CN100349576C

CN100349576C - 蛋白毒素中和剂

Info

Publication number: CN100349576C
Application number: CNB028088530A
Authority: CN
Inventors: 田头素行; 岩丸祥史; 野田公俊; 三宅真美
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2007-11-21
Anticipated expiration: 2022-03-28
Also published as: CN1691952A

Abstract

蛋白毒素中和剂，它包含作为有效组分的得自啤酒花的原花色素。

Description

蛋白毒素中和剂

技术领域

本发明涉及一种蛋白毒素中和剂，它包含作为有效组分的得自啤酒花的原花色素。

技术背景

啤酒花(Humulus lupuls)是一种大麻科多年生植物，而啤酒花球果(成熟未受粉的雌花)通常被称为啤酒花。啤酒花除了包括球果之外，还包括叶、啤酒花茎、根等。存在于啤酒花球果中的蛇麻素部分(在啤酒花球果的内苞根部形成的黄色颗粒)是苦味和香味的来源，而且它与酵母和麦芽一起是啤酒酿造中的重要啤酒原料。在民间疗法中，啤酒花可用作镇静药和抑欲药(anti-aphrodisiac)。啤酒花苞是通过从啤酒花球果除去蛇麻素部分而形成的，而且这些苞片都是无用的。如果情况需要，在啤酒酿造中将这些苞片作为副产品除去。在该情况下，啤酒花苞用作肥料。然而，由于没有发现特别有效的用途，希望开发一种具有高附加值的利用所述苞片的方法。

在日本专利公开发布No.09-2971、日本专利公开发布No.09-163969、日本专利公开发布Nos.09-295944、10-25232、2000-327582和2001-39886(本申请人的申请)中，认识到啤酒花(特别是来自啤酒花苞的多酚)具有抗氧化作用，发泡麦芽饮料的泡沫稳定作用，防龋作用，除臭作用，癌细胞的抗转移作用，以及拓扑异构酶抑制作用。

但是，至于从啤酒花获得的原花色素，迄今还没有发现证明有蛋白毒素中和效果的情况。在这方面，毒性真菌产生的细菌毒素，例如，霍乱细菌产生的霍乱毒素和肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagiccolibacillus)产生的Vero细胞毒素(例如，O-157)，相应于蛋白毒素。蛇(例如，饭匙倩和蝰蛇)的毒液，植物毒素(例如，赖氨酸)相应于蛋白毒素。如果某毒素本身是蛋白毒素，该毒素不受上述毒素的限制。

本发明要解决的问题

根据WHO报告，传染病在全世界引起2千万人死亡。尽管医疗技术有很大进展，传染病仍然威胁人类。

在传染病中，例如，霍乱，百日咳，白喉，产毒性大肠埃希氏菌(Echerichia coli)引起的腹泻和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)引起的机会性感染，已知每一种病毒产生具有ADP-核糖基转移酶作用的外毒素，该外毒素在体内修饰功能蛋白质使它丧失原始作用，从而表达疾病。即，霍乱菌(cholera bacillus)产生的霍乱毒素、百日咳菌(pertussis bacillus)产生的百日咳毒素、产毒性大肠埃希氏菌产生的不耐热肠毒素(LT)、铜绿假单胞菌产生的外毒素、肉毒梭菌(clostridium botulinum)产生的肉毒杆菌(botulinum)C2毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringenus)产生的iota毒素等都是具有ADP-核糖基转移酶作用的蛋白毒素(ADP-核糖基化作用毒素)。

ADP-核糖基转移酶作用表示，从活体辅酶的NAD切割烟酰胺，残余的ADP-核糖部分被不可逆转移到靶蛋白。然后，该靶蛋白不可逆地丧失活体功能。例如，已知白喉毒素和来自铜绿假单胞菌的外毒素A将肽延伸因子EF-2 ADP-核糖基化，而霍乱毒素和产毒性大肠埃希氏菌的LT则将GsαADP-核糖基化。

全世界很多人患由ADP-核糖基化毒素的病原体因子引起的传染病。根据WHO报告，每年患霍乱的人数达十万。即，人们处于由ADP-核糖基化毒素的病原体因子引起的传染病危险中。

另一方面，在痢疾病中，由Vero细胞毒素生产大肠埃希氏菌(VTEC)等引起的出血性结肠炎，每一种病原菌产生具有RNA N-糖苷酶作用的外毒素，该外毒素在体内修饰功能蛋白质使它丧失原来的作用，从而表达疾病。即，痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae)产生的志贺菌毒素、VETC产生的Vero细胞毒素(或者将它称为志贺菌样毒素)等都是具有RNA N-糖苷酶作用的蛋白毒素(RNA N-糖基化毒素)。

RNA N-糖苷酶作用表示，RNA的N-糖苷键被酶解了。具有这种作用的蛋白毒素在核糖体(它是将被不可逆失活的细胞的蛋白合成装置)中修饰核糖体RNA。于是，人们已知细胞的蛋白合成被终止而引发毒性。例如，志贺菌毒素、Vero细胞毒素等特异性地水解腺苷的N-糖苷键(它是从28S核糖体的5′端的第4324位置)。

在RNA N-糖基化毒素引起的传染病中，由VTEC引起的传染病经常在全世界发生，不论是发达国家还是发展中国家。尤其，当Vero细胞毒素输送入血液时，由于受溶血性尿毒症综合征(HUS)或脑病侵袭致死或具有后遗症，所以，上述传染病很严重。在日本，人们记得1996年大阪发生了史无前例的食物中毒，6000多人受感染。

现在，具有抗病原微生物的抗生作用的抗生素通常被用于治疗由ADP-核糖基化毒素或RNA N-糖基化毒素引起的传染病。然而，由于施用抗生素而出现更强的耐受抗生素的病原微生物，抗生素在实际医疗领域中引起了麻烦。因此，需要开发一种不用抗生素的新治疗方法。特别是，在VTEC引起的传染病中，据说由于施用抗生素而由VTEC产生了大量Vero细胞毒素，于是症状变得严重(Matsushiro等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，181，2257～2260(1999))。所以，有很多观点否定施用抗生素。即，事实上，要求迫切建立一种新疗法，其中，不使用像杀微生物的抗生素这样的物质。

考虑到这样的情况，本发明人试图寻找一种将引起传染病的微生物所产生的蛋白毒素中和和解毒的物质，从而解决上述问题。如果发现了中和蛋白毒素的有效物质、特别是中和具有ADP-核糖基转移酶作用和RNA N-糖苷酶作用的蛋白毒素的有效物质，在医疗和工业领域中就很有意义。

发明公开

本发明人认真地研究并发现了，啤酒花中的一种多酚有效地解除ADP-核糖基转移酶作用和RNA N-糖苷酶作用，从而完成了本发明。所述多酚含于啤酒花茎和啤酒花苞部分，尤其大量含于苞片部分。将所述多酚吸附在对多酚表现出亲合性的树脂(例如，苯乙烯-二乙烯基苯树脂)上。当用1000或更高的级分分子量的膜处理所述多酚时，它显示不透过该膜的性能。在含有约5％盐酸的醇溶液中加热并水解所述多酚时，该多酚是产生花青素的原花色素。

该原花色素在GPC(凝胶渗透色谱)分析中给出图1的色谱图，而在吸收光谱分析中给出图2的吸收分布图。

本发明涉及一种蛋白毒素中和剂，它包含作为有效组分的含于啤酒花中(优选含于啤酒花苞部分中)的原花色素。

附图简述

图1示出了来自啤酒花的原花色素的GPC(凝胶渗透色谱)分析结果。

图2示出了来自啤酒花的原花色素的吸收光谱分布。

图3示出了来自啤酒花的原花色素的HPLC分析结果。

图4示出了实施例12的结果。纵轴示出辐射活性。对比示出没有添加霍乱毒素的试验结果。柱的高度是试验值的平均值(n＝3)，误差条示出它的标准误差。

图5示出了实施例13的结果。纵轴示出单位长度上小鼠肠道环内汇集的液体的重量(mg/cm)。柱的高度是试验值的平均值(n＝3)，误差条示出它的标准误差。

图6示出了实施例14的结果。纵轴示出辐射活性，没有添加Vero细胞毒素时数值以100％表示。柱的高度是试验值的平均值(n＝3)，误差条示出它的标准误差。

图7示出了实施例15的结果。纵轴示出活细胞比率，而横轴则示出通过与实施例5或对比实施例1相同的方法获得的物质的添加量(μg/ml)。Vero细胞毒素的添加量是最终浓度62pg/ml。◆表示通过与实施例5相同的方法获得的物质的试验结果，而■表示通过与对比实施例1相同的方法获得的物质的试验结果。纵轴上的每一个值表示每个试验值的平均值(n＝3)，误差条示出它的标准误差。

图8示出了实施例16的结果。纵轴示出单位环长度的液体重量(ml/cm)。横轴示出试验结果。“PBS”表示单独添加PBS，“HBT500”表示添加500μg通过与实施例5相同的方法获得的物质，“VT”表示单独添加100ng Vero细胞毒素，而“VT+HBT 0.8～500”表示添加100ng Vero细胞毒素和0.8～500μg通过与实施例5相同的方法获得的物质。纵轴上的值表示每个试验值的平均值(n＝3)，误差条示出它的标准误差。

实施本发明的最佳方式

作为本发明的蛋白毒素中和剂的原料，优选利用啤酒花的啤酒花茎和啤酒花苞部分。特别是，可利用整体部分而不分离啤酒花的各部分。啤酒花苞表示，通过从啤酒花球果除去蛇麻素后获得的部分。啤酒花苞是通过将啤酒花球果捣碎和过筛后除去蛇麻素而获得的。但是，在近来的啤酒酿造中，为了省去通过过筛除去啤酒花苞的步骤，不用除去啤酒酿造中不必要的啤酒花苞，而是将啤酒花苞加工成丸。这样获得的啤酒花丸往往用在啤酒酿造中。因此，作为本发明的原料，可利用含啤酒花的啤酒花茎和啤酒花苞部分的原料而不加限制，并且可进一步将啤酒花球果和含啤酒花苞的啤酒花丸用作原料而没有问题。

至于蛋白毒素中和剂的生产方法，它包括如下步骤：用水、有机溶剂(例如，80v/v％或更低的醇、丙酮、乙腈等，它们能与水混合)提取含啤酒花茎、啤酒花苞的原料，含啤酒花苞的啤酒花球果，啤酒花丸，或者这些啤酒花植物部分。作为一个优选的实例，可利用含50v/v％或更低的乙醇的水溶液。原料与提取溶剂的比率优选是约1∶20～100w/w，提取温度是4～95℃。优选的是，在搅拌下将混合物提取20～60分钟。通过过滤获得提取物。如果必要的话，可利用助滤剂(例如，珍珠岩)。

采用常规方法(例如，浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥)除去这样获得的提取物中的溶剂，并且可获得蛋白毒素中和剂的粉末。获得的蛋白毒素中和剂本身就很有用且合乎实际，如果必要的话，可通过利用吸附性树脂的方法将它进一步纯化。但是，由于该方法旨在更进一步的纯化，如果不必要，就可省去它。

用对多酚具有亲合性的粒状合成树脂处理上述提取物而浓缩蛋白毒素中和剂。该方法可这样进行，即，使啤酒花提取物流过填充了粒状合成树脂的柱，充分洗涤该柱，再洗脱柱上吸附的中和剂。另外，可将粒状树脂浸入啤酒花提取液而进行分批处理。

当蛋白毒素中和剂吸附在合成树脂上时，将啤酒花提取物冷却到15～30℃的室温，如果必要的话，为了提高吸附效率，优选的是预先降低提取物的有机溶剂的浓度。作为合成树脂，可利用羟丙基化葡聚糖、亲水性乙烯基聚合物、苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等。

然后洗涤合成树脂以进一步提高蛋白毒素中和剂的纯度。至于洗涤用的溶剂，优选可利用水或1～10w/w％乙醇水溶液。溶剂量优选是树脂量的约1～10倍以洗涤所述中和剂。

然后从吸附了多酚的合成树脂洗脱蛋白毒素中和剂。作为洗脱用溶剂，可利用含水醇、含水丙酮、含水乙腈等。特别优选的溶剂是30w/w％或更高的乙醇水溶液或乙醇。流过树脂的洗脱液的量优选是树脂量的约2～6倍。

利用常规方法(例如，浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥)从所得洗脱液中除去溶剂，并且可获得蛋白毒素中和剂的粉末。采用真空浓缩，可回收循环利用醇、丙酮、乙腈等。用80v/v％或更高的醇水溶液或者约0.05N氢氧化钠水溶液等洗涤用过的合成树脂，该树脂就可重复循环利用。

这样获得的蛋白毒素中和剂可原样使用，通过下述应用超滤膜的方法可进一步提高纯度。该步骤适合于提高中和剂的纯度，如果必要的话，可省去该步骤。

将通过上述方法制备的蛋白毒素中和剂溶于水或可与水混合的有机溶剂，用1,000或更高的级分分子量的超滤膜处理。可使用下列超滤膜原料，例如，纤维素、乙酸纤维素、聚砜、聚丙烯、聚酯、聚醚砜和PVDF等而没有任何限制。可利用1,000或更高的级分分子量的超滤膜而没有任何问题。然而，如果利用具有太高级分分子量的超滤膜，产率就急剧降低。如果分子量低，处理时间就长。超滤膜的优选级分分子量是约5,000～50,000。虽然所述处理取决于溶剂类别，或者提取溶剂与啤酒花或啤酒花苞的比率，但优选进行处理至上层静止液的量降到处理开始时的约1/10～1/100。尽管压力取决于超滤膜或过滤装置，但它优选是0.1～10.0kg/cm²。如果必要的话，可再次用合适的溶剂稀释处理过的上层静止液，再循环而提高纯度。

利用常规方法除去溶剂或形成的上层静止液，例如，通过浓缩、冷冻干燥或喷雾干燥，于是可获得蛋白毒素中和剂的粉末。采用真空浓缩，可回收并再利用醇、丙酮、乙腈等。

这样获得的蛋白毒素中和剂是无臭的粉末，它具有轻微的苦味和皮肤色、棕色或浅黄色。所述中和剂吸附在对多酚具有亲合性的合成树脂上，而且它是原花色素，不透过级分分子量为1,000或更大的超滤膜。

产率是0.5～20.0w/w％(转化为啤酒花苞的重量)和0.5～15.0w/w％(转化为啤酒花球果的重量)。

可用常用的载体、助剂、添加剂等配制得到的蛋白毒素中和剂。该中和剂可用作经口或肠胃外施药的医药供应品或者通过与食品原料混合而作为食品和饮料。

经口施药的医药供应品有片剂、胶囊、颗粒、糖浆等，而肠胃外施药的医药供应品则是外用药物，例如，软膏、乳膏和溶液，以及注射液，例如，无菌溶液和悬浮液。如果这些供应品对人体施用，施药量是每天2～1,000mg和每天每次或数次2～500mg，从而给出足够的效果。

含本发明的蛋白毒素中和剂的医药供应品可通过所需的单元量形式与药物上许可的运载体、载体、填充剂、粘合剂、稳定剂、香料等一起配制。可与片剂或胶囊混合的辅剂如下：粘合剂，例如，黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉和明胶；填充剂，例如，微晶纤维素；溶胀剂，例如，玉米淀粉、所有的糊化淀粉、藻酸；润滑剂，例如，硬脂酸镁；甜味剂，例如，蔗糖、乳糖和糖精；以及香料，例如，薄荷油、白珠油(akamono oil)和樱桃香精。胶囊除了含上述物质外还可包含液态载体，例如，脂肪和脂肪油。其它原料有包衣剂。此外，可通过其它方法改变制剂的物理形式。例如，可用紫胶(schellac)或蔗糖包衣片剂。糖浆或酏剂可包含：作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，色素和香料(例如，樱桃或橙香料)。

可通过常规方法配制注射用无菌组分，即，将活性物质溶于或悬浮于下列载体中，例如，注射用水，天然植物油(例如，芝麻油、椰子油、花生油和棉籽油)，或者合成脂肪载体(例如，油酸乙酯)。此外，如果必要的话，可配制缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。外用药物(例如，软膏或乳膏)可通过常规方法利用凡士林、石蜡、脂肪和脂肪油、羊毛脂、大粒凝胶(macrogol)等获得。

含本发明的蛋白毒素中和剂的食品和饮料可通过上述配方形成。另外，可利用常规方法加工它，即，将所需物加入面筋、日本脆点心、饼干或饮料的食品原料中。将所述中和剂加工并作为保健食品或功能性食品口服，每天分数次服用5～500mg以防病和保健。

当将本发明的蛋白毒素中和剂加入这些食品和饮料时，希望可添加呈粉末的该中和剂，在1～2％水溶液或醇水溶液或醇溶液中最终浓度为1～500ppm、而优选10～100ppm。

实施例

虽然如下实施例详细描述了本发明的实施方案，但本发明不限于这些实施例。

实施例1(通过利用凝胶类合成吸附剂从啤酒花球果制备蛋白毒素中和剂)

在研钵内捣碎啤酒花球果20g，用水2L通过在95℃的温度下搅拌40分钟提取。过滤后，冷却提取的水，流过填充了亲水性乙烯基聚合物树脂80ml的柱，用5％乙醇水溶液400ml洗涤。使80％乙醇水溶液流过柱子，回收洗脱液并冻干，获得略具苦味的蛋白毒素中和剂800mg(呈浅黄色无臭粉末)。从啤酒花计算的产率是4％。

实施例2(通过利用凝胶类合成吸附剂从啤酒花苞制备蛋白毒素中和剂)

用50％乙醇水溶液600ml通过在30℃的温度下搅拌20分钟提取啤酒花苞20g。过滤后，将提取液真空浓缩，使浓缩的液体流过填充了苯乙烯-二乙烯基苯树脂80ml的柱，用水400ml洗涤。使80％乙醇水溶液400ml流过柱子，回收洗脱液并冻干，获得略具苦味的蛋白毒素中和剂1.6g(呈浅黄色无臭粉末)。从啤酒花苞计算的产率是8％。

实施例3(通过利用超滤膜从啤酒花球果制备蛋白毒素中和剂)

在研钵内捣碎啤酒花球果20g，用水2L通过在95℃的温度下搅拌40分钟提取。过滤后，冷却提取的液体，在室温和1.0kg/cm²下流过级分分子量为50,000的超滤膜，从而获得液体20ml。真空干燥形成的上层静止液，获得略具苦味的蛋白毒素中和剂200mg(呈浅黄色无臭粉末)。从啤酒花计算的产率是1％。

实施例4(通过利用超滤膜从啤酒花苞制备蛋白毒素中和剂)

用50％乙醇水溶液600ml通过在80℃的温度下搅拌40分钟提取啤酒花苞20g。过滤后，使提取的液体在室温和3.0kg/cm²下流过级分分子量为10,000的超滤膜，从而获得液体60ml。将形成的上层静止液冻干，获得略具苦味的蛋白毒素中和剂0.8g(呈浅黄色无臭粉末)。从啤酒花苞计算的产率是4％。

实施例5(进一步纯化和定性分析所述蛋白毒素中和剂)

将实施例2中获得的蛋白毒素中和剂0.8g溶于10％乙醇水溶液500ml，在室温和1.0kg/cm²下用级分分子量为5,000的超滤膜处理而获得液体20ml。将形成的上层静止液冻干，获得略具苦味、皮肤色的蛋白毒素中和剂0.4g(呈无臭粉末)。利用下列条件通过HPLC分析该粉末，它的色谱图如图3中所示。通过儿茶素测定法(食品法定分析法)来分析该粉末，它是多酚的一般定量分析法之一，按儿茶素含量计算该中和剂是40.6％。

(HPLC条件)装置：Shimazu LC-10A系统，柱：ODS-80TM(Toso，4.6mmI.D.×25cm)，流动相∶线性梯度(A液∶B液)＝从(100∶0)到(50∶50)达30分钟。A液：5％乙腈(含0.1％HCl)，B液：乙腈，样品注射量：20μg，检测：在200～300nm处检测多波长。

实施例6(片剂和胶囊)

实施例5中获得的物质 10.0g

乳糖 75.0g

硬脂酸镁 15.0g

总计 100.0g

将上述组分均匀地混合，通过常规方法获得了片剂和胶囊。通过相同方法，分别用通过实施例1、2、3和4中描述的方法获得的物质代替通过实施例5中描述的方法获得的物质加工成片剂和胶囊。

实施例7(粉末和颗粒)

实施例5中获得的物质 20.0g

淀粉 30.0g

乳糖 50.0g

总计 100.0g

将上述组分均匀地混合，通过常规方法获得了粉末和颗粒。通过相同方法，分别用通过实施例1、2、3和4中描述的方法获得的物质代替通过实施例5中描述的方法获得的物质加工成粉末和颗粒。

实施例8(注射液)

实施例5中获得的物质 1.0g

去污剂 9.0g

生理盐水 90.0g

总计 100.0g

将上述组分加热，混合并灭菌，获得了注射液。通过相同方法，分别用通过实施例1、2、3和4中描述的方法获得的物质代替通过实施例5中描述的方法获得的物质生产了注射液。

实施例9(小麦面筋)

蔗糖 20.0g

稠麦芽糖浆(固含量75％) 70.0g

水 9.5g

着色剂 0.45g

香料 0.045g

实施例5中获得的物质 0.005g

总计 100.0g

应用具有上述含量的每种组分，通过常规方法制备了小麦面筋。通过相同方法，分别用通过实施例1、2、3和4中描述的方法获得的物质代替通过实施例5中描述的方法获得的物质生产了小麦面筋。

实施例10(汁液)

浓缩橙果汁 15.0g

果糖 5.0g

柠檬酸 0.2g

香料 0.1g

着色剂 0.15g

抗坏血酸钠 0.048g

实施例5中获得的物质 0.002g

水 79.5g

总计 100.0g

应用具有上述含量的每种组分，通过常规方法制备了汁液。通过相同方法，分别用通过实施例1、2、3和4中描述的方法获得的物质代替通过实施例5中描述的方法获得的物质生产了汁液。

实施例11(饼干)

软质面粉 32.0g

全蛋 16.0g

奶油 16.0g

蔗糖 25.0g

水 10.8g

发酵粉 0.198g

实施例5中获得的物质 0.002g

总计 100g

利用具有上述含量的每种组分，通过常规方法制备了饼干。通过相同方法，分别用通过实施例1、2、3和4中描述的方法获得的物质代替通过实施例5中描述的方法获得的物质生产了饼干。

对比实施例1

参考Hattori等的方法(Hattori等，化学与药学通报(Chem.Pharm.Bull.)，38，717～720(1990))，从绿茶制备了多酚级分。用沸水200ml提取来自日本静冈县的绿茶10g。将提取液冻干(2.7g)，溶于30％甲醇中，流过ODS柱(15mmI.D.×10cm)。将洗脱液冻干而获得呈黄色粉末的多酚级分2.4g。

实施例12霍乱毒素的ADP核糖基转移酶作用的抑制效果

通过Noda等的方法(Noda M.等，生物化学(Biochemistry)，28，7936(1989))进行了检测。首先，配制了具有下列组成的霍乱毒素溶液和NAD反应液。配制了该霍乱毒素溶液20μl、具有几个浓度的如实施例5中所示获得的物质的PBS溶液20μl和蒸馏水60μl的混合物。往该混合物中添加NAD反应液100μl。然后，将混合物在30℃的温度下保温90分钟。保温后，收集反应液150μl，流过0.5cm×4cm柱的Dowex AG1-X2(Bio-Rad Inc.)以除去未反应的腺嘌呤¹⁴C NAD。通过液体闪烁计数器(Beckman LS6500)测定了生成的腺嘌呤¹⁴C NAD-核糖基化胍基丁胺的量。腺嘌呤¹⁴C NAD-核糖基化胍基丁胺的量被用作指示剂来测定ADP-核糖基转移酶活性。结果如图4中所示。如实施例5中所示获得的物质以浓度依赖关系中和了霍乱毒素的ADP-核糖基转移酶作用。

所述霍乱毒素溶液的组成：将1mg/ml霍乱毒素180μl、1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)60μl、1M二硫苏糖醇水溶液120μl和蒸馏水840μl混合，在37℃的温度下保温20分钟而获得霍乱毒素溶液。

NAD反应液的组成：将1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)190μl、0.1MMgCl₂水溶液190μl、1M二硫苏糖醇水溶液76μl、10mg/ml卵清蛋白38μl、1M胍基丁胺76μl、¹⁴C NAD(25uCi/ml)19μl和蒸馏水1311μl混合而获得¹⁴C NAD反应液。

实施例13在小鼠肠道中霍乱毒素的液体累积毒素的中和效果

通过麻醉下的剖腹术处理了体重为19～21g、5～6周龄的雌性ddY小鼠。将约5cm的回肠部分连接而制作袋式环。将一定量(2μg)的霍乱毒素和含各浓度如实施例5中所示获得的物质的溶液200μl注射入环内。缝合小鼠的腹部并保持安静。然后，对小鼠执行安乐死，测定环内积累的液体重量和环长度。计算单位环长度的液体重量(mg/cm)而指示霍乱毒素的毒性。结果如图5中所示。如实施例5中所示获得的物质以浓度依赖关系中和了霍乱毒素的液体累积。

实施例14Vero细胞毒素的RNA N-糖苷酶作用的抑制效果

将一定浓度(240nM)的Vero细胞毒素水溶液5μl和240～2400μg/ml如实施例5中所示获得的物质的水溶液混合，使它在室温下静置一小时。然后，制备了50μl如下列成分中所示的液体溶解兔网织红细胞，将该液体加到上述混合物中，在30℃温度的水浴中进行蛋白质合成反应达20分钟。反应后，将样品移到冰上，添加1ml 10％三氯乙酸水溶液，将混合物在沸水中煮10分钟，停止反应。用冰冷却样品后，将合成的蛋白质吸附在硝基纤维素滤器上，用10％三氯乙酸水溶液1ml洗涤两次。将蛋白质干燥后，用闪烁计数器测定辐射活性。

结果如图6中所示。如实施例5中所示获得的物质以浓度依赖关系抑制了Vero细胞毒素蛋白质合成。它表明，所述物质抑制了基于Vero细胞毒素的RNA N-糖苷酶作用。

液体溶解兔网织红细胞的组成：50mM腺苷-3磷酸水溶液15μl，10mM鸟苷-3磷酸水溶液15μl，300mM肌酸磷酸水溶液30μl，1mg/ml肌酸激酶水溶液10μl，1M二硫苏糖醇水溶液4μl，1M HEPES缓冲液(pH 7.5)10μl，3M氯化钾水溶液15μl，100mM乙酸镁水溶液15μl，含除Leu之外的各5mM氨基酸的水溶液15μl，100uCi/ml¹⁴C-Leu水溶液50μl，4mg/ml氯高铁血红素水溶液4μl，以及兔网织红细胞溶血液500μl。

实施例15Vero细胞毒素的细胞毒素对Vero细胞的中和效果

预先将调节到2.0×10⁵个细胞/ml的Vero细胞悬浮液100μl吸移入96孔板，使它静置一夜而制备Vero细胞的单层膜。将一定浓度的Vero细胞毒素和10μl PBS溶液总计80μl(含如实施例5和对比实施例1中所示获得的各种物质)加到孔中，在5％CO₂培养箱中，在37℃的温度下将混合物培养48小时。培养后，用细胞计数盒(DojinKagaku Co.)测定Vero细胞的存活率。结果示于图7中。如对比实施例中所示获得的物质不表现任何效果，但如实施例5中所示获得的物质以浓度依赖性中和了Vero细胞毒素对Vero细胞的细胞毒性。

实施例16兔肠道内Vero细胞毒素的液体累积毒素的中和效果

通过麻醉下的剖腹术处理了约2kg重、11～13周龄的雄性日本白兔。将约10cm的回肠部分连接而制作袋式环。将一定量Vero细胞毒素和含各浓度如实施例5中所示获得的物质的PBS溶液1ml注射入环内。缝合兔子的腹部并保持安静一整昼夜。然后，对兔子执行安乐死，测定环内积累的液体重量和环长度。计算单位环长度的液体重量(mg/cm)而指示Vero细胞毒素的毒性。结果如图8中所示。如实施例5中所示获得的物质以浓度依赖关系中和了Vero细胞毒素的细胞毒素。

工业应用性

本发明的蛋白毒素中和剂包含作为有效组分的来自啤酒花的原花色素。该作用剂中和了具有ADP-核糖基转移酶作用和RNA N-糖苷酶作用的细胞毒素，于是，它显示了预防和治疗基于产生ADP-核糖基转移酶的细菌或产生RNA N-糖苷酶的细菌的传染病的优异效果。

Claims

1.一种具有RNA N-糖苷酶活性的蛋白毒素中和剂，它包含作为有效组分的原花色素，所述原花色素得自啤酒花或啤酒花苞而且不通过能通过分子量为1000或更高的分子的超滤器。

2.权利要求1的蛋白毒素中和剂，其中，所述蛋白毒素是Vero细胞毒素。