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PATENTANSPRÜCHE
1. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Hormonen oder hormonbindenden Proteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen, gekennzeichnet durch zwei lösbar miteinander verbundene Röhrchen, von denen das eine (1), unten geschlossene, als Messröhrchen dient und zur Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeit zusammen mit einer ein radioaktiv markiertes Hormon und den entsprechenden Antikörper bzw.
das entsprechende hormonbindende Protein enthaltenden Lösung vorgesehen ist, und das andere (3), welches aus einem Thermoplasten, der 10 bis 60 Gew.-0/o eines Ionenaustauschers enthält, besteht und am äusseren Ende durch einen Verschluss (4) verschliessbar ist und dessen innere Oberfläche (5) hinsichtlich des zu bestimmenden oder des zur Bestimmung verwendeten Hormons adsorptive Eigenschaften aufweist, als Adsorptionsröhrchen dient.
2. Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorptionsröhrchen (3) aus Hochdruckpolyäthylen, welches 20 bis 40 Gew.-0Io eines lonenaustauschers enthält, besteht.
3. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lonenaustauscher eine mittlere Korngrösse von 0,04 bis 1,0 mm Durchmesser, eine Austauscherkapazität von 0,3 bis 3 Val/l und einen Vernetzungsanteil von 1 bis 12% aufweist.
4. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher eine mittlere Korngrösse von 0,08 bis 0,2 mm Durchmesser, eine Austauscherkapazität von 0,5 bis 1,5 Val/l und einen Vernetzungsanteil von 4 bis 1001o aufweist.
5. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lonenaustauscher ionisierbare quaternäre Aminogruppen aufweist.
6. Vorrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lonenaustauscher ionisierbare quaternäre Aminogruppen besitzt und eine mittlere Korngrösse von 0,04 bis 1,0 mm Durchmesser, eine Austauscherkapazität von 0,3 bis 3 Val/l und einen Vernetzungsanteil von 1 bis 12% aufweist.
7. Verfahren zum Betrieb der Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man jeweils bestimmte Mengen einer Lösung eines radioaktiv markierten Hormons sowie des Antikörpers oder des hormonbindenden Proteins und eine bestimmte Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit in das Messröhrchen (1) gibt, dieses mit dem Adsorptionsröhrchen (3) verbindet, dieses mittels des Verschlusses (4) verschliesst, die in der Vorrichtung befindliche Flüssigkeit während einer bestimmten Zeit mit der inneren Oberfläche (5) des Adsorptionsröhrchens (3) in Berührung bringt, anschliessend den nicht adsorbierten Teil der Flüssigkeit in das Messröhr chen (1) ablaufen lässt und die Restaktivität der Flüssigkeit im Messröhrchen (1) bestimmt.
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Flüssigkeit dadurch mehrfach mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchens in Berührung bringt, dass man die Vorrichtung aus Mess- und Adsorptionsröhrchen um eine Achse senkrecht zur Zylinderachse dreht.
9. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Konzentration von Hormonen im Blut bestimmt.
10. Verfahren nach Patentanspruch 7 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Thyroxinkonzentration im Blut bestimmt, wobei man als radioaktiven Indikator mit 125J oder 131 J markiertes Thyroxin verwendet.
11. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man indirekt die TBG-Kapazität des Blutserums bestimmt, wobei als radioaktiver Indikator mit 125J oder 131 J markiertes L-Trijodthyronin verwendet wird.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Hormonen oder hormonbindenden Proteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen sowie ein Verfahren zum Betrieb dieser Vorrichtung.
Die in bestimmten Drüsen des Körpers synthetisierten und in die Blutbahn abgegebenen Hormone kommen im Blut in sehr geringen Konzentrationen vor. Ihre genaue quantitative Bestimmung ist erst durch die Verwendung radioaktiv markierter Indikatoren möglich geworden.
Nach der chemischen Natur des zu untersuchenden Hormons unterscheidet man zwischen zwei Analysenverfahren.
Besitzt das Hormon immunogene Eigenschaften, das heisst lassen sich mit ihm geeignete Antikörper erzeugen, verwendet man zur Bestimmung den sogenannten Radioimmunoassay.
Besitzt das Hormon keine immunogenen Eigenschaften, so verwendet man die sogenannte kompetitive Protein-Bindungsanalyse. Beiden Verfahren ist gemeinsam, dass ein bestimmter Teil des Hormons aus der Reaktionslösung mit Hilfe eines Austauschers oder einer anderen hierfür geeigneten Substanz entfernt werden muss.
Bei bekannten radio-immunochemischen Bestimmungsmethoden wird zum Beispiel eine Mischung aus bekannten Mengen eines Hormons und des gleichen, aber radioaktiv markierten Hormons, mit einem spezifischen Antikörper unter Bildung eines Komplexes zur Reaktion gebracht. Zur Markierung wird ein geeignetes Nuklid, wie zum Beispiel 125J, 131J, 14C, 3H verwendet. Zwischen dem Antikörper und dem Hormon stellt sich ein Reaktions-Gleichgewicht ein, wobei geringe Mengen des Hormons in nicht gebundener Form vorliegen. Dieser freie Anteil ist bei konstanter Antikörperkonzentration direkt proportional der Gesamtmenge des zugesetzten Hormons. Mit einem geeigneten Adsorptionsmittel wird er entfernt und bestimmt. Man zeichnet danach eine Standardkurve, die die Bestimmung einer unbekannten Menge des Hormons erlaubt.
Bei der gleichfalls bekannten kompetitiven Proteinbindungsanalyse wird die Tatsache genutzt, dass Hormone, insbesondere solche mit sehr kleinem Molekulargewicht, im Blut von spezifischen Proteinen gebunden und transportiert werden. Diese Funktion übernimmt beispielsweise für die beiden Schilddrüsenhormone Thyroxin und Trijodthyronin ein a-Globulin, das Thyroxine-Binding-Globulin (TBG). Solche Proteine lassen sich ähnlich wie die Antikörper in den radio-immunochemischen Methoden als primäre Komplexbildner für das betreffende Hormon verwenden. Der freie Hormonanteil wird wiederum von der Lösung getrennt und bestimmt.
Eine Variante dieses Verfahrens stellt die Bestimmung der
Kapazität der Trägerproteine im Serum dar. Das Serum, in dem die Kapazität des Proteins für das bestimmte Hormon ermittelt werden soll, wird mit einer geringen Menge des radioaktiv markierten Hormons versetzt. Zwischen dem Trägerpro tein und dem markierten Hormon findet eine Reaktion statt, bei der das markierte Hormon zum Teil das gebundene inaktive ersetzt und zum Teil selbst direkt gebunden wird. Der nicht gebundene Anteil wird aus der Lösung adsorptiv entfernt und bestimmt. Dieser freie Anteil ist umgekehrt proportional der freien Kapazität des Serumproteins.
Alle diese Methoden haben als gemeinsamen Schritt die
Entfernung des freien Anteils des Hormons aus der Lösung und dessen Bestimmung. Bisher wurden zu diesem Zweck Ionenaus tauscher, wie Amberlite und in Form von Körnern oder eingebet tet in Polyurethanschwamm oder als Folie verwendet. Bei allen diesen Methoden sind nach der Inkubation der Lösung mit dem
Adsorbens zusätzliche zeitraubende und Fehlerquellen beinhal
tende Schritte notwendig. So muss bei der Verwendung von lonenaustascherkörnern nach der Inkubation abzentrifugiert werden, um eine einwandfreie Pipettierung des Überstandes zu ermöglichen. In manchen Fällen werden zusätzlich die Körner noch vor der Messung mehrmals gewaschen. Der Einsatz von Folien und Schwämmen ist zwar ein Fortschritt den Körnern gegenüber, ist jedoch umständlich und zeitraubend: Die Folie muss nämlich vor ihrem Einsatz feucht gehalten werden; bei ihrer Entfernung aus der Lösung können Fehler (Tropfen an der Folie) entstehen. Bei der Verwendung des Austauscherschwammes muss dafür Sorge getragen werden, dass die Luft vor dem Adsorptionsvorgang aus dem Schwamm entfernt ist und nach der Inkubation der Schwamm genügend gewaschen wird.
Es wurde nun gefunden, dass sich die den bekannten Methoden und den zu ihrer Durchführung verwendeten Vorrichtungen anhaftenden Nachteile vermeiden lassen, wenn man zur quantitativen Bestimmung von Hormonen oder hormonbindenden Proteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen die erfindungsgemässe Vorrichtung, welche durch zwei lösbar miteinander verbundene Röhrchen, von denen das eine, unten geschlossene, als Messröhrchen dient und zur Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeit zusammen mit einer ein radioaktiv markiertes Hormon und den entsprechenden Antikörper bzw.
das entsprechende hormonbindende Protein enthaltenden Lösung vorgesehen ist, und das andere, welches aus einem Thermoplasten, der 10 bis 60 Gew.- /0 eines lonenaustauschers enthält, besteht und am äusseren Ende durch einen Verschluss verschliessbar ist und dessen innere Oberfläche hinsichtlich des zu bestimmenden oder des zur Bestimmung verwendeten Hormons adsorptive
Eigenschaften aufweist, als Adsorptionsröhrchen dient, gekennzeichnet ist, einsetzt und diese Vorrichtung in der Weise betreibt, dass man jeweils bestimmte Mengen einer Lösung eines radioaktiv markierten Hormons sowie des Antikörpers oder des hormonbindenden Proteins und eine bestimmte
Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit in das Messröhrchen gibt, dieses mit dem Adsorptionsröhrchen verbindet, dieses mittels des Verschlusses verschliesst,
die in der Vorrichtung befindliche Flüssigkeit während einer bestimmten Zeit mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchens in Berührung bringt, anschliessend den nicht adsorbierten Teil der Flüssig keit in das Messröhrchen ablaufen lässt und die Restaktivität der Flüssigkeit im Messröhrchen bestimmt.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der erfin dungsgemässen Vorrichtung ist in der Figur dargestellt.
Die in der Figur dargestellte Vorrichtung weist die folgen den Bestandteile auf:
Das Messröhrchen 1 zur Aufnahme der zu untersuchenden
Flüssigkeit 2, welche das Hormon und den Antikörper oder das hormonbindende Protein sowie das radioaktiv markierte Hor mon enthält und ein Adsorptionsröhrchen 3, welches mit einem
Verschluss 4 ausgestattet ist und dessen innere Oberfläche 5 adsorbierende Eigenschaften aufweist.
Das Messröhrchen kann aus Glas oder Kunststoff bestehen.
Bevorzugt wird es aus Polyäthylen hergestellt. Länge und
Breite können variieren und hängen von den verfügbaren Volu men der zu untersuchenden Flüssigkeit bzw. der Bohrloch grösse des Detektors ab.
Das Adsorptionsröhrchen besteht aus einem Thermopla sten, der 10-60 Gew.-0/o eines Ionenaustauschers enthält. Eine bevorzugte Form besteht aus Hochdruckpolyäthylen, welches
20-40 Gew.-0lo eines Anionenaustauschers mit ionisierbaren quaternären Aminogruppen enthält. Die Länge der Adsorp tionsröhrchen ist abhängig von der Austauscheraktivität und beträgt zweckmässig 1 bis 6 cm.
Die Herstellung des Adsorptionsröhrchens erfolgt zweck mässig durch thermoplastische Verarbeitung von homogenisierten Mischungen aus Thermoplasten und geeigneten Ionenaustauschern. Als Thermoplasten eignen sich solche Polymere, deren Verarbeitungstemperaturen zwischen 100"C und 200"C, vorzugsweise zwischen 130"C und 1700C liegen. Zum Beispiel können verwendet werden:
Polyäthylen: Hochdruckpolyäthylen mit Schmelzindices (i5) von 0,3 bis 70, vorzugsweise 0,3 bis 10, gemessen nach DIN Norm 53 735 bei 190 C.
Niederdruckpolyäthylen mit Schmelzindices (i5) von 0,3 bis 30, vorzugsweise 10 bis 30, gemessen nach DIN Norm 53 753 bei 1900C.
Polypropylene mit Schmelzindices (i2) von 0,4 bis 40, vorzugsweise 5-30, gemessen nach DIN Norm 53 753 E bei 230"C.
Polyoxymethylene erhalten durch Homo- oder Copolymerisation von Trioxan und Formaldehyd und cyclischen Acetalen mit Schmelzindices (i2) zwischen 1 und 50, vorzugsweise zwischen 15 und 50, gemessen nach DIN Norm 53753 bei 1900C.
Polystyrole mit Schmelzindices (i5) von 2 bis 30, vorzugsweise von 5 bis 25, gemessen nach DIN Norm 53 735 bei 200 C.
Poly(meth)-acrylate mit Schmelzindices von 0,4 bis 10, vorzugsweise von 5 bis 10, gemessen nach ASTMD 1238-62 T.
Polyvinylchlorid mit K-Werten von 40-80, vorzugsweise von 50-70, gemessen nach DIN Norm 53 726 in Cyclohexanon bei 25 C.
Polyester aus zweibasigen Carbonsäuren und Diolen, wobei Polyester aus linearen apliphatischen Dicarbonsäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen und a,co-Diolen mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen zum Beispiel SebacinsäurelÄthylenglykol-Polyester besonders geeignet sind.
Polyamide aus zweibasigen Dicarbonsäuren und Diaminen, wobei der Schmelzpunkt der Polymeren durch Einbau von zum Beispiel Ather-, Methylol- oder Estergruppen oder durch Cokondensation herabgesetzt wird.
Als lonenaustauscher können sowohl Anionen- als auch Kationenaustauscher mit mittleren Korngrössen von 0,04 bis 1,0 mm Durchmesser, vorzugsweise 0,08 bis 0,2 mm Durchmesser eingemischt werden. Die Austauscherkapazität beträgt allgemein 0,3 bis 3 Val/l, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 Val/l. Die Austauscherharze sind in der Regel vernetzt; der Vernetzeranteil liegt zwischen 1 und 120/0, vorzugsweise zwischen 4 und 10 %. Als handelsübliche lonenaustauscherpulver sind Amberliter CG 400, Amerlit(H)' IRA 402, Amberlite' 200 und Dowexe geeignet.
Die Mischungen aus Thermoplasten und lonenaustauscher, die 10 bis 60 Gewichtsprozent, vorzugsweise 20 bis 40 Gewichtsprozent, Austauscherharz enthalten, werden auf Walzen, Kalandern, Knetern oder Extrudern, vorzugsweise Doppelschneckenextrudern, bei Temperaturen zwischen 100"C und 200"C, vorzugsweise zwischen 1300C und 170"C homogenisiert.
Die Herstellung der Adsorptionsröhrchen kann dann sowohl auf Extrusions- als auch auf Spritzgussmaschinen erfolgen.
Bei der Extrusionsverarbeitung wird die homogenisierte Mischung vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 130"C und 170 0C durch eine Ringdüse befördert und über einen Kalibrierungstank bei einem Unterdruck von 1 bis 15 m Wassersäule, vorzugsweise 2 bis 10 m Wassersäule, synchron abgezogen. Das so erhaltene endlose Rohr wird auf die den Adsorptionsröhrchen entsprechende Länge zugeschnitten und die äussere Oberfläche an beiden Enden abgedreht, um einen dichten Verschluss zwischen Adsorptionsröhrchen und Messröhrchen sowie Verschlusskappe zu gewährleisten.
Bei der Spritzgussverarbeitung wird die Mischung im gleichen Temperaturbereich verarbeitet. Das erhaltene Röhrchen hat die für die Dichtigkeit der erfindungsgemässen Vorrichtung erforderlichen Dimensionen. Nachträglich kann in diesem Fall die innere Oberfläche des Formkörpers zur Verbesserung der Adsorptionseigenschaften aufgebohrt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geht man vorzugsweise so vor, dass man die zu untersuchende Flüssigkeit 2, die das Hormon, das als Indikator dienende radioaktiv markierten Hormons sowie eine Lösung eines mit dem Hormon reagierenden Antikörpers oder eines hormonbindenden Proteins enthält, in das Messröhrchen 1 einbringt, auf dieses das Adsorptionsröhrchen 3 aufsteckt oder aufschraubt, die Vorrichtung verschliesst und die Radioaktivität im Messröhrchen misst. Dann bringt man die Flüssigkeit 2 mehrfach mit der Adsorptionsfläche 5 des Adsorptionsröhrchens 3 in Berührung, indem man die Vorrichtung aus Messröhrchen 1 und Adsorptionsröhrchen 3 um eine Achse senkrecht zur Zylinderachse dreht, oder indem man die Vorrichtung schüttelt.
Zweckmässigerweise befestigt man die aus Messröhrchen 1 und Adsorptionsröhrchen 3 bestehende Vorrichtung auf einen Rotator auf und lässt während einer bestimmten Zeit um eine Achse senkrecht zur Zylinderachse rotieren.
Während dieses Vorganges kommt die Lösung mehrfach in Berührung mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchens, wobei der freie Anteil des Hormons adsorbiert und somit aus der Lösung entfernt wird. Nach Beendigung der Adsorption wird die Vorrichtung aufgerichtet, damit die Flüssigkeit aus dem Adsorptionsröhrchen nach unten in das Messröhrchen zurückfliesst und den an der Oberfläche adsorbierten Hormonanteil zurücklässt. Die Trennung der beiden Anteile ist auf diese Weise ausgeführt. Die noch in der Lösung verbliebene Aktivität wird nun, ohne das Adsorptionsröhrchen abzunehmen, zum Beispiel in einem Bohrlochdetektor oder einem automatischen Gamma-Probenwechsler gemessen. Das Adsorptionsröhrchen braucht nicht entfernt zu werden, was sehr vorteilhaft ist, weil dadurch Kontaminationen vermieden werden.
Ein Pipettieren ist ebenfalls nicht notwendig.
Vorteilhaft kann mit dem Verfahren gemäss der Erfindung die Konzentration eines Hormons im Blut bestimmt werden.
Zur Bestimmung der TBG-Kapazität zum Beispiel bringt man in ein Messröhrchen eine genügende Menge radioaktiv markiertes L-Trijodthyronin (T3*) in einem geeigneten Puffer gelöst und gibt das zu untersuchende Serum hinzu. Die spezifische Aktivität des verwendeten T3* kann zwischen 10-200 mCi/mg T3 liegen; im Prinzip sind jedoch sowohl höhere als auch niedrigere Werte möglich. Als Pufferlösung kann jedes System, das eine genügende Pufferkapazität im pH-Bereich von 5-9 hat, benutzt werden. Geeignet sind zum Beispiel die Systeme Tris(hydroxymethyl)-amino-methan/HC1 oder Barbi tal-NaIHCl oder Phosphat nach Sörensen. Der pH-Wert der Pufferlösung sollte zweckmässig 7 sein, kann aber auch grösser oder kleiner sein. Das T3* reagiert mit dem TBG, wobei es zum grössten Teil von ihm gebunden wird.
Man setzt nun das Adsorptionsröhrchen auf, verschliesst die Vorrichtung und misst die Anfangsradioaktivität zum Beispiel in einem Bohrlochdetektor oder automatischen Gamma-Probenwechsler.
Die Länge des aufgesetzten Adsorbtionsröhrchens kann zweckmässig zwischen 1 und 6 cm variieren, abhängig von der Anzahl der adsorbierenden Stellen pro Flächeneinheit. Man befestigt zum Beispiel die erfindungsgemässe Vorrichtung auf einem Rotator und lässt sie eine bestimmte Zeit lang rotieren, wobei die Flüssigkeit mehrfach mit der inneren Oberfläche des Adsorptionsröhrchen in Berührung kommt. Dabei wird das T3 aktiv und inaktiv - im Adsorptionsröhrchen adsorbiert und so aus der Lösung entfernt. Nach beendeter Adsorption wird die Vorrichtung aufgerichtet und nach einigen Minuten die in der Lösung verbliebene Aktivität, wie bereits beschrieben, gemessen.
Das Verfahren gemäss der Erfindung kann in entsprechender Weise zur absoluten Bestimmung der Sch;'ddrüsenhor- mone Thyroxin und Trijodthyronin benutzt werden. Man benötigt hierzu eine TBG-Lösung konstanter Kapazität, mit deren Hilfe eine Standardkurve erstellt wird. Die TBG-Lösung kann nach bekannten säulenchromatographischen Verfahren hergestellt werden. Zu dieser TBG-Lösung wird radioaktiv markiertes Thyroxin (T4*) gegeben, das nach der Gleichung T4*+TBGoTBG-T4* gebunden wird. Wird nun diese Lösung mit inaktivem Thyroxin (T4) versetzt, so wird ein Teil des an das TBG gebundenen aktiven Thyroxins verdrängt und liegt in ungebundener Form vor.
Da diese Menge des verdrängten aktiven Thyroxins direkt proportional dem zugesetzten inaktiven Thyroxin ist, lässt sich eine Beziehung zwischen dem freien T4* und dem zugesetzten T4 aufstellen, die in Form einer Standardkurve graphisch wiedergegeben werden kann.
Zur Bestimmung des T4-Gehalts im Serum werden die Schilddrüsenhormone durch Denaturierung der Trägerproteine mit Alkohol freigesetzt. Der alkoholische Extrakt von L-Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) kann zwecks Konzentrierung eingedampft und erneut aufgelöst werden. Ein aliquoter Teil der Lösung wird zur TBG-T4*-Lösung in das Messröhrchen pipettiert, das Adsorptionsröhrchen gemäss der Erfindung aufgesetzt und ähnlich der T3-Bestimmung zum Beispiel 1 Stunde lang gedreht. Dabei wird das freie T4* im Adsorptionsröhrchen adsorbiert und so aus der Lösung entfernt. Aus dem Quotienten Restaktivität/Anfangsaktivität lässt sich mit Hilfe der Standardkurve die T4-Menge des zu untersuchenden Serums ermitteln. Der abgelesene Wert wird als T4 angegeben, da die T3-Menge im Vergleich dazu sehr gering ist.
In entsprechender Weise kann das erfindungsgemässe Verfahren benutzt werden, um Hormone radio-immunologisch zu bestimmen.
Durch das Verfahren und die Vorrichtung gemäss der Erfindung wird die Bestimmung von Hormonen einfacher und sicherer durchführbar. Das gilt insbesondere für das Abtrennen des freien Anteils des Hormons aus der Lösung. Umständliche Schritte wie Pipettieren, Zentrifugieren und Waschen entfallen.
Es werden gut reproduzierbare Werte erhalten.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das Adsorptionsröhrchen aus thermoplastischem Material und Austauscher keinerlei Quellvorgänge aufweist, die bei fester Verbindung das Messröhrchen sprengen könnten.
Herstellungs-Beispiele für Adsorptionsröhrchen 1. Beispiel
Niederdruckpolyäthylen mit 30010 AmberlitetCG 400 1 in der Chloridform wird über Nacht im Vakuum getrocknet und nach dem Vermischen auf einem Zweischnecken-Extruder granuliert. Das Granulat wird zur Herstellung eines endlosen Rohres mit einem Extruder getrocknet. Aus dem nach diesem Verfahren hergestellten Rohr werden Tuben der Länge 6 cm geschnitten und zur Adsorption verwendet.
2. Beispiel
Hochdruckpolyäthylen mit 35010 AmberliteCG 400 1 in der Chloridform wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet, gut vermischt und auf einem Zwei-Schnecken-Extruder granuliert. Das getrocknete Granulat wird dann zur Herstellung eines endlosen Rohres verwendet aus dem Tuben der Länge 5 cm geschnitten und zur Adsorption eingesetzt werden.
3. Beispiel
Granulat aus Hochdruckpolyäthylen mit 35010 Amber lite69CG 400 I, Cl-Form wurde zur Herstellung spritzgegossener Tuben der Länge 5 cm verwendet.
Anwendungsbeispiel: Bestimmung der TBG-Kapazität a) Herstellung der L-Trijodthyronin-l25J-Lösung
Zu einer 1 0liegen Tris(hydroxy-methylfaminomethan- Lösung, deren pH-Wert mit konz. HCI auf 7,4 eingestellt ist, gibt man eine entsprechende Menge L-Trijodthyronin-125J(T3*) der spezifischen Aktivität 100 mCilmg, so dass die Aktivitätskonzentration etwa 0,7,uCi/ml beträgt.
b) Standard-Serum
Serum mit normaler TBG-Bindungskapazität, gewonnen aus
Blut von Personen mit normalfunktionierender Schilddrüse.
c) Bestimmung der TBG-Kapazität
Dem Patienten, dessen Schilddrüsenfunktion untersucht werden soll, werden etwa 5 ml Blut entnommen. Aus dem daraus nach Gerinnung und Zentrifugation der Blutkörperchen gewonnene Serum pipettiert man 0,2 ml in ein Messröhrchen aus Polypropylen, das 3,3 ml der T3*-Lösung enthält, setzt das nach den Beispielen 1-3 hergestellte Adsorptionsröhrchen auf, verschliesst die Vorrichtung und lässt etwa 10 Minuten stehen.
Entsprechend verfährt man mit dem Standardserum. Während dieser Zeit wird die Gesamtaktivität der Flüssigkeit in einem Bohrlochdetektor oder in einem automatisch arbeitenden Gamma-Proben-Wechsler gemessen. Die Vorrichtung wird anschliessend in einen Rotator eingespannt und eine Stunde lang mit 13 Umdrehungen pro Minute gedreht. Danach richtet man die Vorrichtung auf, lässt die im Adsorptionsröhrchen befindliche Flüssigkeit nach unten abfliessen und misst die in der flüssigen Phase verbliebene Aktivität. Man berechnet den Quotienten G=Restaktivität:Anfangsaktivität für das
Patienten- und das Standardserum und vergleicht sie miteinander.
Man berechnet die prozentuale Thyroxin-Bindungs-Kapazität des Patientenserums nach der Gleichung
G(Patientenserum)
TBK = G(Standardserum) loo Im allgemeinen steigt der TBK-Wert im Vergleich zum normalen Serum beim Vorliegen einer Hypothyreose und fällt bei einer Hyperthyreose ab.
5. Beispiel Bestimmung der Thyroxinkonzentration im Serum
Je 0,5 ml des zu untersuchenden Serums und des Kontrollserums mit einer bekannten Menge nicht markiertem T4 werden in je einem zentrifugierbarem Röhrchen zu je 1,0 ml gegeben und 30 sec. lang auf einem Whirlmixer durchmischt. Man lässt dann 10 min. stehen und zentrifugiert die denaturierten Proteine bei 2500 Upm ab. Die Extraktionsausbeute beträgt 72010 des ursprünglich vorhandenen T4.
Zur Bestimmung des Thyroxingehaltes werden jeweils 0,3 ml des alkoholischen Extraktes in Messröhrchen pipettiert, die 3,3 ml einer nach bekannten säulenchromatographischen Verfahren hergestellte TBG-Lösung und 0,02 pCi/ml mit 125J markiertes Thyroxin enthalten. Zur Erstellung der Standardkurve werden je 0,3 ml einer Standardlösung von 5 bzw. 20 Lg Thyroxin/100 ml ebenso behandelt. Man setzt nun die Adsorptionsröhrchen auf die Messröhrchen, verschliesst die Vorrichtungen und misst nach gründlicher Durchmischung die Gesamtaktivitäten der Lösungen. Zur Adsorption der freien T4-125J-Aktivität werden die Vorrichtungen anschliessend 60 min. lang bei Zimmertemperatur auf einem Rotator mit 13 Umdrehungen pro Minute über Kopf gedreht.
Danach werden die Vorrichtungen aufgerichtet, so dass die Lösung vollständig aus den Adsorptionsröhrchen in die Messröhrchen läuft. Dort wird die in der Lösung verbliebene Restradioaktivität gemessen. Man berechnet nun den Quotienten
Restradioaktivität loo
Gesamtradioaktivität für jede Probe. Die erhaltenen Werte für die Standardproben werden gegen die in den Standardlösungen enthaltenen Mengen Thyroxin in ein Diagramm eingetragen und die beiden Punkte mit einer Geraden verbunden. Man erhält so die Standardkurve. Die unbekannten Gehalte der zu untersuchenden Seren können nun mit Hilfe des Quotienten G der Standardkurve ermittelt werden. Der Thyroxingehalt des Serums ergibt sich aus dem abgelesenen Wert und der Extraktionsausbeute.
Die oben genannte TBG-Lösung wird aus einer bei der säulenchromatographischen Reinigung der Serums anfallenden TBG-haltigen Fraktion (sogenannter Abguss II nach K. Heide und H. Haupt, Behringwerke Mitteilungen Band 43 [1964l 161) hergestellt. Dabei wird die entsprechende Fraktion erst gegen Wasser dialysiert und anschliessend mit 0,1 m Tris(-hydroxy methyl)-aminomethanlHC1-Puffer auf einen Gesamtproteingehalt von 0,022 g/100 ml verdünnt. Zur Stabilisierung und Konservierung wird 0,02 Gew.- /0 NaN3 zugesetzt.
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PATENT CLAIMS
1. Device for the quantitative determination of hormones or hormone-binding proteins using radioactively labeled compounds, characterized by two detachably interconnected tubes, one of which (1), closed at the bottom, serves as a measuring tube and for taking up the liquid to be examined together with one radioactively labeled hormone and the corresponding antibody or
the corresponding hormone-binding protein-containing solution is provided, and the other (3), which consists of a thermoplastic which contains 10 to 60% by weight of an ion exchanger and can be closed at the outer end by a closure (4) and its closure inner surface (5) with respect to the hormone to be determined or used for the determination has adsorptive properties, serves as an adsorption tube.
2. Device according to claim 1, characterized in that the adsorption tube (3) consists of high-pressure polyethylene, which contains 20 to 40% by weight of an ion exchanger.
3. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the ion exchanger has an average grain size of 0.04 to 1.0 mm in diameter, an exchange capacity of 0.3 to 3 Val / l and a crosslinking fraction of 1 to 12%.
4. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the ion exchanger has an average grain size of 0.08 to 0.2 mm in diameter, an exchange capacity of 0.5 to 1.5 Val / l and a crosslinking content of 4 to 1001o .
5. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the ion exchanger has ionizable quaternary amino groups.
6. The device according to claim 1 or 2, characterized in that the ion exchanger has ionizable quaternary amino groups and an average grain size of 0.04 to 1.0 mm in diameter, an exchange capacity of 0.3 to 3 Val / l and a crosslinking fraction of 1 up to 12%.
7. The method for operating the device according to claim 1, characterized in that in each case certain amounts of a solution of a radioactively labeled hormone and of the antibody or the hormone-binding protein and a certain amount of the liquid to be examined are added to the measuring tube (1), with this connects the adsorption tube (3), closes it by means of the closure (4), brings the liquid in the device into contact with the inner surface (5) of the adsorption tube (3) for a certain time, then the non-adsorbed part of the liquid in let the measuring tube (1) drain and determine the residual activity of the liquid in the measuring tube (1).
8. The method according to claim 7, characterized in that the liquid is brought into contact with the inner surface of the adsorption tube several times by rotating the device of measuring and adsorption tubes about an axis perpendicular to the cylinder axis.
9. The method according to claim 7, characterized in that one determines the concentration of hormones in the blood.
10. The method according to claim 7 or 9, characterized in that one determines the thyroxine concentration in the blood, using as a radioactive indicator with 125J or 131 J labeled thyroxine.
11. The method according to claim 7, characterized in that the TBG capacity of the blood serum is determined indirectly, L-triiodothyronine labeled with 125J or 131J being used as the radioactive indicator.
The invention relates to a device for the quantitative determination of hormones or hormone-binding proteins using radioactively labeled compounds and a method for operating this device.
The hormones synthesized in certain glands of the body and released into the bloodstream are found in very low concentrations in the blood. Their precise quantitative determination has only become possible through the use of radioactively marked indicators.
Depending on the chemical nature of the hormone to be examined, a distinction is made between two analytical methods.
If the hormone has immunogenic properties, i.e. suitable antibodies can be generated with it, the so-called radioimmunoassay is used for the determination.
If the hormone has no immunogenic properties, so-called competitive protein binding analysis is used. Both methods have in common that a certain part of the hormone has to be removed from the reaction solution with the help of an exchanger or another suitable substance.
In known radio-immunochemical determination methods, for example, a mixture of known amounts of a hormone and the same but radioactively labeled hormone is reacted with a specific antibody to form a complex. A suitable nuclide such as 125J, 131J, 14C, 3H is used for labeling. A reaction equilibrium is established between the antibody and the hormone, with small amounts of the hormone being present in unbound form. This free portion is directly proportional to the total amount of hormone added at a constant antibody concentration. It is removed and determined using a suitable adsorbent. A standard curve is then drawn, which allows the determination of an unknown amount of the hormone.
In the likewise known competitive protein binding analysis, the fact is used that hormones, in particular those with a very small molecular weight, are bound and transported in the blood by specific proteins. For example, an a-globulin, the thyroxine binding globulin (TBG), takes on this function for the two thyroid hormones thyroxine and triiodothyronine. Similar to the antibodies in radio-immunochemical methods, such proteins can be used as primary complexing agents for the hormone in question. The free hormone fraction is again separated from the solution and determined.
A variant of this method is the determination of the
Capacity of the carrier proteins in the serum. The serum, in which the capacity of the protein for the particular hormone is to be determined, is mixed with a small amount of the radioactively labeled hormone. A reaction takes place between the carrier protein and the labeled hormone, in which the labeled hormone partly replaces the bound inactive and partly directly binds itself. The unbound portion is removed from the solution by adsorption and determined. This free portion is inversely proportional to the free capacity of the serum protein.
All of these methods have the common step of
Removal of the free portion of the hormone from the solution and its determination. So far, ion exchangers such as Amberlite and in the form of grains or embedded tet in polyurethane sponge or as a film have been used for this purpose. With all of these methods, after incubating the solution with the
Adsorbents include additional time-consuming and error sources
necessary steps. When using ion exchange ash grains, for example, centrifugation must be carried out after the incubation in order to allow the supernatant to be pipetted correctly. In some cases, the grains are washed several times before the measurement. The use of foils and sponges is a step forward compared to grains, but is cumbersome and time-consuming: the foil must be kept moist before it is used; when removed from the solution, errors (drops on the film) can occur. When using the replacement sponge, care must be taken to ensure that the air is removed from the sponge before the adsorption process and that the sponge is washed sufficiently after incubation.
It has now been found that the disadvantages inherent in the known methods and the devices used to carry them out can be avoided if, for the quantitative determination of hormones or hormone-binding proteins using radioactively labeled compounds, the device according to the invention, which is provided by two tubes which are detachably connected to one another, one of which, closed at the bottom, serves as a measuring tube and for taking up the liquid to be examined together with a radioactively labeled hormone and the corresponding antibody or
the corresponding hormone-binding protein-containing solution is provided, and the other, which consists of a thermoplastic which contains 10 to 60% by weight of an ion exchanger and can be closed at the outer end by a closure and its inner surface with respect to the one to be determined or of the hormone adsorptive used for the determination
Has properties, serves as an adsorption tube, is characterized, used and operates this device in such a way that in each case certain amounts of a solution of a radioactively labeled hormone and of the antibody or the hormone-binding protein and a certain one
Puts the amount of the liquid to be examined into the measuring tube, connects it to the adsorption tube, closes it with the closure,
brings the liquid in the device into contact with the inner surface of the adsorption tube for a certain time, then drains the non-adsorbed part of the liquid into the measuring tube and determines the residual activity of the liquid in the measuring tube.
A particularly advantageous embodiment of the device according to the invention is shown in the figure.
The device shown in the figure has the following components:
The measuring tube 1 for receiving the to be examined
Liquid 2, which contains the hormone and the antibody or the hormone-binding protein and the radioactively labeled hormone and an adsorption tube 3, which with a
Closure 4 is equipped and the inner surface 5 has adsorbing properties.
The measuring tube can be made of glass or plastic.
It is preferably made from polyethylene. Length and
Widths can vary and depend on the available volume of the liquid to be examined or the borehole size of the detector.
The adsorption tube consists of a thermoplastic which contains 10-60% by weight of an ion exchanger. A preferred form consists of high pressure polyethylene, which
Contains 20-40 parts by weight of an anion exchanger with ionizable quaternary amino groups. The length of the adsorption tube depends on the exchange activity and is expediently 1 to 6 cm.
The adsorption tube is expediently produced by thermoplastic processing of homogenized mixtures of thermoplastics and suitable ion exchangers. Suitable thermoplastics are those polymers whose processing temperatures are between 100 ° C. and 200 ° C., preferably between 130 ° C. and 1700 C. For example, the following can be used:
Polyethylene: high-pressure polyethylene with melt indices (i5) from 0.3 to 70, preferably 0.3 to 10, measured according to DIN standard 53 735 at 190 C.
Low pressure polyethylene with melt indices (i5) from 0.3 to 30, preferably 10 to 30, measured according to DIN standard 53 753 at 1900C.
Polypropylenes with melt indices (i2) from 0.4 to 40, preferably 5-30, measured according to DIN standard 53 753 E at 230 "C.
Polyoxymethylenes are obtained by homo- or copolymerization of trioxane and formaldehyde and cyclic acetals with melt indices (i2) between 1 and 50, preferably between 15 and 50, measured according to DIN standard 53753 at 1900C.
Polystyrenes with melt indices (i5) from 2 to 30, preferably from 5 to 25, measured according to DIN standard 53 735 at 200 C.
Poly (meth) acrylates with melt indexes from 0.4 to 10, preferably from 5 to 10, measured according to ASTMD 1238-62 T.
Polyvinyl chloride with K values of 40-80, preferably 50-70, measured according to DIN standard 53 726 in cyclohexanone at 25 C.
Polyesters from dibasic carboxylic acids and diols, polyester from linear apliphatic dicarboxylic acids with 4 to 12 carbon atoms and α, co-diols with 2 to 8 carbon atoms, for example sebacic acid / ethylene glycol polyester, being particularly suitable.
Polyamides made from dibasic dicarboxylic acids and diamines, the melting point of the polymers being reduced by incorporating, for example, ether, methylol or ester groups or by cocondensation.
Both ion and cation exchangers with average grain sizes of 0.04 to 1.0 mm in diameter, preferably 0.08 to 0.2 mm in diameter, can be mixed in as ion exchangers. The exchange capacity is generally 0.3 to 3 val / l, preferably 0.5 to 1.5 val / l. The exchange resins are usually cross-linked; the proportion of crosslinking agent is between 1 and 120/0, preferably between 4 and 10%. Amberliter CG 400, Amerlit (H) 'IRA 402, Amberlite' 200 and Dowexe are suitable as commercially available ion exchange powder.
The mixtures of thermoplastics and ion exchangers, which contain 10 to 60 percent by weight, preferably 20 to 40 percent by weight, of exchange resin, are on rollers, calenders, kneaders or extruders, preferably twin-screw extruders, at temperatures between 100 "C and 200" C, preferably between 1300C and 170 "C homogenized.
The adsorption tubes can then be produced on both extrusion and injection molding machines.
In extrusion processing, the homogenized mixture is preferably conveyed through an annular die at temperatures between 130 ° C. and 170 ° C. and drawn off synchronously via a calibration tank at a negative pressure of 1 to 15 m water column, preferably 2 to 10 m water column. The endless tube obtained in this way is cut to the appropriate length for the adsorption tube and the outer surface is twisted off at both ends to ensure a tight seal between the adsorption tube and the measuring tube as well as the sealing cap.
In injection molding processing, the mixture is processed in the same temperature range. The tube obtained has the dimensions required for the tightness of the device according to the invention. In this case, the inner surface of the shaped body can subsequently be drilled out to improve the adsorption properties.
When carrying out the method according to the invention, the procedure is preferably such that liquid 2 to be examined, which contains the hormone, the radioactively labeled hormone serving as an indicator and a solution of an antibody reacting with the hormone or a hormone-binding protein, is placed in the measuring tube 1 introduces, on which the adsorption tube 3 is attached or screwed on, closes the device and measures the radioactivity in the measuring tube. Then the liquid 2 is brought into contact with the adsorption surface 5 of the adsorption tube 3 several times by rotating the device comprising the measuring tube 1 and the adsorption tube 3 about an axis perpendicular to the cylinder axis, or by shaking the device.
The device consisting of measuring tube 1 and adsorption tube 3 is expediently attached to a rotator and is rotated for a certain time about an axis perpendicular to the cylinder axis.
During this process, the solution comes into contact with the inner surface of the adsorption tube several times, the free portion of the hormone being adsorbed and thus being removed from the solution. After the adsorption has ended, the device is set up so that the liquid flows downward from the adsorption tube back into the measuring tube and leaves behind the hormone portion adsorbed on the surface. The separation of the two parts is carried out in this way. The activity still remaining in the solution is now measured, for example, in a borehole detector or an automatic gamma sample changer without removing the adsorption tube. The adsorption tube does not have to be removed, which is very advantageous because it avoids contamination.
Pipetting is also not necessary.
The concentration of a hormone in the blood can advantageously be determined with the method according to the invention.
To determine the TBG capacity, for example, a sufficient amount of radioactively labeled L-triiodothyronine (T3 *) is dissolved in a suitable buffer in a measuring tube and the serum to be examined is added. The specific activity of the T3 * used can be between 10-200 mCi / mg T3; in principle, however, both higher and lower values are possible. Any system with a sufficient buffering capacity in the pH range of 5-9 can be used as a buffer solution. For example, the systems tris (hydroxymethyl) amino methane / HC1 or barbital NaIHCl or phosphate according to Sörensen are suitable. The pH value of the buffer solution should expediently be 7, but can also be larger or smaller. The T3 * reacts with the TBG, whereby it is largely bound by it.
Now the adsorption tube is put on, the device is closed and the initial radioactivity is measured, for example in a borehole detector or automatic gamma sample changer.
The length of the attached adsorption tube can suitably vary between 1 and 6 cm, depending on the number of adsorbing sites per unit area. For example, the device according to the invention is attached to a rotator and allowed to rotate for a certain time, the liquid coming into contact with the inner surface of the adsorption tube several times. The T3 becomes active and inactive - adsorbed in the adsorption tube and thus removed from the solution. After the adsorption has ended, the device is erected and, after a few minutes, the activity remaining in the solution is measured, as already described.
The method according to the invention can be used in a corresponding manner for the absolute determination of the thyroid hormones thyroxine and triiodothyronine. This requires a TBG solution of constant capacity, with the help of which a standard curve is created. The TBG solution can be prepared by known column chromatographic methods. Radiolabeled thyroxine (T4 *) is added to this TBG solution, which is bound according to the equation T4 * + TBGoTBG-T4 *. If this solution is now mixed with inactive thyroxine (T4), part of the active thyroxine bound to the TBG is displaced and is available in unbound form.
Since this amount of the displaced active thyroxine is directly proportional to the added inactive thyroxine, a relationship between the free T4 * and the added T4 can be established, which can be graphically represented in the form of a standard curve.
To determine the T4 content in serum, the thyroid hormones are released by denaturing the carrier proteins with alcohol. The alcoholic extract of L-triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4) can be evaporated for concentration and redissolved. An aliquot of the solution is pipetted into the TBG-T4 * solution in the measuring tube, the adsorption tube according to the invention is placed on it and rotated, for example for 1 hour, similarly to the T3 determination. The free T4 * is adsorbed in the adsorption tube and thus removed from the solution. The T4 amount of the serum to be examined can be determined from the quotient residual activity / initial activity using the standard curve. The value read is given as T4 since the amount of T3 is very small in comparison.
The method according to the invention can be used in a corresponding manner to determine hormones by radio-immunology.
The method and the device according to the invention make the determination of hormones easier and more reliable. This applies in particular to the removal of the free portion of the hormone from the solution. Laborious steps such as pipetting, centrifuging and washing are no longer necessary.
Easily reproducible values are obtained.
Surprisingly, it was found that the adsorption tube made of thermoplastic material and exchanger does not have any swelling processes that could burst the measuring tube when connected firmly.
Preparation Examples for Adsorption Tubes 1st Example
Low-pressure polyethylene with 30010 AmberlitetCG 400 1 in the chloride form is dried in a vacuum overnight and, after mixing, granulated on a twin-screw extruder. The granulate is dried with an extruder to produce an endless tube. Tubes 6 cm in length are cut from the tube produced by this method and used for adsorption.
2nd example
High-pressure polyethylene with 35010 AmberliteCG 400 1 in the chloride form is dried in a vacuum for 24 hours, mixed well and granulated on a twin-screw extruder. The dried granulate is then used to produce an endless tube, cut from the 5 cm long tube and used for adsorption.
3rd example
Granules of high-pressure polyethylene with 35010 Amber lite69CG 400 I, Cl-form were used for the production of injection-molded tubes with a length of 5 cm.
Example of use: Determination of the TBG capacity a) Preparation of the L-triiodothyronine-l25J solution
A corresponding amount of L-triiodothyronine-125J (T3 *) with a specific activity of 100 mCilmg is added to a 10% solution of tris (hydroxy-methylfaminomethane, the pH of which is adjusted to 7.4 with concentrated HCl), so that the Activity concentration is about 0.7 uCi / ml.
b) Standard serum
Serum with normal TBG binding capacity, obtained from
Blood from people with normal thyroid function.
c) Determination of the TBG capacity
About 5 ml of blood is taken from the patient whose thyroid function is to be examined. 0.2 ml are pipetted from the serum obtained therefrom after coagulation and centrifugation of the blood cells into a measuring tube made of polypropylene, which contains 3.3 ml of the T3 * solution, the adsorption tube prepared according to Examples 1-3 is put on and the device is closed and let stand for about 10 minutes.
The same applies to the standard serum. During this time, the total activity of the liquid is measured in a borehole detector or in an automatic gamma sample changer. The device is then clamped in a rotator and rotated for one hour at 13 revolutions per minute. The device is then set up, the liquid in the adsorption tube drains down and the activity remaining in the liquid phase is measured. The quotient G = residual activity: initial activity for the
Patient and standard serum and compare them with each other.
The percent thyroxine binding capacity of the patient's serum is calculated according to the equation
G (patient serum)
TBK = G (standard serum) 100 In general, the TBK value rises compared to normal serum when hypothyroidism is present and decreases in hyperthyroidism.
5. Example Determination of the thyroxine concentration in the serum
Each 0.5 ml of the serum to be examined and the control serum with a known amount of unlabelled T4 are placed in a centrifugable tube of 1.0 ml each and mixed on a whirl mixer for 30 seconds. It is then left for 10 min. stand and centrifuge the denatured proteins at 2500 rpm. The extraction yield is 72010 of the original T4.
To determine the thyroxine content, 0.3 ml each of the alcoholic extract is pipetted into measuring tubes which contain 3.3 ml of a TBG solution prepared by known column chromatography methods and 0.02 pCi / ml of 125J labeled thyroxine. To create the standard curve, 0.3 ml of a standard solution of 5 or 20 Lg thyroxine / 100 ml are also treated. The adsorption tubes are now placed on the measuring tubes, the devices are closed and, after thorough mixing, the total activity of the solutions is measured. To adsorb the free T4-125J activity, the devices are then 60 min. long at room temperature on a rotator at 13 revolutions per minute overhead.
The devices are then set up so that the solution runs completely out of the adsorption tubes into the measuring tubes. The residual radioactivity remaining in the solution is measured there. The quotient is now calculated
Residual radioactivity loo
Total radioactivity for each sample. The values obtained for the standard samples are plotted against the amounts of thyroxine contained in the standard solutions and the two points are connected with a straight line. The standard curve is thus obtained. The unknown contents of the sera to be examined can now be determined using the quotient G of the standard curve. The thyroxine content of the serum results from the value read and the extraction yield.
The above-mentioned TBG solution is prepared from a TBG-containing fraction obtained during the column chromatographic purification of the serum (so-called Abguss II according to K. Heide and H. Haupt, Behringwerke Mitteilungen Band 43 [1964l 161). The corresponding fraction is first dialyzed against water and then diluted with 0.1 M tris (-hydroxy methyl) aminomethane / HC1 buffer to a total protein content of 0.022 g / 100 ml. 0.02% by weight / 0 NaN3 is added for stabilization and preservation.