Flüssigkeit zur Behandlung von histologischen Präparaten für die mikroskopische Untersuchung.
Die Gewebepräparierung zum Zweck der mikroskopischen Untersuchung erfordert eine Reihe von Behandlungen der Probestücke, bevor diese geschnitten, auf dem Objektträger montiert, und gefärbt werden. Die Gewebestücke werden nacheinander in eine Reihe von Bädern eingetaucht, zum Zwecke, das Gewebe zu fixieren, das Fixiermittel auszuwaschen und das Gewebe zu entwässern.
Letzteres erfolgt gewöhnlich durch Eintauchen in Alkohole oder andere Entwässerungsmittel. Sodann wird das entwässerte Gewebe mit einem Klärungsmittel behandelt und durch Imprägnierung mit Paraffin, Celloidin oder dergleichen schnittbereit gemacht.
Nachdem das Gewebe in dünne Scheiben geschnitten ist, wozu gewöhnlich ein Mikrotom benutzt wird, muss das Einbettungs Mittel mit Hilfe eines Lösungsmittels entfernt werden, worauf die Schnitte auf dem Objektträger montiert und gefärbt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein flüssiges Mittel, welches sich zur Ent tvässerung von in üblicher Weise fixiertem Gewebe eignet und welches bestimmte Nachteile behebt, die den bisher verwendeten Ent wässerungsmitteln anhaften. Ferner kann die erfindungsgemässe Flüssigkeit vorteilhaft auch für die Entfernung von Paraffin oder andern Einbettungsmitteln aus den Gewebeschnit ten sowie bei der : Färbung der deparaffi- nierten Schnitte verwendet werden, wobei ebenfalls verschiedene Nachteile der früher verwendeten Methoden und Mittel beseitigt werden können.
In der histologischen Technik ist derzeit Äthylalkohol oder Methylakohol das übliche Lösungs- und Entwässerungsmittel. Der Alkohol wird für sich oder in Kombination mit Aceton, Chloroform, verschiedenen Kohlenwasserstoffen usw. verwendet. Alkohol hat im allgemeinen den Nachteil, leicht ent zündlich, sehr flüchtig und so stark hygroskopisch zu sein, dass eine Selbstverdünnung eintritt. Als Entwässerungsmittel für Gewebe bewirkt er Schrumpfung, Verlagerung und Härtung des behandelten Gewebes. Beim Färben hat Alkohol sehr oft die nachteilige Eigenschaft, den Farbstoff vom Gewebe wieder abzuziehen, das heisst, als Entfärbungsund Differenzierungsinittel zu wirken. Demzufolge ist die Anwendung von Alkohol in der Regel nicht vollständig befriedigend.
Bei der Entwässerung von Gewebestücken ist es in der Praxis üblich, dieselben zunächst mit verdünntem Alkohol, dann mit Alkohol von steigender Konzentration und schliesslich mit absolutem Alkohol zu behandeln.
Trotzdem gelingt es aber nicht, die Schrumpfung und Verlagerung des Gewebes in befriedigendem Ausmass zu verhindern.
Die erwähnten und weitere Nachteile bei der Verwendung von Alkoholen und andern Reagentien, die bisher als Entwässerungsund Lösungsmittel in der histologischenTechnik dienten, lassen sich durch die erfindungsgemässe Flüssigkeit beseitigen.
Die erfindungsgemässe Flüssigkeit zur Behandlung von histologischen Präparaten für die mikroskopische Untersuchung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem Gemisch von Diäthylenglykol-monoäthyläther- acetat und einem aliphatischen Alkohol mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen im Molekül besteht.
Die erfindungsgemässe Flüssigkeit kann bei geeigneter Zusammensetzung folgende Vorteile bieten: 1. Eine Verlagerung des Gewebes wird ver hindert oder auf ein Mindestmass be schränkt; 2. das Mittel besitzt eine niedrige Verdamp fungsgeschwindigkeit; 3. ist nicht merklich hygroskopisch ; 4. ist bei Zimmertemperatur nicht leicht entzündlich; 5. hat in bestimmten Ausführungen den wei teren Vorzug, nicht giftig zu sein.
Diäthylenglykol - monoäthyläther - acetat ist ein handelsübliches Lösungsmittel von spezifischem Gewicht 1,0115 und dem Siedepunkt 217,50 C. Es ist vollkommen löslich in Wasser, nicht entzündlich praktisch frei von hygroskopischen Eigenschaften und ungiftig.
Das erfindungsgemässe Mittel entwässert Gewebe infolge seines Gehaltes an Diäthylen glykol- monoäthyläther- acetat wenigstens zum Teil durch Ersatz des Wassergehalts, so dass keine Schrumpfung und Verzerrung des Objektes eintritt wie bei Verwendung von Alkohol allein zufolge der wasserextrahierenden Wirkung. Infolge des Gehaltes an einem niederen Alkohol wird das Eindringen des Acetats in das Gewebe gefördert. Es wurde gefunden, dass Isopropanol besonders geeignet ist, da dieser Alkohol weniger hygro skopisch ist als Äthylalkohol. Der Einfachheit halber soll nachfolgend das Diäthylenglykolmonoäthyläther-acetat mit F, der. niedere Alkohol mit S und das erfindungsgemässe Mittel mit FS bezeichnet werden.
Gute Ergebnisse werden im allgemeinen erzielt, wenn das : Mengenverhältnis F: S zwischen etwa 3 : 1 bis 1 : 1 liegt. Die bevorzugte Zusammensetzung ist 6 Vol.-Teile F und 4 Vol.-Teile Isopropanol: aber auch mit den entsprechenden Mengen Methylalkohol oder ithylalko- hol werden gute Resultate erzielt.
Das erfindungsgemässe Lösungsmittel FS kann zum Beispiel wie folgt verwendet werden: Zur Entwässerung von fixierten Ge webestücken werden diese nach dem Auswaschen nacheinander in einer Reihe von Bechern in das Mittel in der Weise eingetaucht, dass das Gewebe stufenweise mit frischer Lösung behandelt wird. Zweckmässig wird das Gewebe 5mal je 1 Stunde in die FS- Lösung eingetaucht. Sodann wird das Gewebe 2mal 1 Stunde in einer Mischung von gleichen Teilen Lösung FS und Butylacetat eingetaucht und schliesslich wieder 1 Stunde mit reinem Butylacetat behandelt. worauf es durch Imprägnieren mit Po, Paraffin in üblicher Weise sclmittfähig gemacht wird.
Diese Tauchoperationen werden vorzugsweise mit dem in der amerikanischen Patentschrift Nr. 2341198 von Edvfin C. Weiskopf beschriebenen automatischen Eintauchgerät durchgeführt.
Die Behandlung des Gewebes mit einer Mischung des Lösungsmitte] s FS und Butylacetat bezweckt das Klären des Gewebes und die darauffolgende Behandlung mit reinem Butylacetat die Entfernung des Lösungsmittels FS, damit es leichter mit Paraffin imprägniert werden kann. Es wurde gefunden, dass die Elärlmgswirkung von Butylacetat durch den Zusatz des Lösungsmittels FS verbessert wird. Butylacetat ist ein ansgezeichnet wirksames Klärnuttel, welches den Vorzug hat, das Gewebe nicht zu härten.
Die mit Paraffin getränkten Gewebestücke werden alsdann auf dem Mikrotom geschnitten und die Schnitte auf dem Objektträger montiert. Die Entfernung des Ein bettungsmittels kann durch Eintauchen des Objektträgers in Xylol erfolgen und die Färbung der deparaffinierten Schnitte wird in üblicher Weise mit Hämatoxylin und Eosin für basophiles bzw. für acidophiles Material durchgeführt. Geeignete Färbemethoden sind eingehend beschrieben in der schweiz. Patentschrift Nr. 294394.
Die Entfernung des Paraffins aus den montierten Schnitten und die Färbung der depar,zffinierten Schnitte wird vorzugsweise unter Verwendung des erwähnten automatischen Eintauchapparates durchgeführt. Die Becher sind in Stellungen entsprechend der folgenden Tabelle angeordnet und enthalten die angegebenen Flüssigkeiten.
Der Objektträger mit den Schnitten wird für die in Minuten angegebene Zeitdauer in das betreffende Mittel eingetaucht: Behandlungsflüssigkeit Behandlungszeit
1 Xylol 2 Minuten *Lösungsmittel FS 2 Minuten mit Zusatz von 0,280/, Jod
3 3 Lösungsmittel FS 2 Minuten
4 Destilliertes Wasser 2 Minuten 5 Hämatoxylin Lösung 10 Minuten
6 Destilliertes Wasser 4 Minuten
7 Lithiumearbonatlösung 0,01n 2 Minuten
8 Destilliertes Wasser 2 Minuten 9 Eosinlösung 5 Minuten 10 Lösungsmittel FS 5 Minuten II Lösungsmittel FS 5 Minuten 12 Lösungsmittel FS 5 Minuten * Der Zusatz von Jod ist besonders zweckmässig,
wenn ein Fixiermiftel vom Zenker-Typ verwendet wurde.
Die aus Becher 12 entnommenen Objektträger werden etwa 2-4 Minuten in Xylol eingetaucht und dann auf die übliche Weise fertiggestellt.
Liquid for the treatment of histological specimens for microscopic examination.
Tissue preparation for microscopic examination requires a series of treatments of the specimens before they are cut, mounted on the slide, and stained. The tissue pieces are successively immersed in a series of baths for the purpose of setting the tissue, washing out the fixative and draining the tissue.
The latter is usually done by immersion in alcohols or other dehydrating agents. The dehydrated tissue is then treated with a clarifying agent and made ready for cutting by impregnation with paraffin, celloidin or the like.
After the tissue is cut into thin slices, usually using a microtome, the embedding agent must be removed with the aid of a solvent, and the sections are then mounted on the slide and stained.
The present invention relates to a liquid agent which is suitable for draining tissue that has been fixed in the usual way and which eliminates certain disadvantages inherent in the previously used drainage agents. Furthermore, the liquid according to the invention can advantageously also be used for the removal of paraffin or other embedding agents from the tissue sections and for: coloring the deparaffinized sections, whereby various disadvantages of the previously used methods and agents can also be eliminated.
In histological technology, ethyl alcohol or methyl alcohol is currently the common solvent and dehydrating agent. The alcohol is used alone or in combination with acetone, chloroform, various hydrocarbons, etc. Alcohol generally has the disadvantage of being easily ignitable, very volatile and so strongly hygroscopic that self-dilution occurs. As a dehydrating agent for tissue, it causes shrinkage, displacement and hardening of the treated tissue. During dyeing, alcohol very often has the disadvantageous property of pulling the dye off the fabric again, that is, of acting as a decolorizing and differentiating agent. As a result, the use of alcohol is usually not completely satisfactory.
When dewatering pieces of tissue, it is customary in practice to treat them first with diluted alcohol, then with alcohol of increasing concentration and finally with absolute alcohol.
Nevertheless, it does not succeed in preventing the shrinkage and displacement of the tissue to a satisfactory extent.
The mentioned and other disadvantages in the use of alcohols and other reagents, which were previously used as dehydration and solvents in histological technology, can be eliminated by the liquid according to the invention.
The liquid according to the invention for treating histological specimens for microscopic examination is characterized in that it consists of a mixture of diethylene glycol monoethyl ether acetate and an aliphatic alcohol with no more than 4 carbon atoms in the molecule.
With a suitable composition, the liquid according to the invention can offer the following advantages: 1. Dislocation of the tissue is prevented or limited to a minimum; 2. the agent has a low rate of evaporation; 3. is not noticeably hygroscopic; 4. is not highly flammable at room temperature; 5. In certain versions, it has the further advantage of not being toxic.
Diethylene glycol monoethyl ether acetate is a commercially available solvent with a specific gravity of 1.0115 and a boiling point of 217.50 C. It is completely soluble in water, non-flammable, practically free of hygroscopic properties and non-toxic.
The agent according to the invention dehydrates tissue due to its content of diethylene glycol monoethyl ether acetate at least partly by replacing the water content, so that no shrinkage and distortion of the object occurs as when using alcohol alone due to the water-extracting effect. As a result of the content of a lower alcohol, the penetration of the acetate into the tissue is promoted. It has been found that isopropanol is particularly suitable because this alcohol is less hygroscopic than ethyl alcohol. For the sake of simplicity, the diethylene glycol monoethyl ether acetate with F, the. lower alcohol with S and the inventive agent with FS.
Good results are generally achieved when the: quantitative ratio F: S is between about 3: 1 to 1: 1. The preferred composition is 6 parts by volume of F and 4 parts by volume of isopropanol: but good results are also achieved with the corresponding amounts of methyl alcohol or ithyl alcohol.
The solvent FS according to the invention can be used, for example, as follows: To dewater fixed pieces of tissue, after washing them out, they are successively immersed in a series of beakers in the agent in such a way that the tissue is gradually treated with fresh solution. The tissue is expediently immersed in the FS solution 5 times for 1 hour each time. The fabric is then immersed twice for 1 hour in a mixture of equal parts of solution FS and butyl acetate and finally treated again for 1 hour with pure butyl acetate. whereupon it is made smearable in the usual way by impregnating it with bottom and paraffin.
These dipping operations are preferably carried out with the automatic dipping device described in US Pat. No. 2341198 by Edvfin C. Weiskopf.
The purpose of treating the fabric with a mixture of the solvent FS and butyl acetate is to clear the fabric and the subsequent treatment with pure butyl acetate to remove the solvent FS so that it can be more easily impregnated with paraffin. It has been found that the elimination effect of butyl acetate is improved by adding the solvent FS. Butyl acetate is a markedly effective clarifying pouch which has the advantage of not hardening the tissue.
The tissue pieces soaked with paraffin are then cut on the microtome and the sections are mounted on the slide. The embedding agent can be removed by immersing the slide in xylene, and the deparaffinized sections are stained in the usual way with hematoxylin and eosin for basophilic or acidophilic material. Suitable dyeing methods are described in detail in Switzerland. Patent No. 294394.
The removal of the paraffin from the mounted sections and the coloring of the depar, refined sections is preferably carried out using the aforementioned automatic immersion apparatus. The cups are arranged in positions according to the following table and contain the specified liquids.
The slide with the sections is immersed in the relevant agent for the period specified in minutes: treatment liquid treatment time
1 xylene 2 minutes * Solvent FS 2 minutes with the addition of 0.280 /, iodine
3 3 solvent FS 2 minutes
4 Distilled water 2 minutes 5 Hematoxylin solution 10 minutes
6 Distilled water 4 minutes
7 Lithium carbonate solution 0.01n 2 minutes
8 Distilled water 2 minutes 9 Eosin solution 5 minutes 10 Solvent FS 5 minutes II Solvent FS 5 minutes 12 Solvent FS 5 minutes * The addition of iodine is particularly useful,
when a Zenker-type fixation stick was used.
The slides removed from beaker 12 are immersed in xylene for about 2-4 minutes and then finished in the usual manner.