CH674018A5

CH674018A5 -

Info

Publication number: CH674018A5
Application number: CH3239/87A
Authority: CH
Inventors: Kiyoshi Nakayama; Haruo Honda; Yukie Ogawa; Tatsuya Ozawa; Tetsuo Ohta
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1986-08-26
Filing date: 1987-08-24
Publication date: 1990-04-30
Also published as: GB8719507D0; DE3728321A1; FR2603303B1; IT8748319A0; IT1211732B; FR2603303A1; GB2195630A; GB2195630B; CH679401A5; KR880003009A; US4918012A

Description

Le but de la présente invention est de surmonter les inconvénients décrits précédemment de l'état de la technique et de fournir un procédé pour la production bio-chimique de 40 carnitine et plus particulièrement de la L-carnitine.

Ayant constaté l'utilité de la carnitine, plus particulièrement de son isomère optiquement actif L-carnitine, des investigations intensives ont été effectuées pour une méthode biochimique de production de cette carnitine directement à par-45 tir de la carnitineamide, l'intermédiaire le plus efficace pour la synthèse chimique de la carnitine partant d'épichlorohy-drine. Non seulement des microorganismes de collections de cultures ont été étudiés, mais également des microorganismes nouvellement isolés ont été étudiés pour un enzyme appro-50 prié. Comme résultat, un nouvel enzyme, une amidase, plus spécifiquement la carnitineamide hydrolase, s'est révélée comme étant utile dans la présente invention dans l'hydrolyse biochimique de la carnitineamide pour obtenir la carnitine.

55 En conséquence, l'objet de la présente invention consiste en un procédé pour la production de carnitine comprenant l'hydrolyse de carnitineamide par contact, dans un milieu re-actionnel, de carnitineamide avec une carnitineamide hydrolase capable d'hydrolyser la carnitineamide pour former la 60 carnitine ou avec un microorganisme contenant ladite carnitineamide hydrolase.

Il existe deux types d'amidases (carnitineamide hydrolase). La première est une L-carnitineamide hydrolase capable d'hydrolyser la L-carnitineamide pour forme la L-carnitine, DL de celle-ci a jusqu'à présent été utilisée comme stomachi- 65 et l'autre la D-carnitineamide hydrolase capable d'hydroly-que. Récemment, l'attention a été attirée plus particulière- ser la D-carnitineamide pour former la D-carnitine.

ment sur sa forme L. Les microorganismes qui peuvent être utilisés dans la

La L-carnitine est une substance indispensable pour le présente invention contiennent les deux types de carnitine-

monas sp. CA10-1-5 (FERM BP-1376), Pseudomonas sp. CA27B1 (FERM BP-1380), Pseudomonas (sp. CA30-11B) (FERM BP-1378), Pseudomonas sp. CA28-50A (FERM BP-1377) et Pseudomonas sp. CA30-35 (FERM BP-1375).

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel l'hydrolyse de la carnitineamide pour former la carnitine est effectuée à une température de 5 à 60 °C et à un pH de 5 à 10 pendant 1 à 100 heures, la concentration en carnitineamide étant de 0,1 à 30% par rapport au poids du milieu réactionnel.

9. Procédé selon la revendication 5 dans lequel ladite L-carnitineamide hydrolase présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes:

(a) action et spécificité: hydrolyse la L-carnitineamide pour former la L-carnitine et de l'ammoniac;

(b) pH optimum et domaine de pH stable:

pH optimum: 6 à 7

domaine de pH stable: 7 à 8;

(c) température optimale:

agit bien à 26-40 °C, la température optimale étant de

3C;

(d) conditions d'inactivation:

le plus stable lorsque la température est plus basse; conserve 90% ou plus de l'activité à 4 °C pendant 7 jours; à 45 °C ou plus, l'activité diminue rapidement;

(e) poids moléculaire:

le poids moléculaire de l'enzyme obtenu par la méthode de filtratura sur le gel, en utilisant Cellulofine GC-700 m, est d'environ 36.000; et

(f) inhibiteurs:

inhibée avec le ion Ag à une concentration élevée (10 mM); aucune inhibition avec l'acide éthylènediamine-tétracétique et le 2-mercaptoéthanol, même à 10 mM.

DESCRIPTION

La présente invention se rapporte à une méthode pour la production de carnitine par hydrolyse de carnitineamide.

La carnitine, autrefois appelée vitamine BT, est une substance participant au métabolisme des acides gras et la forme

3

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amide- hydrolase, le rapport de l'activité de la L-carnitineamide hydrolase par rapport à celle de la D-carnitineamide hydrolase varie d'une manière importante (par exemple de 100% à 0%) selon la souche et les conditions de croissance.

L'enzyme utilisé dans la méthode selon la présente inven- 5 tion est un enzyme capable d'hydrolyser la carnitineamide pour produire la carnitine et est généralement appelé amida-se. L'amidase est classifiée dans le groupe des hydrolases qui agissent sur les liaisons amide linéaires (classe 3.5.1.) selon la nomenclature de la classification internationale des enzymes, '0 et plus particulièrement dénommée carnitineamide hydrolase. Jusqu'à présent, il n'a pas été fait état d'amidases agissant sur les composés ayant un groupe triméthylamino dans la molécule telle que la carnitineamide. De tels enzymes ont donc été trouvés pour la première fois dans la présente invention.

Des microorganismes qui produisent un enzyme capable de transformer la carnitineamide en carnitine peuvent être sélectivement isolés sur la base de leur capacité de production de la carnitine à partir de la carnitineamide.

Des exemples de tels microorganismes comprennent les bactéries appartenant au genre Pseudomonas, par exemple Pseudomonas sp. CA27B1 (FERM BP-1380), Pseudomonas sp. CA30-11B (FERM BP-1378), Pseudomonas sp.

CA28-50A (FERM BP-1377), Pseudomonas sp. CA10-1-5 (FERM BP-1376), Pseudomonas sp. CA32-C (FERM BP-1379) et Pseudomonas sp. CA30-35 (FERM BP-1375).

Les caractéristiques taxonomiques de ces souches seront décrites ci-après.

Les souches isolées sont toutes des bacilles aérobiques gram-négatifs. Selon le «Manual of Systematic Bacteriolo-gy», Vol. 1 (1984) de Bergey, ils sont considérés comme appartenant au genre Pseudomonas dans la famille des Pseudo monadaceae décrite dans la section 4 de ce manuel de Bergey.

Par la suite, les caractéristiques taxonomiques des souches isolées seront expliquées en séparant les souches en différents groupes basés sur quelques caractéristiques communes.

Premièrement, les caractéristiques qui sont communes à 40

15

20

25

30

35

toutes les souches isolées sont des tiges aérobiques gram-né-gatives et que leurs dimensions cellulaires sont de relativement petites (0,5-0,8 x 0,7-3,0 jxm) à relativement grandes (1,2-1,5 x 2,4-4,2 |xm) comme illustré dans le tableau 1 ci-après. Les souches ne montrent aucun polymorphisme ni de résistance aux acides dans les conditions ordinaires. Elles ne forment pas de spores. Elles ne sont pas mobiles par flagelle polaire. Sur un milieu bouillon agar, elles forment de petites colonies qui ont des rebords intacts avec une forme convexe en élévation. La surface de celles-ci est lisse. L'apparence est translucide, de blanc laiteux à blanc grisâtre (seul le CA30-35 a une couleur de colonie jaune. Dans un milieu bouillon liquide, aucune croissance de surface n'est observée, mais le milieu devient modérément trouble après la croissance. Quelques souches (celles appartenant au groupe V, parmi lesquelles la souche CA32-C est typique) produisent des précipités floconneux, mais d'autres souches ne produisent aucun précipité.

Aucune liquéfaction de gélatine ne se produit. Le test MR, le test VP, la synthèse indole et l'hydrolyse amidon sont tous négatifs. L'utilisation d'une source d'azote inorganique (nitrates et sels d'ammonium) est positive pour toutes les souches sur un milieu acide succinique. L'oxydase et la cata-lase sont toutes deux positives. Le test O-F est oxydatif. L'utilisation d'acide citrique est positive pour toutes les souches sur milieu Simon. Dans le lait de tournesol, les souches appartenant au groupe I, représenté par la souche CA27B1, rendent le lait alcalin et réduisent le tournesol, alors que d'autres souches ne montrent aucun changement (ni coagulation, ni liquéfaction).

La formation d'acide à partir de sucres est montré dans le tableau 1. En outre, la formation d'acide par les souches autres que CA30-35 est négative pour L-arabinose, D-man-nose, D-fructose, sucrose, maltose, D-tréhalose, D-sorbitol, glycérol et amidon.

Le tableau 1 ci-après présente les caractéristiques taxonomiques de souches décrites précédemment réunies en groupes I, II, III, IV, V et VI, basés sur d'autres caractéristiques communes.

Tableau 1

■

Caractéristiques

Groupe I

Groupe II

Groupe III

Groupe IV

Groupe V

Groupe VI

Formation de pigment

hydro-soluble

+

—

+

—

_*

Formation d'uréase

—

+

—

Formation de disulfure

d'hydrogène

+

—

+

Dénitrification

—

+

—

Réduction de nitrate

+

—

Dimensions cellulaires

1.2-1.5 x

1.2-1.5x5

1.2-1.4 x

0.7-1.1 x

0.5-0.8 x

0.6-0.8 x

2.4-4.2

2.1-3.6

2.1-2.8

2.0-4.0

0.7-3.0

1.1-1.3

pH de croissance

6-9

5-9

6-9

Température optimale

de croissance ( °C)

26-30

Croissance à 41 °C

—

±

—

Croissance à 4 °C

+

+ +

—

+

Croissance à 37 °C

±

+

—

Accumulation d'acide

poly-ß-hydroxy-

+

—

butyrique

Formation d'acide à

partir de sucre

D-Glucose

+

—

- —

+

D-Xylose

+

-

—

-

+

D-Galactose

—

+

Lactose

—

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4

Tableau 1 (Suite)

Caractéristiques Groupe I Groupe II Groupe III Groupe IV Groupe V Groupe VI

Assimilation de source

de carbone (méthode

Iizuka & Komagata)***

Mésoinositol

±

—

+

—

Glucose

+

Trehalose

±

+

Arginine

+

—

+

—

Acide 2-Kétogluconique

+

—

L-valine

+

—

ß-Alanine

+

—

Catéchol

—

+

—

Acide protocatéchuique

+

Acide p-hydroxy-

—

**

—

benzoïque Notes:

*) La couleur des cellules est jaune

**) «+» par la méthode Stainer (Stainer, R.Y. et al., J. Gen. Microbiol., 4,159 (1966) ***) Iizuka, H. and Komagata, K., Nippon Noeikagaku Kaishi, 36, 663

35

40

45

Plusieurs souches de microorganismes ayant les caractéri- 25 stiques décrites précédemment ont été isolées de chacun des groupes I à VI.

Bien que les souches appartenant au groupe I ont de nombreuses caractéristiques communes à Pseudomonas putida et Pseudomonas delafieldii, elles sont différentes de P. pu-30 tida dans l'accumulation de l'acide poly-ß-hydroxybutyrique et différent de la P. delafieldii dans la formation d'un pigment hydrosoluble et une croissance à 4 °C. Etant donné qu'il n'a pas été trouvé de type de souche auquel les souches pouvaient correspondre, elles ont été identifiées comme Pseudomonas sp. et une souche typique CA27B1 a été déposée à la Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken, 305 Japon (ci-après dénommé «Bikoken»).

Les souches appartenant au groupe II ont de nombreuses caractéristiques communes au P. delafieldii, mais ils sont différents de celui-ci en ce qui concerne l'assimilation de l'arginine et la croissance à 4 °C. La formation de disulfure d'hydrogène est positive et la croissance au pH 5 est bonne. Etant donné qu'aucun type de souche n'a été trouvé auquel les souches ci-dessus peuvent correspondre, ces souches ont été identifiées comme Pseudomonas sp. et une souche typique CA30-11B a été déposée au Bikoken.

De même, les souches appartenant au groupe III ont de nombreuses caractéristiques communes au P. delafieldii. Toutefois, elles sont différentes de celui-ci dans la formation de pigments hydrosolubles et la croissance à 4 °C. Ils ont été identifiés comme Pseudomonas sp. étant donné qu'aucun ty- 55 pe de souche n'a été trouvé auquel il pouvait correspondre. Une souche typique CA28-50A a été déposée au Bikoken.

Les souches appartenant au groupe IV ont également de nombreuses caractéristiques communes avec P. delafieldii,

mais sont différentes de celle-ci dans l'assimilation de l'argi-nie et de l'inositol ainsi que dans la croissance à 4 °C. Etant donné qu'il n'a pas été trouvé de type de souche à laquelle elles pouvaient correspondre, elles ont été identifiées comme Pseudomonas sp., et une souche typique CA10-1-5 a été déposée au Bikoken.

Bien que les souches appartenant au groupe V ressemblent à Pseudomonas alcaligenes, elles diffèrent de celles-ci en ce qui concerne l'assimilation du glucose et de l'arginine.

Etant donné qu'aucun autre type de souche n'a été trouvé à laquelle elles pouvaient correspondre, ces souches ont été identifiées comme Pseudomonas sp. et une souche typique CA32-C a été déposée au Bikoken.

Les souches appartenant au groupe VI peuvent être identifiées comme appartenant au genre Xanthomonas, étant donné qu'elles requièrent un facteur de croissance pour leur croissance et que la couleur des cellules est jaune. Toutefois, le spectre d'absorption du pigment ne coïncide pas avec celui de la xanthomonadine. Par conséquent elles ont été pour le moment considérées comme appartenant au genre Pseudomonas. La souche de ce groupe forme des acides à partir d'une variété de sucres tel que L-arabinose, D-mannose, D-fructose, D-galactose, maltose, sucrose, trehalose, D-manni-tol et inositol en plus de ceux décrits dans le tableau 1 ci-avant. Etant donné qu'il n'a pas été trouvé d'espèces appropriées dans le genre Pseudomonas sp. à laquelle elles pourraient correspondre ces souches ont été identifiées comme Pseudomonas sp. et une souche typique CA30-35 a été déposée au Bikoken.

La correspondance entre les noms des souches déposées au Bikoken et leurs numéros d'ordre sont mentionnés ci-des-sous. (Date de dépôt au Bikoken: 14 août 1986)

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Nom de la souche

CA27B1

CA30-11B

CA28-50A

CA10-1-5

CA32-C

CA30-35

Numéro d'ordre

FERM BP-1380 FERM BP-1378 FERM BP-1377 FERM BP-1376 FERM BP-1379 FERM-BP-1375

60

65

Ces microorganismes peuvent être des souches naturelles («wild strains») ou des mutants. Des souches contenant des gênes de codage pour l'amidase peuvent également être utilisées dans la présente invention.

Les enzymes peuvent être ceux extraits des cellules de microorganisme décrites ci-dessus ou du bouillon de culture. Des enzymes immobilisés et les microorganismes immobilisés contenant l'enzyme peuvent également être employés pour autant qu'ils présentent l'activité amidase, plus particulièrement l'activité de carnitineamide hydrolase.

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Afin d'obtenir une culture contenant une activité carnitineamide hydrolase en cultivant un microorganisme capable de produire cet enzyme, des méthodes de culture usuelles peuvent être utilisées; par exemple, une culture dans un milieu nutritif contenant un composé organique comme source de carbone, des composés organiques ou inorganiques comme source d'azote et des sels minéraux, à un pH de 4 à 9, à 10 à 40 °C. Il est préférable d'ajouter au moins un composé choisi parmi le groupe comprenant la carnitineamide, la carnitine et la P-butyrobétaïne, étant donné qu'une culture ayant une activité élevée de carnitineamide hydrolase peut être obtenu par addition de tel composé. La concentration de ces composés à ajouter dans un milieu est généralement d'environ 0,1 à 3% en poids, de préférence de 0,5 à 2,0% en poids, par rapport au poids du milieu de culture. L'effet de ces composés est tel que montré dans l'exemple 9 ci-après, duquel on pourra constater que le milieu contenant au moins un tel composé augmente le rendement en enzyme de manière remarquable.

En outre, un milieu solide et un milieu liquide peuvent être utilisés dans la présente invention.

D'autres conditions de culture de l'enzyme produisant les souches peuvent être choisies de manière appropriée, telles que les souches puissent bien croître selon les connaissances de l'homme du métier.

Bien que par culture prolongée ou addition d'un agent d'expulsion l'enzyme soit libéré des cellules, généralement l'activité de l'enzyme est présente essentiellement à l'intérieur des cellules. Après la fin de la culture, les cellules et matériaux insolubles ont été éliminés du bouillon de culture par centrifugation ou filtration, afin d'obtenir une solution d'enzyme brute. La carnitineamide hydrolase contenue dans les cellules peut être éliminée comme solution d'enzyme brute en détruisant les cellules par broyage ou ultra-sons et en extrayant l'enzyme de celle-ci. Bien entendu, les cellules telles quelles peuvent être utilisées comme préparations enzyma-tiques.

La carnitineamide hydrolase purifiée peut être obtenue à partir de la solution d'enzyme brute au moyen de méthodes de purification d'enzymes conventionnelles, telle qu'une méthode par fractionnement de solvant organique, une méthode par précipitation différentielle de sulfate d'ammonium, par dialyse, par une méthode de précipitation au point iso-electrique et par une Chromatographie sur colonne, seules ou en combinaison. Lorsqu'un milieu solide est utilisé, de l'eau est ajoutée au milieu solide contenant les cellules microbiennes, et le mélange tel qu'il est ou après recueillement des cellules est soumis à une méthode par ultra-sons ou à un traitement similaire afin d'obtenir une solution enzymatique brute.

Le substrat de la L-carnitineamide hydrolase est la L-carnitineamide et l'enzyme n'agit pas sur la D-carnitineamide, et ainsi lorsque l'enzyme est utilisé sur la DL-carnitineamide, par exemple, la L-carnitineamide est transformée en L-carni-tine et la D-carnitineamide qui n'est pas sensible à l'action de l'enzyme reste sous forme inchangée. Par des moyens appropriés, les deux composés peuvent être séparés l'un de l'autre pour obtenir la L-carnitine et la D-carnitineamide (qui peut ensuite être transformée en D-carnitine par une méthode traditionnelle, si désiré.

Bien entendu, la carnitineamide peut être utilisée sous la forme de sels de celle-ci, acceptable physiologiquement, par exemple de chlorure, et la carnitine peut être obtenue sous la forme d'un sel acceptable physiologiquement de celle-ci, par exemple un chlorure ou un sulfate.

Les cellules de microorganisme ayant une activité amida-se ou une préparation enzymatique dérivée de celle-ci ainsi obtenues peuvent être mises en contact avec le substrat par

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addition de la préparation enzymatique dans une solution contenant le substrat et incubation du mélange réactionnel jusqu'à ce que la réaction se produise ou par addition du substrat dans un bouillon de culture du microorganisme suivi par l'incubation pour réaction. Alternativement, l'enzyme peut être mise en contact avec le substrat sous la forme de préparations enzymatiques ou de cellules séparées d'un bouillon de culture du microorganisme selon la présente invention, de cellules traitées physicochimiquement ou biochi-miquement telles que des cellules lavées, des cellules lyophilisées et des cellules séchées à l'acétone, des solutions d'extrait, des préparations purifiées, des préparations immobilisées,

etc.

La concentration du substrat varie selon qu'un système 15 discontinu ou un système continu est utilisé. Dans le système discontinu, la concentration est comprise généralement entre environ 0,1 et 30%, de préférence d'environ 0,5 à 10% en poids par rapport au poids du milieu réactionnel. Dans le système continu, des domaines légèrement inférieurs de con-20 centration, à savoir de 0,05 à 20% en poids, sont préférées.

La réaction peut être effectuée généralement à environ 5 à 60 °C, de préférence entre environ 25 et 40 °C, à un pH d'environ 4 à 10, de préférence à un pH d'environ 6 à 8. La durée de la réaction varie selon le mode de repos, l'agitation, 25 la descente à travers la colonne contenant l'enzyme immobilisé, etc., ou bien la forme ou l'activité de l'enzyme, mais généralement est comprise entre environ 1 àj.00 heures.

Le procédé de réaction peut être contrôlé en suivant la formation de carnitine par Chromatographie sur couche min-30 ce ou par analyse de la L-carnitine selon la méthode enzymatique de Pearson (DJ. Pearson et al., Method in Enzym-ology, vol 14, 612, 1969). La proportion de forme L par rapport à la forme D dans la carnitine totale (forme L+forme D) ou la pureté optique peuvent être déterminées par séparation de la carnitine du mélange réactionnel en utilisant une Chromatographie sur silica gel, en transformant la carnitine en carnitineamide de L-phénylalanine, en mesurant la surface de la L-carnitineamide de la L-phénylalanine et de la D-carnitineamide de la L-phénylalanine et en calculant le rapport des surfaces par Chromatographie en phase liquide à haute performance. Après la fin de la réaction, le mélange réactionnel est passé à travers une colonne chargée d'une résine échangeuse d'ion, suivie par une élution, par exemple avec de l'acide chlorhydrique dilué et concentré pour récupé-45 rer le chlorure de L-carnitine.

La détermination de l'activité de la carnitineamide hydrolase peut être effectuée par mesure de la quantité de carnitine produite, par une méthode appropriée, par exemple la méthode de Pearson (DJ. Pearson et al., Method in Enzym-50 ology, Vol. 14, 612, 1969). Lorsqu'il n'y a aucune substance inhibitrice présente, la détermination de l'activité de l'enzyme peut également être effectuée par mesure de la quantité d'ammoniac produite par la réaction.

Ci-après, les caractéristiques enzymologiques de la L-car-55 nitineamide hydrolase selon la présente invention seront expliquées.

(1) Action et spécificité:

L'enzyme catalyse une réaction dans laquelle la L-carnitineamide est hydrolysée pour former la L-carnitine et de 60 l'ammoniac. Il n'agit pas sur la D-carnitineamide. Il n'agit pas non plus sur l'acétamide, la butyramide, l'acrylamide, la nicotinamide, la benzamide, etc., et à cet égard est tout-à-fait différent des amidases généralement connus.

(2) pH optimum:

Les quantités de L-carnitine produites à partir de DL-carnitineamide 2% après 1 heure de réaction à différentes valeurs de pH ont été mesurées, et les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. A partir des résultats

35

40

65

674 018

6

mentionés dans ce tableau 2, le pH optimum est jugé comme étant compris dans le domaine de 6 à 7.

Tableau 2

pHdela Solution Quantité de L-car-

réaction tampon* nitine formée

(mg/ml)

3.0 I 0.007

4.0 I 0.011

5.0 I 0.270

6.0 I 0.677

7.0 I 0.706

7.0 II 0.712

8.0 II 0.519

8.0 III 0.274

9.0 III 0.083

10.0 III 0.053

*1: solution tampon acide citrique-phosphate de sodium (100 mM)

II: solution tampon phosphate de sodium-hydroxyde de sodium (100 mM)

III: solution tampon acide borique-chlorure de sodiumcar-bonate de sodium (100 mM).

(3) Stabilité au pH:

L'enzyme est généralement hautement stable à un pH de 5 à 8 et plus particulièrement à un pH de 7 à 8.

(4) Température optimale:

L'enzyme agit bien à 26-40 °C, et sa température optimale est d'environ 40 °C. A des températures supérieures à 40 °C ou à des températures inférieures à 20 °C, l'activité diminue.

(5) Stabilité en température:

L'enzyme est considérablement stable à 26 °C ou à 4 °C pendant 7 jours et conserve 62%, respectivement 92% de son activité, en comparaison avec l'activité lorsqu'il est stocké à —70 °C. A 45 °C ou à une température supérieure, l'activité diminue rapidement.

(6) Poids moléculaire:

Le poids moléculaire de l'enzyme obtenu par la méthode de filtration sur le gel (en utilisant de la «Cellulofine GC-700 m») est d'environ 36 000.

(7) Inhibiteurs:

Dans une concentration de 1 mM, le ion Ag montre une légère inhibition, mais d'autres ions métalliques (Cu, Fe, Mn, Mg, Zn, Co, Ni) ne montrent aucune inhibition. A 10 mM, le ion Ag montre une inhibition importante, alors que les ions Fe et Ni présentent une inhibition faible. L'ED-TA et le 2-mercaptoéthanol ne présentent pas d'inhibition à 1 mM et 10 mM.

Conformément à la méthode selon la présente invention, la réaction peut être effectuée dans des conditions douces, par exemple à température ambiante, et au voisinage du domaine de pH neutre, ce qui est avantageux en comparaison avec les méthodes conventionnelles du point de vue de la réduction de la consommation d'énergie et de la prévention de la pollution de l'environnement. Contrairement aux méthodes biochimiques conventionnelles utilisant un composé dérivé de la carnitine comme produit de départ, la présente invention permet de produire une carnitine optiquement active à partir de DL-carnitineamide optiquement inactive, ce qui est un intermédiaire pour la synthèse chimique de la carnitine.

La présente invention sera maintenant décrite plus en détail en référence aux exemples qui ne doivent pas être considérés comme limitatifs de celle-ci.

Dans les exemples suivants, tous les pourcentages sont en poids, sauf indication contraire.

Exemple 1

Des grands tubes test (2,4 cm x 19,5 cm) contenant 5 ml d'un milieu consistant en 1% de glucose, 0,1% de chlorure d'ammonium, 0,5% d'extrait de viande, 0,5% de polypepto-ne, 0,75% de phosphate de dipotassium, 0,25% de phosphate de monopotassium, 0,01% de sulfate de magnésium hep-tahydrate, 0,01% de sulfate ferreux heptahydrate, 0,5% de chlorure de sodium, 1 % de chlorhydrate de DL-carnitineamide le reste étant de l'eau (pH 7,2), ont été stérilisés. Ensuite, les microorganismes mentionnés dans le tableau 3 ci-après ont été inoculés et cultivés en agitant à 26 °C pendant 72 heures. A la culture a été ajouté 0,5 ml d'une solution tampon phosphate (pH 7,0) contenant 100 mg/ml de chlorhydrate de DL-carnitineamide et le mélange a été ensuite incubé avec agitation à 26 °C pendant 24 heures. Comme résultat, la L-carnitine (comme chlorhydrate) a été formée en des concentrations mentionnées dans le tableau 3 ci-après.

Tableau 3

Souche Chlorhydrate de L-carnitine

CA27B1 3,1 mg/ml

CA28-50A 3,6 mg/ml

Exemple 2

La même procédure que dans l'exemple 1 a été répétée excepté en ce que la souche CA30-35 a été utilisée comme microorganisme et que le milieu utilisé consistait en 1 % de glucose, 0,5% de polypeptone, 0,3% d'extrait de viande,

0.3% d'extrait de levure, 0,25% de chlorure de sodium, et le reste étant de l'eau (pH = 7,2). Dans ce cas, la quantité de L-carnitine formée était de 5,8 mg/ml (comme chlorhydrate). Lorsque le culture a été poursuivie pendant 48 heures supplémentaires, la quantité de L-carnitine formée était de 8,9 mg/ml (sous forme de chlorhydrate). La proportion de forme L par rapport à la forme D dans la carnitine totale dans le milieu de culture a été analysée comme étant de 91,5%: 8,5%.

Exemple 3

Des cellules ont été séparées par centrifugation à partir du milieu de culture obtenu après la culture des microorganismes mentionnés dans le tableau 4 ci-après pendant 72 heures dans le même milieu que celui utilisé dans l'exemple

1, et lavées deux fois. Des cellules ont été ajoutées à une solution tampon phosphate (pH = 7,0) de manière à ce que la densité cellulaire puisse être la même que celle du milieu de culture original, alors que le chlorure de DL-carnitineamide a été ajouté en une concentration de 10 mg/ml. Le mélange obtenu a été incubé avec agitation à 26 °C pendant 24 heures. La quantité de L-carnitine (comme chlorhydrate) formée dans le milieu de culture et la proportion de forme L dans la carnitine du milieu de culture présenté dans le tableau 4 ci-après ont été obtenues.

Tableau 4

Souche Concentration Proportion de en L-carnitine forme L

CA27BI 4,6 mg/ml 98%

CA28-50A 5,4 mg/ml 94%

Exemple 4

Après culture des souches mentionnées dans le tableau 5 ci-après pendant 72 heures dans le même milieu que celui utilisé dans l'exemple 1, des cellules ont été recueillies par cen-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

674 018

trifugation à partir du bouillon de culture et lavées deux fois. Ensuite, une solution tampon phosphate (pH = 7,0) ainsi que de chlorure de DL-carnitineamide ont été ajoutés aux cellules de telle sorte que la densité cellulaire dans le mélange résultant puisse être 10 fois celui du milieu de culture origi- s nal et la concentration en DL-carnitineamide était de 10 mg/ ml. Le mélange a été incubé avec agitation à 26 °C pendant 18 heures pour réaction. Comme résultat, la quantité de L-carnitine (comme composé libre) formée dans le milieu de culture et la proportion de la forme L dans la carnitine totale io du milieu de culture est mentionné dans le tableau 5 ci-des-

sous.

Tableau 5 Souche

CA30-35

CA28-50A

CA30-11B

CA30-32B

CA32-C

CA10-1-5

* composé libre

Concentration en

L-carnitine*

(mg/ml)

0.26

0.97

0.32

0.44

1.82

1.13

Proportion de forme L

89.5 92.8 47.0 26.8 59.5 41.8

15

20

25

Exemple 5

' La même procédure que dans l'exemple 3 a été répétée, excepté en ce que la concentration en chlorure de carnitineamide dans le cas de l'utilisation de cellules microbiennes per se a été modifiée à 5%. La quantité de L-carnitine (comme 30 chlorhydrate) après 72 heures de réaction était de 1,20 mg/ml pour la souche CA27B1 et de 24,9 mg/ml pour la souche CA28-50A.

35

Exemple 6

Des cellules de la souche CA28-50A obtenues par culture du microorganisme de la même manière que dans l'exemple 1 ont été suspendues dans une solution saline physiologique 40 en une densité de 200 mg/ml et 10 ml de la suspension ont été mélangés avec 10 ml d'une solution à 4% d'alginate de sodium. Le mélange résultant a été ajouté par portions à une solution de chlorure de calcium 15% afin d'obtenir des cellules particulaires immobilisées. La quantité totale de cellules 45 immobilisées a été ajoutée à 20 ml d'une solution tampon phosphate (pH = 7,0) contenant 1% de chlorure de DL-car-nitineamide et laissée au repos à 30 °C pendant 16 heures pour réaction. Comme résultat, 1,6 mg/ml de chlorhydrate de L-carnitine ont été formés. 50

Exemple 7

Dans un erlenmeyer de 300 ml contenant 30 ml d'un milieu consistant en 1% d'acide citrique, 1% de peptone, 0,5% d'extrait de viande, 0,5% de chlorure de sodium, 0,75% de phosphate de dipotassium, 0,25% de phosphate de monopo-tassium, 0,01% de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,001% de sulfate ferreux heptahydrate, 0,5% de chlorhydrate de carnitineamide et le reste étant de l'eau (pH = 7,2) a été inoculée la souche CA28-50A et cultivés sous agitation à 26 °C pendant 3 jours. Les cellules ont été recueillies à partir du bouillon de culture par centrifugation et suspendues dans une solution tampon phosphate (pH = 7,0) contenant 10% de chlorure de DL-carnitineamide (la même quantité que le milieu comme le milieu de culture de croissance), et la suspension obtenue a été laissée au repos à 26 °C pendant 96 heures pour réaction. Comme résultat, 48,9 g/1 de L-carnitine (comme chlorhydrate) ont été formés.

Exemple 8

Dans un milieu consistant en 2% de glucose, 2% de liqueur infusée de blé, 0,5% de chlorure de sodium, 0,75% de phosphate de dipotassium, 0,25% de phosphate de monopotassium, 0,01 % de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,001% de sulfate ferreux heptahydrate, 1% de chlorohydra-te de carnitine amide et le reste étant de l'eau (pH = 7,2) a été inoculée la souche CA28-50A et cultivée en agitant à 20 °C pendant 3 jours. Les cellules ont été recueillies à partir du bouillon de culture par centrifugation et suspendues dans une solution tampon phosphate (pH = 7,0) contenant 20% de chlorhydrate de DL-carnitineamide (la même quantité que le milieu comme le milieu de culture de croissance), et la suspension obtenue a été laissée au repos à 26 °C pendant 144 heures pour réaction. Comme résultat, 97,6 g/1 de L-car-nitine (comme chlorhydrate) ont été formés. Le mélange réactionnel a été passé à travers une colonne de résine échan-geuse d'ions fortement acide (de type sodium) pour adsorber la L-carnitine et la carnitineamide, puis une solution de 2% d'acétate d'ammonium a été passée à travers la colonne pour séparer la L-carnitine de la carnitineamide, suivie par la concentration de la fraction L-carnitine et le refroidissement de celle-ci après addition d'alcool, afin de récupérer la L-carnitine.

Exemple 9

Dans un milieu consistant en 1 % de glucose, 0,5% de peptone, 0,75% de K2HP04,0,25% de KH2P04, 0,01% de MgS04. 7H20, 0,001% de FeS04.7H20 et un des composés présentés dans le tableau 6 ci-après, le reste étant de l'eau (pH = 7,2), a été inoculée la souche CA28-50A et cultivée avec agitation à 26 °C pendant 3 jours. Les cellules recueillies du bouillon de culture par centrifugation ont été suspendues dans une solution réactionnelle contenant 10% de DL-carnitineamide dans la même densité que celle dans le milieu pour la culture de croissance, et la suspension obtenue a été laissée au repos à 26 °C pendant 96 heures pour réaction. Le taux de transformation de la L-carnitineamide en L-carnitine obtenu est présenté dans le tableau 6 ci-après.

Tableau 6

Composé (concentration)

DL-Carnitineamide (0.5%)

DL-Carnitine (0.5%)

y-Butyrobétaïne (0.5%)

NH4C1(0.1%)

*) dilution de 20 fois, densité optique transmise travers 1,00 cm à 660 [xm

Crois

Taux de sance*

transfor

mation (%

0.27

88.7

0.27

90.0

0.26

12.3

0.23

2.9

Exemple 10

Des cellules ont été recueillies de 800 ml du bouillon de 55 culture obtenu par culture de la souche CA28-50A dans le même milieu que celui utilisé dans l'exemple 9 contenant 0,5% de DL-carnitineamide et broyées dans une solution tampon phosphate 10 mM (pH = 7,0) avec du sable de quartz, suivi par une centrifugation pour obtenir 20 ml d'un 60 extrait libre de cellule. A celui-ci ont été ajoutés 300 ml d'une solution tampon phosphate 50 mM (pH = 7,0) et du sulfate d'ammonium a également été ajouté jusqu'à 90% de saturation pour former un précipité, lequel a été ensuite dissous dans 20 ml d'une solution tampon phosphate 50 mM (pH = 65 7,0). La solution obtenue a été dialysée par rapport à une solution tampon phosphate 50 mM, et 40 ml de la solution enzymatique obtenue a été passée à travers un filtre membrane Millipore (Immersible C x 10) à 4 °C pendant 24 heures pour

674 018

donner 4 ml d'une solution enzymatique concentrée. Celle-ci a été soumise à une Chromatographie sur gel en utilisant de la Cellulofïne GC-700m (Chisso Co.) ayant une dimension particulaire de 45 à 105 um (colonne: 10 x 520 mm; volume du gel 70 ml), puis éluée avec une solution de Tris-HCl 0,05 M (pH = 7,5) + KCL 0,1 M, et des fractions de 0,5 ml ont

été recueillies.

Comme résultat, il a été trouvé que la fraction No. 51 présentait l'activité la plus élevée. Cette fraction avait un O.D. à 280 um de 0,039 et a formé 0,593 mg/ml de L-carnitine par réaction à 26 °C pendant 60 minutes. L'activité spécifique (activité par unité O.D.) était de 13,8, ce qui était 4181 fois l'activité spécifique de l'extrait cellulaire.

Exemple 11

Des cellules ont été recueillies par centrifugation à partir de 300 ml du bouillon de culture obtenu par culture de la souche CA28-50A dans le même milieu que celui utilisé dans l'exemple 9 contenant 0,5% de DL-carnitineamide et broyés dans une solution tampon phosphate 50 mM (pH = 7,0) avec du sable de quartz, suivi par une centrifugation pour obtenir 30 ml d'un extrait libre de cellule. Les cellules vivantes et l'extrait libre de cellule ont été chacun ajoutés à une solution réactionnelle contenant 0,2% de DL-carnitine dans la même concentration que celle dans le milieu de culture de croissance en terme de la quantité cellulaire originale, et les mélanges obtenus ont été laissés au repos pour réaction. Les données analytiques sur la durée de réaction et la quantité de L-carnitine formée sont présentées dans le tableau 7 ci-après.

10

15

20

25

durant la culture de croissance par ml du milieu de culture est de 0,122 mg/ml -r- 161.2 \ig (1 (xmol de carnitine): 60 = 0,125 |i/ml, et le titre de l'enzyme dans l'extrait et de 0,145 mg/ml-r- 161 (ig: 60 = 0,15 (i/ml.

Exemple 12

La même procédure que dans l'exemple 9 a été répétée excepté en ce que les micro organismes mentionnés dans le tableau 8 ont été utilisés et la DL-carnitineamide (0,5%)

était le composé ajouté au milieu de croissance de base. Comme résultat, la formation de L-carnitine et de D-carnitine est mentionnée dans le tableau 8. Lorsque la DL-carnitineamide n'a pas été ajoutée et que 0,1 % de NH4C1 a été ajouté au milieu de croissance, la formation de la L-carnitine et de la D-carnitine était inférieure à 1,0 mg/ml.

Tableau 8

Nom de la souche Formation de carnitine (mg/ml)

Totale Forme L Forme D

Ca27Bl

Ca30-35

Ca30-11B

Ca30-32B

Ca32-C

CalO-1-5

43.4 51.4 35.7 85.0 53.0 51.0

41.3

46.0 16.8

21.1 32.0 19.5

2.1 5.4 18.9 63.9

21.4

31.5

Tableau 7 Echantillon 0.5 Hr

1.0 Hr 1.5Hrs2.0Hrs3.0Hrs 19Hrs

Cellules 0.122 0.201 0.233 0.323 0.378 0.866 Extrait 0.145 0.298 0.273 0.340 0.427 0.852

30

35

A partir des résultats ci-dessus, il a été présumé que la réaction se produisait de manière linéaire jusqu'à 0,5 heures et le titre de l'enzyme dans les cellules per se et dans l'extrait ont été calculés à partir de la vitesse de réaction obtenue des 4g résultats ci-dessus. Ainsi, le titre de l'enzyme dans les cellules

A partir des résultats ci-dessus, on peut constater que la D-carnitine a été formée à partir de DL-carnitineamide, bien que la quantité varie selon la souche utilisée. En conséquence, conjointement avec la L-carnitineamide hydrolase, la formation de D-carnitineamide hydrolase peut être confirmée.

En outre, la racémisation de la carnitine et de la carnitineamide par le microorganisme ne se produisent pas.

Bien que l'invention ait été décrite en référence à des exemples préférés, il y a lieu de considérer que des variations et modifications peuvent être utilisées comme cela apparaît à l'homme du métier. De telles variations et modifications doivent être considérées comme étant incluses dans l'étendue des revendications annexées.

C

Claims

674018

2

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la production de carnitine comprenant l'hydrolyse de carnitineamide par mise en contact, dans un milieu réactionnel, de carnitineamide avec une carnitineamide hydrolase capable d'hydrolyser la carnitineamide pour former la carnitine ou avec un micro-organisme contenant cette carnitineamide hydrolase.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite carnitineamide est la DL-carnitineamide et ladite carnitine est la L-carnitine.
3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite carnitineamide est la L-carnitineamide et ladite carnitine est la L-carnitine.
4. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite carnitineamide est la D-carnitineamide et ladite carnitine est la D-carnitine.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite carnitineamide hydrolase est la L-carnitineamide hydrolase.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit micro-organisme est un micro-organisme appartenant au genre Pseudomonas.
7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel ledit microorganisme est une souche choisie parmi le groupe com-

transport des acides gras jusqu'aux mitochondries et est utilisée comme composant de transfusion pour la thérapie des désordres cardiaques, des lipémies, etc. Elle est également utile comme intermédiaire pour la production d'autres subs-5 tances utiles telles que l'acétyl-L-carnitine.

Pendant longtemps, une méthode synthétique chimique a été connue pour la production de carnitine. Toutefois, cette méthode est désavantageuse, du point de vue de la consommation de l'énergie et de la pollution de l'environnement, io étant donné qu'elle implique le chauffage et l'utilisation d'acides minéraux, d'alcalis ou de substances toxiques, et qu'elle ne résulte qu'en une carnitine sous la forme DL.

En outre, la L-carnitine a jusqu'à présent été produite par séparation optique de DL-carnitine obtenue par la mé-15 thode synthétique chimique, utilisant une méthode diastéréo-mère. Récemment, diverses approches biochimiques ont été développées pour la production de L-carnitine, par exemple l'hydroxylation d'acide 4-N-triméthylaminobutyrique (J.

Biol. Chem., 256, 1247,1981), la réduction de 3-déhydrocar-20 nitine (Appi. Environm. Microbiol., 39, 329, 1980), une méthode utilisant un ester d'acide 4-chloro-3-hydroxybutyrique (demande de brevet japonais (OPI) No. 118093/84), une méthode utilisant la crotonobétaïne comme substrat (demandes de brevets japonais (OPI) No. 183694/84 et 118093/84), une prenant Pseudomonas sp. CA32-C (Ferm BP-1379), Pseudo- 25 méthode dans laquelle la DL-O-acylcarnitine est hydrolysée

40

avec une estérase (Biotechnol. Bioeng., 26, 911,1984), etc.

Ces méthodes sont désavantageuses d'un point de vue industriel, étant donné que les matériaux de départ utilisés sont coûteux, que les enzymes utilisés sont instables et que 30 l'apport de co-enzymes coûteux est requis. Bien que l'hydrolyse de la carnitineamine avec un acide minéral ou un similaire soit connu, l'hydrolyse biochimique de cette carnitineamide n'était jusqu'à présent pas connue.

De plus, à ce jour, il n'a pas été fait mention de la carniti-35 neamide hydrolase qui peut être utilisée dans la production d'intermédiaires pour la synthèse de DL-carnitine.