CH616943A5

CH616943A5 -

Info

Publication number: CH616943A5
Application number: CH1273676A
Authority: CH
Inventors: Arlette Adam; Pierre Lefrancier; Edgar Lederer
Original assignee: Anvar
Priority date: 1975-10-09
Filing date: 1976-10-07
Publication date: 1980-04-30
Also published as: GB1562734A; AU522089B2; CA1091651A; FR2326930B1; AU1867676A; BE847103A; DE2645610C2; DE2645610A1; US4101649A; FR2326930A1; JPS5257120A; NL7611088A; JPS618079B2

Description

L'invention est relative à un procédé de préparation d'un agent soluble, efficace comme dépresseur non spécifique de

Sa formule est:

Ce produit est dépourvu de toxicité et constitue un analogue compétitif des adjuvants dérivés des peptidoglycanes bactériens, plus particulièrement de la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine dont l'action adjuvante, lorsque administrée au sein d'une émulsion eau-huile, a été décrite dans la demande no. 7 422 909 du 1er juillet 1974, déposée sous forme de demande de troisième certificat d'addition au brevet principal français no. 7 141 610 du 19 novembre 1971, transformée en demande de brevet indépendant le 18 septembre 1975.

Comme on l'a mis en évidence dans les expérimentations pharmacologiques qui seront décrites plus loin, le susdit principe actif de médicament, la N-acétylmuramyl-D-alanyl-D-

l'immunité, pour inhiber chez un hôte les réponses immunitaires à des antigènes de différentes sortes.

On sait que, dans un certain nombre de traitements théra-• peutiques, il est désirable de déprimer les réponses immunitai-s res d'un hôte. Tel est par exemple le cas de patients ayant subi des greffes d'organes originaires d'individus différentes. Les produits utilisés comme immunodépresseurs sont en général toxiques et interfèrent avec le métabolisme de toutes les cellules, ayant ainsi une action systémique.

io L'invention a pour but de fournir un procédé de préparation de nouveaux produits possédant des propriétés immunodépres-sives, cet agent étant sensiblement exempt des toxicités qui sont caractéristiques de la plupart des immunodépresseurs connus jusqu'à ce jour.

15 L'invention concerne en particulier la préparation du produit nouveau que constitue la N-acétylmuramyl-D-alanyl-D-isoglutamine, qui peut également être désigné par sa nomenclature chimique:

20 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-gIucopyranose)-D-propionyl-D-alanyl-D-isoglutamine.

Ce produit nouveau possède de remarquables propriétés immunodépressives, à caractère non spécifique.

La substance définie ci-dessus peut également être désignée 25 par l'abréviation suivante:

isoglutamine, a une action antagoniste de celle des N-acétyl-muramyl peptides ayant une action adjuvante, telles que la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine.

60 Cette action se manifeste en particulier dans les compositions contenant l'agent immunodépresseur susdit au sein d'une émulsion eau-huile.

Selon l'invention, le susdit agent immunodépresseur est fabriqué par un procédé consistant à faire réagir l'acide N-65 acétyl-muramique, dont les fonctions —OH libres, à l'exception de celle du groupe propionyle de l'acide muramique, ont été préalablement protégées, avec le peptide correspondant dont les fonctions —OH libres ont été également préalableMur-N-Ac-D-Ala-D-Glu, a-NHz

CH20H

h5c

0H, H

MIAo

- OH - 00 - NH ~ 0H - 00JNH«

(ch2)2

d

COOH ^—

d

3

616 943

ment protégées, puis à libérer les fonctions initialement protégées, notamment par hydrolyse en milieu acide.

On peut aussi préparer une N-acétylmuramyl-D-alanyl-D-isoglutamine dont les fonctions — OH libres sont protégées soit par des groupes benzyle, soit par des groupes benzylidène,

dans le cas de certaines des fonctions hydroxyle voisines dans le groupe pyranosyle du groupe muramyle du produit selon l'invention.

Dans ce qui suit, on décrit un exemple de fabrication de la N-acétylmuramyl-D-alanyl-D-isoglutamine.

Le Mur-N-Ac-D-Ala-D-Glu, a-NH2, dont la structure chimique est 2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyranose)-D-propionyl-D-alanyl-D-isoglutamine, est préparé en plusieurs étapes. Dans un premier temps, la chaîne peptidique est synthétisée, puis elle est fixée, dans un deuxième temps, sur un dérivé muramyle dont les fonctions —OH libres, à l'exception de celles du groupe propionyle de l'acide muramique, ont été préalablement protégées, notamment par des groupes benzyle ou benzylidène. Enfin, les fonctions protégées lors de la synthèse sont libérées. Une variante de ce procédé consiste à fixer sur le dérivé muramyle la D-alanine, puis à condenser le produit résultant avec la D-isoglutamine.

Chlorhydrate de l'ester benzylique de l'acide BOC-a-Alanyl-D-isoglutamique (I)

L'abréviation BOC utilisée ci-après désigne le groupe t-butyl-oxycarbonyle.

680 mg (3,4 mmoles) de l'acide t-butyloxycarbonyl-D-alanine (BOC-D-Ala-OH) sont ajoutés sous agitation à une solution dans le diméthylformamide de 1,09 g (4 mmoles) du chlorhydrate de l'ester benzylique de la D-isoglutamine et de 0,45 ml (4 mmoles) de N-diméthylformamide. On ajoute 700 mg (3,4 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide. Le mélange réactionnel est laissé à la température ambiante pendant 12 heures. Il est ensuite concentré à sec. Le résidu sec est repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement avec une solution d'acide citrique à 10%, à l'eau, avec une solution N de bicarbonate de sodium, enfin à l'eau. La phase acétate d'éthyle est séchée sur Mg SO4 et concentrée. En cristallisant dans un mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole, on obtient 780 mg (Rdt 51%).[Fc 128-130°.[a$ = '+25,3°, methanol]. Le produit est dissous dans 5 ml d'une solution normale d'acide chlorhydrique dans l'acide acétique. Après 30 minutes, la solution est concentrée à sec et le résidu est repris dans un minimum de méthanol. Le produit est précipité à l'éther. 370 mg (Rdt 56%). Fc 128-130».

[a] 25 = +26°, (méthanol).

Analyse pour C15H22O4N3CI (343,82):

C

H

N

Calculé:

52,4

6,45

12,2

Trouvé:

52,53

6,60

12,25

2-(benzyl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-3-0-D-glucopyrnosyl)-D-propionyl-D-Ala (v-O-benzyl)-D-Glu,a-NH2 (II)

Une solution de 157 mg benzyl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-3-0-(D-l-carboxyéthyl)-2-déoxy-P-D-gluco-pyranoside (I), (0,33 mmoles) dans le mélange acétonitrile-N-N-diméthyl-formamide (2:1, v/v, 5 ml) contenant un équivalent (0,33 mmoles) de triéthylamine est versée dans une suspension, maintenue à 0°, de N-éthyl-5-phényIisoxazolium-3'-sulfonate (84,3 mg) Aldrich (réactif K de Woodward) dans de l'acétonitrile (5 ml). Le mélange est agité à 0°C jusqu'à l'obtention d'une solution limpide (1 h 30 environ). Une solution de chlorhydrate de D-Ala(7-0-benzyl)-D-Glu-a-NH2 (II) (114,4 mg, 0,33 mmoles) dans le mélange acétonitrile-N-N-diméthylformamide (2:1, v/v, 5 ml) contenant un équivalent (0,33 mmoles) de triéthylamine est alors ajoutée. Après une nuit d'agitation à la température ambiante les solvants sont évaporés sous vide, le résidu solide obtenu étant soigneusement extrait avec de l'eau afin d'éliminer les produits secondaires. Le solide est essoré, séché et cristallisé dans de l'étha-nol, donnant II: 550 g —

(Rdt 73 %)-Fc 255-257°-ags = -30°, diméthylformamide.

2-(2-acétamido-2-déoxy-3-0-D-glucopyranosyl)-D-propionyl-D-Ala-D-Glu,a-NH2 (III)

Le composé (II) (200 mg) est mis en suspension dans de l'acide acétique à 60% (15 ml) et chauffé pendant 1 heure à 100°. Après refroidissement de la solution, l'acide acétique est évaporé sous vide, les dernières traces d'acide étant éliminées par des additions d'eau suivies d'évaporation, les traces d'eau étant finalement éliminées par des co-distillations en présence de toluène. Le résidu obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (15 g) (chloroforme-méthanol, 6:1 v/ v). Les fractions pures sont jointes, évaporées sous vide, donnant un résidu chromatographiquement pur, (120 mg, 73%)

Ce composé (69 mg) est hydrogéné catalytiquement dans l'acide acétique glacial (10 ml), en présence de palladium sur charbon (25 mg). Au bout de 3 h, le catalyseur est essoré et le filtrat évaporé sous vide. On obtient le composé (V) qui présente les caractéristiques analytiques suivantes:

Rdt 73,4 % — a^5 = + 5 8 0, acide acétique Analyse pour Ci9H320nN4-0,5C2H50H (515,534):

C

H

N

Calculé:

46,59

6,84

10,86

Trouvé:

46,52

6,82

10,86

Propriétés pharmacologiques

1) Détermination de l'innocuité des principes actifs du médicament contenant le Mur-N-Ac-D-Ala-D-Glu,a-NH2

Elle a été déterminée par la méthode décrite par L. Chedid et coll., Ann. N.Y. Acad. Sci. 133: 712,1966. Les produits étudiés ont été administrés, par injection intraveineuse, à des souris surénaleçtomisées au préalable, de sorte qu'elles ont été rendues particulièrement sensibles.

On a cependant constaté que toutes les souris survivent à des injections de doses des produits à étudier, pour lesquelles ils présentent une bonne activité comme agents immunodépresseurs (doses déterminées dans les essais suivants). Les principes actifs du médicament contenant le produit selon l'invention présentent donc une excellente innocuité.

2) Propriétés immunodépressives des agents préparés selon l'invention

Dans les deux séries d'essais dont les résultats sont indiqués ci-après, on a étudié l'influence des principes actifs des médicaments préparés selon l'invention sur le taux des anticorps anti-ovalbumine dans les conditions suivantes.

Des cobayes Hartley femelles de 300-350 g ont reçu, dans le coussinet plantaire de chacune des deux pattes arrière, une émulsion composée de parties égales d'adjuvant de Freund incomplet et d'une solution physiologique contenant de l'oval-bumine (5 mg/cobaye) et les préparations à tester. L'adjuvant incomplet de Freund (AIF), l'adjuvant complet (ACF), com-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

616 943

4

mercialisés par la Société DIFCO, et la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine ont été employés comme témoins.

Le taux des anticorps antiovalbumine a été déterminé trois semaines après injection, dans les conditions indiquées dans le brevet français no. 7 141 610 du 19 novembre 1971; il est exprimé en fxg/ml de sérum du précipité antigène-anticorps au point d'équivalence.

Dans la deuxième série d'essais, on a également mesuré l'hypersensibilité retardée à l'ovalbumine par réaction cutanée

Tableau I

quatre semaines après l'injection; elle est exprimée par le diamètre en millimètres de l'érythème (E), de l'induration (I) ou de la nécrose (N), 48 heures après l'injection sous-cutanée de 50 microgrammes d'ovalbumine.

Les résultats de la première série d'essais figurent dans le tableau I ci-après. Ils mettent en évidence les propriétés immu-nodépressives du composé considéré dans le cadre de l'invention.

Substances

Doses (|ig) par animal

Taux des anticorps antiovalbumine (en {ig de protéines par millilitre de sérum)

Moyenne

1 Adjuvant incomplet de Freund (FIA)

—

4200

3800

1720

5200

3100 2940

4200

3592

2 Adjuvant complet de Freund (FCA)

50

11200

8400

6960

11040

10400 9200

4800

8856

3 Mur—N-Ac—L—Ala—D-Glu, CX-NH2 + FIA

25

9280

11200

12000

11600

12000 11600

9280

10992

4 Mur—N—Ac—L—Ala—D—Glu, C1-NH2 + FIA

10

15500

11000

9520

14000

4480 15000

10600

11440

5 Mur—N—Ac—D-Ala—D—Glu, 0-NH2 + FIA

25

200

800

900

1300

1900 900

1500

1068

Comme on peut le constater d'après ce tableau, la substance 20 Les résultats de la deuxième série d'essais figurent dans le préparée selon l'invention a donc une action inverse de celle tableau II ci-après. Cette deuxième série comporte sept essais,

de la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, laquelle l'agent ou les agents à éprouver dans chacun d'eux étant iden-

témoigne d'une activité adjuvante prononcée. tifiés dans la colonne de gauche du tableau.

Tableau II

Substances

Dose

Taux des anticorps

Moyenne

Hypersensibilité

Hg/animal antiovalbumine fAg protéine/ml sérum

retardée

50 [igovalbumine/animal

1 FIA

0

2200 780

5 N/ 51 0

2500

1553

0

1440

1600

5N/ 51

800

0

2 FCA

50

7200 4800

5N/15I 121

3300

4950

5N/12I

4800

5N/15I

4800

5N/15I

4800

10 N / 151

3 Mur—N-Ac-L—Ala-D-Glu, (X-NH2

10

8000 9500

5N/15I 5N/15I

6500

7717

7N/16I

7500

7N/17I

6800

6N/20I

8000

8N/20I

4 Mur—N—Ac—D—Ala—D-Glu, a-NEk

25

1720 660

0 0

3600

1890

5N/12I

1800

5 N

1800

0

1760

0

5 Mur-N-Ac-L-Ala-D-Glu, 0C-NH2

10

1600 4200

121

5N/10I

+

5600

3400

4N /181

Mur—N—Ac—D—Ala-D—Glu, a-NFfc

25

2400 4500 2100

4N/12I 5N/12I 5N/12I

6 Mur—N—Ac—L-Ala—D—Glu, a—NH2

10

1900

4N/12I

+

3700

Mur—N—Ac—D—Ala—D—Glu, a—NH2

10

6400

4917

4N/12I

6000

5N/15I

5900

121

5600

3N/12I

7 Mur—N—Ac—D-Ala-D-Glu, a-NFfc

100

950

1000

1050

5 E

1200

0

5

616 943

Les résultats les plus significatifs de ce tableau sont ceux des essais 3, 5 et 6 qui font nettement ressortir les actions antagonistes compétitives de l'excellent agent adjuvant que constituent la Mur-N-Ac-L-Ala-D-Glu,a-NH2 (essai no. 3) et du produit préparé selon l'invention (essais no. 5 et no. 6). Lorsque le produit préparé selon l'invention est administré simultanément avec l'agent adjuvant, on constate que celui-ci inhibe fortement l'action adjuvante de celui-là.

L'examen du tableau II, en ce qui concerne les actions de l'agent immunodépresseur pris seul, comparées à celles de l'adjuvant incomplet de Freund (FIA), ne pourrait à priori que démontrer l'absence de propriété adjuvante du produit selon l'invention. Il n'en est pas de même dans le tableau I, dans lequel on constate que la Mur-N-Ac-L-Ala-L-Glu,a-NH2 et de façon beaucoup plus importante la Mur-N-Ac-D-Ala-D-GIu,a-NH2 induisent des taux d'anticorps antiovalbumine nettement plus faibles que ceux mesurés chez les animaux n'ayant reçu que l'adjuvant incomplet de Freund. On peut formuler l'hypothèse que, dans la première série d'essais, les animaux éprouvés étaient porteurs d'une légère infection, laquelle aurait ainsi été à l'origine de la découverte des propriétés immunodépressives des principes actifs selon l'invention. Comme on l'a indiqué plus haut, cette action immunodé-pressive a été confirmée de façon extrêmement nette par la mise en jeu des actions antagonistes de la Mur-N-Ac-D-Ala-D-G1u,(x-NH2 et de la Mur-N-Ac-L-AIa-D-Glu,a-NH2.

Les propriétés immunodépressives du composé préparé selon l'invention en font donc un principe actif de grande valeur pour la constitution de médicaments immunodépresseurs, dont l'utilisation est souhaitée dans le traitement de tous états pathologiques mettant en jeu les réponses immunitaires excessives à l'égard d'antigènes particuliers ou de corps étrangers introduits à dessein dans l'organisme de l'hôte, qu'il s'agisse de l'homme ou de l'animal; en particulier, on peut envisager l'utilisation de médicaments selon l'invention pour le traitement de patients ayant subi des greffes d'organes, dans le but de réduire les réponses immunitaires de l'organisme à l'égard de l'organe greffé.

L'agent préparé selon l'invention est utilisable dans des compositions injectables contenant des doses efficaces de 5 celui-ci, notamment au sein d'une émulsion stabilisée eau-huile, cette dernière étant de préférence de nature végétale, surtout dans le cas où elles sont destinées à être administrées à l'homme.

Par exemple, l'émulsion végétale utilisée sera avantageuse-io ment constituée à partir d'un soluté isotonique aqueux et d'une huile végétale métabolisable, contenant environ 2 à environ 6 volumes de soluté aqueux pour 10 volumes de ladite huile végétale, et en outre des protéines non immunogènes, par exemple du type sérum albumines ou globulines, en des preis portions suffisantes pour assurer la stabilité de l'émulsion formée. Par exemple, cette émulsion contient entre environ 30 et environ 150 mg, de préférence entre environ 40 et environ 120 mg, notamment de l'ordre de 60 mg, de protéines par ml de phase aqueuse.

20 Ces protéines dissoutes dans la phase aqueuse peuvent naturellement contribuer à l'isotonicité de cette dernière. Bien entendu, celle-ci peut également, dans la mesure nécessaire, contenir des proportions adéquates d'agents susceptibles de lui conférer cette isotonicité, par exemple de chlorure de sodium, 25 de glucose, de dextrane, etc.

L'administration de ces médicaments peut être envisagée sous forme de compositions injectables par voie intramusculaire ou sous-cutanée, aussi bien que par scarification.

Le principe actif qui a été décrit constitue également un 30 précieux agent de laboratoire en raison de son action antagoniste de celle d'agents efficaces comme adjuvants immunologi-ques, pour stimuler chez un hôte les réponses immunitaires à des antigènes de différentes sortes, telles que la N-acétylmura-myl-L-alanyl-D-isoglutamine. A ce titre, il peut être utilisé en 3s tant qu'agent permettant la vérification ou la confirmation de la nature de l'action adjuvante de substances étudiées en rapport avec cette propriété.

Claims

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1. Procédé de fabrication de N-acétyl-muramyl-D-alanyl-D-isoglutamine, caractérisé en ce que l'on fait réagir l'acide N-acétyl-muramique, dont les fonctions —OH libres, à l'exception de celle du groupe propionyle de l'acide muramique, ont été préalablement protégées, avec le peptide correspondant dont les fonctions — OH libres ont été également préalablement protégées, puis on libère les fonctions initialement protégées.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fixe d'abord la D-alanine sur l'acide N-acétyl-muramique, puis la D-glutamine sur le produit obtenu.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les fonctions — OH des réactifs, à l'exception de celle du groupe propionyle de l'acide muramique, sont bloquées par des groupes benzyle ou benzylidène.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les groupes protégés sont libérés par une hydrolyse acide.