CH620944A5 - Process for the preparation of new aminocyclitol aminoglycoside derivatives - Google Patents

Description

L'invention se rapporte également au procédé de préparation des sels d'addition non toxiques des composés de formule I tel que par exemple le sulfate.

Les composés de formule I peuvent exister sous forme d'épimères et de mélanges de ces épimères. La préparation des épimères et mélanges d'épimères en question fait donc également partie de la présente invention.

Les composés dont il est question ici possèdent une structure chimique semblable à celle de la néomycine ou de la paromomy-cine. Pour cette raison, les composés de formule I seront désignés, par la suite, comme des dérivés de néomycine ou de paromomycine, à savoir:

Déoxy-6 néomycine B lorsque R[ représente hydrogène, R2 représente CH2NH2 et R représente le groupement A dans lequel R3 représente NH2.

Déoxy-6 néomycine C lorsque R[ représente CH2NH2, R2 représente hydrogène et R représente le groupement A dans lequel R3 représente NH2.

Le mélange de ces deux épimères tel qu'obtenu par le procédé décrit ci-après sera nommé, par la suite, déoxy-6 néomycine.

Déoxy-6 paromomycine I lorsque R] représente hydrogène, R2 représente CH2NH2 et R représente le groupement A dans lequel R3 représente OH.

Déoxy-6 paromomycine II lorsque R] représente CH2NH2, R2 représente hydrogène et R représente le groupement A dans lequel R3 représente OH.

Le mélange de ces deux épimères tel qu'obtenu par le procédé décrit ci-après sera nommé, par la suite, déoxy-6 paromomycine.

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Le mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés désignera, par la suite, le mélange non séparé de composés dans lesquels Rt et R2, qui sont différents, représentent hydrogène ou CH2NH2 et R représente le groupement B, ce mélange étant obtenu suivant le procédé décrit ci-après.

«Néomycine» sera utilisé, par la suite, pour désigner le mélange de néomycine B et néomycine C obtenu par culture de Streptomyces fradiae.

De même, «paromomycine» sera utilisé, par la suite, pour désigner le mélange de paromomycine I et paromomycine II obtenu par culture de Streptomyces rimosus forma paromomycinus.

Comme on le démontera par la suite, on a trouvé que les présents dérivés aminoglycosides d'aminocyclitol présentent une remarquable activité antibiotique susceptible de les rendre utiles dans le traitement d'affections provoquées par le développement de bactéries pathogènes telles que, par exemple:

Escherichia coli, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Sorcina lutea, Klebsiella edwardisii, Shigella sonneì, Salmonella typhimurium.

On a observé, depuis quelques années, que certaines souches bactériennes ont développé une résistance à la plupart des antibiotiques commercialisés ayant pour effet une réduction de valeur thérapeutique de ceux-ci de plus de moitié. D'autre part, certaines bactéries sont même à l'heure actuelle, suffisamment puissantes pour résister à tous les antibiotiques connus.

Il est donc, de nécessité primordiale et d'intérêt général de créer de nouveaux antibiotiques capables de détruire des organismes qui sont devenus résistants à des antibiotiques couramment utilisés.

On sait que l'inactivation d'antibiotiques est due à la destruction ou à la modification de la molécule d'antibiotique par des enzymes qui attaquent cette dernière à certains endroits vulnérables.

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En particulier, les antibiotiques aminoglycosides d'aminocyclitol, que l'on utilise à une échelle toujours plus grande, sont sujets à une inactivation par des bactéries résistantes. La résistance développée par certains organismes normalement sensibles à ces antibiotiques aminoglycosides d'aminocyclitol est causée par des enzymes phosphorylants, acylants ou adényly-lants qui attaquent les groupements hydroxyles et amino libres de l'antibiotique (Ann. Rev. Biochem., 42,47,1973).

La suppression des groupements hydroxyles rendra l'antibiotique insensible à une inactivation à ces endroits. Il est donc souhaitable de produire des antibiotiques avec moins de groupements hydroxyles ou amino non essentiels.

Au cours d'essais effectués aves les composés obtenus selon l'invention, on a trouvé que le mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés présente une puissante activité antibiotique à l'égard d'organismes résistants à d'autres antibiotiques aminoglycosides d'aminocyclitol, notamment à l'égard de la néomycine et de la gentamicine.

Ainsi, on a démontré que le mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés est actif à l'égard de souches d'Escheri-chia coli connues pour leur résistance à la gentamicine et à la néomycine en raison respectivement de l'enzyme adénylylant en position 2" et de l'enzyme phosphorylant en position 3'.

Pour cette raison, le mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés, défini ci-dessus, constitue parmi les antibiotiques couverts par la formule I, l'antibiotique préféré.

On sait, d'après le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3 669 838, que l'on peut former des mutants de microorganismes réputés pour produire des antibiotiques contenant un sous-motif aminocyclitol tels que par exemple la néomycine ou la paromomycine, ces mutants étant incapables de biosynthéti-ser le sous-motif aminocyclitol suite à une déficience dans l'élaboration de I'aminocyclitol de sorte qu'aucun antibiotique ne peut être produit.

Cependant, de tels mutants aminocyclitol négatifs ont la capacité d'utiliser une molécule appropriée d'aminocyclitol lorsqu'on ajoute cette dernière à un milieu nutritif pour former un antibiotique.

On sait, également, qu'il est possible d'utiliser cette technique en substituant un pseudodisaccharide au sous-motif aminocyclitol.

Cependant, à partir des résultats cités dans des publications existantes, il n'est pas possible de prédire si un quelconque diaminocyclitol ou un pseudodisaccharide sera incorporé dans un antibiotique par la technique de bioconversion citée précédemment.

En fait, de nombreux exemples ont été décrits dans la littérature où cette méthode d'obtention de nouveaux antibiotiques s'est révélée inefficace.

En conséquence, le procédé décrit précédemment ne peut être généralisé pour la production de nouveaux antibiotiques semi-synthétiques ou totalement synthétiques.

Ce fait est confirmé, par exemple, dans «The Journal of Antibiotics», Vol. XXVI, N° 10, p. 551-561 (1973) où figure une description d'essais entrepris avec 29 aminocyclitols différents en vue de les incorporer dans un antibiotique par la méthode du brevet des Etats-Unis d'Amérique cité précédemment.

Parmi les 29 aminocyclitols ainsi étudiés, on a trouvé qu'uniquement la streptamine et l'épi-2 streptamine étaient incorporées au moyen de mutants déoxy-2 streptamine négatifs (D-) de Streptomyces fradiae, de Streptomyces rimosus forma paromomycinus et de Streptomyces kanamyceticus utilisés à cet effet.

De même, les diaminocyclitols cités dans le brevet français N° 2 203 808 ne pouvaient pas être incorporés dans un antibiotique moyennant les mêmes mutants D- de S. fradiae et de S. rimosus forma paramomycinus que ceux utilisés dans la susdite référence.

Dans «Biochemistry», Vol. 13, N° 25, p. 5073-5078 (1974) on signale qu'aucun succès ne fut enregistré lors de tentatives effectuées en vue d'incorporer les pseudodisaccharides connus sous les appelations néamine, paromamine ou kanosaminido-6 5 déoxy-2 streptamine en utilisant des mutants D~ de S. fradiae, de S. rimosus forma paromomycinus et de S. kanamyceticus.

Parallèlement, «The Journal of Antibiotics», Vol. XXVIII, N° 8, p. 573-579 (1975) rapporte que des gentamines, qui sont des pseudodisaccharides, ne furent pas incorporées dans des io antibiotiques en utilisant un mutant D~ de Micromonospora inyoensis.

On a également trouvé que la O-ßD-ribopyranosyl-5 didéoxy-2,4 streptamine est incapable de produire des antibiotiques en utilisant des mutants D" de S. fradiae et de S. rimosus 15 forma paromomycinus selon le procédé cité précédemment.

On a également démontré dans des publications antérieures que des diaminocyclitols ou des pseudodisaccharides présents dans des antibiotiques déjè connus, tels que la streptomycine, la bluensomycine et l'hygromycine, ne peuvent pas être incorporés 2o dans des antibiotiques moyennant les mutants cités ci-dessus.

Par exemple, on a publié dans «The Journal of Antibiotics», Vol. XXVI, N° 10, cité précédemment, que la bluensamine, la streptidine, la bluensidine, l'hyosamine et l'actinamine ne sont pas incorporées dans des antibiotiques par les mutants D- de S. 25 fradiae, S. rimosus forma paromomycinus et S. kanamyceticus lorsque ces mutants sont utilisés à cet effet.

De même, la néamine et la paromamine, que l'on trouve respectivement dans la néomycine et la paromomycine, ne furent pas incorporées dans des antibiotiques lorsqu'un mutant 30 D- de S. fradiae fut employé («Biochemistry»: référence citée précédemment).

En outre, on a également observé qu'un diaminocyclitol ou un pseudodisaccharide, que l'on parvient à incorporer dans un antibiotique en utilisant une souche mutante selon le procédé du 35 brevet des Etats-Unis d'Amérique cité précédemment, ne sera pas nécessairement incorporé dans un antibiotique par une souche mutante différente. On a cité des exemples dans la référence précédente extraite de «The Journal of Antibiotics», Vol. XXVI, N° 10, laquelle montre qu'un mutant D- de S. 40 rimosus forma paromomycinus ne produit pas d'antibiotique avec l'épi-2-streptamine alors qu'un mutant D " de S. fradiae et de S. kanamyceticus sont capables d'incorporer ce sous-motif dans des antibiotiques.

De plus, le même mutant D- de S. kanamyceticus avec la 45 streptamine ne fournit aucun antibiotique alors que le même mutant D- de S. fradiae et de S. rimosus forma paromomycinus incorpore ce diaminocyclitol dans des antibiotiques.

En ce qui concerne la néamine, ce pseudodisaccharide permet d'obtenir le ribostamycin lorsqu'on utilise un mutant D~ de S. ribosidificus comme cité dans «The Journal of Antibiotics», Vol. XXVI, N° 12, p. 784-785 (1973) alors que la néamine est incapable d'être incorporée dans un antibiotique lorsqu'on emploie un mutant D- de S. fradiae, par exemple.

50

55 Finalement, des publications antérieures ont également montré que la structure d'un antibiotique hypothétique ne peut, en aucune façon, être prédite lorsqu'on utilise un diaminocyclitol ou un pseudodisaccharide avec une souche mutante. Ce fait est clairement démontré dans «The Journal of Antibiotics», 6() Vol. XXVI, N° 12, cité ci-dessus, où on rapporte que des antibiotiques obtenus, lorsqu'un mutant D"" de S. kanamyceticus est utilisé avec la N-méthyl-1 déoxystreptamine ou la myo-inosadiamine-1,3, « ne sont pas les produits espérés» mais d'autres composés. De même, la néamine et un mutant D~ de 65 M. inyoensis fournit la sisomicine; cependant, ce mutant et la paromamine, un pseudodisaccharide différent, produit également la sisomicine («The Journal of Antibiotics» Vol. XXVIII, N° 8, cité ci-dessus).

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On a également démontré qu'un mutant D- de S. ribosidifi-cus, en présence de néamine, ne produit que la ribostamycine mais pas un analogue de néomycine comme on pouvait l'espérer («The Journal of Antibiotics», Vol. XXVI, N° 12 cité ci-dessus).

Il est clair, d'après ce qui précède, qu'il n'est possible de faire aucune prédiction valable au sujet de l'incorporation éventuelle d'un diaminocyclitol ou d'un pseudodisaccharide particulier en utilisant une certaine souche mutante selon le procédé du susdit brevet des Etats-Unis d'Amérique. En aucun cas, il n'est possible de prédire si cette méthode sera valable ou quelle sera la structure exacte de l'antibiotique que l'on espère obtenir.

En conséquence, l'affirmation avancée dans J. Org. Chem. Vol. 40, N° 4, p. 456-461 (1975) que la «didéoxy-2,4 streptamine pourrait être incorporée dans des néomycines, paromomy-cines et dans la ribostamycine au moyen d'une technique de bioconversion» peut être considérée comme excessivement vague, indéfinie et dépourvue de tout fondement valable et raisonnable.

On a maintenant trouvé, de façon tout à fait surprenante, que la didéoxy-2,4 streptamine peut être incorporée dans de nouveaux antibiotiques au moyen de mutants D- de S. fradiae et de S. rimosus forma paromomycinus et qu'un mélange de pseudodisaccharides, à savoir un mélange de gentamines, peut être également incorporé dans de nouveaux antibiotiques au moyen d'un mutant D- de S. rimosus forma paromomycinus.

Cette découverte est d'autant plus surprenante que des essais effectués avec la didéoxy-2,4 streptamine en présence d'un mutant D- de S. kanamyceticus n'a produit aucun antibiotique et qu'un mutant de S. fradiae fut incapable d'incorporer le mélange de gentamines en question dans un antibiotique.

Tous les résultats obtenus avec la didéoxy-2,4 streptamine et le mélange de gentamines rendent l'invention tout à fait imprévisible d'après l'état de la technique.

Les composés de formule I sont préparés en cultivant un mutant déoxystreptamine négatif de Streptomyces dans un milieu approprié contenant un hydrate de carbone soluble, une source d'azote assimilable, des sels minéraux essentiels et un composé de formule

(HA)

ou un sel d'addition d'acide de ce composé, formule dans laquelle X = Y = H, ou bien X = -OH et Y = un groupement de formule

R,

(IIB)

H.

ou un sel d'addition d'acide de ces composés.

En utilisant ce procédé, on obtient l'antibiotique sous forme de base libre, que le diaminocyclitol ou le mélange de gentamines soit sous forme de base libre ou sous forme de sel. Si on désire utiliser l'antibiotique obtenu sous forme de sel, il suffit de le traiter avec un acide organique ou inorganique approprié, tel que par exemple l'acide sulfurique, pour obtenir un sel d'addition non toxique.

Les microorganismes utilisés dans la présente invention sont D- Streptomyces fradiae ATCC 21401 et D~ Streptomyces 5 rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 tous deux décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3 669 838: D~ Streptomyces fradiae ATCC 21401 est utilisé pour produire la déoxy-6 néomycine et D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 est employé pour la préparation de la 10 déoxy-6 paromomycine et du mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés.

Selon des techniques connues, on réalise une culture du microorganisme dans un milieu nutritif ayant la valeur de pH appropriée et contenant, par exemple du glucose, de l'hydroly-15 sat de caséine, (NH4)2HP04, MgS04 • 7H20, FeS04 • 7H20, CuS04 • 5H20, CaC03 puis on ajoute cette culture à un autre milieu de culture contenant le diaminocyclitol de formule IIA ou le mélange de gentamines de formule IIB tous deux sous forme de base libre ou de sel d'addition et, par exemple, de la 20 farine de graines de soya, de l'extrait de levure, NaCl, CaC03 et du glucose, ce milieu étant de nouveau à la valeur de pH appropriée. On incube le milieu de culture à une température d'environ 28 à 30° C tout en secouant et en maintenant sous bonne aération durant au moins 5 jours pour atteindre la 25 production optimale de déoxy-6 néomycine, de déoxy-6 paromomycine ou de mélange de didéoxy-3',4' néomycine et ses dérivés, que l'on souhaite obtenir.

On obtiendra la déoxy-6 néomycine B et la déoxy-6 néomycine C ainsi que la déoxy-6 paromomycine I et la déoxy-6 30 paromomycine II à partir, respectivement de déoxy-6 néomycine et de déoxy-6 paromomycine, suivant des procédés conventionnels, par exemple par séparation au moyen d'une Chromatographie sur papier.

On peut également séparer les isomères constituant le 35 mélange de didéoxy-3 ', 4', néomycine et ses dérivés suivant des procédés connus.

Le diaminocyclitol de formule IIA est un composé connu ayant été décrit dans le brevet français n° 2 270 235. On peut l'obtenir suivant la méthode décrite dans le susdit brevet fran-40 çais, c'est-à-dire en hydrogénant en présence d'un catalyseur, par exemple le nickel de Raney, le lD-(l,3,5/2)-l,5-diazido-2,3-cyclohexanediol obtenu à partir du lL-l,5-di-0-tosyl-1,2,5/3-cyclohexanetétrol et l'azide de sodium.

En ce qui concerne le mélange de gentamines de formule 45 IIB, on peut l'obtenir à partir du sulfate de gentamicine commercial suivant la méthode de COOPER et coll. décrite dans J. Chem. Soc. (c) 1971,960.

Comme mentionné précédemment, on a trouvé que les 50 dérivés aminoglycosides d'aminocyclitol obtenus selon l'invention présentent une activité antibiotique intéressante.

Les résultats décrits ci-dessous illustrent cette activité antibactérienne, à l'égard de divers organismes testés:

55 a) Activité antibactérienne de la déoxy-6 néomycine et de la déoxy-6 paromomycine

On a testé l'activité antibiotique de ces dérivés aminoglycosides d'aminocyclitol en ajoutant, à de l'agar nutritif, des quantités mesurées du composé à étudier dans l'eau stérile. 60 On verse, dans des boîtes de Pétri, l'agar contenant des concentrations croissantes du composé à étudier. Mécaniquement, au moyen d'un multinoculateur, on ensemence, chaque boîte de Pétri, avec plusieurs organismes différents cultivés au préalable dans un milieu approprié et maintenus à —20° C dans 65 un mélange 1:1 de milieu nutritif et de glycérol. On incube alors les boîtes à 37° C pendant 14 heures et on observe le développement.

On enregistre la concentration minimale d'antibiotique qui

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inhibe le développement des bactéries et on la dénomme «concentration inhibitrice minimum» ou C.I.M.

On a consigné dans le Tableau I ci-dessous les résultats obtenus dans ce test en comparaison avec la néomycine et la paromomycine, tous deux sous forme de sulfate.

Les chiffres répertoriés aux Tableaux I et II correspondent à la quantité de base libre.

Tableau I

[ig/ml requis pour empêcher le développement

Organisme (a)

néo déoxy-6

paro-

paro-

mycine néo mony-

momy-

Escherichia coli W3110

mycine cine cyne c-à-d ATCC 27325

2,5

1,25

5,0

40

Proteus mirabilis

c-à-d NCIB 11355

5,0

5,0

1,25

20

Staphylococcus aureus

c-à-d ATCC 9144

2,5

3,75

1,25

20

Sarcina lutea c-à-d

NCIB 11356

2,5

2,5

5,0

40

Klebsiella edwardsii

7,5

10

2,5

40

Shigella sonnei C6319

78 c-à-d NCIB 11357

2,5

3,75

2,5

40

Salmonella typhimurium

LT2 c-à-d ATCC 19585

5,0

5,0

2,5

40

(a) ATCC, American Type Culture Collection; NCIB, National Collection of Industriai Bacteria (Great Britain)

néomycine à l'égard d'Escherichia coli W3110 c-à-d ATCC 27325 est supérieure à celle de la néomycine.

Ces résultats montrent que la suppression du groupement b) Activité de la déoxy-6 néomycine B et de la déoxy-6 néo-hydroxyle en position 6 de l'entité aminocyclitol de la néomy- 30 mycine C.

cine, ce qui correspond à la déoxy-6 néomycine, ne modifie pas On a étudié l'activité antibactérienne de la déoxy-6 néo-

de façon significative l'activité antibactérienne globale de la mycine B et de la déoxy-6 néomycine C par la même méthode néomycine. que celle décrite ci-dessus en utilisant de l'agar D.S.T. comme

On remarquera que l'activité antibactérienne de la déoxy-6 milieu nutritif.

35 La C.I.M. a été enregistrée en comparaison avec la néomycine et la déoxy-6 néomycine:

Tableau II Organisme

Escherichia coli Bristol c-à-d NCIB 11351 Proteus mirabilis c-à-d NCIB 11355

Staphylococcus aureus c-à-d ATCC 9144 Salmonella typhy-murium c-à-d ATCC 19585

(xg/ml requis pour empêcher le développement néomycine néomycine néomycine déoxy-6

0,62

1,25

0,62

2,5

B

0,62

1,25

0,62

2,5

déoxy-6 déoxy-6

neomycine neomycme neomycme B C

80

10

80

40

2,5

2,5

2,5

10

20

20

On peut conclure, à partir de ces résultats, que la déoxy-6 néomycine B est quelque peu moins active que la néomycine B mais que la déoxy-6 néomycine C est plus puissante que la néomycine C.

c) Activité du mélange de didéoxy-3', 4'néomycine et ses dérivés

L'activité antibactérienne du mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés a été déterminée selon le procédé décrit ci-dessous.

On incube D- Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 à 30° C sur une plaque d'agar nutritif contenant 50 (ig/ml d'un mélange de gentamines de formule IIB. Après trois jours, on recouvre la plaque par de l'agar ensemencé d'un organisme à tester et on observe la production d'antibiotique par une zone d'inhibition autour du Streptomyces. On mesure 60 cette zone d'inhibition et on la compare avec celle d'un contrôle constitué uniquement d'agar nutritif.

Comme comparaison, un test semblable a également été effectué avec 50 [ig/ml de néamine en addition à l'agar nutritif au lieu du mélange de gentamines de formule IIB et en utilisant 65 aussi D - Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484. On a trouvé que l'antibiotique ainsi produit correspond à la néomycine.

Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau suivant:

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Tableau IH

Organisme

Escherichia coliPT2

Escherichia coli ML 1629

c-à-d NCIB 11354

Escherichia coli ML 1410

c-à-d NCIB 11353

Escherichia coli JR 66

c-à-d NCIB 11352

Zone d'inhibition (en mm) lorsque l'agar nutritif est additionné de:

Rien Néamine Mélange de gentamines de formule III

11

0

0

25

20

25

Ces résultats montrent que le mélange de didéoxy-3',4' néomycine et ses dérivés est actif à l'égard d'organismes qui sont résistants à la néomycine. On mentionnera, par ailleurs, que l'organisme E. coli PT2 est également résistant à la gentamicine.

Les compositions thérapeutiques peuvent être présentées sous toutes formes convenant à l'administration en thérapie humaine ou vétérinaire. Pour ce qui concerne les unités d'administration, celles-ci peuvent prendre la forme, par exemple, d'un comprimé dragéifié ou non, d'une capsule, d'une gélule, d'une suspension ou d'un sirop pour l'administration orale.

Les compositions thérapeutiques peuvent également être présentées sous forme d'un suppositoire pour l'administration rectale, d'un ovule pour l'administration vaginale, d'une solution ou d'une suspension pour l'administration parentérale ou d'une crème ou d'un onguent pour l'administration topique.

Quelle que soit la voie d'administration choisie, les compositions thérapeutiques seront préparées en mettant en association au moins un des composés de formule I avec un véhicule pharmaceutique ou un excipient approprié.

Les Exemples non limitatifs suivants illustrent la préparation des composés de formule I:

Exemple 1

Préparation de la déoxy-6 néomycine base et de son sulfate, a) Déoxy-6 néomycine sous forme de base libre

Dans un ballon, on réalise une culture de la souche D" Streptomyces fradiae ATCC 21401 pendant 48 heures sur le milieu suivant préalablement ajusté à pH 7,2-7,3:

g

Glucose 1

Hydrolysat de caséine 1

(NH4)2HP04 1

MgS04 • 7H20 0,05

FeS04-7H20 0,005

CuS04 • 5H20 0,005

CaC03 1

Eau jusque 100 ml

On secoue et maintient cette culture à 28° C durant la période de temps indiquée ci-dessus. On ajoute alors une concentration à 10% de l'inoculum de la culture au milieu nutritif suivant ajusté à pH 7,2 à 7,3:

On incube des cultures dans des flacons Erlenmeyer à 28° C à 30° C et on les secoue, sous bonne aération, sur un appareil rotatif.

La production de déoxy-6 néomycine débute après 2 jours 5 et est maximale après 5 jours.

Des cultures de contrôle ne contenant pas de dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine ne produisent pas de déoxy-6 néomycine.

On centrifuge alors le milieu de culture et on verse le liquide io surnageant dans une colonne contenant une résine échangeuse de cations faiblement acide, de type carboxylique (polyméth-acrylique) et de porosité moyenne (Amberlite IRC-50, Amber-lite est une marque déposée), cette résine étant sous forme ammonium.

i5 On réalise deux fois cette opération pour extraire la déoxy-6 néomycine et le dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine intact. On lave la colonne avec de l'eau et on élue la déoxy-6 néomycine avec une solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium 2N. On concentre l'éluat sous vide au moyen d'un évapo-20 rateur rotatif puis on le verse dans une colonne Sephadex G-10. En éluant avec une solution 0,1 molaire d'hydroxyde d'ammonium, on obtient la déoxy-6 néomycine dans les premières fractions et le dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine dans les fractions suivantes.

25 De cette manière, on produit une quantité de déoxy-6 néomycine sous forme de base libre représentant 83 unités d'activité (1 unité = 1 (ig/ml de néomycine). Ce résultat correspond à l'incorporation dans la déoxy-6 néomycine ainsi obtenue d'environ 22% du dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine initial.

Ce chiffre représente l'activité maximum obtenue et une incubation ultérieure ne fournit plus de déoxy-6 néomycine.

Suivant une alternative, on purifie la déoxy-6 néomycine brute par Chromatographie sur papier Whatman N° 3 MM développée avec une solution 4/1 de méthanol/hydroxyde d'ammonium. On localise la déoxy-6 néomycine au moyen d'une solution aqueuse à 0,25% d'hypochlorite de sodium, ensuite avec de l'éthanol absolu et enfin avec une solution aqueuse à 1 % d'amidon soluble et à 1 % d'iodure de potassium, chaque application étant séparée par un séchage à l'air.

Dans cet essai, le Rf de la déoxy-6 néomycine est égal à 0,30.

A des fins de comparaison, on mentionnera que les Rf de la néomycine, de la déoxy-2 streptamine et de la didéoxy-2,4 streptamine avec le même système de solvants sont:

30

35

45

Néomycine Déoxy-2 streptamine Didéoxy-2,4 streptamine

55

Glucose

Farine de graines de soya Extrait de levure NaCl CaC03

Dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine Eau jusque 100 ml g 1

2,5 0,5 0,5 0,2 0,025

Rf 0,26 0,58 0,62

60

b) Sulfate de déoxy-6 néomycine

On convertit la déoxy-6 néomycine obtenue comme décrit ci-dessus, en son sulfate par réaction avec la quantité équivalente d'acide sulfurique dilué.

[a] ^ du sulfate de déoxy-6 néomycine: +43° (c= 1,0; eau)

c) Structure de la déoxy-6 néomycine

On a déterminé la structure du composé antibiotique de formule I sous forme de base libre obtenu précédemment par comparaison avec l'antibiotique naturel, néomycine, formé lorsqu'on incube la déoxy-2 streptamine dans le milieu approprié. Le produit présumé déoxy-6 néomycine sera dénommé ci-après Composé X.

La méthanolyse de la néomycine ainsi que celle du Composé X au moyen d'une solution méthanolique à 10% de chlorure d'hydrogène pendant deux heures au reflux, fournit deux pro-

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8

duits principaux, l'un d'entre eux correspondant à la méthylnéo-biosaminide produite à partir des deux composés.

L'autre produit appelé par la suite Z, est différent chez les deux antibiotiques, le Composé Z obtenu à partir de la néomycine migrant moins que le produit Z obtenu à partir du Composé X au cours d'un essai de Chromatographie en utilisant une solution 4/1 de méthanol/hydroxyde d'ammonium comme solvant.

On a confirmé la structure de chaque produit Z par spectro-métrie de masse des dérivés per-triméthyl-silyles.

Bien qu'il ne soit pas possible d'obtenir les ions moléculaires, le spectre du produit Z obtenu à partir de la néomycine et celui du produit Z obtenu à partir du Composé X sont très semblables à cette différence près que deux pics du spectre du premier (m/e 343 et 460) sont déplacés en arrière de 88 unités de masse chez le second (m/e 255 et 372).

Ceci correspond à une perte de OSi(CH3)3 et à un remplacement par l'hydrogène.

La structure du produit Z, obtenu à partir de la néomycine correspond donc à la néamine et la structure du produit Z, obtenu à partir du Composé X, correspond à la déoxy-6 néamine.

L'acétylation des deux produits Z dans le méthanol suivie d'une hydrolyse acide avec une solution d'acide chlorhydrique 3N au reflux pendant 10 heures, fournit, dans chaque cas, deux produits principaux. Lors d'une Chromatographie sur papier, il apparaît qu'un de ces produits est le même dans les deux cas, qu'il soit obtenu à partir du produit Z de la néomycine ou du produit Z du Composé X. Ce produit commun doit être considéré comme correspondant au diamino-2,6 didéoxy-2,6 D-glucose. Quant aux deux autres composés, ceux-ci sont, en Chromatographie, identiques l'un à la déoxy-2 streptamine obtenue à partir de la néamine, l'autre à la didéoxy-2,4 streptamine à partir de la déoxynéamine.

Ces résultats amènent à conclure que le Composé X correspond à la déoxy-6 néomycine.

Exemple 2

Séparation de la déoxy-6 néomycine en déoxy-6 néomycine B et déoxy-6 néomycine C.

On sépare la déoxy-6 néomycine, obtenue suivant la méthode décrite dans l'Exemple 1, en déoxy-6 néomycine B et déoxy-6 néomycine C par Chromatographie sur papier en utilisant un mélange 3/16/6/1 de tertbutanol/butanone/solution d'hydroxyde d'ammonium 6,5 N/méthanol comme solvant.

On détecte la déoxy-6 néomycine B et la déoxy-6 néomycine C sur le papier en utilisant la même méthode que celle décrite précédemment.

En utilisant comme système de solvants le méthanol et l'hydroxyde d'ammonium dans la proportion 4 à 1 sur papier chromatographique 3 MM Whatman, on a déterminé les valeurs de Rf des déoxy-6 néomycines B et C en comparaison avec les épimères correspondantes de la néomycine et on a obtenu les résultats suivants:

Farine de graines de soya Hydrolysat de caséine CaC03 ; Glucose NaCl NH4C1

Eau jusqu'à 100 ml g 1

0,25

0,5

1

0,5 0,167

10

15

30

35

On secoue et maintient cette culture à 28° C durant la période de temps indiquée précédemment. On ajoute alors une concentration à 10% de l'inoculum de cette culture à un milieu identique à celui cité précédemment mais contenant en supplément 0,025 g de dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine.

On incube des cultures dans des flacons Erlenmeyer à 28° à 30° C et on les secoue, sous bonne aération, sur un appareil rotatif.

Les opérations ultérieures de préparation et de purification de la déoxy-6 paromomycine sont exactement les mêmes que celles décrites à l'Exemple la ci-dessus.

Une purification par Chromatographie sur papier dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'Exemple 1 précédent montre que le Rf de la déoxy-6 paromomycine est de 0,30.

A des fins de comparaison, on mentionnera que le Rf de la paromomycine dans un essai chromatographique identique est de 0,27.

En utilisant comme système de solvants le méthanol et l'hydroxyde d'ammonium dans la proportion 4 à 1 sur papier chromatographique 3 MM Whatman, on a déterminé les valeurs de Rf des déoxy-6 paromomycines I et II en comparaison avec les épimères correspondants de la paromomycine et on a obtenu les résultats suivants:

Déoxy-6 paromomycine I Déoxy-6 paromomycine II Paromomycine I Paromomycine II

0,34 0,275 0,3 0,22

45

50

55

Déoxy-6 néomycine B Déoxy-6 néomycine C Néomycine B Néomycine C

0,29 0,21 0,25 0,165

Exemple 3

Préparation de la déoxy-6 paromomycine ainsi que de ses épimères I et II.

Dans un ballon, on réalise une culture de la souche D~ Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 pendant deux à trois jours sur le milieu suivant préalablement ajusté à pH 7,5:

65

Exemple4

Préparation du mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés a) Mélange de gentamines de formule IIB

On prépare d'abord un mélange de gentamines de formule IIB à partir du sulfate de gentamicine commercialisé. Dans un premier temps, on convertit ce sel en sa base libre puis on évapore pour obtenir une huile. On ajoute, à cette huile, une solution d'acide chlorhydrique dans le méthanol, préparée par addition d'acide chlorhydrique à du méthanol sec, et on porte au reflux, pendant deux heures, la solution ainsi obtenue. On élimine l'acide chlorhydrique méthanolique sous vide et on reprend l'huile résultante, dans un peu d'eau. On passe alors cette solution au travers d'une colonne d'Amberlite I.R.A. 400 pour obtenir la base libre des gentamines désirées. On évapore à sec les différentes fractions ainsi recueillies et on les sépare d'une part en méthyl garosaminide et d'autre part en mélange de gentamines par Chromatographie sur gel de silice en utilisant un mélange 1/1/1 de méthanol/chloroforme/hydroxyde d'ammonium comme solvant. Dans cette séparation chromatographique, le Rf du méthyl garosaminide est de 0,8 et celui du mélange de gentamines est de 0,2.

b) Mélange de didéoxy-3',4' néomycine et ses dérivés

Dans un ballon, on réalise une culture de la souche D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 pendant deux à trois jours sur le milieu suivant préalablement ajusté à pH 7,5:

9

620 944

g

Farine de graines de soya 1

Hydrolysat de caséine 0,25

CaCo3 0,5

Glucose 1

NaCl 0,5

NH4C1 0,167

On secoue et maintient cette culture à 28° C durant la période de temps mentionnée précédemment. On ajoute alors une concentration à 10% de l'inoculum de cette culture à un milieu identique à celui cité ci-dessus et ajusté à pH 7,2 mais contenant en supplément 50 [xg du mélange de gentamines obtenu précédemment.

On incube des cultures dans des flacons Erlenmeyer à 30° C

et on les secoue, sous bonne aération, sur un appareil rotatif durant 5 jours. On purifie le mélange de didéoxy-3',4' néomycine et ses dérivés, obtenu sous forme brute par Chromatographie sur papier en utilisant du papier Whatman N° 3 MM 5 développée avec une solution 4/1 de méthanol/hydroxyde d'ammonium. On détermine la localisation du mélange de didéoxy-3',4' néomycine et ses dérivés au moyen d'hypochlorite de sodium à 0,25 % dans l'eau, ensuite avec de l'éthanol absolu suivi d'une solution aqueuse à 1 % d'amidon soluble et à 1 % 10 d'iodure de potassium en séchant à l'air entre chaque application.

Dans cet essai, le Rf du mélange de didéoxy-3',4' néomycine et ses dérivés est de 0,25.

A des fins de comparaison, on mentionnera que le Rf du 15 mélange de gentamines de formule IIB dans un essai chromatographique identique se situe entre 0,5 et 0,7.

C

Claims (6)

1. 620 944

   2

   REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de nouveaux dérivés aminoglyco-sides d'aminocyclitol correspondant à la formule générale:

   CH OH

   OR

   10

   (I)

   OH

   dans laquelle Rt et R2, qui sont différents, représentent de l'hydrogène ou un groupe ch2 nh2, et R est choisi parmi les groupements:

   'H

   dans lesquels R3 représente nh2 ou oh et R4 représente

   R5 ch3

   I I

   -c h—nh2 ou —c h—nhch3, R5 représentant de l'hdydrogène ou un groupe méthyle, ainsi que leurs sels d'addition non toxiques, caractérisé en ce que l'on cultive un mutant déoxy-streptamine négatif de Streptomyces dans un milieu nutritif contenant un hydrate de carbone soluble, une source d'azote assimilable, des sels minéraux essentiels et un composé de formule

   NH,

   YO

   NH,

   HO

   (IIA)

   X

   ou un sel d'addition d'acide de ce composé, formule dans laquelle X=Y=H, ou bien X = -OH et Y = un groupement de formule

   (IIB)

   ces fradiae ATCC 21401 ou D~ Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 ou de ses sels quand x=h, et

   35 D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 lorsque x = -oh, la base libre ainsi obtenue étant, par la suite, traitée, si on le désire, avec un acide organique ou inorganique pour obtenir un sel d'addition d'acide non toxique.
2. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que D"

   40 Streptomyces fradiae ATCC 21401 est cultivé en présence de didéoxy-2,4 streptamine ou d'un de ses sels d'addition pour obtenir le déoxy-6 néomycine sous forme de base libre.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que

   45 D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 dichlorhydrate de didéoxy-2,4 streptamine pour obtenir la déoxy-6 néomycine sous forme de base libre.
4. 4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que D- Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484

   so est cultivé en présence du mélange de gentamines pour obtenir le mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés, sous forme de base libre.
5. 5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'acide organique est l'acide sulfurique.

   55 6. Déoxy-6 néomycine telle que préparée selon le procédé de la revendication 2.
6. 7. Mélange de didéoxy-3', 4' néomycine et ses dérivés tel que préparé selon le procédé de la revendication 4.

   60

   65 La présente invention se rapporte à un procédé de prépara-ou un sel d'addition d'acide de ces composés, pour obtenir, sous tion de nouveaux dérivés aminoglycosides d'aminocyclitol ayant forme de base libre, les composés de formule I, ledit mutant une activité pharmacologique lesquels peuvent être représentés déoxystreptamine négatif de Streptomyces étant D~ Streptomy- par la formule générale:

   620 944

   (I)

   dans laquelle Rj et R2, qui sont différents, représentent hydrogène ou CH2 NH2 et R est choisi parmi les groupements:

   (A)

   NEL

   (B)

   dans lesquels R3 représente NH2 ou OH et R4 représente R, CH3

   l'I

   CH-NH2 ou CH-NHCH3 dans lequel R5 représente hydrogène ou méthyle.