1基因片段核苷酸序列为：
atgggaaggaagtcagattgttttcgaaagagtggcttctgtgcatttctgaagtgcccttccctcactctcatcagtgggaaatgctcaagattttacc
；
PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到130bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；
（3）、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程：将过程2的鸡防御素-1基因片段的PCR扩增产物用酚氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE溶解物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收130bp的条带；以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段和3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时；pcDNA3.1(+)质粒为Invitrogen公司的产品
a、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的双酶切鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3.1(+)-Gal-1双酶切后产生5.4kb和130bp的两条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；
b、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鉴定：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：5μL 的10×PCR Buffer，2μL 的4×dNTPs，浓度均为20μmol/L的上、下游引物各0.5μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 40.5μL，浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5μL；反应过程为：a、95℃处理3min；b、然后94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 1min；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min，PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见130bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；
（4）、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程：从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。
2.一种含鸡防御素-1基因真核表达质粒的的分子佐剂，其特征在于将权利要求1所述的鸡防御素-1基因真核表达质粒用PBS缓冲液稀释到1mg/ml而成。
3.一种含鸡防御素-1基因真核表达质粒的疫苗，其特征在于将权利要求2所述的鸡防御素-1基因分子佐剂与DNA疫苗混合而成。
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