Procédé de préparation de vglutamylpeptides
L'objet de la présente invention est un procédé d'obtention de y-glutamyl-peptides dérivant de l'acide glutamique de la formule suivante :
EMI1.1
On sait que différents polypeptides naturels renferment parmi l'enchaînement des peptides qui les constituent un ou, plusieurs groupes glutamyl-peptide et le procédé selon l'invention fournit un moyen d'ac cès aux L-glutamyl-peptides des formules VI à partir desquels on peut édifier des chaînes polypeptidiques ou. qu'on peut introduire dans la molécule à synthéti- ser. Certains de ces, glutamyl-peptides peuvent également présenter un intérêt biologique ou industriel par eux-mêmes.
Dans son brevet suisse No 338197, la titulaire a décrit la préparation de N-trityl-aminoacides par réaction, des esters des aminoacides correspondants employés à l'état libre ou de chlorhydrate de la fonction amine, avec le chlorure de trityle en présence d'une base tertiaire. Si 1'ester est employé à l'état de chlorhydrate, on utilise un excès de base susceptible de le libérer extemporanément et de neutraliser en même temps l'acide chlorhydrique formé au cours de la réaction. La saponification de l'aminoester N-tritylé ainsi formé conduit au N-trityl-aminoacide cherché.
En outre, le brevet susmentionné décrit un procédé d'obtention de N-peptides en transformant lesdits N-trityl-aminoacides en anhydrides mixtes selon les méthodes connues et en faisant réagir ces derniers avec un amino-ester. La saponification de 1'ester du
N-trityl-peptide obtenu suivie d'une détritylation par chauffage avec l'acide acétique aqueux conduit aux peptides cherches sans racémisation. Certains aminoacides N-tritylés ne se prêtant pas à la transformation en peptides par la méthode aux anhydrides mixtes, la titulaire a montré dans son brevet suisse No 343407 qu'on peut les transformer aisément en N-trityl-peptides correspondants en les faisant réagir sur un aminoester en présence de dicyclohexylcarbodiimide ;
la saponification et la détritylation à l'acide acétique aqueux fournissant le N-peptide cherché.
On peut accéder aux y-glutamyl-peptides en mettant à profit certaines propriétés particulières de dif férents diesters N-tritylés de l'acide L-glutamique III, ainsi que des monoesters de formule IV, ou de certains diesters mixtes de formule IIIa où R'est différent de R.
Il a été trouvé en effet que les diesters glutamiques III excellent par une stabilité très grande du groupe ester en a vis-à-vis des alcalis, de sorte que leur monosaponification en y est facile à réaliser. On peut aboutir ainsi à l'a-monoester N-tritylé de formule IV. Cette même stabilité peut être mise à profit, comme la titulaire l'a déjà montré dans le brevet suisse No 344714 pour préparer le N-trityl-glutamate de y-méthyle et d'a-benzyle de formule IIIa, où
R'= CH2-C6H5 et R = CH3 et qui consiste à soumettre le¯ N-trityl-glutamate de dibenzyle de formule III (R = R'= CH2-C6q,,) à une méthanolyse en présence d'an agent alcalin.
Conformément au brevet suisse No 348161, on aboutit facilement aux a-glutamyl-peptides en sou mettant le N-trityl-glutamate de y-méthyle et d'a- benzyle de formule IIIa (R'=-CH2-C, ; H", R = CH) à une hydrogénolyse, en condensant le N-trityl-glutamate de y-monométhyle ainsi obtenu avec un aminoester en présence de dicyclohexylcarbodiimide et en saponifiant par des alcalis et en détritylant par l'acide acétique le diester de l'a-glutamyl-peptide N tritylé résultant.
On aurait donc pu penser que l'accès aux y-glutamyl-peptides se ferait avec la même simplicité au départ de l'a-monoester de formule IV, mentionné plus haut. En fait, l'application de la méthode au dicyclohexylcarbodiimide ne conduit pas aux y-pepti- des attendus. Il se forme cependant le diester du N trityl-L-y-glutamyl-peptide de formule V. Mais la fonction ester en a de ce composé est très labile, tandis qu'elle est très stable dans le diester glutamique N-tritylé de départ.
En présence d'alcalis, le composé de formule V engendre donc vraisemblablement le composé intermédiaire de formule Va, dont l'hydrolyse alcaline suivie de détritylation fournit essentiellement l'a-glutamyl-peptide à côté d'un faible pourcentage de y-glutamyl-peptide.
La saponification entraînant la transposition, il fallait donc l'éviter pour accéder aux y-glutamyl-peptides. On y parvient en appliquant le procédé qui fait l'objet de la présente invention et qui est caractérisé en ce qu'on condense le N-trityl-glutamate d'a-ben- zyle IV avec l'ester benzylique d'un aminoacide, de préférence en présence de dicyclohexylcarbodiimide, pour obtenir le diester benzylique du N-trityl-y-gluta- myl-peptide V (R = R'=-CH-CQHS) dont on libère les deux carboxyles par hydrogénolyse, et qu'on détrityle l'acide dicarboxylique résultant, de préfé- rence par l'acide acétique aqueux.
Le N-trityl-glutamate d'a-benzyle peut être obtenu au départ du composé IIIa par monosaponification.
Il est à remarquer que le procédé suivant l'inven- tion conduit aux y-peptides de l'acide L-glutamique avec d'excellents rendements et sans aucune racémi- sation. A fortiori, on peut préparer selon le même procédé les y-peptides de l'acide DL-glutamique, et il est évident que le procédé est également applicable à l'acide D-glutamique.
Le schéma (page 3) explique les modalités d'accès aux différents composés illustrés par les exemples suivants. Les points de fusion sont des points de fusion instantanée déterminés sur bloc de Maquenne.
Exemple 1
Préparation de la L-y-glutamyl-glycine VI (RI = H)
à partir du N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle IV
(R' = -CH2-C6H5) a) Condensation du N-trityl-L-glutamate
d'a-benzyle avec le glycinate de benzyle
On prépare 3, 6 g de glycinate de benzyle libre
en traitant ure solution du chlorhydrate de glyci
nate de benzyle avec la quantité théorique de
potasse 5N, relargue au sel, extrait à l'éther et
évapore. Le glycinate de benzyle ainsi obtenu est
dissous dans 6 cm de chlorure de méthylène, on
ajoute la solution de 5 g de dicyclohexylcarbodi
imide dans 10 cm ? de chlorure de méthylène, re
froidit à 0 et introduit 9, 6 g de N-trityl-L-gluta
mate d'a-benzyle.
On obtient ainsi le diester dibenzylique brut
de formule V, (R'et R"=-CH.,-C6H5,
Ri = H) avec un rendement quantitatif. b) Hydrogénoly du diester dibenzylique
brut de la N-trityl- l-glutamyl-glycine V
(R'et R"=-CH.-C (iH5, R, = H) et
détritylation
Le produit brut obtenu selon a) est hydro
génolysé en solution alcoolique. Après l'avoir dis
sous dans 55 cm3 d'alcool, on en distille 5 cmS
pour éliminer le chlorure de méthylène, puis on
dilue à 300cm3 par addition d'alcool et ajoute
6 g de noir palladié obtenu à partir de 30 cm3 de
chlorure palladeux et hydrogène.
On fixe facile
ment 760cm3 d'hydrogène (la théorie demande
880 cm3). On filtre, lave le noir à l'alcool et Úva
pore à sec sous vide. Le résidu est détritylé par
20 cm3 d'acide acétique aqueux à 50 /o en chauf
fant au bain-marie, puis on ajouts 20 cm ? d'eau.
Après avoir laissé refroidir et avoir éliminé le tri
phényl carbinol par filtration, on concentre le
filtrat à faible volume, reprend par l'eau, concen-
tre à nouveau pour chasser l'acide acétique et
reprend à l'alcool. La y-glutamyl-glycine VI
(R1 = H) précipite. On essore, lave à l'acétone et
sèche. Rendement : 1, 4 g, soit 70 ouzo de la théorie.
On la purifie par dissolution dans 1'eau et repré
cipitation par l'alcool ou l'acétone et obtient fina
lement le produit cristallisé pur avec un rendement
d'environ 60%. [α]20 = + 11,5¯ ¯ 1 (c = 2 /o,
eau). Il donne une réaction fortement positive à
la ninhydrine. La y-glutamyl-glycine se présente
en prismes solubles dans l'eau, les acides et alca
lis dilués aqueux, insolubles dans l'alcool, l'éther,
l'acétone et le benzène.
Le N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle utilisé comme composé de départ peut être obtenu comme suit :
A une solution bouillant à reflux de 9, 87 g
de N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle et de y-mé-
thyle (décrit dans le brevet suisse No 344714)
dans 100 cm3 de méthanol, on ajoute petit à petit,
en quinze à vingt minutes, environ 21 cm de
soude normale et maintient l'ébullition encore
quinze minutes. On concentre la solution de moi
tiÚ, la dilue par 40 cm3 d'eau, passe au noir végé-
tal, puis acidifie par l'acide chlorhydrique jusqu'à
pH 2 à 3. Le produit précipite à l'état pulvéru-
lent.
On l'essore, lave à 1'eau et sèche en exsicca
teur. Le N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle ainsi
obtenu est utilisé directement pour la synthèse du g-glutamyl-peptide.
EMI3.1
<tb>
<SEP> HOOC-CH-CH2-CH2-COOH
<tb> <SEP> NU,
<tb> <SEP> (I)
<tb> <SEP> Estérification
<tb> <SEP> R'OOC-CH-CH2-CH2-COOR
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> NH.,
<tb> <SEP> (II) <SEP> (R= <SEP> R')
<tb> <SEP> Tritylation
<tb> <SEP> R'OOC-CH-CH2-CH2-COOR <SEP> alcoolyse <SEP> R'OOC-CH-CH2-CH2-COOR
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (qHfi) <SEP> 3 <SEP> NH-C <SEP> (qH5) <SEP> 3
<tb> <SEP> aII) <SEP> (R= <SEP> R')
<tb> <SEP> monosaponification <SEP> (IIIa) <SEP> (R <SEP> différent <SEP> de <SEP> R')
<tb> <SEP> Monosaponification
<tb> <SEP> R'OOC-CH-CH,-CI-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (C6H5) <SEP> 3 <SEP> + <SEP> NHe-CH-COOR"
<tb> <SEP> t
<tb> <SEP> R'OOC-CH-CH2-CH,-CO-NH-CH-COOR"
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (CGH5) <SEP> Rt <SEP> (V)
<tb> <SEP> Hydrogenolyse <SEP> saponification
<tb> <SEP> Y <SEP> g <SEP> Y <SEP> p
<tb> <SEP> et <SEP> \
<tb> <SEP> Détritylation
<tb> <SEP> CH2-CO
<tb> <SEP> CH2 <SEP> N-CH-COOR"
<tb> <SEP> CH <SEP> CO <SEP> Ri
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (H5) <SEP> 3
<tb> <SEP> (Va)
<tb> <SEP> Ri <SEP> et <SEP> détritylation
<tb> <SEP> \ <SEP> (formation <SEP> très <SEP> limitée)
<tb> HOOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-COOH
<tb> <SEP> NH2
<tb> <SEP> (VI)
<tb> γ
-glutamyl-peptide
Exemple 2
Préparation de la L-y-glutamyl-L-leucine VI
EMI4.1
à partir du N-trityl-L-glutamate d'a-monobenzyle IV (R'=-CH2C6H) a) Condensation du N-trityl-glutamate
d'a-monobenzyle avec le L-leucinate
de benzyle
On opère comme dans l'exemple 1 a), à partir
de 4, 5 g de leucinate de benzyle préparé selon la
technique de Cipera et Nicholls (Chemistry and
Industry, 1955, 1, 16), 5 g de dicyclohexylcarbo
diimide et 9, 6 g de N-trityl-glutamate d'a-mono-
benzyle préparé selon l'exemple 1.
On obtient
ainsi 15, 2 g de diester benzylique du N-trityl-Y-
glutamyl-peptide brut V (R'= R = -CH2-C6H5;
EMI4.2
b) Hydrogenolyse du diester benzylique
de la N-trityl-L-y-glutamyl-L-leucine
et detritylation
Le produit de condensation obtenu selon a)
est repris dans 200 cm3 d'alcool absolu et hydro
géné en présence de 1, 5 g de charbon palladié à
6, 5"/o de palladium. Après cinq minutes, on
ajoute encore 4, 5 g de charbon palladié et pour
suit l'hydrogénation pendant trente minutes. On
filtre, concentre à petit volume et essore.
Le pro
duit semi-cristallisé ainsi obtenu est repris pen
dant dix minutes à chaud par 20 cm3 d'acide acé
tique aqueux à 50 /o. On ajoute 20 cm3 d'eau,
essore le triphényl carbinol, concentre la solution
résultante jusqu'à consistance sirupeuse et ajoute
au concentrât 300 cm3 d'acétone. On essore, sèche
à 800 C et obtient ainsi 2, 6 g de L-y-glutamyl-L-
leucine, soit un rendement de 50 ouzo par rapport
au N-trityl-glutamate d'a-monobenzyle de départ.
Le produit fond à 185 C (fusion lente) et 2200 C
(fusion instantanée) avec décomposition. [a12 =
-14 1 (c = 2 /0, eau). Ces constantes corres
pondent bien à celles de la littérature (cf.
Rowland et Young, J. Chem. Soc., 1952, 3937).
Exemple 3
Préparation de la y-glutamyl-L-tyrosine VI
EMI4.3
à partir du N-trityl-glutamate d'a-benzyle IV (R'=-CH2-C ; H5) a) Condensation du N-trityl-glutamate d'a
benzyle avec le L-tyrosinate de benzyle
On opère comme dans l'exemple 1 a), le tyro
sinate de benzyle étant préparé selon la technique de Cipera et Nicholls (Chemistry and Industry 1955, p. 16). Ce produit est utilisé à l'état brut.
Pour l'analyse, on le purifie par recristallisation en acétate d'éthyle, F = 120¯C. [α]25 = -12,5¯ 1 (c = 2"/o, méthanol). A partir de 5, 6 g de tyrosinate de benzyle, 20 cm3 de chlorure de mé thylène, 5 g de dicyclohexylcarbodiimide et 9, 6 g de N-trityl-glutamate d'a-benzyle, on obtient, après le traitement usuel, 16 g de diester benzylique, du N-trityl-y-glutamyl-peptide brut V (R = R-=-CH-QH,,
EMI4.4
b) Hydrogénolyse du diester benzylique
de la N-trityl-L-y-glutamyl-L-tyrosine
et ditritylation
On opère comme dans l'exemple 2 b).
Après
avoir concentré la solution acétique du peptide
cherche à petit volume, on ajoute de l'acétone.
Le produit devient pulvérulent. On essore, sèche,
dissout le peptide dans 10 cm3 d'eau, filtre cette
solution, précipite par l'acétone, essore, lave à
l'acétone et sèche. On obtient 4 g de y-glutamyl-
L-tyrosine, soit un rendement de 65 /0. Le pro
duit amorphe cristallise lentement par dissolution
dans le minimum d'eau et addition d'acétone jus
qu'à ce que la solution commence à se troubler.
F. (déc.) = environ 255o C, M = + 26 1
(c = 2 o/o, eau).
Le composé est identique à celui obtenu par
une autre voie par Le Quesne et Young (J. Chem.
Soc., 1950, p. 1959).