PL104557B1 - Sposob wytwarzania nowych aminoglikozydowych pochodnych aminocyklitolu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych aminoglikozydowych pochodnych aminocyklito¬ lu o ogólnym wzorze 1, w którym Rx i R2 rózniace sie miedzy soba, oznaczaja atom wodoru lub grupe -CH2NH2, a R oznacza grupe o wzorze 4 lub 5, w których R3 oznacza grupe -NH2 lub OH, a R4 oznacza grupe -CH(R5)-NH2 lub -CH(CH3)*NHCH3, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami.

Zwiazki o wzorze 1 wykazuja czynnosc farmakologiczna i moga istniec w postaci epimerów i mieszanin epimerów. Sposób wedlug wynalazku obejmuje równiez wytwarzanie powyzszych postaci zwiazków o wzorze 1.

Zwiazki o wzorze 1 maja budowe chemiczna podobna do budowy neomycyny lub paromomycyny i dlate¬ go w dalszej czesci opisu okresla sie je jako nastepujace pochodne neomycyny lub paromomycyny: 6-dezoksyneomycyna B, gdy we wzorze 1 Rj oznacza atom wodoru, R2 oznacza grupe -CH2NH2 aR oznacza grupe o wzorze 4, w którym R3 pznacza grupe NH2, 6-dezoksyneomycyna C, gdy we wzorze 1 Rj oznacza grupe -CH2NH2, R2 oznacza atom wodoru aR oznacza grupe o wzorze 4, w którym R3 oznacza grupe -NH2.

Mieszanine tych dwóch epimerów, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, okresla sie dalej jako 6-dezoksyneomycyne. 6-dezoksyparomomycyna I, gdy we wzorze 1 R2 oznacza atom wodoru, R2 oznacza grupe -CH2NH2 a R oznacza grupe o wzorze 4, w którym R3 oznacza grupe -OH, 6-dezoksyparomomycyna II, gdy we wzorze 1 Rj oznacza grupe -CH2NH2, R2 oznacza atom wodoru, a R oznacza grupe o wzorze 4, w którym Rs oznacza grupe -OH.

Mieszanine tych dwóch epimerów, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku okresla sie dalej jako 6-dezoksyparomomycyne.

Okreslenie „mieszanina 3', 4'-dwudezoksyneomycyny ijej pochodnych" oznacza nierozdzielona miesza¬ nine zwiazków o wzorze 1, w którym Ri iR2, rózniace sie miedzy soba oznaczaja atom wodoru lub grupe -CH2NH2, a R oznacza grupe o wzorze 5, przy czym mieszanine te wytwarza sie sposobem wedlug wynalazku.

Okreslenie „neomycyna" oznacza mieszanine neomycyny B i neomycyny C, otrzymana z hodowli Strepto-2 104557 myces fradiae. Podobnie, okreslenie „paromomycyna" oznacza mieszanine paromomycyny I i paromomycyny II, otrzymana z hodowli Streptomyces rimosus forma paromomycinus.

Zwiazki o wzorze 1 znajduja zastosowanie jako zasadnicze skladniki aktywne srodków farmaceutycznych i srodków do leczenia zwierzat, które zawieraja co najmniej jeden z epimerów o wzorze 1 lub jego farmaceutycz¬ nie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem badz mieszanine epimerów o wzorze 1 lub ich farmaceutycznie do¬ puszczalnych soli addycyjnych z kwasami oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik lub zaróbke.

Jak wykazano dalej, aminoglikozydowe pochodne aminocyklitolu o wzorze 1 wykazuja cenne wlasciwosci antybiotyczne, co czyni je przydatnymi do leczenia chorób, wywolywanych przez bakterie chorobotwórcze, takie jak np. Escherichia coli, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Klebsiella edwardsii, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium.

Zwiazki o wzorze 1 przeciwdzialaja rozwojowi bakterii chorobotwórczych w ciele zywiciela i w przypadku potrzeby zwalczania bakterii chorobotwórczych podaje sie zywicielowi co najmniej jeden z epimerów zwiazku o wzorze 1, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól z kwasem badz mieszanine epimerów zwiazku o wzorze 1 lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami.

Od pewnegp czasu obserwuje sie rozwój odpornosci pewnych szczepów bakterii na dzialanie wiekszosci antybiotyków dostepnych w handlu, co obniza wartosc tych antybiotyków jako leków o wiecej niz polowe, a niektóre bakterii sa nawet wystarczajaco uodpornione, aby zniesc dzialanie wszystkich znanych antybiotyków.

Wiadomo, ze oslabienie dzialania antybiotyku powodowane jest zniszczeniem lub zmiana czasteczki anty¬ biotyku przez enzymy, które atakuja pewne podatne miejsca tej czasteczki. Zwlaszcza antybiotyki stanowiace aminoglikozydowe pochodne aminocyklitoli, stosowane na coraz wieksza skale, sa sklonne do inaktywacji przez odporne bakterie. Uodpornienie osiagniete przez pewne drobnoustroje, które normalnie sa wrazliwe na dzialanie antybiotyków stanowiacych aminoglikozydowe pochodne aminocyklitolu powodowane jest dzialaniem fosfory- lujacym, acylujacym lub adenylylujacym enzymów atakujacych wolne grupy hydroksylowe i aminowe antybioty¬ ku (Ann. Rev, Biochem., 42,47, 1973).

Usuniecie grup hydroksylowych powoduje uodpornienie tych miejsc czastek antybiotyku na inaktywacje.

Dlatego pozadane jest wytwarzanie antybiotyków o mniejszej ilosci mniej waznych grup hydroksylowych lub aminowych.

Podczas prób, prowadzonych ze zwiazkami o wzorze 1, stwierdzono, ze mieszanina 3', 4'-dwudezoksyne- omycyny i jej pochodnych wykazuje znaczne dzialanie antybiotyczne wobec drobnoustrojów uodpornionych na dzialanie innych antybiotyków stanowiacych aminoglikozydowe pochodne aminocyklitolu, a zwlaszcza neomy¬ cyny i gentamycyny.

I tak wykazano, ze mieszanina 3', 4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych wykazuje skuteczne dziala¬ nie wobec szczepów Escherichia coli, o których wiadomo, ze sa odporne na dzialanie gentamycyny i neomycyny ze wzgledu na dzialania, odpowiednio, enzymu 2" — adenylylujacego i enzymu 3'-fosforylujacego. Dlatego mie¬ szanina 3', 4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych opisana poprzednio i objeta wzorem 1 stanowi korzystny antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wynalazku.

Z opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 3669838 wiadomo, ze mutanty drobnoustrojów, znane z tego, ze wytwarzaja antybiotyki zawierajace w czasteczce czlon aminocyklitolu, takie jak np. neomycyna lub paromomy¬ cyna, mozna otrzymac w postaci, która nie wykazuje zdolnosci do biosyntezy czlonu aminocyklilolu, a to ze wzgledu na defekt w kierowanym przez nia przebiegu reakcji prowadzacej do wytwarzania aminocyklitolu tak, ze nie mozna wytworzyc antybiotyku.

Jednak takie mutanty negatywne jesli chodzi o wytwarzanie aminocyklitolu maja zdolnosc do wykorzysty¬ wania odpowiedniej czasteczki aminocyklitolu dodanej do pozywki, tak ze moga wytwarzac antybiotyk. Wiado¬ mo, ze sposób ten mozna wykorzystywac do podstawiania pseudodwucukru do czlonu aminocyklitolu.

Na podstawie znanego stanu techniki nie mozna jednakze przewidziec, czy okreslony dwuaminocyklitol lub pseudodwucukier bedzie, przy zastosowaniu tego sposobu, wlaczany do czasteczki wytwarzanego antybiotyku.

W literaturze opisano wiele przypadków, gdy ten sposób wytwarzania nowych antybiotyków zawodzi.

Takwiec, opisanego znanego sposobu nie mozna uogólnic w odniesieniu do wytwarzania nowych pólsyn- tetycznych lub syntetycznych antybiotyków. Potwierdza to np. publikacja w The Journal of Antibiotics, Vol XXII No 10, str. 551—561 (1973), w której opisano próby wprowadzenia do czasteczki antybiotyku 29 róznych aminocyklitoli sposobem opisanym we wspomnianym opisie patentowym St. Zjedn. Am. Stwierdzono, ze sposród 29 badanych aminocyklitoli tylko streptamina i 2-epistreptamina zostaly wprowadzone w sklad czasteczki antybiotyku przez stosowanie w tym celu 2-dezoksystreptamino-negatywne (D") mutanty Strepto¬ myces fradiae, Streptomyces rimosus forma paromomyciuns i Streptomyces kanamyceticus.

Podobnie, dwuaminocyklitole wymienione we francuskim opisie patentowym nr 2203808 nie zostaja wpro-104557 3 wadzone do czasteczki antybiotyku przy zastosowaniu tych samych D" mutantów S.Fradiae i S.rimosus forma paromomyciuns jak w publikacji omówionej poprzednio.

W publikacji „Biochemistry", tom 13 nr 25. str. 5073-5078 (1974) podano, ze nie uzyskano pozytywnych wyników, próbujacy wprowadzic do czasteczki antybiotyku pseudodwucukry znane jako neamina, paromamina lub 6-kanosaminido-2- dezoksystreptamina przy uzyciu D" mutantów takich jak S. fradiae, S. rimosus forma paromomycinus i S.kanamyceticus.

Podobnie, „The Journal of Antibiotics", tom XXVIII nr 8 str. 573-579 (1975) podaje, ze gentaminy, które sa pseudocukrami, nie daja sie wbudowac w czastke antybiotyku przy uzyciu D" mutanta Micromono- spora inyoensis.

Stwierdzono, tez, ze 5-0- D-rybopiranozylo-2,4- dwudezoksystreptamina jest nieprzydatna do wytwarzania antybiotyków sposobem opisanym poprzednio przy uzyciu D~ mutantów S.fradiae i S.rimosus forma paromo- mycimus.

Wczesniejsze publikacje wskazuja równiez, ze dwuaminocyklitole lub pseudodwucukry wystepujace w zna¬ nych antybiotykach, takich jak streptomycyna, bluensomycyna ihygromycyna nie moga byc wlaczone do czasteczki antybiotyków za pomoca poprzednio wymienionych mutantów.

Na przyklad w „The Journal of Antibiotics" tom XXVI nr 10, w wymienionej poprzednio publikacji poda¬ no, ze bluensamina, streptydyna, bluensydyna, hyosamina i aktynamina nie zostaja wbudowane do czasteczek antybiotyków, gdy uzywa sie w tym celu D" mutantów S.fradiae, S.rimosus forma paramomycinus i S.kanamy- ceticus.

Podobnie, neamina i paromamina, których obecnosc stwierdzono odpowiednio w czasteczkach neomycyny i paromomycyny, nie ulegaja wbudowaniu do czasteczek antybiotyków, gdy stosuje sie D" mutant S.fradiae (patrz wspomniana poprzednio publikacja w „Biochemistry").

Stwierdzono takze, ze dwuaminocyklitol lub pseudodwucukier, który moze zostac wbudowany do czasteczki antybiotyku przy uzyciu odpowiedniego mutanta sposobem ujawnionym we wspomnianym poprzed¬ nio opisie patentowym St. Zjedn. Am., nie musi byc wbudowywany do czasteczki antybiotyku przez inny mutant tego samego szczepu. Przyklady takie podano we wspomnianej publikacji w „The Journal of Antibiotics" tom XXVI nr 10, wskazujac, ze D" mutant S.rimosus forma paromomycinus z 2-epistreptamina nie wytwarza zadnego antybiotyku, podczas gdy D" mutanty S.fradiae i S.kanamyceticus zdolne sa do wprowadzania tego czlonu do czasteczek wytwarzanych antybiotyków. Ponadto ten sam D" mutant S.kanamyceticus ze streptamina nie wytwarza zadnego antybiotyku, podczas gdy D" mutant S.fradiae i S.rimosus forma paromomycinus wpro¬ wadzaja ten dwuaminocyklitol do czasteczek wytwarzanych antybiotyków.

Jesli chodzi o neamine, to ten pseudodwucukier moze tworzyc rybostamycyne przy uzyciu D" mutanta S.ribosidificus, jak opisano w „The Journal of Antibiotics" tom XXVI, nr 12, str. 784-785 (1973), podczas gdy neamina nie zostaje wlaczona do czasteczki antybiotyku, gdy stosuje sie np. D~ mutant S.fradiae.

Wczesniejsze publikacje wskazuja równiez, ze w zadnym przypadku nie mozna przewidziec struktury hipo¬ tetycznego antybiotyku gdy stosuje sie dwuaminocyklitol lub pseudodwucukier wraz z okreslonym mutantem szczepu. Wskazano to wyraznie w wymienionej poprzednio publikacji w „The Journal of Antibiotics" tom XXVI nr 12, gdzie ujawniono, ze antybiotyki, otrzymane wówczas gdy stosuje sie D" mutant S.kanamyceticus razem z 1-N-metylodezoksystreptarnina lub myoinoza-l,3-dwuamina, „nie sa oczekiwanymi produktami" lecz innymi zwiazkami. Podobnie, neamina i D" mutant M.inyoensis powoduja utworzenie sisomycyny, lecz ten sam mutant z paromamina, innym pseudodwucukrem, równiez wytwarza sisomycyne (wspomniana poprzednio publikacja w „Thejournalof Antibiotics", tom XXVIII nr 8).

Wykazano takze, ze D~ mutant S.ribosidificus w obecnosci samej neaminy daje rybostamycyne a nie, jak mozna oczekiwac, analog neomycyny („The Journal of Antibiotics, tom XXVI nr 12, wymieniona poprzednio).

Jak wynika z przedstawionego stanu techniki, w sposobie wedlug opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 3669858 nie mozna z cala pewnoscia przewidywac ewentualnego wlaczenia okreslonego dwuaminocyklitolu lub pseudodwucukru do czasteczki antybiotyku, przy zastosowaniu okreslonego mutanta szczepu. W zadnym razie nie mozna przewidziec, czy sposób ten bedzie nadawac sie do zastosowania lub jaka bedzie dokladnie budowa antybiotyku, którego wytwarzania mozna oczekiwac.

Dlatego stwierdzenie, podane wJ.Org.Chem. tom 40 nr 4, str.456-461 (1975), ze 2,4-dwudezoksystre¬ ptamina moze byc wprowadzana do czastek neomycyn, paromomycyn i rybostamycyny na drodze przemiany biologicznej nalezy uznac za zbyt niejasne, nieokreslone i pozbawione zasadniczych podstaw.

Nieoczekiwanie stwierdzono, ze 2,4-dwudezoksystreptamina daje sie wprowadzic do nowych antybioty¬ ków, gdy stosuje sie D" mutanty S.fradiae i S.rimosus forma paramomycinus, i ze do czasteczek nowych anty¬ biotyków wytwarzanych przez D" mutant S.rimosus forma paramomycinus mozna równiez wprowadzic miesza-4 104557 nine pseudodwucukrów, to jest mieszanine gentamin.

Jest to tym bardziej nieoczekiwane, jesli wziac pod uwage fakt, ze w próbach z 2,4-dwudezoksystreptarnina w obecnosci D" mutanta S.kanamyceticus nie powstaje zaden antybiotyk i ze ET mutant S.fradiae nie ma zdol¬ nosci wlaczania mieszaniny omawianych gentamin do czasteczki antybiotyku.

Wszystkie wyniki, uzyskane z 2,4-dwudezoksystreptamina i mieszanina gentamin wskazuja, ze sposób wedlug wynalazku calkowicie jest nieoczekiwany w swietle stanu techniki.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze nowe aminoglikozydowe pochodne aminocyklitolu o wzorze 1, w którym R, Ri iR2, maja poprzednio podane znaczenie oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole addy¬ cyjne z kwasem wytwarza sie, hodujac dezoksystreptaminonegatywny mutant Streptomyces w odpowiedniej pozywce, zawierajacej rozpuszczalny weglowodan, zródlo przyswajalnego azotu, podstawowe sole mineralne oraz albo 1D-(1»3,5(2>1,5- dwuaminocykloheksanodiol-2,3 lub 2,4-dwudezoksystreptamine o wzorze 2, ewentu¬ alnie jej sól addycyjna, np. dwuchlorowodorek, albo mieszanine gentamin o ogólnym wzorze 3, w którym R4 ma poprzednio podane znaczenie lub jej soli addycyjnej z kwasem.

W sposobie wedlug wynalazku antybiotyk otrzymuje sie w postaci wolnej zasady, niezaleznie od tego, czy dwuaminocyklitol o wzorze 2 lub mieszanine gentamin o wzorze 3 stosuje sie w postaci wolnej zasady czy w postaci soli. Gdy pozadane jest otrzymywanie antybiotyku w postaci soli, wystarczy poddac go reakcji z od¬ powiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym, takim jak np. kwas siarkowy, wytwarzajac farmaceutycz¬ nie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem.

Jako drobnoustroje w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie ET Streptomyces fradiae ATCC21401 iD" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484, opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 3669838. D" Streptomyces fradiae ATCC 21401 stosuje sie do wytwarzania 6-dezoksyneomycyny, a D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 stosuje sie do wytwarzania 6-dezoksyparomo- mycyny i mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych.

Drobnoustrój hoduje sie w znany sposób w pozywce o odpowiedniej wartosci pH i zawierajacej np. glu¬ koze, hydrolizat kazeiny, (NH4)2 HP04, MgS04v7H20, FeS04-7H20, CuS04-5H20, CaC03, a nastepnie wprowadza do nowej pozywki hodowlanej, zawierajacej dwuaminocyklitol o wzorze 2 lub mieszanine gentamin o wzorze 3, w postaci wolnej zasady lub soli addycyjnej z kwasem, i np. make sojowa, ekstrakt drozdzy, NaCl CaCOj i glikoze, o odpowiedniej wartosci pH. Hodowle inkubuje sie w temperaturze 28-30°C z wytrzasaniem i dobrym napowietrzaniem w ciagu co najmniej 5 dni, aby uzyskac optymalne wytwarzanie zadanej 6-dezoksy¬ neomycyny, 6-dezoksyparomomycyny lub mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych. 6-dezoksyneomycyne B i 6-dezoksyneomycyne C jak równiez 6-dezoksyparomomycyne I i 6-dezoksyparo- momycyne II otrzymuje sie, odpowiednio z 6-dezoksyneomycyny i 6-dezoksyparomomycyny w znany sposób, np. przez rozdzielanie ich na drodze chromatografii bibulowej.

Izomery stanowiace mieszanine 3\4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych równiez mozna rozdzielac w znany sposób.

Dwuaminocyklitol o wzorze 2 jest znanym zwiazkiem opisanym w brytyjskim opisie patentowym nr 1445675. Mozna go wytworzyc sposobem opisanym we wspomnianym brytyjskim opisie patentowym przez uwodornienie w obecnosci katalizatora, np. niklu Raney'a lD-(l,3,5/2)-l,5- dwuazydocykloheksandiolu-2,3, otrzymywanego z lL-l,5-dwu-0-tosylo-1,2,5/3- cykloheksantetrolu i azdyku sodu.

Mieszanine gentamin o wzorze 3 wytwarza sie z*dostepnego w handlu siarczanu gentamycyny sposobem opisanym przez Coopera i innych w J.Chem.Soc. (c), 1971, 960.

Jak stwierdzono poprzednio, aminoglikozydowe pochodne aminocyklitolu wytwarzane sposobem wedlug wynalazku odznaczaja sie znaczna czynnoscia antybiotyczna. Czynnosc te wobec róznych testowych drobno¬ ustrojów przedstawiaja ponizsze dane. a) Dzialanie przeciwbakteryjne 6-dezoksyneomycyny i 6-dezoksyparomomycyny Badano czynnosc antybiotyczna tych zwiazków, dodajac odmierzona ilosc badanego zwiazku w sterylnej wodzie do pozywki agarowej. Nastepnie agar, zawierajacy wzrastajace stezenia badanych zwiazków wylewano do szalek Petriego i kazda z nich szczepiono mechanicznie z multinokulatora szeregiem róznych drobnoustrojów, hodowanych poprzednio w odpowiedniej pozywce i przechowywanych w temperaturze —20°C w mieszaninie pozywki wzrostowej i gliceryny w stosunku 1:1. Szalki inkubowano wciagu 14 godzin w temperaturze 37°C a nastepnie badano wzrost drobnoustrojów. Nastepnie notowano stezenie antybiotyku, hamujace wzrost bakterii okreslane jako minimalne stezenie hamujace (MIC).

Wyniki uzyskane w tej próbie podano w tablicy I, w porównaniu z neomycyna i paromomycyna, obu w po¬ staci siarczanów. Dane w tablicach I i II odnosza sie do ilosci wolnej zasady.}04557 5 Tablica I Drobnoustrój (a) Escherichia coli W 3110, ATCC 27325 Proteus mirabilis NCIB 11355 Staphylococcus aureus ATCC 9144 Sarcina lutea NCIB 11356 Klebsiella edwardsii Shigella sonnei C 631978, NCIB 11357 Salmonella typhi murium LT 2, ATCC 19585 Stezenie w jug/ml zapobiegajace wzrostowi neomycy¬ na 2,5 ,0 2,5 2,5 7,5 2,5 ,0 6-dezoksy- neomycyna 1,25 ,0 3,75 2,5 3,75 ,0 paromo- zycyna ,0 1,25 1,25 ,0 2,5 2,5 2,5 6-dezo- ksyparo- momycyna 40 40 40 40 40 a) ATCC, American Type Culture Collection, NCIB, National Collection of Industrial Bacteria (W. Bry¬ tania). Wyniki te wskazuja, ze usuniecie grupy hydroksylowej w pozycji 6 reszty aminocyklilolu w neomycynie, co odpowiada 6-dezoksyneomycynie, nie zmienia w znaczniejszy sposób ogólnego dzialania przeciwbakteryjnegtf neomycyny. Warto zwrócic uwage na dzialanie przeciwbakteryjne 6-dezoksyneomycyny wobec Escherichia coli W3110, ATCC 27325, które jest lepsze niz neomycyny. b) Dzialanie przeciwbakteryjne 6-dezoksyneomycyny B i 6-dezoksyneomycyny C.

Dzialanie przeciwbakteryjne 6-dezoksyneomycyny B i 6-dezoksyneomycyny C badano sposobem opisanym poprzednio, stosujac jako pozywke agar DST i okreslajac MIC w porównaniu z neomycyna i 6-dezoksyneomy- cyna.

Tablica II Drobnoustrój Escherichia coli Bristol, NCIB 11351 Proteus mirabilis NCIB 11355 Staphylococcus aureus, ATCC 9144 Salmonella typhimu- rium,ATCC 19585 Stezenie w jug/ml zapobiegajace wzrostowi neomy- na 0,62 1,25 0,62 2,5 neomycy- • naB 0,62 1,25 0,62 2,5 neomy¬ cyna C 80 80 40 1 6-dezo- ksyneo- mycyna 2,5 ' 5 ' 6-dezo- ksyneo- mycyna B 2,5 2,5 6-dezoksy- neomycyna C 206 104557 Z wyników przedstawionych w tablicy II mozna wnioskowac, ze 6-dezoksyneomycyna B ma nieco slabsze dzialanie niz neomycyna B, natomiast 6-dezoksyneomycyna C jest silniejsza w dzialaniu niz neomycyna C. c) Dzialanie przeciwbakteryjne mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych. Atywnosc prze- ciwbakteryjna mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych badano sposobem opisanym wyzej.

Drobnoustrój D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 inkubuje sie w temperaturze °C na plytkach z pozywka agarowa, zawierajaca 50 /ig/ml mieszaniny gentamin o wzorze III. Po uplywie trzech dni plytki pokrywa sie agarem z wysianym badanym drobnoustrojem. Wytwarzanie antybiotyku wskazuje strefa zahamowania wzrostu drobnoustrojów dokola Streptomyces. Mierzy sie srednice tej strefy i porównuje z próbka kontrolna, zawierajaca sama pozywke agarowa.

Dla porównania prowadzono podobna próbke, zastepujac mieszanine gentamin o wzorze 3 dodawana do pozywki agarowej neamine w ilosci 50 /zg/ml i stosujac równiez D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484. Stwierdzono, ze wytwarzany antybiotyjc stanowi neomycyna.

Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy III.

Tablica III 1 Drobnoustrój »Escherichia coli' PT2 Escherichia coli ML 1629, NCIB H354 Escherichia coli ML 1410, NCIB 11353 Escherichia coli JR 66, NCIB 11352 Strefa hamowania wzrostu (w mm) gdy" pozywka zawiera nastepujace dodatki Bez dodatków 0 0 0 0 Neamina 0 0 0 0 Mieszanina gentamin o wzorze 3 21 Przedstawione dane wskazuja, ze mieszanina 3'4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku wykazuje aktywne dzialanie wobec drobnoustrojów, odpornych na dzialanie ne¬ omycyny. Mozna tu dodac, ze drobnoustrój E.coli PT2 równiez jest odporny na gentamycyne.

W zastosowaniach leczniczych zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku podaje sie w postaci srod¬ ków leczniczych lub srodków do leczenia zwierzat w postaci dawek jednostkowych odpowiednich do zadanego sposobu podawania. Srodki takie zawieraja jako substancje czynna co najmniej jeden zwiazek otrzymany sposo¬ bem wedlug wynalazku w polaczeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nosnikiem lub zaróbka. Do podawania doustnego srodek moze miec np. postac powleczonych lub niepowleczonych tabletek, twardych lub miekkich kapsulek zelatynowych, zawiesiny lub syropu. Alternatywnie, srodek moze miec postac nadajaca sie do podawa¬ nia doodbytniczo lub dopochwowo, postac roztworu lub zawiesiny do podawania pozajelitowo badz kremu lub masci do stosowania zewnetrznego.

Przyklad I. Wytwarzanie 6-dezoksyneomycyny w postaci zasady i siarczanu.

Wytwarzanie 6-dezoksyneomycyny w postaci zasady. W kolbie w ciagu 48 godzin hoduje sie szczep ET Streptomyces fradiae ATCC 21401 na pozywce o nastepujacym skladzie, której pH doprowadza sie wczesniej do wartosci 7,2 - 7,3.104557 7 Glikoza 1 g Hydrolizatkazeiny Ig (NH4)2HP04 lg MgS04-7H20 0,05 g FeS04-7H20 0,005 g CuS04-5H20 0,005 g CaC03 lg Woda do objetosci 100 ml Hodowle prowadzi sie w ciagu poprzednio wymienionego okresu wstrzasajac i utrzymujac w temperaturze 28°C.

Nastepnie 10% inokulum hodowli wprowadza sie do pozywki o wczesniej nastawionym pH 7,2 - 7,3, o nastepu¬ jacym skladzie: Glikoza Maka sojowa Ekstrakt drozdzy NaCl NaC03 Dwuchlorowodorek 2,4- -dwudezoksystreptamlny Woda do objetosci lg 2,5 g 0,5 g 0,5 g 0,2 g 0,025 g 100 ml Hodowle inkubuje sie w kolbach Erlenmeyera w temperaturze 28—30°C na wstrzasarce obrotowej z dobrym napowietrzaniem. Wytwarzanie 6-dezoksyneomycyny rozpoczyna sie po 2 dniach i jest optymalne po 5 dniach. Hodowla porównawcza nie zawierajaca dwuchlorowodorku 2,4-dwudezoksystreptaminy nie produkuje 6-dezoksyneomycyny.

Nastepnie hodowle odwirowuje sie i górna warstwe cieczy zlewa przez kolumne, zawierajaca slabo kwasna kationowa zywice jonowymienna z grupami karboksylowymi (typu metakrylanu) o sredniej porowatosci (Amber- lite IRC—50) w postaci soli amoniowej.- Operacje te przeprowadza sie dwukrotnie w celu wyekstrahowania 6-dezoksyneomycyny i nieprzereagowanego dwuchlorowodorku 2,4-dwudezoksystreptaminy. Kolumne przemy¬ wa sie woda i 6-dezoksyneomycyne eluuje sie 2N wodnym roztworem wodorotlenku amonowego. Eluat zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem na wyparce obrotowej i przenosi na kolumne Sephadex G10. Eluowanie 0,1 M roztworem wodorotlenku amonowego daje w pierwszych frakcjach 6-dezoksyneomycyne a w nastepnych frakcjach dwuchlorowodorek 2,4-dwudezoksystreptaminy.

W ten sposób wytwarza sie 6-dezoksyneomycyne w postaci wolnej zasady w ilosci odpowiadajacej ak¬ tywnosci 83 jednostek (1 jednostka- 1 //g/ml meomycyny). Odpowiada to wlaczeniu w sklad tak otrzymanej 6-dezoksyneomycyny okolo 22% poczatkowej ilosci uzytego dwuchlorowodorku 2,4-dwudezoksystreptaminy.

Okresla to maksymalna aktywnosc i dalsze inkubowanie nie powoduje wzrostu ilosci wytwarzanej 6-dezoksyne¬ omycyny.

W alternatywnym sposobie, surowa 6-dezoksyneomycyne oczyszcza sie metoda chromatografii bibulowej na bibule Whatman No 3 MM, stosujac jako srodek rozwijajacy, mieszanine metanol/wodorotlenek amonowy w stosunku 4:1. Umiejscowienie 6-dezoksyneomycyny na chromatogramie staje sie widoczne po zastosowaniu 0,25% roztworu podchlorynu sodu w wodzie, nastepnie absolutnego etanolu i wreszcie 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej i 1% jodku potasu w wodzie, przy czym bibule suszy sie po uzyciu kazdej z wymienionych substancji. W próbie tej wspólczynnik Rf 6-dezoksyneomycyny wynosi 0,30. Dla porównania, wspólczynnik Rf dla neomycyny, 2-dezoksystreptaminy i 2,4-dwudezoksystreptaminy przy uzyciu takiego samego ukladu roz¬ puszczalników ma nastepujacawartosc: Rf Neomycyna 0,26 2-dezoksystreptamina 0,58 2,4-dwudezoksystreptamina 0,62 Wytwarzanie siarczanu 6-dezoksyneomycyny. 6-dezoksyneomycyne otrzymana jak opisano wyzej przepro¬ wadza sie w siarczan, poddajac ja reakcji z rówowazna iloscia rozcienczonego kwasu siarkowego. Skrecalnosc siarczanu 6-dezoksyneomycyny [£]2£ = +43° (c = 1,0, woda).

Oznaczanie budowy 6-dezoksyneomycyny. Budowe antybiotyku o wzorze 1 w postaci wolnej zasady, otrzymanego jak opisano poprzednio, oznacza sie przez porównanie z antybiotykiem naturalnym, neomycyna, utworzonym gdy inkubuje sie odpowiednia pozywke, zawierajaca 2-dezoksystreptamine.

Domniemana 6-dezoksyneomycyne okresla sie dalej jako zwiazek X.

• Metanoliza neomycyny i zwiazku X 10% metanolowym roztworem chlorowodorku w ciagu 2 godzin w wa¬ runkach wrzenia pod chlodnica zwrotna, daje dwa glówne produkty, z których jeden odpowiada metyleno-8 104557 biosaminidowi i powstaje z obu zwiazków.

Drugi produkt, zwany dalej produktem Z, jest dla kazdego z badanych antybiotyków rózny, przy czym produkt Z otrzymany z neomycyny podczas chromatografii przy uzyciu jako rozpuszczalnika eluujacego miesza¬ niny metanol/roztwór wodorotlenku amonowego o wzajemnym stosunku skladników 4:1 ulega mniejszej migra¬ cji niz produkt Z otrzymany ze zwiazku X.

Potwierdzenie budowy kazdego z produktów Z uzyskuje. sie w oparciu o spektroskopie masowa po¬ chodnych nadtrójmetylosililowych.

Chociaz nie uzyskuje sie jonów czasteczkowych, widma produktu Z otrzymanego z neomycyny i ze zwiaz¬ ku X sa bardzo podobne z ta róznica, ze dwa piki widma pierwszego z tych produktów (m)e 343 i 460) sa przesuniete o 88 jednostek masy mniej w drugim z nich (m/e 255 i 372). Odpowiada to utracie grupy OSi(CH3)3 i zastapieniu jej atomem wodoru.

Takwiec, budowa produktu Z otrzymanego z neomycyny odpowiada neaminie, a produktu Z otrzymanego ze zwiazku X odpowiada 6-dezoksyneaminie.

Acylowanie obu produktów Z w metanolu i nastepnie hydroliza kwasowa 3 N roztworem kwasu solnego w ciagu 10 godzin w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrotna daje w kazdym przypadku dwa glówne pro¬ dukty. Podczas chromatografii bibulowej jeden z nich okazuje sie byc taki sam w obu przypadkach, niezaleznie od tego, czy otrzymuje sie go z produktu Z pochodzacego z neomycyny czy ze zwiazku X i nalezy przyjac, ze stanowi on 2,6-dwuamino-2,6-dwudezoksy-D-glikoze. Dwa pozostale zwiazki sa chromatograficznie identyczne z 2-dezoksystreptamina pochodzaca z neaminy i z 2,4-dwudezoksystreptamina pochodzaca z dezoksyneaminy.

Otrzymane wyniki prowadza do wniosku, ze zwiazek X odpowiada 6-dezoksyneomycynie.

Przyklad II. Rozdzielanie 6-dezoksyneomycyny na 6-dezoksyneomycyne B i6-dezoksyneomycy- ne C. 6-dezoksyneomycyne otrzymana jak w przykladzie I rozdziela sie na 6-dezoksyneomycyne B i 6-dezoksy¬ neomycyne C na drodze chromatografii bibulowej, stosujac jako rozpuszczalnik mieszanine Illrzed. butanol/bu- tanon/6,5 N roztwór wodorotlenku amonowego/metanol o wzajemnym stosunku skladników 3:16:6:1. 6-dezoksyneomycyne B i 6-dezoksyneomycyne C wykrywa sie na bibule jak opisano w przykladzie I.

Stosujac jako uklad rozpuszczalnikowy mieszanine metanol/wodorotlenek amonowy o stosunku skladni¬ ków 4:1, oznacza sie na bibule do chromatografii 3 MM Whatman wartosc wspólczynnikówRf 6-dezoksyneomy- cyn B i C w porównaniu z odpowiednimi epimerami i neomycyny, otrzymujac nastepujace wyniki: 6-dezoksyneomycyna B 6-dezoksyneomycyna C Neomycyna B Neomycyna C Rf 0,29 0,21 0,25 0,165 Przyklad III. Wytwarzanie 6-dezoksyparomomycyny i jej epimerów I i II. W kolbie na pozywce o skladzie: makasojowa "Ig hydrolizat kazeiny 0,25 g CaC03 0,5 g glikoza 1 g NaCl 0,5 g NH4CI 0,167 Woda do objetosci 100 ml której pH doprowadza sie poprzednio do wartosci 7,5 hoduje sie w ciagu 2—3 dni szczep D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484. Hodowle w tym czasie wytrzasa sie i utrzymuje w temperaturze 28°C. 10% inokulum tej hodowli przenosi sie na pozywke taka sama jak opisana poprzednio, lecz zawierajaca dodatkowo 0,025 g dwuchlorowodorku 2,4-dwudezoksystreptaminy. Hodowle inkubuje sie w kolbach Erlen- meyera w temperaturze 28—30°C na wstrzasarce obrotowej i dobrze napowietrza. Nastepnie operacje wytwarza¬ nia i oczyszczania prowadzi sie postepujac jak w przykladzie I w przypadku wytwarzania 6-dezoksyneomycyny w postaci wolnej zasady.

Oczyszczanie na drodze chromatografii bibulowej w taki sam sposób jak w przykladzie I wskazuje, ze wspólczynnik Rf 6-dezoksyparomomycyny ma wartosc 0,30. Dla porównania, wartosc wspólczynnika Rf paro- momycyny w identycznej próbie chromatograficznej wynosi 0,27.

Stosujac jako uklad rozpuszczalnikowy mieszanine metanolu i wodorotlenku amonowego w stosunku 4:1,104557 9 okresla sie na bibule do chromatografii 3MM Whatman wartosc wspólczynnika Rf 6-dezoksyparomomycyn I i II w porównaniu z wartosciami wspólczynnika Rf odpowiednich epimerów paromomycyny, otrzymujac nastepu¬ jace wyniki: Rf 6-dezoksyparomomycyna I 0,34 6-dezoksyparomomycynaII 0,275 ParomomycynaI 0,3 ParomomycynaII 0,22 Przyklad IV. Wytwarzanie mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny ijej pochodnych.

Wytwarzanie mieszaniny gentamin o wzorze 3. Mieszanine gentamin o wzorze 3 wytwarza sie z dostepnego w handlu siarczanu gentamycyny. Sól te przeprowadza sie najpierw w postac wolnej zasady i odparowuje do otrzymania oleju, do którego dodaje sie roztwór kwasu chlorowodorowego w metanolu, sporzadzony przez dodanie kwasu chlorowodorowego do suchego metanolu. Takotrzymany roztwór ogrzewa sie w ciagu 2 godzin w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrotna. Metanolowy roztwór kwasu chlorowodorowego usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem a powstaly olej roztwarza w malej ilosci wody i przepuszcza przez kolumne wypelnio¬ na zywica Amberlite IRA 400, otrzymujac zadane gentaminy w postaci wolnej zasady. Rózne zebrane frakcje odparowuje sie do sucha i rozdziela na metylogarosaminid i mieszanine gentamin na drodze chromatografii na zelu krzemionkowym, stosujac jako rozpuszczalnik mieszanine metanol/chloroform/wodorotlenek amonowy o wzajemnym stosunku skladników 1:1:1. Podczas rozdzielania metylogarosaminid wykazuje wspólczynnik Rf 0,8 a mieszanina gentamin Rf 0,2.

Wytwarzanie mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny ijej pochodnych. Szczep D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 hoduje sie w ciagu 2—3 dni w kolbie na pozywce o nastepujacym skladzie, której pH doprowadza sie wczesniej do wartosci 7,5: makasojowa Ig hydrolizatkazeiny 0,25 g CaCOa 0,5 g glikoza Ig NaCl 0,5 g NH4CI 0,167 g Hodowle prowadzi sie w ciagu wskazanego okresu czasu, wytrzasajac ja i utrzymujac w temperaturze 28°C. % inokulum z tej hodowli wprowadza sie do takiej samej pozywki jak opisana poprzednio opH7,2, lecz zawierajacej dodatkowo 50 /ig mieszaniny gentamin otrzymanych jak opisano poprzednio. Hodowle inkubuje sie w ciagu 5 dni w kolbach Erlenmeyera w temperaturze 30°C na wstrzasarce, z dobrym napowietrzaniem.

Tak otrzymana surowa mieszanine 3',4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych oczyszcza sie na drodze chromatografii bibulowej na bibule Whatman No 3MM, uzywajac jako roztwór rozwijajacy mieszanine meta¬ nol/wodorotlenek amonowy o wzajemnym stosunku skladników 3:1.

Umiejscowienie mieszaniny 3',4'-dwudezoksyneomycyny i jej pochodnych na chromatogramie staje sie widoczne po uzyciu 0,25% wodnego roztworu podchlorynu sodu, nastepnie absolutnego etanolu i wreszcie roztworu 1% rozpuszczalnej skrobi i 1% jodku potasu w wodzie, przy czym bibule suszy sie po uzyciu kazdej z wymienionych substancji.

W próbie tej stwierdzono, ze wartosc wspólczynnika Rf mieszaniny 3\4'-dwudezoksyneomycyny i jej po¬ chodnych wynpsi 0,25.

Dla porównania, wartosc wspólczynnika Rf mieszaniny gentamin o wzorze 3 w identycznych warunkach wynosi 0,5-0,7.

Claims (8)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowych aminoglikozydowych pochodnych aminocyklitolu o ogólnym wzorze 1, w którym Rj i R2 rózniace sie miedzy soba, oznaczaja atom wodoru lub grupe -CH2NH2, aR oznacza grupe o wzorze 4, w którym R3 oznacza grupe NH2 lub -OH oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyj¬ nych z kwasami, znamienny tym, ze hoduje sie dezoksystreptamino-negatywny mutant Streptomyces w temperaturze 28—30°C w odpowiedniej pozywce, zawierajacej rozpuszczalny weglowodan, zródlo przyswajal¬ nego azotu, podstawione sole mineralne i zwiazek o wzorze 6 lub jego sól addycyjna z kwasem, przy czym X i Y sa identyczne i oba oznaczaja atom wodoru, otrzymujac zwiazek o wzorze 1 w postaci wolnej zasady, przy czym jako dezoksystreptamino-negatywny mutant Streptomyces stosuje sie D" Streptomyces fradiae ATCC 21401 lub10 104557 D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484, po czym otrzymana wolna zasade ewentualnie poddaje sie reakcji z odpowiednim organicznym lub nieorganicznym kwasem, wytwarzajac farmaceutycznie do¬ puszczalna sól addycyjna z kwasem lub rozdziela na izomery za pomoca chromatografii bibulowej.

2. Sposób wedlug zastrz, 1, znamienny tym, ze mutant D" Streptomyces fradiae ATCC 21401 hoduje sie w obecnosci 2,4-dwudezoksystreptaminy lub jej soli addycyjnej z kwasem, wytwarzajac 6-dezoksy- neomycyne w postaci wodnej zasady. ,

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mutant D~ Streptomyces fradiae ATCC 21401 hoduje sie w obecnosci dwuchlorowodorku 2,4-dwudezoksystreptaminy, wytwarzajac 6-dezoksyneomycyne w postaci wolnej zasady.

4. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze mutant D" Streptomyces rimosus forma paromo¬ mycinus ATCC 21484 hoduje sie w obecnosci mieszaniny gentamin, wytwarzajac mieszanine 3\4'-dwudezoksy- neomycyny i jej pochodnych w postaci wolnej zasady.

5. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze jako kwas nieorganiczny stosuje sie kwas siarkowy.

6. Sposób wytwarzania nowych aminoglikozydowych pochodnych aminocyklitolu o ogólnym wzorze 1, w którym Ri iR2 rózniace sie miedzy soba, oznaczaja atom wodoru lub grupe -CH2NH2, aR oznacza grupe o wzorze 5, w którym R4 oznacza grupe -CH(R5)*NH2 lub -CH(CH3)*NHCH3, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze hoduje sie dezoksystreptamino-negatywny mutant Streptomyces w temperaturze 28—30°C w odpo¬ wiedniej pozywce, zawierajacej rozpuszczalny weglowodan, zródlo przyswajalnego azotu, podstawione sole mi¬ neralne i zwiazek o wzorze 6 lub jego sól addycyjna z kwasem, przy czym X oznacza grupe -OH, a Y oznacza grupe o wzorze 7, w którym R4 oznacza grupe -CH(R5)'NH2 lub -CH(CH3)NH3, gdzie R5 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, otrzymujac zwiazek o wzorze 1 w postaci wolnej zasady, przy czymjako dezoksy¬ streptamino-negatywny mutant Streptomyces stosuje sie D" Streptomyces rimosus forma paromomycinus ATCC 21484 po czym otrzymana wolna zasade ewentualnie poddaje sie reakcji z odpowiednim organicznym lub nieorganicznym kwasem, wytwarzajac farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem lub rozdziela na izomery za pomoca chromatografii bibulowej.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze mutant D" Streptomyces rimosus forma paromo¬ mycinus ATCC 21484 hoduje sie w obecnosci mieszaniny gentamin, wytwarzajac mieszanine 3\4'-dwudezoksy- neomycyny i jej pochodnych w postaci wolnej zasady.

8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze jako kwas nieorganiczny stosuje sie kwas siarkowy. CH20H zr*" WZ0R 1 HO HO NH2 NH2 WZÓR 2 WZ0R 3104 557 CH2R3 HO—^\ O H0^A NH2 WZOR L NH2 • i t • L HjNÓ- \ \ NH2 H WZOR 5 R\4 H2N WZCJR 7