**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.
PATENTANSPRÜCHE
1. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Hormonen oder hormonbindenden Proteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen, gekennzeichnet durch zwei lösbar miteinander verbundene Röhrchen, von denen das eine (1), unten geschlossene, als Messröhrchen dient und zur Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeit zusammen mit einer ein radioaktiv markiertes Hormon und den entsprechenden Antikörper bzw.
das entsprechende hormonbindende Protein enthaltenden Lösung vorgesehen ist, und das andere (3), welches aus einem Thermoplasten, der 10 bis 60 Gew.-0/o eines Ionenaustauschers enthält, besteht und am äusseren Ende durch einen Verschluss (4) verschliessbar ist und dessen innere Oberfläche (5) hinsichtlich des zu bestimmenden oder des zur Bestimmung verwendeten Hormons adsorptive Eigenschaften aufweist, als Adsorptionsröhrchen dient.
2. Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorptionsröhrchen (3) aus Hochdruckpolyäthylen, welches 20 bis 40 Gew.-0Io eines lonenaustauschers enthält, besteht.
3. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lonenaustauscher eine mittlere Korngrösse von 0,04 bis 1,0 mm Durchmesser, eine Austauscherkapazität von 0,3 bis 3 Val/l und einen Vernetzungsanteil von 1 bis 12% aufweist.
4. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher eine mittlere Korngrösse von 0,08 bis 0,2 mm Durchmesser, eine Austauscherkapazität von 0,5 bis 1,5 Val/l und einen Vernetzungsanteil von 4 bis 1001o aufweist.
5. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lonenaustauscher ionisierbare quaternäre Aminogruppen aufweist.
6. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lonenaustauscher ionisierbare quaternäre Aminogruppen besitzt und eine mittlere Korngrösse von 0,04 bis 1,0 mm Durchmesser, eine Austauscherkapazität von 0,3 bis 3 Val/l und einen Vernetzungsanteil von 1 bis 12% aufweist.
7. Verfahren zum Betrieb der Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man jeweils bestimmte Mengen einer Lösung eines radioaktiv markierten Hormons sowie des Antikörpers oder des hormonbindenden Proteins und eine bestimmte Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit in das Messröhrchen (1) gibt, dieses mit dem Adsorptionsröhrchen (3) verbindet, dieses mittels des Verschlusses (4) verschliesst, die in der Vorrichtung befindliche Flüssigkeit während einer bestimmten Zeit mit der inneren Oberfläche (5) des Adsorptionsröhrchens (3) in Berührung bringt, anschliessend den nicht adsorbierten Teil der Flüssigkeit in das Messröhr chen (1) ablaufen lässt und die Restaktivität der Flüssigkeit im Messröhrchen (1) bestimmt.
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Flüssigkeit dadurch mehrfach mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchens in Berührung bringt, dass man die Vorrichtung aus Mess- und Adsorptionsröhrchen um eine Achse senkrecht zur Zylinderachse dreht.
9. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Konzentration von Hormonen im Blut bestimmt.
10. Verfahren nach Patentanspruch 7 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Thyroxinkonzentration im Blut bestimmt, wobei man als radioaktiven Indikator mit 125J oder 131 J markiertes Thyroxin verwendet.
11. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man indirekt die TBG-Kapazität des Blutserums bestimmt, wobei als radioaktiver Indikator mit 125J oder 131 J markiertes L-Trijodthyronin verwendet wird.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Hormonen oder hormonbindenden Proteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen sowie ein Verfahren zum Betrieb dieser Vorrichtung.
Die in bestimmten Drüsen des Körpers synthetisierten und in die Blutbahn abgegebenen Hormone kommen im Blut in sehr geringen Konzentrationen vor. Ihre genaue quantitative Bestimmung ist erst durch die Verwendung radioaktiv markierter Indikatoren möglich geworden.
Nach der chemischen Natur des zu untersuchenden Hormons unterscheidet man zwischen zwei Analysenverfahren.
Besitzt das Hormon immunogene Eigenschaften, das heisst lassen sich mit ihm geeignete Antikörper erzeugen, verwendet man zur Bestimmung den sogenannten Radioimmunoassay.
Besitzt das Hormon keine immunogenen Eigenschaften, so verwendet man die sogenannte kompetitive Protein-Bindungsanalyse. Beiden Verfahren ist gemeinsam, dass ein bestimmter Teil des Hormons aus der Reaktionslösung mit Hilfe eines Austauschers oder einer anderen hierfür geeigneten Substanz entfernt werden muss.
Bei bekannten radio-immunochemischen Bestimmungsmethoden wird zum Beispiel eine Mischung aus bekannten Mengen eines Hormons und des gleichen, aber radioaktiv markierten Hormons, mit einem spezifischen Antikörper unter Bildung eines Komplexes zur Reaktion gebracht. Zur Markierung wird ein geeignetes Nuklid, wie zum Beispiel 125J, 131J, 14C, 3H verwendet. Zwischen dem Antikörper und dem Hormon stellt sich ein Reaktions-Gleichgewicht ein, wobei geringe Mengen des Hormons in nicht gebundener Form vorliegen. Dieser freie Anteil ist bei konstanter Antikörperkonzentration direkt proportional der Gesamtmenge des zugesetzten Hormons. Mit einem geeigneten Adsorptionsmittel wird er entfernt und bestimmt. Man zeichnet danach eine Standardkurve, die die Bestimmung einer unbekannten Menge des Hormons erlaubt.
Bei der gleichfalls bekannten kompetitiven Proteinbindungsanalyse wird die Tatsache genutzt, dass Hormone, insbesondere solche mit sehr kleinem Molekulargewicht, im Blut von spezifischen Proteinen gebunden und transportiert werden. Diese Funktion übernimmt beispielsweise für die beiden Schilddrüsenhormone Thyroxin und Trijodthyronin ein a-Globulin, das Thyroxine-Binding-Globulin (TBG). Solche Proteine lassen sich ähnlich wie die Antikörper in den radio-immunochemischen Methoden als primäre Komplexbildner für das betreffende Hormon verwenden. Der freie Hormonanteil wird wiederum von der Lösung getrennt und bestimmt.
Eine Variante dieses Verfahrens stellt die Bestimmung der
Kapazität der Trägerproteine im Serum dar. Das Serum, in dem die Kapazität des Proteins für das bestimmte Hormon ermittelt werden soll, wird mit einer geringen Menge des radioaktiv markierten Hormons versetzt. Zwischen dem Trägerpro tein und dem markierten Hormon findet eine Reaktion statt, bei der das markierte Hormon zum Teil das gebundene inaktive ersetzt und zum Teil selbst direkt gebunden wird. Der nicht gebundene Anteil wird aus der Lösung adsorptiv entfernt und bestimmt. Dieser freie Anteil ist umgekehrt proportional der freien Kapazität des Serumproteins.
Alle diese Methoden haben als gemeinsamen Schritt die
Entfernung des freien Anteils des Hormons aus der Lösung und dessen Bestimmung. Bisher wurden zu diesem Zweck Ionenaus tauscher, wie Amberlite und in Form von Körnern oder eingebet tet in Polyurethanschwamm oder als Folie verwendet. Bei allen diesen Methoden sind nach der Inkubation der Lösung mit dem
Adsorbens zusätzliche zeitraubende und Fehlerquellen beinhal
tende Schritte notwendig. So muss bei der Verwendung von lonenaustascherkörnern nach der Inkubation abzentrifugiert werden, um eine einwandfreie Pipettierung des Überstandes zu ermöglichen. In manchen Fällen werden zusätzlich die Körner noch vor der Messung mehrmals gewaschen. Der Einsatz von Folien und Schwämmen ist zwar ein Fortschritt den Körnern gegenüber, ist jedoch umständlich und zeitraubend: Die Folie muss nämlich vor ihrem Einsatz feucht gehalten werden; bei ihrer Entfernung aus der Lösung können Fehler (Tropfen an der Folie) entstehen. Bei der Verwendung des Austauscherschwammes muss dafür Sorge getragen werden, dass die Luft vor dem Adsorptionsvorgang aus dem Schwamm entfernt ist und nach der Inkubation der Schwamm genügend gewaschen wird.
Es wurde nun gefunden, dass sich die den bekannten Methoden und den zu ihrer Durchführung verwendeten Vorrichtungen anhaftenden Nachteile vermeiden lassen, wenn man zur quantitativen Bestimmung von Hormonen oder hormonbindenden Proteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen die erfindungsgemässe Vorrichtung, welche durch zwei lösbar miteinander verbundene Röhrchen, von denen das eine, unten geschlossene, als Messröhrchen dient und zur Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeit zusammen mit einer ein radioaktiv markiertes Hormon und den entsprechenden Antikörper bzw.
das entsprechende hormonbindende Protein enthaltenden Lösung vorgesehen ist, und das andere, welches aus einem Thermoplasten, der 10 bis 60 Gew.- /0 eines lonenaustauschers enthält, besteht und am äusseren Ende durch einen Verschluss verschliessbar ist und dessen innere Oberfläche hinsichtlich des zu bestimmenden oder des zur Bestimmung verwendeten Hormons adsorptive
Eigenschaften aufweist, als Adsorptionsröhrchen dient, gekennzeichnet ist, einsetzt und diese Vorrichtung in der Weise betreibt, dass man jeweils bestimmte Mengen einer Lösung eines radioaktiv markierten Hormons sowie des Antikörpers oder des hormonbindenden Proteins und eine bestimmte
Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit in das Messröhrchen gibt, dieses mit dem Adsorptionsröhrchen verbindet, dieses mittels des Verschlusses verschliesst,
die in der Vorrichtung befindliche Flüssigkeit während einer bestimmten Zeit mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchens in Berührung bringt, anschliessend den nicht adsorbierten Teil der Flüssig keit in das Messröhrchen ablaufen lässt und die Restaktivität der Flüssigkeit im Messröhrchen bestimmt.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der erfin dungsgemässen Vorrichtung ist in der Figur dargestellt.
Die in der Figur dargestellte Vorrichtung weist die folgen den Bestandteile auf:
Das Messröhrchen 1 zur Aufnahme der zu untersuchenden
Flüssigkeit 2, welche das Hormon und den Antikörper oder das hormonbindende Protein sowie das radioaktiv markierte Hor mon enthält und ein Adsorptionsröhrchen 3, welches mit einem
Verschluss 4 ausgestattet ist und dessen innere Oberfläche 5 adsorbierende Eigenschaften aufweist.
Das Messröhrchen kann aus Glas oder Kunststoff bestehen.
Bevorzugt wird es aus Polyäthylen hergestellt. Länge und
Breite können variieren und hängen von den verfügbaren Volu men der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. der Bohrloch grösse des Detektors ab.
Das Adsorptionsröhrchen besteht aus einem Thermopla sten, der 10-60 Gew.-0/o eines Ionenaustauschers enthält. Eine bevorzugte Form besteht aus Hochdruckpolyäthylen, welches
20-40 Gew.-0lo eines Anionenaustauschers mit ionisierbaren quaternären Aminogruppen enthält. Die Länge der Adsorp tionsröhrchen ist abhängig von der Austauscheraktivität und beträgt zweckmässig 1 bis 6 cm.
Die Herstellung des Adsorptionsröhrchens erfolgt zweck mässig durch thermoplastische Verarbeitung von homogenisierten Mischungen aus Thermoplasten und geeigneten Ionenaustauschern. Als Thermoplasten eignen sich solche Polymere, deren Verarbeitungstemperaturen zwischen 100"C und 200"C, vorzugsweise zwischen 130"C und 1700C liegen. Zum Beispiel können verwendet werden:
Polyäthylen: Hochdruckpolyäthylen mit Schmelzindices (i5) von 0,3 bis 70, vorzugsweise 0,3 bis 10, gemessen nach DIN Norm 53 735 bei 190 C.
Niederdruckpolyäthylen mit Schmelzindices (i5) von 0,3 bis 30, vorzugsweise 10 bis 30, gemessen nach DIN Norm 53 753 bei 1900C.
Polypropylene mit Schmelzindices (i2) von 0,4 bis 40, vorzugsweise 5-30, gemessen nach DIN Norm 53 753 E bei 230"C.
Polyoxymethylene erhalten durch Homo- oder Copolymerisation von Trioxan und Formaldehyd und cyclischen Acetalen mit Schmelzindices (i2) zwischen 1 und 50, vorzugsweise zwischen 15 und 50, gemessen nach DIN Norm 53753 bei 1900C.
Polystyrole mit Schmelzindices (i5) von 2 bis 30, vorzugsweise von 5 bis 25, gemessen nach DIN Norm 53 735 bei 200 C.
Poly(meth)-acrylate mit Schmelzindices von 0,4 bis 10, vorzugsweise von 5 bis 10, gemessen nach ASTMD 1238-62 T.
Polyvinylchlorid mit K-Werten von 40-80, vorzugsweise von 50-70, gemessen nach DIN Norm 53 726 in Cyclohexanon bei 25 C.
Polyester aus zweibasigen Carbonsäuren und Diolen, wobei Polyester aus linearen apliphatischen Dicarbonsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen und a,co-Diolen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen zum Beispiel SebacinsäurelÄthylenglykol-Polyester besonders geeignet sind.
Polyamide aus zweibasigen Dicarbonsäuren und Diaminen, wobei der Schmelzpunkt der Polymeren durch Einbau von zum Beispiel Ather-, Methylol- oder Estergruppen oder durch Cokondensation herabgesetzt wird.
Als lonenaustauscher können sowohl Anionen- als auch Kationenaustauscher mit mittleren Korngrössen von 0,04 bis 1,0 mm Durchmesser, vorzugsweise 0,08 bis 0,2 mm Durchmesser eingemischt werden. Die Austauscherkapazität beträgt allgemein 0,3 bis 3 Val/l, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 Val/l. Die Austauscherharze sind in der Regel vernetzt; der Vernetzeranteil liegt zwischen 1 und 120/0, vorzugsweise zwischen 4 und 10 %. Als handelsübliche lonenaustauscherpulver sind Amberliter CG 400, Amerlit(H)' IRA 402, Amberlite' 200 und Dowexe geeignet.
Die Mischungen aus Thermoplasten und lonenaustauscher, die 10 bis 60 Gewichtsprozent, vorzugsweise 20 bis 40 Gewichtsprozent, Austauscherharz enthalten, werden auf Walzen, Kalandern, Knetern oder Extrudern, vorzugsweise Doppelschneckenextrudern, bei Temperaturen zwischen 100"C und 200"C, vorzugsweise zwischen 1300C und 170"C homogenisiert.
Die Herstellung der Adsorptionsröhrchen kann dann sowohl auf Extrusions- als auch auf Spritzgussmaschinen erfolgen.
Bei der Extrusionsverarbeitung wird die homogenisierte Mischung vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 130"C und 170 0C durch eine Ringdüse befördert und über einen Kalibrierungstank bei einem Unterdruck von 1 bis 15 m Wassersäule, vorzugsweise 2 bis 10 m Wassersäule, synchron abgezogen. Das so erhaltene endlose Rohr wird auf die den Adsorptionsröhrchen entsprechende Länge zugeschnitten und die äussere Oberfläche an beiden Enden abgedreht, um einen dichten Verschluss zwischen Adsorptionsröhrchen und Messröhrchen sowie Verschlusskappe zu gewährleisten.
Bei der Spritzgussverarbeitung wird die Mischung im gleichen Temperaturbereich verarbeitet. Das erhaltene Röhrchen hat die für die Dichtigkeit der erfindungsgemässen Vorrichtung erforderlichen Dimensionen. Nachträglich kann in diesem Fall die innere Oberfläche des Formkörpers zur Verbesserung der Adsorptionseigenschaften aufgebohrt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geht man vorzugsweise so vor, dass man die zu untersuchende Flüssigkeit 2, die das Hormon, das als Indikator dienende radioaktiv markierten Hormons sowie eine Lösung eines mit dem Hormon reagierenden Antikörpers oder eines hormonbindenden Proteins enthält, in das Messröhrchen 1 einbringt, auf dieses das Adsorptionsröhrchen 3 aufsteckt oder aufschraubt, die Vorrichtung verschliesst und die Radioaktivität im Messröhrchen misst. Dann bringt man die Flüssigkeit 2 mehrfach mit der Adsorptionsfläche 5 des Adsorptionsröhrchens 3 in Berührung, indem man die Vorrichtung aus Messröhrchen 1 und Adsorptionsröhrchen 3 um eine Achse senkrecht zur Zylinderachse dreht, oder indem man die Vorrichtung schüttelt.
Zweckmässigerweise befestigt man die aus Messröhrchen 1 und Adsorptionsröhrchen 3 bestehende Vorrichtung auf einen Rotator auf und lässt während einer bestimmten Zeit um eine Achse senkrecht zur Zylinderachse rotieren.
Während dieses Vorganges kommt die Lösung mehrfach in Berührung mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchens, wobei der freie Anteil des Hormons adsorbiert und somit aus der Lösung entfernt wird. Nach Beendigung der Adsorption wird die Vorrichtung aufgerichtet, damit die Flüssigkeit aus dem Adsorptionsröhrchen nach unten in das Messröhrchen zurückfliesst und den an der Oberfläche adsorbierten Hormonanteil zurücklässt. Die Trennung der beiden Anteile ist auf diese Weise ausgeführt. Die noch in der Lösung verbliebene Aktivität wird nun, ohne das Adsorptionsröhrchen abzunehmen, zum Beispiel in einem Bohrlochdetektor oder einem automatischen Gamma-Probenwechsler gemessen. Das Adsorptionsröhrchen braucht nicht entfernt zu werden, was sehr vorteilhaft ist, weil dadurch Kontaminationen vermieden werden.
Ein Pipettieren ist ebenfalls nicht notwendig.
Vorteilhaft kann mit dem Verfahren gemäss der Erfindung die Konzentration eines Hormons im Blut bestimmt werden.
Zur Bestimmung der TBG-Kapazität zum Beispiel bringt man in ein Messröhrchen eine genügende Menge radioaktiv markiertes L-Trijodthyronin (T3*) in einem geeigneten Puffer gelöst und gibt das zu untersuchende Serum hinzu. Die spezifische Aktivität des verwendeten T3* kann zwischen 10-200 mCi/mg T3 liegen; im Prinzip sind jedoch sowohl höhere als auch niedrigere Werte möglich. Als Pufferlösung kann jedes System, das eine genügende Pufferkapazität im pH-Bereich von 5-9 hat, benutzt werden. Geeignet sind zum Beispiel die Systeme Tris(hydroxymethyl)-amino-methan/HC1 oder Barbi tal-NaIHCl oder Phosphat nach Sörensen. Der pH-Wert der Pufferlösung sollte zweckmässig 7 sein, kann aber auch grösser oder kleiner sein. Das T3* reagiert mit dem TBG, wobei es zum grössten Teil von ihm gebunden wird.
Man setzt nun das Adsorptionsröhrchen auf, verschliesst die Vorrichtung und misst die Anfangsradioaktivität zum Beispiel in einem Bohrlochdetektor oder automatischen Gamma-Probenwechsler.
Die Länge des aufgesetzten Adsorbtionsröhrchens kann zweckmässig zwischen 1 und 6 cm variieren, abhängig von der Anzahl der adsorbierenden Stellen pro Flächeneinheit. Man befestigt zum Beispiel die erfindungsgemässe Vorrichtung auf einem Rotator und lässt sie eine bestimmte Zeit lang rotieren, wobei die Flüssigkeit mehrfach mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchen in Berührung kommt. Dabei wird das T3 aktiv und inaktiv - im Adsorptionsröhrchen adsorbiert und so aus der Lösung entfernt. Nach beendeter Adsorption wird die Vorrichtung aufgerichtet und nach einigen Minuten die in der Lösung verbliebene Aktivität, wie bereits beschrieben, gemessen.
Das Verfahren gemäss der Erfindung kann in entsprechender Weise zur absoluten Bestimmung der Sch;'ddrüsenhor- mone Thyroxin und Trijodthyronin benutzt werden. Man benötigt hierzu eine TBG-Lösung konstanter Kapazität, mit deren Hilfe eine Standardkurve erstellt wird. Die TBG-Lösung kann nach bekannten säulenchromatographischen Verfahren hergestellt werden. Zu dieser TBG-Lösung wird radioaktiv markiertes Thyroxin (T4*) gegeben, das nach der Gleichung T4*+TBGoTBG-T4* gebunden wird. Wird nun diese Lösung mit inaktivem Thyroxin (T4) versetzt, so wird ein Teil des an das TBG gebundenen aktiven Thyroxins verdrängt und liegt in ungebundener Form vor.
Da diese Menge des verdrängten aktiven Thyroxins direkt proportional dem zugesetzten inaktiven Thyroxin ist, lässt sich eine Beziehung zwischen dem freien T4* und dem zugesetzten T4 aufstellen, die in Form einer Standardkurve graphisch wiedergegeben werden kann.
Zur Bestimmung des T4-Gehalts im Serum werden die Schilddrüsenhormone durch Denaturierung der Trägerproteine mit Alkohol freigesetzt. Der alkoholische Extrakt von L-Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) kann zwecks Konzentrierung eingedampft und erneut aufgelöst werden. Ein aliquoter Teil der Lösung wird zur TBG-T4*-Lösung in das Messröhrchen pipettiert, das Adsorptionsröhrchen gemäss der Erfindung aufgesetzt und ähnlich der T3-Bestimmung zum Beispiel 1 Stunde lang gedreht. Dabei wird das freie T4* im Adsorptionsröhrchen adsorbiert und so aus der Lösung entfernt. Aus dem Quotienten Restaktivität/Anfangsaktivität lässt sich mit Hilfe der Standardkurve die T4-Menge des zu untersuchenden Serums ermitteln. Der abgelesene Wert wird als T4 angegeben, da die T3-Menge im Vergleich dazu sehr gering ist.
In entsprechender Weise kann das erfindungsgemässe Verfahren benutzt werden, um Hormone radio-immunologisch zu bestimmen.
Durch das Verfahren und die Vorrichtung gemäss der Erfindung wird die Bestimmung von Hormonen einfacher und sicherer durchführbar. Das gilt insbesondere für das Abtrennen des freien Anteils des Hormons aus der Lösung. Umständliche Schritte wie Pipettieren, Zentrifugieren und Waschen entfallen.
Es werden gut reproduzierbare Werte erhalten.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das Adsorptionsröhrchen aus thermoplastischem Material und Austauscher keinerlei Quellvorgänge aufweist, die bei fester Verbindung das Messröhrchen sprengen könnten.
Herstellungs-Beispiele für Adsorptionsröhrchen 1. Beispiel
Niederdruckpolyäthylen mit 30010 AmberlitetCG 400 1 in der Chloridform wird über Nacht im Vakuum getrocknet und nach dem Vermischen auf einem Zweischnecken-Extruder granuliert. Das Granulat wird zur Herstellung eines endlosen Rohres mit einem Extruder getrocknet. Aus dem nach diesem Verfahren hergestellten Rohr werden Tuben der Länge 6 cm geschnitten und zur Adsorption verwendet.
2. Beispiel
Hochdruckpolyäthylen mit 35010 AmberliteCG 400 1 in der Chloridform wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet, gut vermischt und auf einem Zwei-Schnecken-Extruder granuliert. Das getrocknete Granulat wird dann zur Herstellung eines endlosen Rohres verwendet aus dem Tuben der Länge 5 cm geschnitten und zur Adsorption eingesetzt werden.
3. Beispiel
Granulat aus Hochdruckpolyäthylen mit 35010 Amber lite69CG 400 I, Cl-Form wurde zur Herstellung spritzgegossener Tuben der Länge 5 cm verwendet.
Anwendungsbeispiel: Bestimmung der TBG-Kapazität a) Herstellung der L-Trijodthyronin-l25J-Lösung
Zu einer 1 0liegen Tris(hydroxy-methylfaminomethan- Lösung, deren pH-Wert mit konz. HCI auf 7,4 eingestellt ist, gibt man eine entsprechende Menge L-Trijodthyronin-125J(T3*) der spezifischen Aktivität 100 mCilmg, so dass die Aktivitätskonzentration etwa 0,7,uCi/ml beträgt.
b) Standard-Serum
Serum mit normaler TBG-Bindungskapazität, gewonnen aus
Blut von Personen mit normalfunktionierender Schilddrüse.
c) Bestimmung der TBG-Kapazität
Dem Patienten, dessen Schilddrüsenfunktion untersucht werden soll, werden etwa 5 ml Blut entnommen. Aus dem daraus nach Gerinnung und Zentrifugation der Blutkörperchen gewonnene Serum pipettiert man 0,2 ml in ein Messröhrchen aus Polypropylen, das 3,3 ml der T3*-Lösung enthält, setzt das nach den Beispielen 1-3 hergestellte Adsorptionsröhrchen auf, verschliesst die Vorrichtung und lässt etwa 10 Minuten stehen.
Entsprechend verfährt man mit dem Standardserum. Während dieser Zeit wird die Gesamtaktivität der Flüssigkeit in einem Bohrlochdetektor oder in einem automatisch arbeitenden Gamma-Proben-Wechsler gemessen. Die Vorrichtung wird anschliessend in einen Rotator eingespannt und eine Stunde lang mit 13 Umdrehungen pro Minute gedreht. Danach richtet man die Vorrichtung auf, lässt die im Adsorptionsröhrchen befindliche Flüssigkeit nach unten abfliessen und misst die in der flüssigen Phase verbliebene Aktivität. Man berechnet den Quotienten G=Restaktivität:Anfangsaktivität für das
Patienten- und das Standardserum und vergleicht sie miteinander.
Man berechnet die prozentuale Thyroxin-Bindungs-Kapazität des Patientenserums nach der Gleichung
G(Patientenserum)
TBK = G(Standardserum) loo Im allgemeinen steigt der TBK-Wert im Vergleich zum normalen Serum beim Vorliegen einer Hypothyreose und fällt bei einer Hyperthyreose ab.
5. Beispiel Bestimmung der Thyroxinkonzentration im Serum
Je 0,5 ml des zu untersuchenden Serums und des Kontrollserums mit einer bekannten Menge nicht markiertem T4 werden in je einem zentrifugierbarem Röhrchen zu je 1,0 ml gegeben und 30 sec. lang auf einem Whirlmixer durchmischt. Man lässt dann 10 min. stehen und zentrifugiert die denaturierten Proteine bei 2500 Upm ab. Die Extraktionsausbeute beträgt 72010 des ursprünglich vorhandenen T4.
Zur Bestimmung des Thyroxingehaltes werden jeweils 0,3 ml des alkoholischen Extraktes in Messröhrchen pipettiert, die 3,3 ml einer nach bekannten säulenchromatographischen Verfahren hergestellte TBG-Lösung und 0,02 pCi/ml mit 125J markiertes Thyroxin enthalten. Zur Erstellung der Standardkurve werden je 0,3 ml einer Standardlösung von 5 bzw. 20 Lg Thyroxin/100 ml ebenso behandelt. Man setzt nun die Adsorptionsröhrchen auf die Messröhrchen, verschliesst die Vorrichtungen und misst nach gründlicher Durchmischung die Gesamtaktivitäten der Lösungen. Zur Adsorption der freien T4-125J-Aktivität werden die Vorrichtungen anschliessend 60 min. lang bei Zimmertemperatur auf einem Rotator mit 13 Umdrehungen pro Minute über Kopf gedreht.
Danach werden die Vorrichtungen aufgerichtet, so dass die Lösung vollständig aus den Adsorptionsröhrchen in die Messröhrchen läuft. Dort wird die in der Lösung verbliebene Restradioaktivität gemessen. Man berechnet nun den Quotienten
Restradioaktivität loo
Gesamtradioaktivität für jede Probe. Die erhaltenen Werte für die Standardproben werden gegen die in den Standardlösungen enthaltenen Mengen Thyroxin in ein Diagramm eingetragen und die beiden Punkte mit einer Geraden verbunden. Man erhält so die Standardkurve. Die unbekannten Gehalte der zu untersuchenden Seren können nun mit Hilfe des Quotienten G der Standardkurve ermittelt werden. Der Thyroxingehalt des Serums ergibt sich aus dem abgelesenen Wert und der Extraktionsausbeute.
Die oben genannte TBG-Lösung wird aus einer bei der säulenchromatographischen Reinigung der Serums anfallenden TBG-haltigen Fraktion (sogenannter Abguss II nach K. Heide und H. Haupt, Behringwerke Mitteilungen Band 43 [1964l 161) hergestellt. Dabei wird die entsprechende Fraktion erst gegen Wasser dialysiert und anschliessend mit 0,1 m Tris(-hydroxy methyl)-aminomethanlHC1-Puffer auf einen Gesamtproteingehalt von 0,022 g/100 ml verdünnt. Zur Stabilisierung und Konservierung wird 0,02 Gew.- /0 NaN3 zugesetzt.