CH622532A5 - - Google Patents

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CH622532A5
CH622532A5 CH1586076A CH1586076A CH622532A5 CH 622532 A5 CH622532 A5 CH 622532A5 CH 1586076 A CH1586076 A CH 1586076A CH 1586076 A CH1586076 A CH 1586076A CH 622532 A5 CH622532 A5 CH 622532A5
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mycobacterium
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sterols
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CH1586076A
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Alfred Dr Weber
Mario Dr Kennecke
Rudolf Dr Mueller
Ulrich Dr Eder
Rudolf Prof Dr Wiechert
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Schering Ag
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten der Formel
0
worin
X eine 6,7-Methylengruppe oder einen in der 6- oder 7-Stel-Iung befindlichen Fluor-, Chlor- oder Methylsubstituenten darstellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Sterin-Derivat der Formel
0
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt und Ri den 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins darstellt, mit einer zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.
Unter einem 8 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest Ri soll ein Rest verstanden werden, wie er in den gegebenenfalls hydrierten Seitenketten von natürlich vorkommenden Zoo- oder Phytosterinen, wie z.B. Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Brassicasterin oder den Sitosteri-nen vorliegt.
Geeignete Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II sind beispielsweise solche Verbindungen, die durch die Formel
,CH
CH
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(II a)
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt, und R2 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe bedeutet, charakterisiert werden können.
Geeignete Ausgangsverbindungen für das erfindungsge-mässe Verfahren sind beispielsweise solche Sterine der allgemeinen Formel IIa, in denen der Substituent X ein 6a-Fluoratom, eine 6a-Methylgruppe, eine 6a, 7a- oder 6ß, 7ß-Methylengruppe, eine 7a-Methylgruppe oder eine 7ß-Methylgruppe bedeutet. Als geeignete Ausgangsverbindun-gen seien beispielsweise genannt:
das 6a-Fluor-4-cholesten-3-on,
das 6a-Methyl-4-cholesten-3-on,
das 7a-Methyl-4-cholesten-3-on,
das 7ß-Methyl-4-cholesten-3-on,
das 6a-Fluor-4-stigmasten-3-on,
das 6a-Methyl-4-stigmasten-3-on,
das 7a-Methyl-4-stigmasten-3-on,
das 7ß-Methyl-4-stigmasten-3-on,
das 6a-Fluor-4-campesten-3-on,
das 6a-Methyl-4-campesten-3-on,
das 7a-Methyl-4-campesten-3-on,
das 7ß-Methyl-4-campesten-3-on oder die entsprechenden Sitosterinderivate.
Es ist bekannt, dass zahlreiche Mikroorganismen, so z.B. solche der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Micro-
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bacterium, Protaminobacter, Bacillus, Norcardia, Streptomy-ces und insbesondere Mycobacterium, die natürliche Fähigkeit besitzen, Zoo- und Phytosterine zu Kohlendioxyd und Wasser abzubauen und dass bei diesem Abbau intermediär 4-Andro-sten-3,17-dion und l,4-Androstadien-3,17-dion gebildet werden.
Ferner ist bekannt, dass es mit Hilfe von Inhibitorzusätzen oder mutierten Mikroorganismen möglich ist, den Abbau der Sterine so zu lenken, dass ein Abbau des gebildeten 4-Andro-sten-3,17-dions oder l,4-Androstadien-3,17-dions vermieden wird (siehe deutsche Offenlegungsschriften 1 543 269 und 1 593 327 sowie US-Patentschrift 3 684 657).
Für den Fachmann ist es überraschend, dass unter den bekannten Bedingungen auch die Seitenketten von Sterin-Derivaten der Formel II abgebaut werden, weil bekannt ist, dass der Seitenkettenabbau von Sterinen durch ein sehr komplexes Fermentsystem bewirkt wird und man nicht erwarten konnte, dass alle am Seitenkettenabbau natürlicher Steroide mitwirkenden Enzyme die Fähigkeit besitzen, auch den Seitenkettenabbau der in der Natur nicht vorkommenden Sterin-Derivate der Formel II bewirken. Darüber hinaus konnte man nicht vorhersehen, dass die den Abbau des 1,4-Androstadien-3,17-dions und des 4-Androsten-3,17-dions bewirkenden Enzymsysteme nicht befähigt sind, die 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der Formel I abzubauen.
Abgesehen von der Verwendung anderer Ausgangsverbindungen und von der Tatsache, dass die Umsetzung in Abwesenheit von Inhibitoren durchgeführt werden kann, wird das erfindungsgemässe Verfahren gewöhnlich unter den gleichen Fermentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Seitenkettenabbau-Reaktio-nen von Sterinen anwendet.
Erfindungsgemäss wird die Fermentation unter Verwendung der Mikroorganismenkulturen durchgeführt, welche man üblicherweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen verwendet. Geeignete Kulturen sind beispielsweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Bakterienkulturen der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium. Als geeignete Mikroorganismen seien beispielsweise genannt: Microbacterium lactum IAM-1640, Protaminobacter alboflavus IAM-1040, Bacillus roseus IAM-1257, Bacillus sphäricus ATTC-7055, Norcardia gardneri IAM-105, Norcardia minima IAM-374, Norcardia corallina IFO-3338, Streptomyces rubescens IAM-74 oder insbesondere die Mikroorganismen Mycobacterium avium IFO-3082, Mycobacterium phlei IFO-3158, Mycobacterium phlei (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 29), Mycobacterium phlei ATCC-354, Mycobacterium smegmatis IFO-3084, Mycobacterium smegmatis ATCC-20, Mycobacterium smegmatis (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 27), Mycobacterium smegmatis ATCC-19 979, Mycobacterium fortuitum CBS-49 566, Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 und Mycobacterium spec. NRRL-B-3683. Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen wurden in den US-Patenten Nr. 3 684 657 sowie Nr. 3 759 791 beschrieben. Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen können in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet werden. Dann setzt man den Kulturen gewöhnlich das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.
Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikroni-sierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie z.B. Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polyglyko-len. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin®, Tween® und Span® beispielsmässig genannt.
Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus abhängig. Diese Grössen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbaren 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der Formel I sind wertvolle Zwischenprodukte zur Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide.
So kann man beispielsweise die 17-Ketogruppe der 4-Androsten-3,17-dion-Derivate, gegebenenfalls nach Ketalisie-rung der 3-Oxo-gruppe reduzieren oder mit einer metallorganischen Verbindung der allgemeinen Formel IV
MeR4 (IV),
worin R4 einen niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest darstellt und Me ein Alkalimetallatom oder ein Magnesiumhalogenidrest bedeutet, umsetzen und erhält nach Abspaltung der gegebenenfalls vorhandenen Ketal-gruppe, die 17ß-Hydroxy-4-androsten-3-on-Derivate der Formel III
C
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt und R3 das gleiche wie R4 bedeutet oder ein Wasserstoffatom darstellt.
Unter einem niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest R3 soll vorzugsweise ein Methylrest, ein Äthylrest, ein Vinylrest oder ein Äthinylrest verstanden werden.
Die Reduktion der 17-Ketogruppe der 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der allgemeinen Formel I kann mittels der dem Fachmann wohlbekannten Arbeitsmethode (siehe z.B. John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry—van Nostrand Reinhold Comp., New York etc. 1972, Volume 1 Seite 61ff) erfolgen. So kann man diese Verbindungen beispielsweise nach Ketalisierung mit Natriumborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid umsetzen und erhält nach Spaltung der Ketale die entsprechenden 17ß-Hydroxy-4-androsten-3-on-Derivate der Formel III, welche bekanntlich eine anabole und/oder androgene Wirksamkeit besitzen.
Ebenso bekannt sind die Methoden, die 17-Ketogruppe zu alkylieren (siehe z.B. John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry - van Nostrand Reinhold Comp., New York etc. 1972, Volume 2, Seite 53ff). So kann man die 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der Formel I gegebenenfalls nach Ketali-
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sierung der 3-Oxogruppe beispielsweise mit Alkylmagnesium-halogeniden, Vinyllithium oder Alkalimetallacetyliden umsetzen und erhält nach Spaltung der gegebenenfalls vorhandenen Ketalgruppen die 17aR-17ß-hydroxy-4-androsten-3-on-Derivate der Formel III, welche bekanntlich pharmakologisch wirksame Substanzen sind oder Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmakologisch wirksamen Steroiden.
Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Sterin-Derivate der Formel II können aus den entsprechenden Sterinen mittels der Methoden hergestellt werden, welche man konventionellerweise zur Einführung der entsprechenden 6- und/oder 7-ständigen Substituenten in Steroide anwendet.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens.
A) Ausführungsbeispiele betreffend den mikrobiologischen Seitenkettenabbau.
Beispiel 1
Ein 750 ml Erlenmeyerkolben wird mit 200 ml einer sterilen Nährlösung, enthaltend 1% Hefeextrakt, 0,45% Dinatri-umhydrogenphosphat, 0,34% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2 % Tween® 80 - eingestellt auf pH = 6,7 - beschickt, mit einer Abschwemmung einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 Kultur beimpft und 3 Tage lang bei 30°C mit 190 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Ein 501 Fermenter mit 401 steriler Nährlösung, enthaltend 1,23% Hefeextrakt, 0,68% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2 % Tween® 80 — eingestellt auf pH = 6,0 - wird mit 200 ml der Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und 48 Stunden lang unter Belüften (2 m3 pro Stunde) bei 30cC inkubiert.
Ein 501 Fermenter mit 401 Nährlösung, enthaltend 2,0% Com steep liquor, 0,3% Diammoniumhydrogenphosphat und 0,25 % Tween® 80 — eingestellt auf pH = 6,5 — wird zur Induktion mit 5 g 6a-Fluor-4-cholesten-3-on versetzt und 24 Stunden lang unter Belüften (2 m3 pro Stunde) und Rühren (200 Umdrehungen pro Minute) bei 30°C inkubiert.
Dann setzt man der Kultur eine sterilfiltrierte Lösung von 20 g 6a-Fluor-4-cholesten-3-on in 150 ml Dimethylformamid zu und fermentiert weitere 56 Stunden lang unter Rühren und Belüften bei 30°C.
Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur dreimal mit je 51 Äthylenchlorid extrahiert, die Extrakte im Vakuum eingeengt, der Rückstand über eine Kieselgelsäule gereinigt und man erhält nach Umkristallisation aus Diisopropyläther 8,7 g 6a-Fluor-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 229-231°C.
Herstellung des Ausgangsmaterials:
a) 60 g 3ß-Hydroxy-5-cholesten werden in 360 ml abs. Tetrahydrofuran und 120 ml Methylenchlorid bei Eiskühlung mit 60 g N-Bromsuccinimid versetzt und anschliessend portionsweise 120 ml Pyridin: Fluorwasserstoff-Reagenz (70%ig) zugegeben. Es wird 1 Stunde bei Kühlung nachgerührt und dann in Eiswasser/Kaliumcarbonat eingerührt. Nach Ätherextraktion wird das erhaltene Rohprodukt an Silicagel chromato-graphiert aus Methanol umkristallisiert und man erhält 40,8 g 5-Brom-6ß-fluor-5a-cholestan-3ß-ol vom Schmelzpunkt
114,5-116°C.
b) 30 g 5-Brom-6ß-fluor-5a-cholestan-3ß-ol werden in 730 ml Aceton gelöst und bei 10°C mit 24,1 ml Chromschwefelsäure (hergestellt aus 267 g Chrom(VI)-oxid, 400 ml Wasser, 230 ml konz. Schwefelsäure a. d. 1000 ml mit Wasser) versetzt. Es wird 15 Minuten bei 10°C nachgerührt, in Eiswasser eingerührt, der Niederschlag abfiltriert und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird das erhaltene Rohprodukt in 290 ml Essigsäure gelöst, 3 Stunden bei 30°C gerührt, dann 4,65 g Natriumacetat zugesetzt und weitere 15 Minuten bei -30°C gerührt. Es wird dann in Eiswasser gefällt, der Niederschlag abfiltriert und in Methylenchlorid aufgenommen. Der nach dem Eindampfen erhaltene Rückstand wird an Silicagel chromatogräphiert, aus Methanol umkristallisiert und man erhält 14,5 g 6a-Fluor-4-cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 111-115°C.
In der gleichen Weise lässt sich das 5-Stigmasten-3ß-ol in das 6a-Fluor-4-stigmasten-3-on überführen.
Beispiel 2
20 g 6a-Fluor-4-stigmasten-3-on (91,5%iges Rohprodukt) werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen mit einer Mycobacterium spec. NRRL-3805 Kultur umgesetzt und man erhält 6,1 g 6a-Fluor-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 228-231°C.
Beispiel 3
20 g 6a-Fluor-4-cholesten-3-on werden unter den Bedingungen des Beispiels 1, jedoch unter Verwendung einer Kultur von Mycobacterium phlei ATCC 354 umgesetzt und aufbereitet. Man erhält 4,8 g 6a-Fluor-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 228-231°C.
Beispiel 4
Ein 21 Erlenmeyerkolben mit 500 ml sterilem Nährmedium, enthaltend 1 % Hefeextrakt, 0,45 % Dinatriumhydrogenphos-phat, 0,34% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2% Tween® 80 - eingestellt auf pH = 6,7 - wird mit einer Suspension einer Mycobacterium spec. NRRL B-3805 Trockenkultur beimpft und drei Tage lang bei 30°C mit 190 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
20 Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml sterilen Nährmediums, enthaltend 2,0% Corn steep liquor, 0,3 % Diammoniumhydrogenphosphat und 0,25 % Tween® 80 — eingestellt auf pH = 6,5 - werden mit jeweils 5 ml der Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und 24 Stunden lang bei 30°C mit 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Dann setzt man jeder Kultur 100 mg 7a-Methyl-4-chole-sten-3-on in 5 ml Dimethylformamid gelöst zu und fermentiert weitere 96 Stunden lang.
Der vereinigten Kulturen werden mit Äthylenchlorid extrahiert, der Extrakt im Vakuum eingeengt, der Rückstand durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule gereinigt und man erhält nach Umkristallisation aus Diisopropyläther 0,8 g 7 a-Methyl-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 193-194°C.
Herstellung des Ausgangsmaterials:
30 g Cholesterin, 34,29 g Lithiumbromid und 34,3 g Lithiumcarbonat werden in 525 ml Dimethylformamid suspendiert, anschliessend auf 75-80°C (Innentemperatur) erhitzt und innerhalb von 45 Minuten mit 7,95 ml Brom in 170 ml Dioxan tropfenweise versetzt. Es wird 2 Stunden nachgerührt, anschliessend in 31 Wasser eingerührt, 30 Minuten nachgerührt, bei Eiskühlung mit Eisessig bis pH = 4 angesäuert und mit Essigester extrahiert. Die Extrakte werden mit halbgesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.
Man erhält 34,4 g Rohprodukt, das durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt wird. Die anschliessende Kristallisation aus Methanol liefert 25,6 g 4,6-Cholastadien-3-on vom Schmelzpunkt 80-82,5°C.
Aus 7 g Magnesiumspänen, 275 ml Äther und 6,26 ml Methyljodid bereitet man sich in der üblichen Weise eine ätherische Methylmagnesiumjodid-Lösung.
Nach der Umsetzung werden unter gleichzeitigem Abdestil-lieren des Äthers 550 ml abs. Tetrahydrofuran zugetropft, bis die Innentemperatur 58-60° beträgt. Bei intensiver Eisküh-
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Jung werden 1,4 g Kupfer-I-chlorid zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten tropft man innerhalb von 30 Minuten eine Lösung von 27,5 g 4,6-Cholestadien-3-on zu, rührt für 2 Stunden nach, versetzt vorsichtig mit 300 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung, verdünnt mit 21 Äther und arbeitet wie üblich auf. Das Rohprodukt (28,7 g) wird in 250 ml Tetrahydrofuran gelöst und nach Zugabe von 10 ml 2 n Schwefelsäure 2 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Aus der üblichen Aufarbeitung resultieren 26,3 g Rohprodukt, das zur Reinigung an Kieselgel chromatographiert wird. Man erhält 16,6 g 7 a-Methyl-4-cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 72/73—75°C (Pentan).
Beispiel 5
In 20 Erlenmeyerkolben werden mittels den Bedingungen des Beispiels 4 jeweils 100 mg 6a-Methyl-4-cholesten-3-on mit einer Mycobacterium spec. NRRL B-3805 Kultur fermentiert und aufbereitet.
Man erhält 0,8 g 6a-Methyl-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 171-174°C.
Herstellung des Ausgangsmaterials:
Man löst 30 g Cholesterin in 600 ml Methylenchlorid und fügt bei Eiswasserkühlung 17,4 g m-Chlorperbenzoesäure anteilweise im Verlauf von 20 Minuten zu. 30 Minuten nach der letzten Zugabe wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt,
zweimal mit je 200 ml gesättigter Natriumsulfat-Lösung, zweimal mit je 200 ml verdünnter Natriumbicarbonat-Lösung und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmit-s tel im Vakuum abdestilliert. Das Rohprodukt wird aus Methanol kristallisiert.
Man erhält 23,4 g 3ß-Hydroxy-5,6-epoxy-cholesterin vom Schmelzpunkt 133-136°C.
xo Aus 3,64 g Magnesiumspänen und 9,5 ml Methyljodid bereitet man sich in 100 ml Äther eine Methylmagnesiumjo-did-Lösung. Dann tropft man 20 g 3ß-Hydroxy-5,6-epoxy-cholesterin in 400 ml absolutem Toluol zu und rührt bei 60-65° 45 Stunden lang. Bei Eiskühlung wird vorsichtig mit ls 100 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung versetzt und wie üblich aufgearbeitet. Das Rohprodukt (21,3 g braunes, zähes öl) wird in 400 ml Benzol gelöst und nach Zugabe von 100 ml Cyclohexanon 20 g Aluminium-i-propylat für 21 Stunden unter Rückfluss gekocht. Die abgekühlte Lösung wird mit 20 Benzol verdünnt, mehrmals mit 1 n Schwefelsäure ausgeschüttelt und mit Wasser neutral gewaschen.
Das Rohprodukt wird zur Reinigung an Kieselgel chromatographiert. Man erhält nach Kristallisation aus Methanol 12,75 g 6a-Methyl-4-cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 151— 25 154°C.
B

Claims (2)

  1. 622 532
    2
    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten der Formel
    0
    worin
    X eine 6,7-Methylengruppe oder einen in der 6- oder 7-Stel-lung befindlichen Fluor-, Chlor- oder Methylsubstituenten darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Sterin-Derivat der Formel
    0
    worin X die obengenannte Bedeutung besitzt und Ri den 8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins darstellt, mit einer zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.
  2. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Fermentation eine zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Mikroorganismenkultur der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Prota-minobacter, Bacillus Norcardia, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium verwendet.
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