Procédé de préparation de la 6-diazo-5-oxo-norleucine
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines, soit la D-6-diazo- 5-oxo-norleucine, la L-6-diazo-5-oxo-norleuoine et la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine possèdent des propre6- tés tout à fait particulières, comme cela ressort de la description qui suit.
Comme ces substances diffèrent les unes des autres au point de vue chimique seulement en ce que les premières sont des formes isomères optiquement actives tandis que la dernière est la forme optiquement racémique de la 6-diazo-5-oxo norleucine, les propriétés chimiques de ces composes sont identiques de même que beaucoup de leurs pro priétés physiques. Ces composés contiennent seulement les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote et ont la formule brute CH9N30,. Ils ont un poids moléculaire de 171 et peuvent être représentés par la formule développée :
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Le pouvoir rotatoire spécifique [a] 2D de la L-6diazo-5-oxo-norleucine est + 21 (à 5, 4 /o dans 1'eau), et de la D-6-diazo-5-oxo-norleucine,-16, 1 (à 1, 98 ID/o dans l'eau à 25o C).
La D-6-diazo-5-oxo-norleucine, la L-6-diazo-5 oxo-norleucine et la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine sont relativement instables à la chaleur et se décomposent avant de fondre. La décomposition ne se produit pas à une température spéciale et, par consé- quent, les points de décomposition et de fusion varient entre de larges limites selon la méthode employée pour leur détermination. La décomposition commence en général à environ 145"C et peut conte nuer jusqu'à ce qu'on atteigne 155 C. La décomposition est accompagnée d'un dégagement de gaz. Ces composés se décomposent dans les acides aqueux avec libération d'azote. Les courbes de liaison d'hy drogène montrent des valeurs pour pK dans l'eau de 2, 1 et 8, 95.
Ces produits sont très solubles dans l'eau, mais insolubles dans les solvants organiques non polaires ordinaires. Ils sont seulement très légèrement solubles dans le méthanol absolu, l'éthanol absolu ou l'acétone à froid, mais sont solubles dans les solutions aqueuses chaudes de ces solvants. Ils donnent la coloration spécifique bleu pourpre dans l'essai à la ninhydrine. L'oxydation par l'acide périodique de la L 6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide L-glutamique.
Une réaction semblable avec la D-6-diazo-5-oxonorleucine ou la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide D-glutamique, respeAivement l'acide DL, glu- tamique.
Ces produits forment des sels de métaux par réaction avec des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoyloxydes, amidures, etc., de métaux alcalins ou alcalino-terreux.
Les spectres d'absorption dans l'ultraviolet de la
D-6-diazo-5-oxo-norleucine, L-6-diazo-5-oxo=norleu- cine et DL-6-diazo-5-oxo-norleucine sont identiques.
Dans un tampon de phosphate aqueux, à un pH de 7, les maxima caractéristiques d'absorption dans l'ultraviolet sont pour Bde 683 à une longueur d'onde de 274 millimicrons et de 376 à une longueur d'onde de 244 millimicrons.
Les spectres d'absorption dans l'infrarouge de la D6-diazo-5-oxo-norl¯U) Cine et die la L-6-diazo-5- oxo-norleucine sont identiques. Quand on les déter mine par la méthode au disque de bromure de potassium, le spectre montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 3, 19, 3, 32, 3, 78, 4, 66, 6, 14, 6, 30, 6, 59, 6, 90, 7, 18, 7, 39, 7, 54, 8, 33, 8, 66 8, 98, 9, 36, 9, 71, 10, 08, 10, 22, 10, 59, 11, 65, 12, 08 12, 34 et 13, 16 microns.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge pour la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine déterminé par la méthode au disque de bromure de potassium, montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 3, 34, 4, 66, 6, 13, 6, 31, 6, 59, 7, 06, 7, 19, 7, 43, 8, 72, 9, 26, 9, 90, 10, 67 et 11, 32 microns.
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines possèdent des propriétés phytotoxiques bien marquées, et sont parti- culièrement utiles comme herbicides, destructeurs de mauvaises herbes et semblables. A ces fins, on emploie une solution aqueuse diluée, et celle-ci est ap- pliquée à la plante ou à une culture de plantes selon les méthodes connues dans ce domaine. Ces composés sont efficaces à de hautes dilutions et ont une action sélective contre certaines espèces de mauvaises herbes particulièrement indésirables.
Par exemple, dans le cas de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine, une solution aqueuse à une concentration de 1000 parties par million, appliquée par projection jusqu'au point d'égouttement à des parcelles de terrain pour essais à cultures séparées vigoureuses d'ansérines et de chénopodes a donné 100 de destruction, tandis que la croissance sur une parcelle de blé comparable n'a été empêchée que pour 20 /0 dans des conditions identiques.
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines possèdent un haut degré d'activité contre les levures. Grâce à ce caractère, elles peuvent être utilisées pour isoler des bactéries de mélanges microbiens dans lesquels un ou plu
sieurs des microorganismes sont des levures.
Ces composés possèdent aussi des propriétés ex traordinaires du fait qu'ils empêchent la biosynthèse, dans les cellules vivantes, d'acides nucléiques essentiels et de précurseurs d'acides nucléiques et exercent
aussi une action inhibitrice sur le développement de néoplasmes. L'effet inhibiteur de la L-6-diazo-5-oxo-
norleucine est plus grand que celui des composés DL et D correspondants ; le composé DL, de son côté,
possède un effet inhibiteur plus élevé que le composé
D. La croissance de tumeurs implantées dans des
souris ou des rats est tout à fait empêchée par des
injections journalières de L-6-diazo-5-oxo-norleucine.
Les variétés de tumeurs qui sont ainsi atteintes comprennent le Sarcome 180 (formes liquide et solide),
le Sarcome T 241, le Sarcome MA 387, l'Adenocar-
cinome mammaire E 0771, l'Adenocarcinome Miyo
no, le Lymphosarcome Mecca, le Sarcome ostéogéni-
que de Ridgway, le Sarcome ostéogénique de Wag
ner, l'Adenocarcinome mammaire RC, le Carcinome
d'Ehrlich (formes liquide et solide), le Carcinome
1025, le Carcinome Krebs 2 (forme fluide) et le
Lymphosarcome du rat, de Murphy.
Ces propriétés
extraordinaires montrent que ces produits peuvent t
éventuellement être employés, soit seuls soit en com binaison avec d'autres agents d'inhibition des néoplas- mes (carcinomes, sarcomes, leucémies, etc.). Ces produits peuvent être administrés soit par voie buccale soit par injections.
Il est entendu que les formules développées et les désignations chimiques figurant dans le présent exposé englobent, en l'absence de spécification de la forme optique, la forme isomère D active, la forme isomère L active et la forme DL optiquement inactive de ces composés. Ainsi danc, quand une désignation chimique ne spécifie pas de quelle forme il s'agit, cette désignation doit être interprétée dans son sens général, c'est-à-dire comme désignant soit l'isomère D actif, soit l'isomère L actif, soit la forme racémique
DL, optiquement inactive.
Le procédé selon invention est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé de formule
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dans laquelle R est un métal alcalin, un métal alcalino-terreux ou un radical alcoyle inférieur, avec de l'hydrazine, pour obtenir un composé de formule
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en ce que, dans le cas où R est un radical alcoyle inférieur, on hydrolyse le groupe ester présent en milieu alcalin aqueux au-dessous de la température ordinaire, et en ce que l'on neutralise le sel de métal de la 6-diazo-5-axo-norlucine avec un acide.
Pour effectuer l'hydrazinolyse, les meilleurs résul- tats sont obtenus en employant deux équivalents d'hydrazine. On peut en utiliser un léger excès, mais inférieur à trois équivalents ; de plus grandes quantités tendent à occasionner la formation de l'hydrazide correspondante en diminuant ainsi le rendement en le produit intermédiaire de 6-diazo-5-oxo-norleu- cine cherché. L'hydrazine peut être introduite sous différentes formes dans le mélange de réaction. Par exemple, on peut employer des solutions aqueuses d'hydrazine ou d'hydrate d'hydrazine.
Dans le cas où le produit intermédiaire est un sel de métal, la réaction est effectuée en général dans des conditions aqueuses, et, quand ce produit est un ester, elle peut être effectuée dans un solvant organique tel qu'un alcool aliphatique inférieur, un hydrocarbure chloré, un éther cyclique, etc. Comme exemples spécifiques de solvants pouvant être employés, on peut citer le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, le chlorure de méthylène, le dioxane, etc. La réaction peut être faite de manière commode à des températures au-dessous d'environ 500 C et de préférence à la température ordinaire ou au-dessous. Les esters de 6-diazo-5-oxo- N-phtaloyl-norleucine peuvent être préparés de la manière décrite au J. Am. Chem.
Soc., 72, 2469 (1950) pour la préparation de 1'ester méthylique de 6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine.
L'hydrolyse de 1'ester de 6-diazo-5-oxo-norleucine est effectuée en milieu aqueux alcalin, de préférence en présence d'un solvant organique miscible à l'eau. Comme agents alcalins, on peut employer des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, aloxydes, amidures, etc., de métaux alcalins ou alcalino-terreux. De préférence, on emploie une solution diluée, contenant 1, 0 à 1, 1 équivalents, d'un hydro oxyde de métal alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou de potassium, à une température entre-10 et Se C. L'hydrolyse est ordinairement terminée en 1 heure à 0 C et en 1 à 2 heures à 4 C.
La neutrali- sation du sel de métal alcalin ou alcalino-terreux de 6-diazo-5-oxoenorleucine peut être effectuée, au-dessous de la température ordinaire, de préférence entre -10 et 5O C. Comme acide, on préfère un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et semblables. La neutralisation est réalisée en général en abaissant avec soin le pH entre 5, 5 et 7, et de préférence entre 6 et 6, 5. Le produit peut être isolé de façon commode par évaporation dans le vide, par lyophilisation, chromatographiquement, etc.
Exemple 1 :
a) On dissout 4, 3 g d'ester méthylique de L-6 diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine dans 70ml de di- chlorure de méthylène ; on ajoute 1, 35 g d'hydrate d'hydrazine et agite le mélange pendant environ deux heures, puis on le laisse reposer à 20-250 C pendant seize heures. Le mélange de réaction est ensuite maintenu à 0"C pendant quatre heures, puis filtré.
Le gâteau de filtre contient le sel d'hydrazine de la phtaloyl-hydrazine. Le filtrat est évaporé dans le vide.
Le résidu est 1'ester méthylique de L-6-diazo-5-oxo- norleucine, dont la formule est :
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forme L
b) On dissout 2, Z g d'ester methylique de L-b- diazo-5-oxo-norleucine dans 60ml de méthanol et refroidit à 0"C, puis on ajoute 15 ml d'hydroxyde de sodium normal, et la solution est laissée à 00 C pendant seize heures. La solution froide est amenée à un pH de 6, 5 par addition d'acide chlorhydrique 2N en agitant rapidement. La solution jaune est évaporée dans le vide pour éliminer le méthanol. Le produit résiduaire est dissous dans environ 50ml d'eau, la solution est congelée et la glace est sublimée de cette masse congelée sous un vide élevé.
On dissout 250 milligrammes du résidu solide dans 10 ml d'eau contenant 1 /n d'acétone et la solution est versée dans une colonne d'adsorption contenant 15 g de charbon activé et 15 g de terre de diatomées. La colonne est immédiatement lavée et développée avec approxima- tivement 2, 5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse à 1 c/o, et l'éluat est recueilli en fractions de 10 ml.
Les trois fractions qui montrent la plus forte absorp- tion dans l'ultraviolet a une longueur d'onde de 275 millimicrons, sont congelées, la glace en est sublimée sous un vide élevé et l'on obtient la L-6-diazo-5-oxonorleucine cherchée, qui a la formule :
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forme L
Le produit peut être purifié par recristallisation d'unesolution dans plusieurs gouttes d'eau par addi- tion de cinq volumes d'méthanol absolu. Les proprié- tés chimiques, biologiques et physiques de la L-6 diazo-5-oxo-norleucine sont celles qui ont été exposées dans ce qui précède.
L'isomère formant 1'antipode-optique, la D-6diazo-5-oxo-norleucine, peut Être préparé de la façon exposée à l'exemple 1 a) et b) en partant d'un ester de D-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine.
Exemple 2 :
a) Une solution de 24 g d'ester méthylique de DL-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine dans 170 ml de chlorure de méthylène est traitée avec 7, 7 g d'hy- drate d'hydrazine et la solution trouble est agitée à 22-25o C pendant 15 heures, puis est filtrée. On éva- pore le filtrat dans le vide. Le produit résiduaire, l'es- ter méthylique de DL-6-diazo-5-oxo-norleucine, a la formule
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forme DL
b) On dissout 12, 5 g d'ester methylique de DL-6- diazo-5-oxo-norleucine dans 300 ml de méthanol et refroidit à 00 C.
On ajoute 70 ml d'hydroxyde de sodium 1N et on maintient à 00 C pendant seize heures la solution rouge pâle. On amène le pH de la solution à 6, 5 avec de l'acide chlorhydrique 2N, et éva- pore le mélange dans le vide pour éliminer le métha- nol. Le résidu est congelé et la glace est enlevée de la masse congelée par sublimation sous un vide élevé. Le résidu solide est dissous dans de l'acétone aqueuse à 1 /o et adsorbé dans une colonne contenant 45 g de charbon activé et 45 g de terre de diatomées.
La colonne est lavée et développée avec environ 2, 5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse à 1 /0 et l'éluat est recueilli en fractions de 10 ml. Les fractions montrant la plus forte absorption dans l'ultraviolet à 275 millimicrons sont congelées et la glace en est enlevée par sublimation ; on obtient ainsi la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine cherchée. Ce produit, qui correspond à la formule :
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forme DL est recristallisé dans de l'alcool aqueux et l'on obtient une substance ayant une absorption dans l'ultraviolet, Eleéomde 683 à une longueur d'onde de 274 milli- microns.
Les propriétés chimiques, biologiques et les autres propriétés physiques de cette DL-6-diazo-5- oxo-norleucine sont les mêmes que celles qui ont été indiquées dans la description qui précède.
Exemple 3 :
On ajoute 0, 90 g d'hydrate d'hydrazine à une suspension de 3, 1 g du sel de potassium de L-6-diazo-5 oxo-N-phtaloyl-norleucine dans 60 ml de méthanol, et agite le mélange pendant environ deux heures, puis on le laisse reposer à 20-25o C pendant seize heures.
On concentre le mélange de réaction par évaporation dans le vide. Le résidu est dissous dans 50 ml d'eau et le pH est ajusté à 6, 5 avec de l'acide chlorhydri- que 1 N. La solution est filtrée et le filtrat est versé dans une colonne d'adsorption contenant 20 g de charbon activé et 20 g de terre de diatomées. La colonne est immédiatement lavée et développée avec environ 2, 5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse e à 1 /0, et l'éluat est recueilli en fractions de 10 ml.
Les quatre fractions qui montrent la plus forte absorption dans l'ultraviolet à 275 millimicrons sont congelées et la glace en est sublimée dans un vide élevé ; on obtient la L-6-diazo-5-oxo-norleucine cherchée. L'isomère optique opposé, la D-6-diazo-5-oxo- norleucine, peut être préparé de la même manière en partant du sel de potassium de D-6-diazo-5-oxo- phtaloyl-norleucine, lequel peut être préparé à partir d'un ester alcoylique correspondant de la manière exposée immédiatement ci-après.
La matière de départ ci-dessus mentionnée peut être obtenue de la façon suivante : on dissout 4, 5 g d'ester méthylique de L-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl- norleucine dans 50 ml de méthanol à 70 /o ; on ajoute 2, 5 g de carbonate de potassium et laisse reposer la solution à 10 C pendant 24 heures. La solution est alors évaporée dans le vide. Le produit résiduaire est le sel de potassium de L-6-diazo-5-oxo-N- phtaloyl-norleucine, qui peut être employé directement comme matière première pour l'opération cidessus exposée, sans autre traitement. On peut préparer d'autres sels de métaux de la même manière.