CN100346161C - 一种大豆总皂甙的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆总皂甙的检测方法，用传统测定总皂甙的重量法测定大豆及其制品中的“总皂甙”结果中含有不容忽视的大豆异黄酮，然后用已知的HPLC法测出其中大豆异黄酮含量，再用减差法求得大豆总皂甙的含量。本方法的优点是所测结果比较实际、准确、误差小、可重复性高，样品处理相对比较简单，而且不使用大豆皂甙组分标准品。此方法适用于大豆、大豆粕、大豆乙醇提取物及其制品中的大豆皂甙总含量的测定。

Description

一种大豆总皂甙的检测方法

【技术领域】

本发明涉及一种化学检测方法，具体地说，本发明涉及一种大豆总皂甙的检测方法。

【背景技术】

大豆皂甙(Soybean Saponin)属三萜五环酸性皂甙，具有辛辣和苦味。目前，已发现的大豆皂甙组分达22种之多，作为最终基本稳定的组分有11种。其中，双糖链的A族皂甙6种，单糖链的B族皂甙5种^[3]，是大豆中存在的一类具有较强生物活性的物质。大豆皂甙具有降脂、减肥作用；抗凝血、抗血栓及抗糖尿病作用；具有抗氧化作用；具有抗病毒的增强免疫力的作用等。因此，大豆皂甙的开发应用具有广阔的前景。大豆生物活性物质的提取及应用，其中包括大豆皂甙、大豆异黄酮及大豆低聚糖等，近年来风靡世界。其原因在于它们各自对人体明显有益的功效，无毒副作用及原料易取。大豆皂甙原料及应用方面的研究很多，但生产厂家相对较少，其根本原因在于许多厂家并非不能生产，而是生产出来的大豆皂甙产品如何定量成为制约其发展的关键因素。

据文献报导，Frenwik和Oakenful所测大豆中皂甙含量为4.3％，Price所测大豆中大豆皂甙含量为0.65％，而Kitagawa等利用TLC法和HPLC法所测大豆中的皂甙含量平均在0.3％左右。这样的结果一方面是由于大豆品种、产地及栽培方法等条件不同所至，但其根本原因尚在于其分析方法的不同^[1]。

我们在此所述的大豆总皂甙测定是指大豆皂甙的总和。

现有文献资料中的大豆皂甙分析方法简述如下：

1、高压液相色谱法(HPLC法)，此法可以分析大豆皂甙11种主要组分。其缺点是对于(1)A族和B族皂甙必须分二次测定。(2)必须有11种标准样品方才能准确定量。但目前国内外尚无大豆皂甙组分标准样可买。故虽此方法较好，但不实用^[4]。(3)有人使用人参皂甙Re标准品等作为参照物进行分子量加权换算以得结果(并非有11种大豆皂甙标准品)。显然，由于不同大豆皂甙组分在结构上的差异^[8]，其光吸收响应值(OD)也不会相同，而不同品种大豆及栽培和加工条件的不同其组分间的比例亦会有明显的差异^[7]，故此结果也是个粗略结果。

2、薄层色谱法(TLC法)，此法优缺点大致与上述HPLC法相同。此法可由一次分析做出结果，但最多可做出7个组分，尚缺少4个基本组分，所用参照物通常为齐墩果酸标准品^[5]。显然，TLC法还不如HPLC法。

3、分光光度法(UV法)

此方法的原理：大豆皂甙在香兰素、冰乙酸、高氯酸溶液中起颜色反应，以齐墩果酸为标准品进行比色测定。然后以现在已知的大豆皂甙加权平均分子量进行计算。

此法的缺点是显而易见的：(1)加权平均值为2.2。它是这样得出来的，大豆皂甙“据文献的平均相对分子质量为1157.5，与齐墩果酸相对分子质量456对比，二者理论上的量比系数为2.54，考虑到在提取过程中失糖和前期研究中样品2的高压液相色谱测定结果的对比分析，所以将量比系数定为2.2是适宜的”^[5]。显然，这也是个很粗的结果。由于大豆品种、产地以及栽培条件和加工过程的不同，大豆皂甙各种组分的比例会有很大差异，故这个量比系数的确定，在许多情况下是不适用的。(2)紫外分光光度法在原理方面是对的，但由于大豆皂甙成分的复杂性，特别是含有不可忽略的干扰组分—大豆异黄酮，决定了这个方法所测大豆皂甙的结果是很粗的，可以说是不能用的。

李里特先生断言过，“分光光度法利用大豆皂甙与香草醛或对甲基苯醛发生颜色反应进行测定，由于有时反应不唯一，象异黄酮这样的化合物也可以产生具有颜色物质，所以这种方法不实用于计算大豆皂甙含量。”^[4]我们在实践中也证明了这一点。

我们分析某脱脂大豆乙醇提取物，其中大豆异黄酮、大豆低聚糖和蔗糖使用HPLC法测定，大豆蛋白质及灰分、水分使用国标法测定，其结果如下(绝干结果)：

大豆异黄酮   41.2％

大豆低聚糖   6.9％

蔗糖         6.5％

蛋白质       6.8％

灰分         4.5％

小计：       65.9％

这个小计结果应是可靠的，根据生产工艺结果判断，其余34.1％左右应为大豆皂甙的含量(用本发明的检测方法实测结果为33.98％)。

用分光光度法测此样品，其大豆皂甙值为64.3％。此值与上述所测其它成份总和为130.2％，显然此结果因严重偏高而不可用。

值得提及的是这个检测的前处理方法是使用“正丁醇再分配法纯化制得的大豆皂甙提取物，黄色粉末”^[6]进行分析的。这种前处理方法不损失大豆皂甙基本组分，应是最好的前处理方法。

根据相应资料^[5]提供的TLC图谱数据，前处理过程中增加大孔树脂处理步骤的样品，显然缺失3个组分，故增加大孔树脂进行前处理的方法不能算是个好的方法。

4、重量法(Weight)，根据“中草药有效成分提取与分离”等方面专业书藉资料：“皂甙通常从水溶液中用丁醇或戊醇抽提，使之与糖类和蛋白质等亲水性成分分开”，由此干燥后称重可得皂甙含量(即重量法)。在“人参的研究”(王本祥)中人参皂甙含量即有使用重量法的报导^[6]。

实践证明，使用水饱和的丁醇或戊醇精制皂甙，由于大豆异黄酮甙亦属于甙类，因此也混在皂甙之中，且其含量不容忽视，故传统的重量法不适用于大豆皂甙含量的检测。由于前处理使用大孔树脂，易丢失组分，故在其后使用通常的重量法测定大豆皂甙也是不严谨的。所以目前还没有使用重量法测定大豆皂甙的报导。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种既绕开了高压液相色谱法(HPLC)及薄层色谱(TLC)测定大豆皂甙因国内外无标准品可买而不实用的缺憾，又不采用不适合于大豆皂甙测定的紫外分光度法(UV)，同时，还避免了通常重量法不适用于测定大豆皂甙含量检测的缺点的大豆总皂甙检测方法。这种方法的优点是所测结果比较实际、准确、误差小，可重复性高，样品处理相对比较简单，而且不使用大豆皂甙组分标准品。此方法实为“减差法”，适用于大豆、大豆粕及大豆提取物中的大豆皂甙总含量的测定。

本发明所提供的大豆总皂甙的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)样品处理

称取绝干粉末或液体样品，重量为G1；

(2)脱脂

按照粗脂肪含量测定的标准方法，在脂肪抽提器中脱脂；

(3)提取

将上述脱脂后干燥的滤纸包连同脱脂后的样品一起移至另一脂肪抽提器中，然后加入乙醇或甲醇提取，提取条件与上述脱脂条件相同；

(4)水溶

将上述乙醇或甲醇提取液真空浓缩干燥，然后用水溶解并洗涤后，转入分液漏斗中备用；

(5)精制

用1∶1体积的丁醇或戊醇溶液加入上述备用分液漏斗中振摇萃取后静置分层，然后取下层水层再加1∶1体积的丁醇或戊醇溶液反复萃取3-4次，取全部上层萃取液；

(6)将上述萃取液置于重量为G2的真空干燥迥旋浓缩瓶中浓缩至干，然后在烘箱中干燥后冷却称重，所得蒸干物的重量为G3；

(7)用乙醇或甲醇溶液充分溶解上述蒸干物，进行离心处理后，取上清液备用；

(8)取上述备用上清液，注入高压液相色谱仪，测定蒸干物中大豆异黄酮含量，得G3中大豆异黄酮的重量为G4；

(9)计算：具体计算式如下：

其中所述的绝干样品为大豆及粕样品或大豆胚芽及其粕样品。

本发明还提供了一种优选检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)样品处理

称取绝干粉末或液体样品，重量为G1。其中，(a)大豆及粕样品称重为：10-20g；(b)大豆胚芽及其粕样品称重为：1-2g；(c)大豆皂甙、大豆异黄酮和大豆低聚糖粉称重为：0.1-0.2g；(d)大豆皂甙、大豆异黄酮和大豆低聚糖粉再加工制品称重为：0.3-0.5g；(e)大豆提取物的水溶液称重为：1-3g(mL)备用；

(2)脱脂

将上述备用粉状样品按照粗脂肪含量测定的标准方法，在脂肪抽提器中脱脂；

(3)提取

将上述脱脂后干燥的滤纸包连同脱脂后的样品一起移至另一脂肪抽提器中，然后加入70-95％的乙醇或甲醇提取，提取条件与上述脱脂条件相同，取提取液备用；

(4)水溶

将上述备用的乙醇或甲醇提取液真空浓缩干燥，然后分步用总量200mL水充分溶解并洗涤瓶后，转入分液漏斗中备用；

(5)精制

用丁醇或戊醇溶液200mL加入上述备用分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层200mL水层再加200mL丁醇或戊醇溶液反复萃取3-4次，将全部上层萃取液合并，共600-800mL备用；

(6)将上述600-800mL萃取液置于重量为G2的干燥真空迴旋浓缩瓶中浓缩至干，然后在105℃烘箱中干燥2h，冷却后称重，所得蒸干物的重量为G3；

(7)用80％乙醇/甲醇溶液50mL充分溶解上述蒸干物，取1mL离心处理后的上清液备用；

(8)取上述备用上清液10-20μL，注入高压液相色谱仪，测定蒸干物G3中大豆异黄酮含量，得出G3中的大豆异黄酮重量G4。

(9)计算：具体计算式如下：

其中若已知某产品中大豆异黄酮含量为G0，则所测得大豆皂甙和大豆异黄酮总重量G3中的大豆异黄酮重量G4＝G1×G0。

对于已知不含粗脂肪的相应样品，可省略脱脂步骤，直接进入提取步骤。

本检测方法亦适用于相应大豆提取物的液体产品，在检测过程中取一定量液体样品直接进入水溶步骤或将此样品蒸干后按本发明进行检测。

本方法中所指的甲醇或乙醇含量为体积百分比浓度。

所述的丁醇或戊醇溶液是用水饱和的丁醇或戊醇溶液。

所述的脱脂方法是指粗脂肪含量测定的相应标准方法中的残余法。

高压液相色谱仪测定大豆异黄酮通用条件是：(1)高压液相色谱仪，附柱温箱及紫外检测器；(2)色谱柱：C18柱，Φ4.6×250mm；(3)柱温：40℃；(4)流动：0.1％冰乙酸水溶液∶乙晴＝85∶15；(5)流量：1.5mL/min；(6)检测波长：254nm。

本发明提出的“一种大豆总皂甙检测方法”实为重量法与HPLC法相结合的一种新方法。传统的、且目前不为人们所用的重量法所测结果中含有大豆异黄酮甙。因为丁醇或戊醇萃取过程中，将甙类，其中包括大豆皂甙和不可忽略的大豆异黄酮甙总括其中，故重量法不为人们用于大豆皂甙的检测。大豆异黄酮各种成分的检测，目前使用HPLC方法已很成熟。所以在使用传统的重量法测定出“大豆皂甙”含量，实为大豆皂甙及大豆异黄酮甙的总和。用HPLC法测定出这“总和”中的大豆异黄酮甙的含量，显然，可用减差法求得大豆皂甙的含量。值得说明的一点是：正确的重量法是最基础的检测方法。

本发明的前处理方法，仅使用丁醇或戊醇精制萃取，不使用大孔树脂净化，以减少皂甙某些组分的缺失。

这种检测方法的优点是所测结果比较实际、准确、误差小、可重复性高，样品处理相对比较简单，而且不使用大豆皂甙组分标准品。此方法适用于大豆、大豆粕、大豆乙醇提取物及其制品中的大豆皂甙总含量的测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

某品种大豆种子中的大豆皂甙含量的测定。

(1)按照粗脂肪含量测定法(残余法GB2906-82)在索氏抽提器中进行脱脂。其中称取粉碎后干燥的大豆粉15.213g(G1)作为测试样品，分装成15个滤纸包；

(2)将上述脱脂后的15个滤纸包(已除掉乙醚有机溶剂)装进另一索氏抽提器中，加入80％乙醇后，按照脱脂条件进行抽提。抽提结束后，将抽提液浓缩至干，然后用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(3)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(4)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL，继续萃取2次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并三次所收集的正丁醇相600mL备用；

(5)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为133.258g(G2)备用；

(6)将第(4)步骤所收集的备用正丁醇相600mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并于真空迥旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为133.334g(G3)备用；

(7)将50mL 80％乙醇溶液倒入上述备用茄形瓶中充分溶解后，取1mL在10000rpm、10min条件下离心，取上清备用；

(8)取上述备用上清液20μL注入高压液相色谱仪，测定此样品中大豆异黄酮重量为0.023g(G4)；

(9)结果计算：

$=\frac{133.334-133.258-0.023}{15.213}\×100$

$=0.35(\%)$

(10)结果描述

100g绝干大豆中含有大豆皂甙0.35g。

实施例2：

某含65％大豆胚芽脱脂粕原料中大豆总皂甙含量的测定。

(1)按照粗脂肪含量测定法(残余法GB2906-82)在索氏抽提中进行脱脂。其中称取粉碎后干燥的大豆胚芽粉2.011g(G1)作为测试样品，分装成4个滤纸包；

(2)将上述脱脂后的4个滤纸包(已除掉乙醚有机溶剂)装进另一索氏抽提器中，加入90％乙醇后，按照脱脂条件进行抽提。抽提结束后，将抽提液浓缩至干，然后用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(3)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(4)按照上述步骤方法用水饱和的正丁醇溶液200mL，继续萃取3次备用下层水溶液后弃之，然后合并四次所收集的正丁醇相800mL备用；

(5)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为128.356g(G2)备用；

(6)将第(4)步骤所收集的备用正丁醇相800mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并于真空迥旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为128.452mg(G3)备用；

(7)将50mL 80％乙醇溶液倒入上述备用茄形瓶中充分溶解后，取1mL在10000rpm、10min条件下离心，取上清备用；

(8)取上述备用上清液20μL注入高压液相色谱仪，测定大豆异黄酮含量为0.021g(G4)；

(9)结果计算：

$=\frac{125.452-128.356-0.021}{2.011}\×100$

$=3.73(\%)$

(10)结果描述

100g绝干某大豆胚芽脱脂粕中含有3.73g大豆皂甙。

实施例3：

大豆皂甙片中大豆皂甙含量的测定。

(1)取粉碎过40以上筛目的均匀样品3-5g放于玻璃皿中摊平，置105℃烘箱中1h后，移至真空干燥器中冷却后备用；

(2)称取上述干燥后备用的样品0.305g(G1)备用；

(3)将上述备用样品用滤纸包好后，装入索氏提取器中，用90％的乙醇提取，其条件与索氏法脱脂条件相同。取乙醇提取液备用；

(4)取上述备用乙醇提取液，在真空浓缩蒸发器中蒸干，然后用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(5)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(6)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL继续萃取3次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并四次所收集的正丁醇相800mL备用；

(7)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为131.326g(G2)备用；

(8)将第(6)步骤所收集的备用正丁醇相800mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并置于真空迴旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为131.427g(G3)备用；

(9)将50mL 80％乙醇溶液倒入上述备用茄形瓶中充分溶解后，取1mL在10000rpm、10min条件下离心，取上清备用；

(10)取上述备用上清液20μL注入高压液相色谱仪，测定大豆异黄酮含量为0.014g(G4)；

(11)结果计算：

$=\frac{131.427-131.326-0.014}{0.305}\×100$

$=28.52(\%)$

(12)结果描述

100g绝干大豆皂甙片中含有大豆皂甙28.52g。

实施例4：

大豆异黄酮片中大豆皂甙含量的测定。

(1)取粉碎过40以上筛目的均匀样品3-5g放于玻璃皿中摊平，置105℃烘箱中1h后，移至真空干燥器中冷却后备用；

(2)称取上述干燥后备用的样品0.452g(G1)备用；

(3)将上述备用样品用滤纸包好后，装入索氏提取器中，用80％的乙醇提取，其条件与索氏法脱脂条件相同。取乙醇提取液备用；

(4)取上述备用乙醇提取液，在真空浓缩蒸发器中蒸干，然后用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(5)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(6)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL继续萃取2次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并三次所收集的正丁醇相600mL备用；

(7)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为133.258g(G2)备用；

(8)将第(6)步骤所收集的备用正丁醇相600mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并置于真空迥旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为133.306g(G3)备用；

(9)大豆异黄酮片检验报告单出示准确大豆异黄酮含量为12.1％(G0)，称样0.103g(G1)，故样品中异黄酮重量为0.012g(G4)；

(10)结果计算：

$=\frac{133.306-133.258-0.012}{0.452}\×100$

$=7.96(\%)$

(11)结果描述

100g绝干大豆异黄酮片中含有大豆皂甙7.96g。

实施例5：

大豆低聚糖片中大豆皂甙含量的测定。

(1)取粉碎过40以上筛目的均匀样品3-5g放于玻璃皿中摊平，置105℃烘箱中1h后，移至真空干燥器中冷却后备用；

(2)称取上述干燥后备用的样品0.502g(G1)备用；

(3)将上述备用样品用滤纸包好后，装入索氏提取器中，用70％的乙醇提取，其条件与索氏法脱脂条件相同。取乙醇提取液备用；

(4)取上述备用乙醇提取液，在真空浓缩蒸发器中蒸干，然后用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(5)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(6)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL继续萃取2次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并三次所收集的正丁醇相600mL备用；

(7)将真空迴旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为128.356g(G2)备用；

(8)将第(6)步骤所收集的备用正丁醇相800mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并置于真空迥旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为128.451g(G3)备用；

(9)将50mL 80％乙醇溶液倒入上述备用茄形瓶中充分溶解后，取1mL在10000rpm、10min条件下离心，取上清备用；

(10)取上述备用上清液20μL注入高压液相色谱仪，测定大豆异黄酮含量为0.020g(G4)；

(11)结果计算：

$=\frac{128.451-128.356-0.020}{0.502}\×100$

$=14.94(\%)$

(12)结果描述

100g绝干大豆低聚糖片中含有大豆皂甙14.94g。

实施例6：

大豆皂甙粉中大豆皂甙含量的测定。

(1)取均匀样品3-5g放于玻璃皿中摊平，置105℃烘箱中1h后，移至真空干燥器中冷却后备用；

(2)称取上述干燥后备用的样品0.102g(G1)，用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(3)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(4)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL继续萃取3次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并四次所收集的正丁醇相800mL备用；

(5)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为132.224g(G2)备用；

(6)将第(4)步骤所收集的备用正丁醇相800mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并置于真空迥旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为132.305g(G3)备用；

(7)将50mL 80％乙醇溶液倒入上述备用茄形瓶中充分溶解后，取1mL在10000rpm、10min条件下离心，取上清备用；

(8)取上述备用上清液20μL注入高压液相色谱仪，测定大豆异黄酮含量为0.008g(G4)；

(9)结果计算：

$=\frac{132.305-132.224-0.008}{0.102}\×100$

$=71.57(\%)$

(10)结果描述

100g绝干大豆皂甙粉中含有大豆皂甙71.57g。

实施例7：

40％大豆异黄酮粉中大豆皂甙含量的测定。

(1)取均匀样品3-5g放于玻璃皿中摊平，置105℃烘箱中1h后，移至真空干燥器中冷却后备用；

(2)称取上述干燥后备用的样品0.103g(G1)，用总量200mL水分步充分溶解并洗瓶后，转入分液漏斗中备用；

(3)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(4)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL继续萃取2次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并三次所收集的正丁醇相600mL备用；

(5)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为131.326g(G2)备用；

(6)将第(4)步骤所收集的备用正丁醇相600mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并置于真空迴旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为131.403g(G3)备用；

(7)40％大豆异黄酮粉检验报告单出示准确大豆异黄酮含量为41.2％(G0)，称样0.103g(G1)，故样品中异黄酮重量为0.042g(G4)；

(8)结果计算：

$=\frac{131.403-131.326-0.042}{0.103}\×100$

$=33.98(\%)$

(10)结果描述

100g绝干大豆异黄酮粉中含有大豆皂甙33.98g。

实施例8：

某以大豆为原料生产的口服液中大豆皂甙含量的测定。

(1)取样品溶液1.0g(mL)备用G1；

(2)将上述备用样品溶液用总量200mL水分步充分稀释后，移入分液漏斗中备用；

(3)将用水饱和的正丁醇溶液200mL加入上述备用的分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层的200mL水层备用，同时收集上层(正丁醇相)200mL备用；

(4)按照上述步骤方法分别用水饱和的正丁醇溶液200mL继续萃取2次上述备用下层水溶液后弃之，然后合并三次所收集的正丁醇相600mL备用；

(5)将真空迥旋浓缩器的茄形瓶置于105℃烤箱中干燥2h后，置于真空干燥器中冷却后，称重为133.224g(G2)备用；

(6)将第(4)步骤所收集的备用正丁醇相600mL移入上述干燥备用的茄形瓶中，并置于真空迥旋浓缩器中浓缩至干。然后将此茄形瓶连同蒸干物料置于105℃烘箱中干燥2h后，放进真空干燥器中冷却后，称重为133.256g(G3)备用；

(7)将50mL 80％乙醇溶液倒入上述备用茄形瓶中充分溶解后，取1mL在10000rpm、10min条件下离心，取上清备用；

(8)取上述备用上清液20μL注入高压液相色谱仪，测定大豆异黄酮含量为0.001g(G4)；

(9)结果计算：

$=\frac{133.256-133.224-0.001}{1.0}\×100$

$=3.1(\%)$

(10)结果描述

100g口服液中含有大豆皂甙3.1g。

参考资料：

[1]大豆科学  第15卷  第1期1996.2  P76

《大豆皂甙研究进展》王学章

[2]《大豆生物活性物质的开发与应用》主编  崔洪斌  P117

[3]《大豆皂甙最新研究概况》唐传核等

大豆科学  第20卷  第1期  2001.2  P60

[4]《功能性大豆食品》李里特等  P324

[5]《保健食品检验与技术规范实施手册》清华同方电子出版社

2003年P1135<大豆总皂甙的测定方法>(分光光度法)

[6]《人参的研究》王本祥  P79

[7]粗脂肪的测定残余法(GB2906-82)

[8]《大豆胚芽与大豆叶中的大豆皂甙的区别研究》 朱克瑞等  淮阴工学院学报2004.13(1)/80-82

Claims (9)

1、一种大豆总皂甙的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)样品处理

称取绝干粉末或液体样品，重量为G1；

(2)脱脂

按照粗脂肪含量测定的标准方法，在脂肪抽提器中脱脂；

(3)提取

将上述脱脂后干燥的滤纸包连同脱脂后的样品一起移至另一脂肪抽提器中，然后加入乙醇或甲醇提取，提取条件与上述脱脂条件相同；

(4)水溶

将上述乙醇或甲醇提取液真空浓缩干燥，然后用水溶解并洗涤后，转入分液漏斗中备用；

(5)精制

用1∶1体积的丁醇或戊醇溶液加入上述备用分液漏斗中振摇萃取后静置分层，然后取下层水层再加1∶1体积的丁醇或戊醇溶液反复萃取3-4次，取全部上层萃取液；

(6)将上述萃取液置于重量为G2的真空干燥迴旋浓缩瓶中浓缩至干，然后在烘箱中干燥后冷却称重，所得蒸干物的重量为G3；

(7)用乙醇或甲醇溶液充分溶解上述蒸干物，进行离心处理后，取上清液备用；

(8)取上述备用上清液，注入高压液相色谱仪，测定蒸干物中大豆异黄酮含量，得G3中大豆异黄酮的重量为G4；

(9)计算：具体计算式如下：

2、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为大豆及粕样品、大豆胚芽及其粕样品、大豆皂甙粉、大豆异黄酮粉、大豆低聚糖粉、大豆皂甙再加工制品、大豆异黄酮再加工制品、大豆低聚糖粉再加工制品或大豆提取物的水溶液。

3、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)样品处理

称取绝干粉末或液体样品，重量为G1，其中，(a)当样品为大豆及粕时，称重为：10-20g；(b)当样品为大豆胚芽及其粕时，称重为：1-2g；(c)当样品为大豆皂甙粉、大豆异黄酮粉或大豆低聚糖粉时，称重为：0.1-0.2g；(d)当样品为大豆皂甙、大豆异黄酮或大豆低聚糖粉的再加工制品时，称重为：0.3-0.5g；(e)当样品为大豆提取物的水溶液时，称重为：1-3g或1-3mL备用；

(2)脱脂

将上述备用粉状样品按照粗脂肪含量测定的标准方法，在脂肪抽提器中脱脂；

(3)提取

将上述脱脂后干燥的滤纸包连同脱脂后的样品一起移至另一脂肪抽提器中，然后加入70-95％的乙醇或甲醇提取，提取条件与上述脱脂条件相同，取提取液备用；

(4)水溶

将上述备用的乙醇或甲醇提取液真空浓缩干燥，然后分步用总量200mL水充分溶解并洗涤瓶后，转入分液漏斗中备用；

(5)精制

用丁醇或戊醇溶液200mL加入上述备用分液漏斗中充分振摇萃取后静置分层，然后取下层200mL水层再加200mL丁醇或戊醇溶液反复萃取3-4次，将全部上层萃取液合并，共600-800mL备用；

(6)将上述600-800mL萃取液置于重量为G2的干燥真空迴旋浓缩瓶中浓缩至干，然后在105℃烘箱中干燥2h后，冷却后称重，所得蒸干物的重量为G3；

(7)用80％乙醇溶液或甲醇溶液50mL充分溶解上述蒸干物，取1mL离心处理后的上清液备用；

(8)取上述备用上清液10-20μL，注入高压液相色谱仪，测定蒸干物G3中大豆异黄酮含量，得出G3中的大豆异黄酮重量G4；

(9)计算：具体计算式如下：

4、如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，对于已知不含粗脂肪的相应样品，可省略脱脂步骤，直接进入提取步骤。

5、如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，样品为液体产品时，在检测过程中取一定量液体样品直接进入水溶步骤或将此样品蒸干后使用。

6、如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，若已知某产品中大豆异黄酮含量为G0，则所测得大豆皂甙和大豆异黄酮总重量G3中的大豆异黄酮重量G4＝G1×G0。

7、如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，所述的丁醇或戊醇溶液是用水饱和的丁醇或戊醇溶液。

8、如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，本方法中所指的甲醇或乙醇含量为体积百分比浓度。

9、如权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，所述的脱脂方法是指粗脂肪含量测定的相应标准方法中的残余法。