Procédé de préparation de la 6-diazo-5-oxo-norleucine
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines, soitla D-6-diazo-5- oxo-norleucine, la L-6-diazo-5-oxo-norleucine et la DLr6-diazo-5-oxo-norleucine possèdent des propdé- tés tout à fait particulières, comme cela ressort de la description qui suit. Comme ces substances différent les unes, des. autres au point de vue chimique seulement en ce que les premières sont des formes isomères s optiquement actives tandis que la dernière est la forme optiquement racémique de la 6-diazo-5-oxo- norleucine, les propriétés chimiques de ces composes sont identiques de même que beaucoup de leurs, propriétés physiques.
Ces composés contiennent seulement les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote et ont la formule brute CgHgNgOg. Ils ont un poids moléculaire de 171 et peuvent être représentés par la formule, développée :
EMI1.1
Le pouvoir rotatoire spécifique [a] 2D de la L-6 d, iazo-5-oxo-norleucine est + 210 (à 5,4 /o dans l'eau), et de la D-6-diazo-5-oxo-norleucine,-16, 10 (à 1,98 /o dans l'eau à 250 C).
La D-6-diazo-5-oxo-norleucine, la L-6-diazo"5- oxo-norleucine et la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine sont relativement instables à la chaleur et se décomposent avant de fondre. La décomposition ne se produit pas à une température spéciale et, par conséquent, les points de décomposition et de fusion varient entre de larges limites selon la méthode employée pour leur détermination. La décomposition commence en général à environ 145 C et peut continuer jusqu'à ce qu'on atteigne 1550 C. La décompo- sition est accompagnée d'un dégagement de gaz.
Ces composés, se décomposent dans les acides aqueux avec libération d'azote. Les courbes de liaison d ! hy- drogène montrent des valeurs pour pK'α dans l'eau de 2,1 et 8,95.
Ces produits sont très solubles dans l'eau, mais insolubles dans les solvants organiques non polaires ordinaires. Ils sont seulement très légèrement solu- bles dans le méthanol absolu, l'éthanol absolu ou l'acétone à froid, mais sont solubles dans les solutions aqueuses chaudes de ces solvants. Ils donnent la coloration spécifique bleu pourpre dans Fessai à la ninhydrme. L'oxydation par l'acide périodique de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide L-glutami- que. Une réaction semblable avec la D-6-diazo-5-oxo- norlieucine ou la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide D-glutamique, respectivement l'acide DL-glutamique.
Ces produits forment des sels de métaux par réaction avec des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoyl-oxyd, es, amidures, etc., de métaux al calins ou alcalinoXberreux.
Les spectres d'absorption dans l'ultraviolet de la
D-6-diazo-5-oxo-norleucine, L-6-diazo-5-oxo-norleu- cine et DL-6-diazo-5-oxo-norleucine sont identiques.
Dans un tampon de phosphate aqueux, à un pH de 7, les maxima caractéristiques d'absorption dans l'ultraviolet sont pour EtL9/mdle 683 à une longueur d'onde de 274 millimicrons et de 376 à une longueur d'onde de 244 millimicrons.
Les spectres d'absorption dans l'infrarouge de la D-6-diiazo-5-oxo-norleucine et de la L-6-diazo ; 5-oxo- norleucine sont identiques. Quand on les détermine par la méthode au disque de bromure de potassium, le spectre montre des sommets d'absorption aux lon- gueurs d'onde suivantes : 3,19,3,32,3,78,4,66,6,14, 6,30, 6. 59,6,90,7,18,7,39,7,54,8,33,8,66,8,98, 9,36,9,71,10,08,10,22,10,59,11,65,12,08,12,34 et 13,16 microns.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge pour la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine déterminé par la méthode au disque de bromure de potassium, montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde sui- vantes : 3,34,4,66,6,13,6,31,6,59,7,06,7,19, 7,43,8,72,9,26,9,90,10,67 et 11,32 microns.
Les 6-diazo-5-oxo-norleucines possèdent des propriétés phytotoxiques bien marquées, et sont particulièrement utiles comme herbicides, destructeurs de mauvaises herbes et semblables. A ces fins, on emploie une solution aqueuse diluée, et celle-ci est appui- quée à la plante ou à une culture de plantes selon les méthodes connues dans ce domaine. Ces composés sont efficaces à de hautes dilutions et ont une action sélective contre certaines espèces de mauvaises herbes particulièrement indésirables.
Par exemple, dans le cas de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine, une solution aqueuse à une concentration de 1000 parties par million, appliquée par projection jusqu'au point d'égouttement à des parcelles de terrain pour r essais à cultures séparées vigoureuses d'ansérines et de chénopodes a donné 100 O/o de destruction, tandis que la croissance sur une parcelle de blé comparable n'a été empêchée que pour 20 /0 dans des conditions identiques.
Les 6-diazo-S-oxo-norleucines possèdent un haut degré d'activité contre les levures. Grâce à ce caractère, elles peuvent être utilisées pour isoler des bactéries de mélanges microbiens dans lesquels un ou plusieurs des microorganismes sont des levures.
Ces composés possèdent aussi Ws propriétés extraordinaires du fait qu'ils empêchent la biosynthèse, dans les cellules vivantes, d'acides nucléiques essentiels et de précurseurs d'acides nucléiques et exercent aussi une action inhibitrice sur le développement de néoplasmes. L'effet inhibiteur de la L-6 diazo-5-oxo-norleucine est plus grand que celui des composés DL et D correspondants ; le composé DL, de son côté, possède un effet inhibiteur plus élevé que le composé D.
La croissance de tumeurs implantées dans des souris ou des rats est tout à fait empêchée par des injections journalières de L-6-diazo-5-oxo- norleucine. Les variétés de tumeurs qui sont ainsi atteintes comprennent le Sarcome 180 (formes liquide et solide), le Sarcome T 241, le Sarcome MA 387, l'Adenocarcinome mammaire E 0771, l'Adenocarcinome Miyono, le Lymphosarcome Mecca, le Sarcome ostéogénique de Ridgway, le Sarcome ostéo- génique de Wagner, l'Adenocarcinome mammaire
RC, le Carcinome d'Ehrlich (formes liquide et solide), le Carcinome 1025, le Carcinome Krebs 2 (forme fluide) et le Lymphosarcome du rat, de Murphy.
Ces propriétés extraordinaires montrent que ces produits peuvent éventuellement être employés, soit seuls soit en combinaison avec d'autres agents d'inhibition des néoplasmes, tels que la 6-mercaptopurine, dans le traitement de maladies néoplastiques (carcinomes, sarcomes, leucémies, etc.). Ces produits peuvent être administrés soit par voie buccale soit par injections.
La dénomination commune ou générique diazo- oxonorleucine a été adoptée pour la L-6-diazo-5- oxo-norleucine.
Il est entendu que les formules développées et les désignations chimiques figurant dans le présent exposé, englobent, en l'absence de spécification de la forme optique, la forme isomère D active, la forme isomère L active et la forme DL optiquement inactive de ces composés. Ainsi donc, quand une désignation chimique ne spécifie pas de quelle forme optique il s'agit, cette désignation doit être interprétée dans son sens général, c'est-à-dire comme désignant soit l'iso- mère D actif, soit l'isomère L actif, soit la forme racémique DL, optiquement inactive.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un ester de la 6-diazo-5-oxo-N-tri- fluoracétyl-norleucine à une hydrolyse.
Cette hydrolyse peut être effectuée en milieu aqueux alcalin à une température au-dessous d'environ 300 C. La réaction est favorisée en présence de solvants organiques miscibles à l'eau tels que des alcools aliphatiques inférieurs ou semblables. Comme agent alcalin, on peut employer les hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoxydes, amides et semblables de métaux alcalins ou alcalino-terreux.
De préférence, on emploie une solution diluée contenant deux équivalents d'un hydroxyde de métal alcalin, tel que l'hydroxyde de sodium ou de potassium, à une température entre-10 et 00 C. L'hydrolyse est en général terminée au bout de huit à douze heures. Le produit, qui est sous la forme d'un sel de métal, peut être converti en l'acide libre 6-diazo-5 oxo-norleucine en neutralisant le mélange de réaction par exemple avec un acide au-dessous de la temperature ordinaire. On peut utiliser pour cela un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique ou phosphorique. La neutralisation peut être effectuée en abaissant avec précaution le pH entre 5,5 et 7, et de préférence entre 6 et 6,5.
Le produit de l'hydrolyse et de la neutralisation peut être isolé par les méthodes d'adsorption sélective et élution, et l'éluat peut être purifié en le desséchant à l'état congelé et en cristallisant le résidu solide dans un solvant convenable. L'hydrolyse peut aussi être produite par des moyens enzymatiques, en employant par exemple une combinaison d'estérase et d'acylase comme on peut l'obtenir à partir de rognons de porcs.
Exemple
I. Preparation de la matière de départ
a) Un mélange de 36 g d'acide N-trifluoroacétyl-
L-glutamique et 50 ml d'anhydride acétique est chauffé à 100 C au bain-marie pendant six heures.
On ajoute alors rapidement 150 ml de xylène et le mélange de réaction est maintenu pendant seize heures à-50 C. Le produit qui se sépare est retiré par filtration, lavé avec du xylène et séché dans un des siccateur à vide ; P. F. 66-680 C [a] 27 =-19, 7 (dans dioxane, 4 /0). Le produit est l'anhydride N trifluoroacétyl-L-glutamique de formule :
EMI3.1
forme L
b) On dissout rapidement 21 g d'anhydride N- trifluoroacétyl-L-glutamique dans 100ml de méthanol froid (0-10 C) contenant 5 g de méthoxyde de sodium.
On laisse reposer la solution résultante pendant quatre heures à 0-15 C. On concentre la solution dans le vide et reprend le produit résiduaire dans environ 300 ml d'eau. La solution est acidifiée à un pH de 1,5 avec un mélange d'acide chlorhydrique concentré et de glace. La solution aqueuse est extraite cinq fois avec des portions d'éther de 75 ml et les extraits sont combinés, sèches sur du sulfate de magnésium anhydre et filtrés ; le filtrat est concen- tré dans le vide.
Le produit résiduaire contient une forte proportion de l'ester a-méthylique de l'acide N trifluoroacétyl-L-glutamique, de formule :
EMI3.2
forme L
Ce produit contient aussi l'ester a-méthylique de l'acide N-trifluoroacétyl-L-glutamique.
c) L'ester méthylique produitenb) est chauffé au bain-marie avec 100 g de chlorure de thionyle pen- dant quarante-cinq minutes à la température de reflux. La solution résultante est concentrée dans le vide en une huile incolore. On ajoute 25 ml de benzène puis élimine dans le vide toute substance volatile.
Le produit résiduaire est un mélange de chlorure de L-4-carbométhoxy-4-trifluoroacétamidobutyryle, de formule :
EMI3.3
forme L et de chlorure de L-2-trifluoroacétamido-4-carbo- méthoxybutyryle, formé comme sous-produit.
d) Le produit obtenu en c) est repris avec 200 ml d'éther et ajouté lentement à une solution éfhérique contenant quatre équivalents (15 g) de diazométhane à 0-5O C. On laisse reposer le mélange de réaction à cette température pendant environ 30 minutes puis on le laisse se réchauffer à 250 C pendant 2 Va heules. Le mélange de réaction est filtré et le solvant est éliminé par distillation dans le vide.
Le produit contient l'ester méthylique de L-6-diazo-5-oxo-N-tri- fluoroacétyl-norleucine, de formule :
EMI3.4
forme L
II. Mise en ceuvre du procédé
Le produit obtenu en d) est repris avec 250 ml de méthanol à 00 C. On ajoute 2 litres d'hydroxyde de sodium 0,1 N refroidi à 30 C, ot la solution résul- tante est maintenue à-5 C pendant 11 heures. La solution est neutralisée avec un mélange d'acide chlorhydrique 2N et de glace à un pH de 6, puis concentrée dans un évaporateur à circulation à des températures de 20-300 C, jusqu'à un volume de 500 ml.
Le produit, qui contient la L-6-diazo-5-oxo- norleucine, de formule :
EMI3.5
formeL peut être purifié par adsorption sélective et elution de la manière suivante : une solution ne contenant pas plus de 3 g de L-6-diazo-5-oxo-norleucine, déterminée par bio-essai, est versée dans une colonne contenant un mélange de 200 g de charbon activé et 200 g de terre de diatomées. Le produit est élue avec environ 2,5 fois le volume retenu d'acétone aqueuse à 1 /o et l'éluat est recueilli en fractions de un dixième de volume retenu.
Les fractions montrant t l'absorption la plus forte dans l'ultraviolet à 275 milmicrons sont congelées,et la glace en est sublimée ; on obtient la L-6-diazo-5-oxo-norleucine sous forme d'une poudre jaune clair.
Après recristallisation dans de l'éthanol, le produit a un pouvoir rotatif [ ] 2D de + 210 (C = 5,4 /0 dans l'eau). La D-6-diazo-5-oxo- norleucine et la DL-6-diazo-5-oxo-norleucine peuvent être préparées de la même manière à partir des acides N-trifluoroacétyl-D-glutamique et N-triSluoroacé- tyl-DL°glutamique, et jen opérant comme indiqué de a) à d) ci-dessus.