Procédé de préparation de la 6-diazo-5-oxo-norleucine
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines, soit la D-6-diazo- 5-oxo-norleucine, la L-6-diazo-5-oxo-norleuoine et la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine possèdent des propre6- tés tout à fait particulières, comme cela ressort de la description qui suit.
Comme ces substances diffèrent les unes des autres au point de vue chimique seulement en ce que les premières sont des formes isomères optiquement actives tandis que la dernière est la forme optiquement racémique de la 6-diazo-5-oxo norleucine, les propriétés chimiques de ces composes sont identiques de même que beaucoup de leurs pro priétés physiques. Ces composés contiennent seulement les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote et ont la formule brute CH9N30,. Ils ont un poids moléculaire de 171 et peuvent être représentés par la formule développée :
EMI1.1
Le pouvoir rotatoire spécifique [a] 2D de la L-6diazo-5-oxo-norleucine est + 21 (à 5, 4 /o dans 1'eau), et de la D-6-diazo-5-oxo-norleucine,-16, 1 (à 1, 98 ID/o dans l'eau à 25o C).
La D-6-diazo-5-oxo-norleucine, la L-6-diazo-5 oxo-norleucine et la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine sont relativement instables à la chaleur et se décomposent avant de fondre. La décomposition ne se produit pas à une température spéciale et, par consé- quent, les points de décomposition et de fusion varient entre de larges limites selon la méthode employée pour leur détermination. La décomposition commence en général à environ 145"C et peut conte nuer jusqu'à ce qu'on atteigne 155 C. La décomposition est accompagnée d'un dégagement de gaz. Ces composés se décomposent dans les acides aqueux avec libération d'azote. Les courbes de liaison d'hy drogène montrent des valeurs pour pK dans l'eau de 2, 1 et 8, 95.
Ces produits sont très solubles dans l'eau, mais insolubles dans les solvants organiques non polaires ordinaires. Ils sont seulement très légèrement solubles dans le méthanol absolu, l'éthanol absolu ou l'acétone à froid, mais sont solubles dans les solutions aqueuses chaudes de ces solvants. Ils donnent la coloration spécifique bleu pourpre dans l'essai à la ninhydrine. L'oxydation par l'acide périodique de la L 6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide L-glutamique.
Une réaction semblable avec la D-6-diazo-5-oxonorleucine ou la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide D-glutamique, respeAivement l'acide DL, glu- tamique.
Ces produits forment des sels de métaux par réaction avec des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoyloxydes, amidures, etc., de métaux alcalins ou alcalino-terreux.
Les spectres d'absorption dans l'ultraviolet de la
D-6-diazo-5-oxo-norleucine, L-6-diazo-5-oxo=norleu- cine et DL-6-diazo-5-oxo-norleucine sont identiques.
Dans un tampon de phosphate aqueux, à un pH de 7, les maxima caractéristiques d'absorption dans l'ultraviolet sont pour Bde 683 à une longueur d'onde de 274 millimicrons et de 376 à une longueur d'onde de 244 millimicrons.
Les spectres d'absorption dans l'infrarouge de la D6-diazo-5-oxo-norl¯U) Cine et die la L-6-diazo-5- oxo-norleucine sont identiques. Quand on les déter mine par la méthode au disque de bromure de potassium, le spectre montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 3, 19, 3, 32, 3, 78, 4, 66, 6, 14, 6, 30, 6, 59, 6, 90, 7, 18, 7, 39, 7, 54, 8, 33, 8, 66 8, 98, 9, 36, 9, 71, 10, 08, 10, 22, 10, 59, 11, 65, 12, 08 12, 34 et 13, 16 microns.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge pour la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine déterminé par la méthode au disque de bromure de potassium, montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 3, 34, 4, 66, 6, 13, 6, 31, 6, 59, 7, 06, 7, 19, 7, 43, 8, 72, 9, 26, 9, 90, 10, 67 et 11, 32 microns.
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines possèdent des propriétés phytotoxiques bien marquées, et sont parti- culièrement utiles comme herbicides, destructeurs de mauvaises herbes et semblables. A ces fins, on emploie une solution aqueuse diluée, et celle-ci est ap- pliquée à la plante ou à une culture de plantes selon les méthodes connues dans ce domaine. Ces composés sont efficaces à de hautes dilutions et ont une action sélective contre certaines espèces de mauvaises herbes particulièrement indésirables.
Par exemple, dans le cas de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine, une solution aqueuse à une concentration de 1000 parties par million, appliquée par projection jusqu'au point d'égouttement à des parcelles de terrain pour essais à cultures séparées vigoureuses d'ansérines et de chénopodes a donné 100 de destruction, tandis que la croissance sur une parcelle de blé comparable n'a été empêchée que pour 20 /0 dans des conditions identiques.
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines possèdent un haut degré d'activité contre les levures. Grâce à ce caractère, elles peuvent être utilisées pour isoler des bactéries de mélanges microbiens dans lesquels un ou plu
sieurs des microorganismes sont des levures.
Ces composés possèdent aussi des propriétés ex traordinaires du fait qu'ils empêchent la biosynthèse, dans les cellules vivantes, d'acides nucléiques essentiels et de précurseurs d'acides nucléiques et exercent
aussi une action inhibitrice sur le développement de néoplasmes. L'effet inhibiteur de la L-6-diazo-5-oxo-
norleucine est plus grand que celui des composés DL et D correspondants ; le composé DL, de son côté,
possède un effet inhibiteur plus élevé que le composé
D. La croissance de tumeurs implantées dans des
souris ou des rats est tout à fait empêchée par des
injections journalières de L-6-diazo-5-oxo-norleucine.
Les variétés de tumeurs qui sont ainsi atteintes comprennent le Sarcome 180 (formes liquide et solide),
le Sarcome T 241, le Sarcome MA 387, l'Adenocar-
cinome mammaire E 0771, l'Adenocarcinome Miyo
no, le Lymphosarcome Mecca, le Sarcome ostéogéni-
que de Ridgway, le Sarcome ostéogénique de Wag
ner, l'Adenocarcinome mammaire RC, le Carcinome
d'Ehrlich (formes liquide et solide), le Carcinome
1025, le Carcinome Krebs 2 (forme fluide) et le
Lymphosarcome du rat, de Murphy.
Ces propriétés
extraordinaires montrent que ces produits peuvent t
éventuellement être employés, soit seuls soit en com binaison avec d'autres agents d'inhibition des néoplas- mes (carcinomes, sarcomes, leucémies, etc.). Ces produits peuvent être administrés soit par voie buccale soit par injections.
Il est entendu que les formules développées et les désignations chimiques figurant dans le présent exposé englobent, en l'absence de spécification de la forme optique, la forme isomère D active, la forme isomère L active et la forme DL optiquement inactive de ces composés. Ainsi danc, quand une désignation chimique ne spécifie pas de quelle forme il s'agit, cette désignation doit être interprétée dans son sens général, c'est-à-dire comme désignant soit l'isomère D actif, soit l'isomère L actif, soit la forme racémique
DL, optiquement inactive.
Le procédé selon invention est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé de formule
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dans laquelle R est un métal alcalin, un métal alcalino-terreux ou un radical alcoyle inférieur, avec de l'hydrazine, pour obtenir un composé de formule
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en ce que, dans le cas où R est un radical alcoyle inférieur, on hydrolyse le groupe ester présent en milieu alcalin aqueux au-dessous de la température ordinaire, et en ce que l'on neutralise le sel de métal de la 6-diazo-5-axo-norlucine avec un acide.
Pour effectuer l'hydrazinolyse, les meilleurs résul- tats sont obtenus en employant deux équivalents d'hydrazine. On peut en utiliser un léger excès, mais inférieur à trois équivalents ; de plus grandes quantités tendent à occasionner la formation de l'hydrazide correspondante en diminuant ainsi le rendement en le produit intermédiaire de 6-diazo-5-oxo-norleu- cine cherché. L'hydrazine peut être introduite sous différentes formes dans le mélange de réaction. Par exemple, on peut employer des solutions aqueuses d'hydrazine ou d'hydrate d'hydrazine.
Dans le cas où le produit intermédiaire est un sel de métal, la réaction est effectuée en général dans des conditions aqueuses, et, quand ce produit est un ester, elle peut être effectuée dans un solvant organique tel qu'un alcool aliphatique inférieur, un hydrocarbure chloré, un éther cyclique, etc. Comme exemples spécifiques de solvants pouvant être employés, on peut citer le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, le chlorure de méthylène, le dioxane, etc. La réaction peut être faite de manière commode à des températures au-dessous d'environ 500 C et de préférence à la température ordinaire ou au-dessous. Les esters de 6-diazo-5-oxo- N-phtaloyl-norleucine peuvent être préparés de la manière décrite au J. Am. Chem.
Soc., 72, 2469 (1950) pour la préparation de 1'ester méthylique de 6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine.
L'hydrolyse de 1'ester de 6-diazo-5-oxo-norleucine est effectuée en milieu aqueux alcalin, de préférence en présence d'un solvant organique miscible à l'eau. Comme agents alcalins, on peut employer des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, aloxydes, amidures, etc., de métaux alcalins ou alcalino-terreux. De préférence, on emploie une solution diluée, contenant 1, 0 à 1, 1 équivalents, d'un hydro oxyde de métal alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou de potassium, à une température entre-10 et Se C. L'hydrolyse est ordinairement terminée en 1 heure à 0 C et en 1 à 2 heures à 4 C.
La neutrali- sation du sel de métal alcalin ou alcalino-terreux de 6-diazo-5-oxoenorleucine peut être effectuée, au-dessous de la température ordinaire, de préférence entre -10 et 5O C. Comme acide, on préfère un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et semblables. La neutralisation est réalisée en général en abaissant avec soin le pH entre 5, 5 et 7, et de préférence entre 6 et 6, 5. Le produit peut être isolé de façon commode par évaporation dans le vide, par lyophilisation, chromatographiquement, etc.
Exemple 1 :
a) On dissout 4, 3 g d'ester méthylique de L-6 diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine dans 70ml de di- chlorure de méthylène ; on ajoute 1, 35 g d'hydrate d'hydrazine et agite le mélange pendant environ deux heures, puis on le laisse reposer à 20-250 C pendant seize heures. Le mélange de réaction est ensuite maintenu à 0"C pendant quatre heures, puis filtré.
Le gâteau de filtre contient le sel d'hydrazine de la phtaloyl-hydrazine. Le filtrat est évaporé dans le vide.
Le résidu est 1'ester méthylique de L-6-diazo-5-oxo- norleucine, dont la formule est :
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forme L
b) On dissout 2, Z g d'ester methylique de L-b- diazo-5-oxo-norleucine dans 60ml de méthanol et refroidit à 0"C, puis on ajoute 15 ml d'hydroxyde de sodium normal, et la solution est laissée à 00 C pendant seize heures. La solution froide est amenée à un pH de 6, 5 par addition d'acide chlorhydrique 2N en agitant rapidement. La solution jaune est évaporée dans le vide pour éliminer le méthanol. Le produit résiduaire est dissous dans environ 50ml d'eau, la solution est congelée et la glace est sublimée de cette masse congelée sous un vide élevé.
On dissout 250 milligrammes du résidu solide dans 10 ml d'eau contenant 1 /n d'acétone et la solution est versée dans une colonne d'adsorption contenant 15 g de charbon activé et 15 g de terre de diatomées. La colonne est immédiatement lavée et développée avec approxima- tivement 2, 5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse à 1 c/o, et l'éluat est recueilli en fractions de 10 ml.
Les trois fractions qui montrent la plus forte absorp- tion dans l'ultraviolet a une longueur d'onde de 275 millimicrons, sont congelées, la glace en est sublimée sous un vide élevé et l'on obtient la L-6-diazo-5-oxonorleucine cherchée, qui a la formule :
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forme L
Le produit peut être purifié par recristallisation d'unesolution dans plusieurs gouttes d'eau par addi- tion de cinq volumes d'méthanol absolu. Les proprié- tés chimiques, biologiques et physiques de la L-6 diazo-5-oxo-norleucine sont celles qui ont été exposées dans ce qui précède.
L'isomère formant 1'antipode-optique, la D-6diazo-5-oxo-norleucine, peut Être préparé de la façon exposée à l'exemple 1 a) et b) en partant d'un ester de D-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine.
Exemple 2 :
a) Une solution de 24 g d'ester méthylique de DL-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl-norleucine dans 170 ml de chlorure de méthylène est traitée avec 7, 7 g d'hy- drate d'hydrazine et la solution trouble est agitée à 22-25o C pendant 15 heures, puis est filtrée. On éva- pore le filtrat dans le vide. Le produit résiduaire, l'es- ter méthylique de DL-6-diazo-5-oxo-norleucine, a la formule
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forme DL
b) On dissout 12, 5 g d'ester methylique de DL-6- diazo-5-oxo-norleucine dans 300 ml de méthanol et refroidit à 00 C.
On ajoute 70 ml d'hydroxyde de sodium 1N et on maintient à 00 C pendant seize heures la solution rouge pâle. On amène le pH de la solution à 6, 5 avec de l'acide chlorhydrique 2N, et éva- pore le mélange dans le vide pour éliminer le métha- nol. Le résidu est congelé et la glace est enlevée de la masse congelée par sublimation sous un vide élevé. Le résidu solide est dissous dans de l'acétone aqueuse à 1 /o et adsorbé dans une colonne contenant 45 g de charbon activé et 45 g de terre de diatomées.
La colonne est lavée et développée avec environ 2, 5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse à 1 /0 et l'éluat est recueilli en fractions de 10 ml. Les fractions montrant la plus forte absorption dans l'ultraviolet à 275 millimicrons sont congelées et la glace en est enlevée par sublimation ; on obtient ainsi la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine cherchée. Ce produit, qui correspond à la formule :
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forme DL est recristallisé dans de l'alcool aqueux et l'on obtient une substance ayant une absorption dans l'ultraviolet, Eleéomde 683 à une longueur d'onde de 274 milli- microns.
Les propriétés chimiques, biologiques et les autres propriétés physiques de cette DL-6-diazo-5- oxo-norleucine sont les mêmes que celles qui ont été indiquées dans la description qui précède.
Exemple 3 :
On ajoute 0, 90 g d'hydrate d'hydrazine à une suspension de 3, 1 g du sel de potassium de L-6-diazo-5 oxo-N-phtaloyl-norleucine dans 60 ml de méthanol, et agite le mélange pendant environ deux heures, puis on le laisse reposer à 20-25o C pendant seize heures.
On concentre le mélange de réaction par évaporation dans le vide. Le résidu est dissous dans 50 ml d'eau et le pH est ajusté à 6, 5 avec de l'acide chlorhydri- que 1 N. La solution est filtrée et le filtrat est versé dans une colonne d'adsorption contenant 20 g de charbon activé et 20 g de terre de diatomées. La colonne est immédiatement lavée et développée avec environ 2, 5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse e à 1 /0, et l'éluat est recueilli en fractions de 10 ml.
Les quatre fractions qui montrent la plus forte absorption dans l'ultraviolet à 275 millimicrons sont congelées et la glace en est sublimée dans un vide élevé ; on obtient la L-6-diazo-5-oxo-norleucine cherchée. L'isomère optique opposé, la D-6-diazo-5-oxo- norleucine, peut être préparé de la même manière en partant du sel de potassium de D-6-diazo-5-oxo- phtaloyl-norleucine, lequel peut être préparé à partir d'un ester alcoylique correspondant de la manière exposée immédiatement ci-après.
La matière de départ ci-dessus mentionnée peut être obtenue de la façon suivante : on dissout 4, 5 g d'ester méthylique de L-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl- norleucine dans 50 ml de méthanol à 70 /o ; on ajoute 2, 5 g de carbonate de potassium et laisse reposer la solution à 10 C pendant 24 heures. La solution est alors évaporée dans le vide. Le produit résiduaire est le sel de potassium de L-6-diazo-5-oxo-N- phtaloyl-norleucine, qui peut être employé directement comme matière première pour l'opération cidessus exposée, sans autre traitement. On peut préparer d'autres sels de métaux de la même manière.
Process for preparing 6-diazo-5-oxo-norleucine
6-diazo-5-oxo-norleucines, i.e. D-6-diazo- 5-oxo-norleucine, L-6-diazo-5-oxo-norleuoine and DL-6-diazo-5-oxo-norleucine have quite specific characteristics, as is apparent from the description which follows.
As these substances differ from each other chemically only in that the former are optically active isomeric forms while the latter is the optically racemic form of 6-diazo-5-oxo norleucine, the chemical properties of these compounds are identical as are many of their physical properties. These compounds contain only the elements carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen and have the chemical formula CH9N30 ,. They have a molecular weight of 171 and can be represented by the structural formula:
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The specific optical rotation [a] 2D of L-6diazo-5-oxo-norleucine is + 21 (at 5.4 / o in water), and of D-6-diazo-5-oxo-norleucine, -16.1 (at 1.98 ID / o in water at 25o C).
D-6-diazo-5-oxo-norleucine, L-6-diazo-5 oxo-norleucine and DL-6-diazo-5-oxo-norleucine are relatively unstable in heat and decompose before melting. Decomposition does not occur at a special temperature, and therefore the decomposition and melting points vary between wide limits depending on the method employed for their determination. Decomposition generally begins at about 145 ° C and may continue until reaching 155 ° C. Decomposition is accompanied by the evolution of gases. These compounds decompose in aqueous acids with the liberation of nitrogen. The hydrogen binding curves show values for pK in water of 2, 1 and 8, 95.
These products are very soluble in water, but insoluble in ordinary nonpolar organic solvents. They are only very slightly soluble in absolute methanol, absolute ethanol or cold acetone, but are soluble in hot aqueous solutions of these solvents. They give the specific blue-purple stain in the ninhydrin test. Periodic acid oxidation of L 6-diazo-5-oxo-norleucine gives L-glutamic acid.
A similar reaction with D-6-diazo-5-oxonorleucine or DL-6-diazo-5-oxo-norleucine gives D-glutamic acid, respectively DL, glutamic acid.
These products form metal salts by reaction with hydroxides, carbonates, bicarbonates, oxides, alkyloxides, amides, etc., of alkali or alkaline earth metals.
The ultraviolet absorption spectra of the
D-6-diazo-5-oxo-norleucine, L-6-diazo-5-oxo = norleucine and DL-6-diazo-5-oxo-norleucine are the same.
In aqueous phosphate buffer, at pH 7, the characteristic ultraviolet absorption maxima are 683 at a wavelength of 274 millimicrons and 376 at a wavelength of 244 millimicrons.
The infrared absorption spectra of D6-diazo-5-oxo-norl (U) Cine and L-6-diazo-5-oxo-norleucine are identical. When determined by the potassium bromide disc method, the spectrum shows absorption peaks at the following wavelengths: 3, 19, 3, 32, 3, 78, 4, 66, 6, 14, 6, 30, 6, 59, 6, 90, 7, 18, 7, 39, 7, 54, 8, 33, 8, 66 8, 98, 9, 36, 9, 71, 10, 08, 10, 22 , 10, 59, 11, 65, 12, 08 12, 34 and 13, 16 microns.
The infrared absorption spectrum for DL-6-diazo-5-oxo-norleucine determined by the potassium bromide disk method, shows absorption peaks at the following wavelengths: 3, 34, 4, 66, 6, 13, 6, 31, 6, 59, 7, 06, 7, 19, 7, 43, 8, 72, 9, 26, 9, 90, 10, 67 and 11, 32 microns.
6-Diazo-5-oxo-norleucines possess strong phytotoxic properties, and are particularly useful as herbicides, weed killers and the like. For these purposes, a dilute aqueous solution is employed, and this is applied to the plant or to a plant culture according to methods known in the art. These compounds are effective at high dilutions and have a selective action against certain particularly undesirable weed species.
For example, in the case of L-6-diazo-5-oxo-norleucine, an aqueous solution at a concentration of 1000 parts per million, applied by spraying to the point of drip on plots of land for testing at Vigorous separate cultures of anserins and chenopods gave 100 kill, while growth on a comparable wheat plot was only prevented for 20/0 under identical conditions.
6-Diazo-5-oxo-norleucines have a high degree of activity against yeasts. Thanks to this trait, they can be used to isolate bacteria from microbial mixtures in which one or more
sieurs of the microorganisms are yeasts.
These compounds also have extraordinary properties in that they prevent the biosynthesis, in living cells, of essential nucleic acids and nucleic acid precursors and exert
also an inhibitory action on the development of neoplasms. The inhibitory effect of L-6-diazo-5-oxo-
norleucine is greater than that of the corresponding DL and D compounds; the DL compound, for its part,
has a higher inhibitory effect than the compound
D. The growth of tumors implanted in
mice or rats is quite prevented by
daily injections of L-6-diazo-5-oxo-norleucine.
The varieties of tumors that are thus affected include Sarcoma 180 (liquid and solid forms),
Sarcoma T 241, Sarcoma MA 387, Adenocar-
mammary cinoma E 0771, Adenocarcinoma Miyo
no, Mecca Lymphosarcoma, Osteogenic Sarcoma
than Ridgway, Osteogenic Wag's Sarcoma
ner, Mammary Adenocarcinoma RC, Carcinoma
Ehrlich (liquid and solid forms), Carcinoma
1025, Carcinoma Krebs 2 (fluid form) and
Murphy's rat lymphosarcoma.
These properties
extraordinary show that these products can t
possibly be used, either alone or in combination with other agents for inhibiting neoplasms (carcinomas, sarcomas, leukaemias, etc.). These products can be administered either by mouth or by injections.
It is understood that the structural formulas and chemical designations appearing in this disclosure encompass, without specification of the optical form, the active D-isomer form, the active L-isomer form and the optically inactive DL form of these compounds. Thus, when a chemical designation does not specify which form it is, this designation should be interpreted in its general sense, that is to say as designating either the active D-isomer or the active L-isomer. , or the racemic form
DL, optically inactive.
The process according to the invention is characterized in that a compound of formula
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in which R is an alkali metal, an alkaline earth metal or a lower alkyl radical, with hydrazine, to obtain a compound of the formula
EMI2.2
in that, in the case where R is a lower alkyl radical, the ester group present in aqueous alkaline medium is hydrolyzed below room temperature, and in that the metal salt of 6-diazo is neutralized -5-axo-norlucin with an acid.
For carrying out hydrazinolysis, the best results are obtained by employing two equivalents of hydrazine. A slight excess can be used, but less than three equivalents; larger amounts tend to cause the formation of the corresponding hydrazide thereby decreasing the yield of the desired 6-diazo-5-oxo-norleucine intermediate. Hydrazine can be introduced in various forms into the reaction mixture. For example, aqueous solutions of hydrazine or hydrazine hydrate can be employed.
In the case where the intermediate product is a metal salt, the reaction is generally carried out under aqueous conditions, and, when this product is an ester, it can be carried out in an organic solvent such as a lower aliphatic alcohol, a chlorinated hydrocarbon, a cyclic ether, etc. As specific examples of solvents which can be employed, there may be mentioned methanol, ethanol, chloroform, methylene chloride, dioxane, etc. The reaction can conveniently be carried out at temperatures below about 500 ° C and preferably at room temperature or below. The esters of 6-diazo-5-oxo-N-phthaloyl-norleucine can be prepared as described in J. Am. Chem.
Soc., 72, 2469 (1950) for the preparation of the 6-diazo-5-oxo-N-phthaloyl-norleucine methyl ester.
The hydrolysis of the 6-diazo-5-oxo-norleucine ester is carried out in an alkaline aqueous medium, preferably in the presence of an organic solvent miscible with water. As alkaline agents, hydroxides, carbonates, bicarbonates, oxides, aloxides, amides, etc., of alkali or alkaline earth metals, may be employed. Preferably, a dilute solution is employed, containing 1.0 to 1.1 equivalents, of an alkali metal hydroxide such as sodium or potassium hydroxide, at a temperature between -10 and Se C. hydrolysis is usually completed in 1 hour at 0 C and in 1 to 2 hours at 4 C.
The neutralization of the alkali or alkaline earth metal salt of 6-diazo-5-oxoenorleucine can be carried out, below room temperature, preferably between -10 and 5O C. As the acid, a mineral acid is preferred. such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. Neutralization is generally carried out by carefully lowering the pH to between 5.5 and 7, and preferably between 6 and 6.5. The product can be conveniently isolated by vacuum evaporation, lyophilization, chromatography, etc.
Example 1:
a) 4.3 g of L-6 diazo-5-oxo-N-phthaloyl-norleucine methyl ester are dissolved in 70 ml of methylene dichloride; 1.35 g of hydrazine hydrate are added and the mixture is stirred for about two hours, then allowed to stand at 20-250 ° C. for sixteen hours. The reaction mixture is then kept at 0 ° C for four hours, then filtered.
The filter cake contains the hydrazine salt of phthaloyl hydrazine. The filtrate is evaporated in a vacuum.
The residue is L-6-diazo-5-oxonorleucine methyl ester, which has the formula:
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L shape
b) 2.2 g of Lb-diazo-5-oxo-norleucine methyl ester are dissolved in 60 ml of methanol and cooled to 0 ° C., then 15 ml of normal sodium hydroxide are added, and the solution is left at 00 C for sixteen hours. The cold solution is brought to a pH of 6.5 by adding 2N hydrochloric acid with rapid stirring. The yellow solution is evaporated in vacuo to remove the methanol. The residual product is dissolved in approximately 50ml of water, the solution is frozen and the ice is sublimated from this frozen mass under a high vacuum.
250 milligrams of the solid residue are dissolved in 10 ml of water containing 1 / n of acetone and the solution is poured into an adsorption column containing 15 g of activated carbon and 15 g of diatomaceous earth. The column is immediately washed and developed with approximately 2.5 times the retained volume of 1 c / o aqueous acetone, and the eluate is collected in 10 ml fractions.
The three fractions which show the strongest absorption in the ultraviolet at a wavelength of 275 millimicrons are frozen, the ice is sublimated under a high vacuum and L-6-diazo-5 is obtained. -oxonorleucine sought, which has the formula:
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L shape
The product can be purified by recrystallizing a solution from several drops of water by adding five volumes of absolute methanol. The chemical, biological and physical properties of L-6 diazo-5-oxo-norleucine are those which have been discussed in the above.
The antipode-optical isomer, D-6diazo-5-oxo-norleucine, can be prepared as set out in Example 1 a) and b) starting from an ester of D-6-diazo. -5-oxo-N-phthaloyl-norleucine.
Example 2:
a) A solution of 24 g of DL-6-diazo-5-oxo-N-phthaloyl-norleucine methyl ester in 170 ml of methylene chloride is treated with 7.7 g of hydrazine hydrate and the cloudy solution is stirred at 22-25o C for 15 hours, then filtered. The filtrate is evaporated in vacuo. The waste product, DL-6-diazo-5-oxo-norleucine methyl ester, has the formula
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DL form
b) 12.5 g of DL-6-diazo-5-oxo-norleucine methyl ester are dissolved in 300 ml of methanol and cooled to 00 ° C.
70 ml of 1N sodium hydroxide are added and the pale red solution is maintained at 00 ° C. for sixteen hours. The pH of the solution is brought to 6.5 with 2N hydrochloric acid, and the mixture is evaporated in vacuo to remove the methanol. The residue is frozen and the ice is removed from the frozen mass by sublimation under a high vacuum. The solid residue is dissolved in 1 / o aqueous acetone and adsorbed in a column containing 45 g of activated carbon and 45 g of diatomaceous earth.
The column is washed and developed with about 2.5 times the retained volume of 1/0 aqueous acetone and the eluate is collected in 10 ml fractions. The fractions showing the strongest UV absorption at 275 millimicrons are frozen and the ice removed by sublimation; the desired DL-6-diazo-5-oxo-norleucine is thus obtained. This product, which corresponds to the formula:
EMI3.4
DL form is recrystallized from aqueous alcohol to obtain a substance having ultraviolet absorption, Eleomde 683 at a wavelength of 274 millimicrons.
The chemical, biological and other physical properties of this DL-6-diazo-5-oxo-norleucine are the same as those which have been indicated in the above description.
Example 3:
0.90 g of hydrazine hydrate is added to a suspension of 3.1 g of the potassium salt of L-6-diazo-5 oxo-N-phthaloyl-norleucine in 60 ml of methanol, and the mixture is stirred for about two hours, then let it sit at 20-25o C for sixteen hours.
The reaction mixture is concentrated by evaporation in a vacuum. The residue is dissolved in 50 ml of water and the pH is adjusted to 6.5 with 1N hydrochloric acid. The solution is filtered and the filtrate is poured into an adsorption column containing 20 g of charcoal. activated and 20 g of diatomaceous earth. The column is immediately washed and developed with about 2.5 times the retained volume of 1/0 aqueous acetone, and the eluate is collected in 10 ml fractions.
The four fractions which show the highest UV absorption at 275 millimicrons are frozen and the ice is sublimated in a high vacuum; the desired L-6-diazo-5-oxo-norleucine is obtained. The opposite optical isomer, D-6-diazo-5-oxo-norleucine, can be prepared in the same way starting from the potassium salt of D-6-diazo-5-oxo-phthaloyl-norleucine, which can be prepared from a corresponding alkyl ester as set forth immediately below.
The above-mentioned starting material can be obtained as follows: 4.5 g of L-6-diazo-5-oxo-N-phthaloyl-norleucine methyl ester is dissolved in 50 ml of 70% methanol. o; 2.5 g of potassium carbonate are added and the solution is left to stand at 10 ° C. for 24 hours. The solution is then evaporated in a vacuum. The waste product is the potassium salt of L-6-diazo-5-oxo-N-phthaloyl-norleucine, which can be used directly as a raw material for the above operation without further treatment. Other metal salts can be prepared in the same way.