Procédé de préparation d'cc-glutamylWpeptides
L'objet de la présente invention est un procédé de préparation d'a-glutamyl-peptides dérivant de l'acide glutamique de la formule suivante 1 :
EMI1.1
On sait que différents polypeptides naturels renferment parmi l'enchaînement des peptides qui les constituent un ou plusieurs groupes glutamyl-peptide et le procédé selon l'invention fournit un moyen d'accès aux L-glutamyl-peptides de formule VII à partir desquels on peut édifier des chaînes polypepti- diques ou qu'on peut introduire dans la molécule à synthétiser. Certains de ces glutamyl-peptides peuvent également présenter un intérêt biologique ou industriel par eux-mêmes.
Dans son brevet suisse Nu 338197, la titulaire a décrit la préparation de N-trityl-aminoacides par réaction des esters des aminoacides correspondants employés à l'état libre ou de chlorhydrate de la fonc- tion amine, avec le chlorure de trityle en présence d'une base tertiaire. Si 1'ester est employé à l'état de chlorhydrate, on utilise un excès de base susceptible de le libérer extemporanément et de neutraliser en même temps l'acide chlorhydrique formé au cours de la réaction. La saponification de l'aminoester N-tri tylé ainsi formé conduit au N-trityl-aminoacide cherché.
En outre, le brevet susmentionné décrit un procédé d'obtention de N-peptides en transformant lesdits N-trityl-aminoacides en anhydrides mixtes selon les méthodes connues et en faisant réagir ces derniers avec un amino ester. La sponification de l'ester du N-trityl-peptide obtenu suivie d'une détrityla- tion par chauffage avec l'acide acétique aqueux conduit selon une caractéristique particulière du procédé aux peptides cherchés sans racémisation. Certains aminoacides, N-tritylés ne se prêtant pas à la transformation en peptides par la méthode aux anhydrides mixtes,
la titulaire a montré dans son brevet suisse ? 338197 qu'on peut les transformer aisément en N-trityl-peptides correspondants en les faisant réagir sur un aminoester en présence de dicyclohexyl- carbodiimide. La saponification et la détritylation à l'acide acétique aqueux fournissent le N-peptide cherché.
On peut accéder aux a-glutamyl-peptides en mettant à profit certaines propriétés particulières de dif férents diesters N-tritylés de l'acide L-glutamique III, ainsi que des monoesters de formule IV, ou de certains diesters mixtes de formule VIII où R'est différent de R.
Les diesters glutamiques III excellent par une stabilité très grande du groupe ester en a vis-à-vis des alcalis de sorte que leur monosaponification en y est facile à réaliser. On peut aboutir ainsi à l'a- monoester N-tritylé de formule IV.
Cette même stabilité peut être mise à profit, comme la titulaire l'a déjà montré dans le brevet suisse No 344714, pour préparer le N-trityl-glutamate de y-méthyle et d'abenzyle de formule VIII, où R'=CH2-C6H5 et R= CH3 et qui consiste à soumettre le N-tritylglutamate de dibenzyle de formule III
(R = R'=-CH2-C6H5 à une méthanolyse en présence d'un agent alcalin.
Par hydrogénolyse du N-trityl-glutamate de y-méfhyle et d'a-benzyle, on peut aboutir au N-trityl-glutamate de y-monométhyle de formule IX.
Le procédé suivant l'invention consiste à condenser un a-ou y-monoester glutamique N-tritylé (formules IV et IX) avec un ester d'aminoacide, à saponifier par des alcalis le diester du N-trityl glutamyl-peptide obtenu et à détrityler le N-trityl-a- glutamyl-peptide résultant.
Il est avantageux d'effectuer la condensation, en présence de dicyclohexylcarbodiimide. La détdtyla- tion est effectuée, de préférence, à l'aide d'acide acétique aqueux chaud.
On aurait pu s'attendre à ce que la condensation des a-monoesters de formule IV avec les esters d'aminoacides conduise aux y-peptides. En fait, l'application de la méthode du dicyclohexylcarbodiimide ne conduit pas aux y-peptides attendus. Il se forme cependant le diester du N-trityl-Ly-utamyl-peptide de formule V. Mais la fonction ester en a de ce composé est très labile tandis qu'elle est très stable dans le diester glutamique N-tritylé. En présence d'alcalis, le composé de formule V engendre vraisemblablement le composé intermédiaire de formule VI.
La détritylation de ce composé fournit essentiellement
EMI2.1
<tb> <SEP> HOOC-CH-CH2-CH2-COOH
<tb> <SEP> NH2 <SEP> (
<tb> <SEP> Estérification
<tb> R'OOC-CH-CH2-CH2-COOR
<tb> <SEP> NHa <SEP> (II)
<tb> <SEP> Tritylation
<tb> R'OOC-4 <SEP> tH-CH2-CH2-COOR <SEP> alcoolyse <SEP> > <SEP> R'OOC-CH-CH2-CH2-COOR
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (C6Hs) <SEP> 3 <SEP> (III) <SEP> NH-C <SEP> (C6Hs) <SEP> s
<tb> <SEP> (VIII)
<tb> <SEP> (R <SEP> = <SEP> R') <SEP> monosaponification <SEP> (R <SEP> différent <SEP> de <SEP> R')
<tb> <SEP> Monosaponification/iydrogenolyse
<tb> R'OOC-CH-CH2-CH2-COOH <SEP> HOOC-CH.
<SEP> CH2-CH2-COOR
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (C6Hs) <SEP> 3 <SEP> + <SEP> NH2-CH-COOR"NH-C <SEP> (C6Hs) <SEP> 3 <SEP> + <SEP> NH2-CH-COOR"
<tb> <SEP> (IV) <SEP> Ri <SEP> (IX) <SEP> Ri
<tb> <SEP> R'OOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-COOR"R"OOC-CH-NH-CO-CH-CH2-CH2-COOR
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (C6Hs) <SEP> s <SEP> Ri.
<SEP> Ri <SEP> NH-C <SEP> (CeHs) <SEP> 3
<tb> <SEP> (X)
<tb> <SEP> \ <SEP> saponification
<tb> <SEP> CH2-CO
<tb> <SEP> Saponification
<tb> <SEP> CH2 <SEP> N-CH-COOR"et
<tb> <SEP> \/I <SEP> Détritylation
<tb> <SEP> CH-CO <SEP> Ri
<tb> <SEP> NH-C <SEP> (C6H5) <SEP> S
<tb> <SEP> \ <SEP> Détritylation
<tb> <SEP> Ri
<tb> <SEP> COOH-CH-NH-CO-CH-CH2-CH2-COOH
<tb> <SEP> NH2
<tb> <SEP> (VII)
<tb> <SEP> a-glutamyl-peptide
<tb> l'a-glutamyl-peptide de formule VII, à côté d'un faible pourcentage de y-glutamyl-peptide.
Il est à remarquer qu'en partant aussi bien d'un y-monoester glutamique N-tritylé que d'un a-moester glutamique N-tritylé, on obtient des a-glu- tamyl-peptides avec d'excellents rendements et qu'il n'y a pas de racémisation. A fortiori, peut-on préparer selon les mêmes modes d'exécution les a- peptides de l'acide DL-glutamique et il est évident que le procédé est également applicable à l'acide Dglutamique.
Le schéma (page 2) explique les modalités d'ac cès aux différents composés illustrés par les exemples suivants. Les points de fusion sont des points de fusion instantanée déterminés sur bloc de Maquenne.
Exemple 1
Preparation de l'a-L-glutamyl-glycine a) Condensation du N-trityl-L-glutamate d'a-mono
éthyle avec le glycinate d'éthyle
On dissout 1, 1 g de glycinate d'éthyle libre (obtenu à partir de son chlorhydrate d'après le procédé décrit dans le brevet suisse No 338197) dans 3 cm3 de chlorure de méthylène et on ajoute la solution de 2, 5 g de, dicyclohexylcarbodiimide dans 5 cm3 de chlorure de méthylène. On refroidit à 0 et introduit 4, 17 g de N-trityl-L-glutamate d'a-monoéthyle.
On abandonne une nuit à la température ambiante, décompose l'excès de dicyclohexylcarbodiimide par addition de 0, 5 cm3 d'acide acétique, abandonne trente minutes, essore la dicyclohexylurée formée, lave la solution en ampoule avec 3 cm3 d'acide chlorhydrique normal, puis à l'eau, à l'ammoniaque diluée et à l'eau, sèche sur sulfate de ma gnésium, filtre et évapore à sec.
On obtient ainsi le diester diéthylique brut (formule V, R' et R" =-CBH,) qu'on utilise sans purification. b) Saponification du diester diéthylique brut de la N-trityl-{-glutamyl-glycine
Le diester brut obtenu selon a) est saponifié par cinq minutes de reflux avec 10 cm3 de potasse méthanolique à 20% et 2 cm3 d'eau. On dilue par 50 cm3 d'eau, essore un léger insoluble et acidifie par l'acide acétique. Après extraction au chloroforme et lavage à l'eau, la solution chloroformique est séchée sur sulfate de magnésium puis évaporée à sec.
A la suite de la transposition provoquée par la sapo nification, le produit obtenu est constitué essentiellement par la N-trityl-a-glutamyl-glycine. Le produit brut est chauffé cinq minutes au bain-marie avec 20 cm d'acide acétique à 50 /n. Le triphényl-car- binol libéré cristallise. On refroidit, ajoute 10 cm3 d'eau et essore le triphényl-carbinol formé. Le filtrat est concentré à faible volume. On ajoute de l'alcool absolu et laisse cristalliser.
Après glaçage et essorage, lavage à l'alcool et séchage, on obtient 1, 5 g (soit un rendement de 75%) d'a-glutamyl-glycine de formule VII (RI = H) que l'on recristallise dans l'al- cool à 50s /o. On obtient ainsi, après séchage, 1, 1 g d'a-glutamyl-glycine exempte de y-glutamyl-glycine (le produit ne donne pas de réaction à la ninhydrine),
F = 220 C (déc.), [oj = + 79"5 1 (c = 2 /o, eau). Le produit est soluble dans l'eau, les acides et alcalis dilués aqueux, insolubles dans l'alcool et l'Úther. La littérature indique un pouvoir rotatoire de + 800.
Analyse: C7H12O5N2 = 204, 2
Calculé :
CO/o 41, 2 H% 5, 9 N'ouzo 13, 7 O% 39, 2
Trouvé :
C /0 41, 0 H /0 6, 1 N /0 13, 6 O% 39, 4
Le N-trityl-L-glutamate d'a-monoéthyle utilisé comme composé de départ dans cet exemple peut être obtenu de la manière suivante :
A une solution refroidie à 00 de 2, 4 g de chlor- hydrate de L-glutamate de diéthyle dans 25 cm3 de chloroforme et 3 cm3 de triéthylamine, on ajoute 2, 8 g de chlorure de trityle. On abandonne une heure à la température ordinaire.
La solution chlorofor- mique du produit réactionnel est lavée à 1'eau et séchée sur sulfate de magnésium. On chasse le solvant et reprend le produit brut huileux par 40 cm3 d'alcool. On neutralise la solution par quelques gout- tes de soude normale, porte au reflux et ajoute par fractions en vingt minutes environ, au fur et à mesure de la neutralisation, qu'on suit à la phénolphtaléine, 10 cm3 de soude normale.
A la fin de la réaction, la solution reste légèrement alcaline. On refroidit, acidifie à l'acide acétique, essore le précipité et le lave à l'eau. Après séchage, on obtient 3, 3 g de N-trityl-L-glutamate d'a-mono- éthyle, soit un rendement de 80 /0. Le produit gom- meux n'a pas pu être cristallisé. Il fournit par contre dans l'alcool à 50"/o, avec le D (-)-thréo-l-p-nitro- phényl-2-amino-propane-1, 3-diol un sel bien cristallisé en feuillets hydratés (environ une molécule d'eau de cristallisation).
F = 100¯ C (déc.), [α]20 D = + 34¯, 5 1 (c = 2 /0, méthanol). Le produit est jaunâtre, soluble en alcool et acétone, peu soluble en éther, très peu soluble dans l'eau, insoluble dans le benzène. Les acides et alcalis dilués le décomposent.
Analyse : C3DHa908N3= 629, 7
Calculé :
C /0 66, 8 H /0 6, 2 N /o 6, 7 O /0 20, 3
Trouvé :
C% 66, 8 H% 6, 2 N < '/o 6, 7 O% 20, 5
Ce produit est nouveau.
On arrive au même produit au départ d'autres a-monoesters de l'acide N-trityl-glutamique comme l'ester a-méthylique en suivant le même mode opératoire. Les radicaux esters de la glycine peuvent être différents de ceux de l'acide glutamique. Ainsi, à partir du N-trityl-glutamate d'a-méthyle et du glycinate d'éthyle, on obtient le diester mixte de formule
V, (R'= CH3, R"= CJHÏ) fournissant l'a-gluta- myl-glycine.
Le N-trityl-L-glutamate d'a-monométhyle peut être préparé de la manière suivante :
Ce composé est obtenu au départ du chlorhydrate du L-glutamate de diméthyle en opérant, pour la Ntritylation et la saponification, de la manière décrite ci-dessus. Le produit brut peut être cristallisé en cyclohexane. Le rendement en produit pur,
F = 140-141o C, [a] D = + 450 + 1 (c = 2 11/o, m6- thanol), est de 50 /0. I1 se présente en aiguilles incolores, solubles en acétone, chloroforme, éther et les alcalis dilués, peu solubles en alcool, insolubles dans 1'eau et les acides dilués. Ce produit est nou- veau.
Il fournit, avec le D (-)-thréo-l-p-nitro-phényl- 2-amino-propane-1, 3-diol, un sel hydraté,
F = 100-C (déc.), [a] = + 32 , 5 l (c = 2 /o, méthanol) qui est également nouveau.
Le N. trityl-L-glutamate d'-a-monométhyle, F = 140 C, a été soumis à l'analyse :
C, H2504N = 403, 5
Calculé :
C /0 74, 4 H /o 6, 25 N O/o 3, 5 Qo/o 15, 9
Trouvé :
C /o 74, 6 H /o 6, 2 N% 3, 5 Oo/o16, 3
Exemple 2
Preparation de l'a-glutamyl-glycine a) Condensation du N-trityl-L-glutamate de y-metyle
avec le glycinate d'ethyle
On opère comme dans l'exemple 1 a). b) Saponification du diester de la N-trityl-a-gluta
myl-glycine et dÚtritylation
On opère comme dans l'exemple 1 b) et obtient l'a-L-glutamyl-glycine avec un rendement de 55 /o.
Exemple 3
Préparation de la L-a-glutamyl-glycine a) Condensation du N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle
avec le glycinate de benzyle
On prépare 3, 6 g de glycinate de benzyle libre en traitant une solution du chlorhydrate de glycinate de benzyle avec la quantité théorique de potasse 5 N, relargue au sel, extrait à l'éther et évapore. Le glycinat de benzyle ainsi obtenu est dissous dans 6 cm3 de chlorure de méthylène, on ajoute la solu- tion de 5 g de dicyclohexylcarbodiimide dans 10 cm3 de chlorure de méthylène, refroidit à 00 et introduit 9, 6 g de N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle brut.
Après un traitement identique à celui de l'exemple 1, on obtient le diester dibenzylique brut de formule V (R'et R"=-CH -C6HÏ Rj = H) avec un rendement quantitatif. b) Saponification du diester dibenzylique brut de la
N-trityl-y-glutamyl-glycine et detritylation
On saponifie le produit obtenu selon a) par dix minutes d'ébullition avec la potasse méthanolique comme dans l'exemple précédent. Après distillation d'une partie du méthanol et dilution par l'eau, on
extrait, après acidification à l'acide acétique, au chloroforme.
Le produit constitué par un mélange de N-trityl-L-a-glutamyl-glycine et de N-trityl-L-y- glutamyl-glycine obtenu après évaporation du chloroforme est détritylé par chauffage avec l'acide aqueux à 50 /0. Après séparation du triphényl-car- binol, on concentre et fait cristalliser comme précé- demment par addition d'alcool. Après recristallisation en alcool aqueux, on obtient finalement, avec un rendement de 50 /o, l'a-glutamyl-glycine pure, identique au produit obtenu dans l'exemple 1.
Le N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle utilisé comme composé de départ peut être obtenu de la manière suivante :
Ce composé est préparé au départ du N-trityl-Lglutamate d'a-benzyle et de y-méthyle décrit dans l'exemple 2 du brevet suisse No 344714.
A une solution bouillant à reflux de 9, 87 g de ce diester mixte dans 100 cm3 de méthanol, on ajoute petit à petit, en quinze à vingt minutes, environ 21 cm3 de soude normale et maintient l'ébullition encore quinze minutes. On concentre la solution de moitié, la dilue par 40 cm3 d'eau, passe, au noir végétal puis acidifie par l'acide chlorhydrique jusqu'à pH 2 à 3. Le produit précipite à l'état pulvérulent.
On l'essore, lave à 1'eau et sèche en exsiccateur. Le e
N-trityl-L-glutamate d'a-benzyle ainsi obtenu peut être utilisé directement pour la réaction suivante.
Exemple 4
Préparation de la L-a-glutamyl-L-leucine a) Condensation du N-trityl-glutamate de y-methyle avec le L-leucinate de methyle
On prépare 3, 2g de leucinate de méthyle libre à partir de son chlorhydrate selon la technique employée pour la préparation du glycinate d'éthyle citée dans l'exemple 1. Le produit est dissous dans 20 cm3 de chlorure de méthylène, on ajoute 5 g de dicyclohexylcarbodiimide, refroidit à 0 C, ajoute 8, 1 g de N-trityl-glutamate de y-méthyle dont la préparation est décrite dans le brevet suisse No 344714, agite pour dissoudre et abandonne 65 heures en glacière.
On ajoute alors 1 cm3 d'acide acétique, laisse trente minutes au repos, essore la dicyclohexylurée qu'on lave au chlorure de méthylène que l'on joint au filtrat. Ce filtrat est lavé à l'acide chlorhydrique dilué, à l'ammoniaque diluée puis à l'eau, filtre et évapore à sec sous vide. Le résidu huileux est repris par 25 cm3 de méthanol, on ajoute 4 cm3 d'eau, laisse cristalliser en glaçant, essore, lave au méthanol aqueux et sèche. Le produit directement utilisable pèse 6, 8 g.
Les eaux-mères abandonnent par cris tallisation prolongée encore 0, 6 g du même produit de formule X
EMI5.1
soit un rendement de 70 /o. Pour l'analyse on le recristallise en méthanol aqueux
F = 121-133o C, [a32D = + 10o + 1 (c = 2 /0, méthanol). Le diester méthylique de la L-N-trityl-a- glutamyl-L-leucine se présente sous forme d'aiguilles solubles dans l'alcool et l'éther, les alcools aqueux, insolubles dans 1'eau et les alcalis dilués aqueux. Les acides dilués aqueux le décomposent.
Analyse : C32H,,,, 05N2 = 530, 6
Calculé :
C /e 72, 43 H o/o 7, 23 O% 15, 08 No/o5, 28
Trouvé :
C O/o 72, 5 H /o 7, 1 O% 15, 0 N ouzo 5, 4
Ce composé est nouveau. b) Saponification du diester mithylique de la L-N trityl-α-glutamyl-L-leucine et dÚtritylation
6, 3 g de diester brut préparés selon a) sont repris par 20 cm3 de méthanol.
On ajoute 10 cm3 de potasse méthanolique à 20 /o et 5 cm3 d'eau. On porte deux minutes au reflux et ajoute au liquide bouillant 25 cm3 d'eau, chasse le méthanol sous vide partiel, refroidit, acidifie à pH 2 par addition d'environ 35 cms d'acide chlorhydrique normal et extrait le trityl-peptide au chloroforme. La solution chloroformique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée à sec sous vide. Le résidu est repris par 20 cm d'acide acétique aqueux à 50 ID/o. On fait bouillir une minute, ajoute 20 cm3 d'eau, filtre le triphényl-carbinol à chaud et le lave à 1'eau bouillante. Les solutions acétiques réunies sont concentrées à faible volume. Le peptide cristallise.
On ajoute de l'alcool absolu, glace, essore, sèche et obtient 2, 2 g de L-a-glutamyl-L-leucine, soit un rendement de 71 ID/o. Le produit se présente en feuillets incolores, F 2500 C. En tube capillaire il fond à 195¯ C environ. [a] 2D = + 10 + 1 (c = 2 /o, eau et une molécule d'acide chlorhydrique). Il est soluble dans les acides et alcalis aqueux dilués, peu soluble dans l'eau, insoluble dans l'alcool, l'éther, le benzène et l'acétone. Il ne donne pas de réaction à la ninhydrine. Le même composé a été obtenu par une autre voie par Le Quesne et Young (J. Chem.
Soc., 1950, p. 1954).
Exemple 5
Préparation de la L-a-glutamyl-L-tyrosine a) Condensation du N-trityl-L-glutamate de y-me
thyle avec le tyrosinate d'éthyle
Le tyrosinate d'éthyle libre est préparé par reprise du chlorhydrate dans l'ammoniaque 5 N en excès. Le produit cristallise. On essore, lave à l'eau et sèche en exsiccateur sulfurique.
En opérant comme dans l'exemple 1 a), on obtient au départ de 4, 3 g de tyrosinate d'éthyle, 20 cm3 de chlorure de méthy- lène et 8, 1 g de L-N-trityl-glutamate de y-monométhyle, 14 g de produit de condensation brut de formule X
R = CH3,
R"= C2H5,
EMI5.2
b) Saponification du diester mixte (de formule X) de la N-trityl-a-glutamyl-L-tyrosine et detrityla-
tion
On saponifie comme dans l'exemple 1 b) et en présence de 20 cm3 d'éther, acidifie le produit sapo nifié filtré par l'acide chlorhydrique jusqu'à pH 2.
Le composé se résout en une masse cristalline puis se délite peu à peu. Après empâtage à l'éther et essorage, on obtient 7, 8 g de N-trityl-a-glutamyl-peptide qu'on peut détrityler directement. Pour l'analyse, on recristallise en méthanol aqueux. Le produit se présente en aiguilles. [a] 25 D = + 19¯ ¯ 1 (c = 1 /0, méthanol à 75"/e + 1 NaOH). Il est soluble dans l'éther, le chloroforme et l'alcool, peu soluble dans les alcalis dilués aqueux, insoluble dans l'eau. Les acides dilués le décomposent.
Analyse: C33H32O6N2 = 552, 6
Calculé :
CO/o7l, 72 H%5, 85 O%17, 37 N%5, 07
Trouvé :
C% 71, 7 H%6,1 O%17, 3 N /0 5, 1
Ce composé est nouveau.
En détritylant le produit brut par l'acide acétique à 50 < Vo on obtient après le traitement habituel la L-a-glutamyl-L-tyrosine avec un rendement de 75 %.
F (déc.) = 235¯ C [α] D = + 29¯ ¯ 1 (c = 2 ID/o, eau + 1 HC1). Le peptide se présente en aiguilles incolores. Il est soluble dans les acides et alcalis aqueux, très peu soluble dans l'eau, insoluble dans l'alcool, l'acétone, le benzène. Il est identique au produit décrit par Bergmann et Coll. (Ztschr. f. physiol. Chem., 1934, 224, 17).