CH617458A5

CH617458A5 - Use of filamentary structures containing encapsulated fumarase for the enzymatic production of l-malic acid

Info

Publication number: CH617458A5
Application number: CH412274A
Authority: CH
Inventors: Franco Morisi; Rosanna Mosti; Mario Bettonte
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1973-03-30
Filing date: 1974-03-25
Publication date: 1980-05-30
Also published as: DD111067A5; BE812860A; JPS49126887A; ZA742031B; GB1426137A; IT981777B; FR2223351B1; JPS547875B2; DE2415310B2; NL7404353A; LU69744A1; CS182252B2; FR2223351A1; DE2415310A1; AU6692974A

Description

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RIVENDICAZIONI

1. Utilizzazione di strutture filamentose contenenti inglobata la fumarasi ed ottenute a partire da polimeri scelti tra polimeri cellulosici esterificati o nitrati, poliolefine, polimeri e copolimeri di acrilonitrile, acrilati, metacrilati, esteri vinilici, cloruro di vinile, cloruro di vinilidene, stirolo, poliam-mide o polivinile buttirrale per la produzione enzimatica di acido 1-malico, caratterizzata dal fatto di mettere a contatto soluzioni saline di acido fumarico con dette strutture.

2. Utilizzazione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che la struttura filamentosa è ottenuta a partire di triacetato di cellulosa.

Oggetto della presente invenzione è un'utilizzazione di strutture filamentose contenenti in globata la fumarasi ed ottenute a partire da polimeri scelti tra polimeri cellulosici esterificati o nitrati, poliolefine, polimeri e copolimeri di acrilonitrile, acrilati, metacrilati, esteri vinilici, cloruro di vinile, cloruro di vinilidine, stirolo, poliammide o polivinile butirra-le per la produzione enzimatica di acido 1-malico.

L'enzima estratto da varie fonti viene utilizzato come catalizzatore in forma eterogenea in quanto viene immobilizzato in strutture filamentose dall'interno delle quali esso non può' sfuggire pur essendo tuttavia accessibile al substrato.

È ormai noto l'interesse sviluppato attorno ad acidi organici quali l'acido citrico, tartarico ecc. impiegati nell'industria alimentare come acidulanti.

Si è guardato recentemente all'acido malico da impiegare in applicazioni dello stesso tipo ed anche se è stato proposto l'impiego del composto racemo è chiaro che il poter disporre dell'isomero naturale, cioè L-malico che è del resto prodotto in notevole quantità nell'organismo umano, in quanto intermedio di uno dei più importanti cicli metabolici, costituisce una sicurezza soprattutto quando gli alimenti sono destinati all'infanzia.

Vari metodi sono stati proposti per la produzione di acido, malico. Da una parte ci sono metodi di sintesi chimica che conducono al composto racemo con gli svantaggi di cui si è già parlato; inoltre l'acido malico proveniente dalla sintesi chimica contiene sempre come impurezza dell'acido maleico che occorre eliminare, con procedimenti relativamente costosi, dato il forte carattere tossico.

Altri metodi sono quelli microbiologici che, se hanno il vantaggio di produrre il composto naturale levo, sono costosi e laboriosi; il mantenimento del ceppo microbico, la fermentazione che impiega impianti voluminosi e dispendiosi nonché l'utilizzazione di materie prime, aria compressa e vapore sono altrettanti svantaggi dei metodi sopra menzionati. Inoltre la separazione dell'acido malico dai brodi di fermentazione comporta qualche difficoltà dovuta al fatto che il prodotto si trova assieme a parecchie impurezze. Si poteva pensare ad un metodo enzimatico utilizzando l'enzima solubile, però ciò ha diversi svantaggi: inquinamento del prodotto finale, necessità di inattivare l'enzima, uso di quantità considerevoli di enzima che viene usato una sola volta e quindi incide fortemente sul costo.

L'utilizzazione di strutture filamentose contenenti in globata la fumarasi per la produzione enzimatica di acido 1-malico è definita nella rivendicazione 1.

L'utilizzazione di cui è oggetto la presente invenzione permette di ottenere l'idratazione enzimatica dell'acido fumarico ad acido 1-malico con notevole semplicità; l'impianto è costituito da una semplice colonna; l'enzima, essendo immobilizzato, può essere riusato per un numero imprecisato, comunque grande di volte, e non inquina il prodotto; quest'ultimo è facilmente separabile dalla miscela di reazione.

Le strutture filamentose impiegabili ed il metodo di inglobamento dell'enzima sono quelli descritti nel brevetto italiano n. 836 462 secondo il quale le fibre inglobanti enzima possono essere preparate a partire da soluzioni di polimero capaci di dare fibre nelle quali vengono dispersi preparati enzimatici in forma di minutissime goccioline dell'ordine di grandezza delle emulsioni.

L'emulsione così ottenuta può essere filata a umido o a secco per dare una fibra che presenta nel suo interno piccolissime cavità nelle quali si dispongono gli enzimi che sono separati dall'ambiente da una sottilissima membrana, la quale impedisce la fuoriuscita dell'enzima e la sua dispersione nella massa di reazione e tuttavia permette che l'enzima possa esplicare la sua attività catalitica.

Fra i polimeri che possono inglobare gli enzimi si possono citare i polimeri cellulosici esterificati, nitrati, poliolefine, i polimeri e copolimeri ottenuti da acrilonitrile, acrilati, metacrilati, esteri vinilici, cloruro di vinile, cloruro di vinilidene, stirolo, ed inoltre le poliammidi, il polivinile butirrale e simili.

Con le fibre enzimatiche così ottenute, disposte in una colonna, è possibile procedere alla trasformazione di acido fumarico in 1-malico con un sistema continuo facilmente auto-matizzabile.

Una pompa preleva la soluzione di fumarato di sodio, (la cui concentrazione può variare tra 0,1 e 1,2 moli/lt ed il cui pH fra 6,0 e 9,0) e la manda nella colonna contenente il catalizzatore. A seconda del flusso e della temperatura alla quale si opera, nell'effluente si ottiene una concentrazione di 1-malico che al massimo raggiunge i valori dell'equilibrio termodinamico.

Dall'effluente per acidificazione si separa l'acido fumarico non trasformato che viene rimesso in ciclo; il 1-malico può essere recuperato con vari metodi e allo stato puro cristallino o allo stato di sciroppo concentrato.

Gli esempi che seguono servono ad illustrare la presente invenzione, ma non sono limitativi di essa.

Esempio 1

Si sciolgono sotto agitazione, in un reattore, gr. 10 di triacetato di cellulosa in gr. 140 di cloruro di metilene.

A parte si prepara la soluzione di enzima sciolgliendo, in tampone fosfato pH 7,2, la fumarasi ad una concentrazione di 20 mg di proteina per mi.

10 mi di soluzione enzimatica vengono addizionati alla soluzione organica di triacetato e si favorisce l'emulsione delle due fasi con energia agitazione a 0° C per 30 min.

L'emulsione viene versata in un fusorino mantenuto a -6° C e si fila sotto pressione di azoto.

11 filo si coagula in toluolo a temperatura ambiente e lo si raccoglie in arroccatrice. Si essicca sotto vuoto il filo ottenuto per allontanare i solventi organici.

Un campione di 2 gr. di filo, dopo lavaggio con tampone fosfato, pH 7,2, viene immerso in 50 mi di soluzione 0,10 molare di fumarato sodico.

Si agita a temperatura controllata di 25° C.

Trascorsi 90 minuti si dosa nella miscela di reazione il 20,5 % dell'acido fumarico iniziale. Il restante 79,5 % è stato trasformato in 1-malico.

Lo stesso campione di filo dopo essere stato utilizzato per 10 volte consecutive conserva circa il 40 % dell'attività iniziale.

Esempio 2

Seguendo la procedura descritta nell'esempio n. 1 si ingloba in fili di triacetato di cellulosa una preparazione enzimatica grezza di fumarasi ottenuta da cellule microbiche di Pa-racolobactrum aerogenoides. Grammi 450 di cellule umide ottenute coi metodi tradizionali di fermentazione aerobica sommersa vengono sottoposti all'azione degli ultrasuoni per

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20'; si allontanano gli acidi nucleici con MnCl2 e si precipita l'enzima con ammonio solfato fra il 40 e 60 % di saturazione. Il precipitato viene ridisciolto in tampone fosfato 0,01 molare, pH 7,0. La soluzione contiene 49 mg di proteine per mi ed una attività corrispondente a 45 U/ml (si definisce come unità di attività la quantità di enzima che trasforma 1 jj,M di substrato al min. a 25° C).

100 mi di questa soluzione enzimatica sono inglobati in filo come descritto nell'esempio 1.

Un campione di filo pari a 85 gr viene posto in colonna (65 X 3 cm), termostatata a 25° C, si manda dal basso verso l'alto una soluzione di fumarato sodico 0,5 molare in tampone fosfato, pH 7,0, ad un flusso di 50 ml/h.

Nell'effluente si ottiene la conversione del 54 % dell'acido fumarico in 1-malico.

Dopo 35 giorni di uso ininterrotto della stessa fibra la conversione dell'acido fumarico in malico scende al 38 %.

Esempio 3

Seguendo la procedura descritta nell'esempio n. 1 si ingloba in fili di triacetato di cellulosa una preparazione enzimatica grezza di fumarasi ottenuta da cellule microbiche di Pseudomonas sp. Grammi 315 di cellule umide ottenute con i metodi tradizionali di fermentazione aerobica sommersa vengono sottoposti all'azione degli ultrasuoni per 20'; si allontanano gli acidi nucleici con protammina solfato e si precipita l'enzima fra 30 e 60 % di saturazione con solfato ammonico. Il precipitato contenente l'attività viene disciolto in tampone fosfato 0,1 molare, pH 7,0.

La soluzione contiene 61,5 mg di proteine per mi ed una attività corrispondente a 80 U/ml (si definisce come unità di attività la quantità di enzima che trasforma 1 jimole di substrato la min. a 25° C). 100 mi di questa soluzione enzimatica sono inglobati in filo come descritto nell'esempio 1.

Un campione di filo pari a 70 g viene posto in colonna (60 X 3 cm), termostatata a 25° C.

Si manda, dal basso verso l'alto, una soluzione di fumarato sodico 0,5 molare, in tampone fosfato pH 7,0, ad un flusso di 50 ml/h. Nell'effluente si ottiene la conversione del 60 % dell'acido fumarico in 1-malico. Il reattore contenente la fibra enzimatica è stato usato ininterrottamente per 60 giorni senza perdita sensibile dell'attività.

Dalla miscela di reazione si separa per acidificazione l'acido fumarico che viene rimesso in ciclo ottenendo un recupero del 90 %. Si concentra sotto vuoto fino a consistenza sciropposa e vengono allontanati i sali inorganici.

Si estrae con alcool l'acido malico che viene precipitato con aggiunta di cloroformio. L'acido 1-malico ha una purezza del 100 %. La resa è del 60 %.

10 Esempio 4

Secondo la tecnica già descritta nell'esempio 1 si ingloba in filo di triacetato di cellulosa una soluzione enzimatica ottenuta da cellule microbiche di Pseudomonas sp. 500 gr di cellule umide ottenute da una fermentazione aerobica sommersa 15 vengono sottoposte all'azione degli ultrasuoni per 20'; gli acidi nucleici sono allontanati con MnCl2; la soluzione proteica • viene riscaldata per 10' a 50° C; l'enzima viene precipitatcf con solfato di ammonio al 40 % di saturazione. Il precipitato è solubilizzato con fosfato 0,01 M pH 8.

20 La soluzione contiene 60 mg/ml di proteine e una attività corrispondente a 150 U/ml. 50 mi di questa soluzione sono inglobati in triacetato di cellulosa secondo quanto già descritto.

Un campione del filo pari a 80 gr è posto in colonna (60 25 x 3 cm) termostatata a 25° C. Essa è alimentata dal basso con una soluzione di fumarato di ammonio 0,5 M in tampone fosfato a pH 7,0 ad un flusso di 50 ml/h.

Nell'effluente si ha una conversione del 75 % di acido fumarico in 1-malico.

Esempio 5

Una soluzione enzimatica, ottenuta da cellule microbiche 35 di Pseudomonas sp., secondo quanto descritto nell'esempio 2 viene inglobata in triacetato di cellulosa.

Un campione di 80 gr di tale filo è posto in una colonna (60 X 3 cm), termostatata a 25° C. Si fa fluire dal basso verso l'alto una soluzione di fumarato di Ca 0,06 M in tampone 40 fosfato pH 7,0 con una velocità di flusso pari a 50 ml/h. Nel-, l'effluente si dosa una quantità di 1-malato corrispondente al 70 % di conversione dell'acido fumarico.

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