Procédé de préparation d'acide ptéroy1glutamique. La présente invention a pour objet un pro cédé de préparation d'acide ptéroylglutamique qui, dans l'une de ses formes tautomères au moins, répond à, la formule suivante:
EMI0001.0004
ce procédé étant. caractérisé par le fait que l'on fait réagir de la 2,4,5-triamino-6-hydroxy- pyrimidine, du 2,3-dihy droxy acry lal.déhyde et de l'acide p-aminobenzoylglittamique.dont l'une au moins des fonctions acides est bloquée par un groupement susceptible d'être éliminé par hydrolyse en régénérant l'acide, et en ce qu'on hydrolyse le produit de la, réaction pour obte nir l'acide ptéroylglutamique.
L'acide ptéroylglutamique obtenu par le procédé selon la présente invention est un so lide jaune à brun rougeâtre difficilement so luble dans l'eau et les solvants organiques. Cet acide, comme il est connu, possède des pro priétés analogues à celles de vitamines et semble être nécessaire à la vie de certaines bactéries et d'organismes plus développés du domaine animal, ou pour en stimuler la crois sance. Ce composé est en outre utile pour sti muler la formation d'hémoglobine et pour le traitement d'anémies macrocytiques.
On peut préparer les sels d'acides de l'acide ptéroylglutamique en le traitant par des acides minéraux forts tels que l'acide chlor hydrique et l'acide sulfurique. On peut. aussi en obtenir des sels de bases en le traitant au moyen d'un alcali approprié, par exemple au moyen d'un hydroxyde de métal alcalin, d'am moniaque ou d'une amine. A partir de ces sels on peut obtenir d'autres sels métalliques con tenant des cations tels que le zinc, l'argent, le nickel, le cuivre, le magnésium et le baryum, par double décomposition, par exem ple en traitant une solution d'un sel de métal alcalin de l'acide ptéroy1glutamique par un sel soluble du cation voulu.
Le premier réactif, la 2,4,5-triamino-6- hydroxy-pyrimidine, est un composé connu que l'on peut préparer selon les méthodes déjà décrites dans la littérature chimique. Il est en outre bien connu que ce composé existe sous une ou plusieurs formes tautomères telles que la 2,4,5-triamino-pyrimidone-6 ou la 2-imino- 4,5-diamino-pyrimidone-6.
La forme sous laquelle le composé existe, c'est-à-dire la forme cétonique ou la forme énolique, dépend probablement du pH du milieu dans lequel il est dissout. Chacune de ces formes tautomères réagissant dans une même réaction de manière analogue, il est donc indifférent que l'une ou l'autre soit pré sente.
Le second réactif, le 2,3-dihy droxy acryl- aldéhyde, qui sera dénommé par la suite ré- ductone , répond à la formule de constitution suivante:
EMI0002.0009
Ce composé peut également exister sous une autre forme tautomère, par exemple sous la forme cétonique que l'on désigne par 2-oxo-3- hydroxypropionaldéhyde. Ici aussi la forme sous laquelle ledit réactif est présent n'a pas d'influence sur la réaction.
Le troisième réactif, constitué d'ordinaire par un ester ou un amide de l'acide p-amino- benzoylgiutamique, peut être préparé par ac tion de chlorure de p-nitrobenzoyle sur un ester ou un amide de l'acide ghitamique et par réduction du groupe nitro en groupe amino. Cet ester peut être un ester partiel (a ou y<B>)\</B> ou un ester complet (a, y ), par exemple un ester méthy- liqui,
éthylique ou propy lique. L'amide peut être un a-amide ou un ;-amide ou un a,,,-amide ou encore un amide comprenant plusieurs liai sons amidiques, tels que l'acide p-aminobenzoyl- y-gIutamylglutamique, l'acide p-aminobenzoyl- y-gltitamyl-y-glutamyiglutamique,
l'acide p- aminobenzoyl - y - ghitamy 1- a-glutamy iglutami- que, l'acide p-aminobenzoyl-digIutamyl--hitami- que ou l'acide p-aminobenzoyl-a-gIutamyl-a- glutamylglutamique.
La réaction donnant. lieu à la formation d'acide ptéroylglutamique par le procédé selon la présente invention peut être représentée par l'équation suivante
EMI0002.0042
où R et R' sont des groupements hydroxyle, alcoxy ou amino, Fun au moins de ces deux symboles toutefois représentant un groupe ment alcoxy ou amino.
On peut effectuer la réaction de synthèse en mélangeant simultanément les trois réactifs ou en faisant premièrement réagir le second réactif avec l'un des deux autres puis en ajou tant, le troisième réactif au mélange réaction nel, sans isoler les intermédiaires. L'hydrolyse du produit. de la réaction peut se faire en milieu acide, en présence par exemple d'acide sulfurique ou chlorhydrique, ou en milieu alcalin, en présence par exemple d'hydroxyde de sodium ou de potassium.
La réaction de synthèse peut être effec tuée clans de l'eau ou dans un solvant orga nique, de préférence dans un liquide organi que hy droxy lé tel que l'alcool éthylique ou le glycol éthylénique. On peut également uti liser d'autres solvants tels que l'acétone, le benzène ou le formamide. La température peut varier entre la température ambiante et 160 C environ, les températures supérieures à 100 C étant préférées. Le temps nécessaire pour ache ver la réaction dépend naturellement de la température et des autres conditions. Pour effectuer l'hydrolyse, il est habituellement nécessaire de chauffer le mélange de la réaction à une température comprise entre 50 et 100 C.
Le groupement ester est. facile ment éliminé par hydrolyse dans un acide ou un alcali, tandis que le groupement amide demande plus de temps pour ôtre éliminé.
On peut effectuer la synthèse dans de larges limites de pH. On obtient. toutefois les meilleurs résultats en utilisant une solution sensiblement aqueuse ayant un pH compris entre 3 et 5.
Différentes manières de mettre en auvre le procédé selon la présente invention sont décrites dans les exemples suivants.
Exemple <I>1:</I> On a dissous 5 g d'ester y-éth@-lique d'acide p-nitro-benzoy iglutamique dans 25 cm' d'éthanol, additionné la solution de 25 cm-' d'eau et effectué la réduction au moyen de 7 g du couple zinc-cuivre, en utilisant de l'acide chlorhydrique pour maintenir le pH à environ 3,0. On élimine le zinc par filtration, on amène le pH de la solution de l'ester-y- éthylique de l'acide p-aminobenzoylglutami- que à 2,5 et on additionne la solution de \?5 cm' d'eau.
On ajoute 1,6 g de réductone et on agite la. solution pendant 20 minutes. La solution est ensuite refroidie. L'ester y-éthylique de L'acide p-(2,3-diliyclroxy-2-ène- propylidène-amino)-benzoyigltttamique obtenu est isolé, lavé à l'eau et séché. Rendement 5,5 g.
3,.5 g de ce produit et 2,8 g de 2,4,5-tri- a.mino-6-hy droxypyrimidine sont mis en sus pension dans 18 cm' de glycol éthylénique et chauffés à 135 C pendant 30 minutes. Le mélange est refroidi, dilué par 2 volumes d'eau et ensuite de nouveau refroidi, l'ester y-éthylique de l'acide ptéroylglutamique étant ensuite isolé. Rendement: 3,7 g. La pureté dé- terminêe par analyse chimique est de 15,8 /o.
On dissout cette substance dans de l'hydroxyde de sodium à 0,1 n et on chauffe la solution à 50 C pendant 30 minutes. L'essai avec S. faecalis R donne la valeur de 17,6 /o- qui indique que l'hydrolyse de l'ester en acide ptéroylglutamique est complète. L'acide ptéroy lglutamique ainsi obtenu est première ment dissous dans une solution d'hydroxyde de sodium 0,2n à une concentration de 400 microgrammes!cm'. On ajoute ensuite du chlorure de baryum en quantité suffisante pour obtenir une normalité de 0,2, le mélange étant ensuite agité pendant 10 minutes et filtré.
On ajoute de l'alcool éthylique au filtrat jusqu'à obtention d'une concentration de 201/o et, après agitation, on filtre de nou veau la, solution et on rejette la matière inso luble, s'il y en a. L'excès de baryum contenu dans le filtrat est alors précipité par addition d'une quantité équivalente d'acide sulfurique en prenant soin de maintenir le mélange nettement alcalin, si nécessaire par addition d'hydroxyde de sodium. Après élimination du. sulfate de baryum, la solution est étendue à 100 microgrammes/em' de composé actif, puis ajustée à pH 7,0.
On filtre de nouveau la solution et on concentre le filtrat à un volume tel que la concentration du composé actif soit de 200 mierogrammesr\cm'. Cette solution est épuisée au moyen de 4 portions de 10 parties en volume de buta.nol. Les extraits butanoli- ques sont rejetés. La. phase aqueuse est alors traitée au moyen d'une quantité -de charbon actif équivalent au poids total de composé actif présent. On filtre la solution et on éli mine le charbon. On ajuste le pII du filtrat à 3,0 et on chauffe pour dissoudre le com posé actif qui peut précipiter à cette acidité. On peut ajouter de l'eau, si nécessaire.
On laisse alors refroidir la .solution, saturée à 4 C environ et on recueille le produit préci pité. On peut le faire recristalliser en le dis solvant clans de l'eau chaude ajustée à pH 3, si on le désire.
Exemple On met en suspension 0,3 g de l'ester di- éthylique d'acide p-(2,3-dihydroxy-2-ène- propylidène-amino)-benzoy1glutamique, ob tenu selon la méthode de l'exemple 1, et 0,25 g de 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine dans 6 cm" de glycol éthylénique et on chauffe la suspension à 1350 C pendant 30 minutes. Ensuite, on la refroidit et on l'additionne de 4 volumes d'eau. Après un nouveau refroi dissement, le solide est recueilli, lavé et séché. Rendement: 0,25 g.
Pureté déterminée par analyse chimique: 17,10/a. On dissout ce pro duit dans de l'hydroxyde de sodium 0,1 n et on chauffe la solution à 500 C pendant 30 mi nutes. L'essai avec S. faecalis R donne une valeur de 21,5 % qui indique que l'hydrolyse de l'ester en acide ptéroylglutamique est complète.
Exemple <I>3:</I> On a dissous 3 g de p-nitrobenzoy@iso- glutaminate éthylique dans 50 cm3 d'éthanol. chaud à 900/0,, additionné la solution de 25 cm' d'eau et effectué la réduction à. une tempé rature de 40-500 C et à pH 3,0 en utilisant 4 g du couple zinc-cuivre.
Après 40 minutes, on élimine le zinc par filtration et on ajoute de l'eau à la solution .du p-aminobenzoyliso- glutaminate pour obtenir un volume de 140 eni3. On ajoute alors 1,2 g de réductone et on agite le mélange à la température am biante pendant plusieurs heures. On laisse bien refroidir le mélange, le produit. étant alors recueilli, lavé et séché. Rendement: 2,8 g de p-(2,3-dihydroxy 2-èiie-prop@-lidène-amino)- benzaylisogluta.minate éthylique.
On met en suspension 2,5 de ce produit et 2 g de 2,4,5-triamino-6-liydroxy pyrimidine dans 13 cm" de glycol éthylénique et on chauffe la suspension à. 135 C pendant. 30 mi nutes. Le ptéroylisoglutaminate éthi-lique est recueilli, lavé et séché. Rendement: 2,3 g. Teneur déterminée par analyse chimique: 22 0/a.
On dissout ce produit dans de l'hydroxyde de sodium 0,25 n et on chauffe la solution à 550 C pendant 1 heure. L'essai avec S. faecalis R .donne alors une valeur de 12,3 % qui in- dique que l'hydrolyse de l'ester en acide ptéroylglutamique est incomplète.
Le produit obtenu, c'est-à-dire l'acide, ptéroylglutamique, est purifié de la maille re suivante: On dissout 2,15; du produit brut dans 400 em d'hydroxyde de sodium 0,2n et on agite la solution à. 50" C pendant 1 heure. On ajoute 14,5 cm" de chlorure de calcium à 30 0/0, on élève la. température à 70" C et. on filtre la solution. On ajoute au filtrat à 50" C une solution diluée de chlorure de zinc jus qu'à ce que le pH soit tombé à 10,5.
On filtre et on ajoute du chlorure de zinc à 30 % jus- qu'à ce que le pH ait atteint 6,75. Ce mé lange est chauffé à. 80" C et filtré. On dissout le gâteau de filtrage dans 3 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, on traite la solution au moyen de charbon actif et on filtre. On ajoute la solution à 30 cm;, d'eau chaude, puis on laisse bien refroidir.
Le produit est recueilli et dissous .de nouveau dans 2,5 cm:\ d'acide chlorhydrique concentré. La solution est traitée par du charbon actif et ensuite filtrée. On ajoute 30 cm" d'eau chaude au filtrat et on laisse bien refroidir. Le produit est recueilli, lavé à l'eau, au méthanol et à l'éther et séché. Rendement: 55 mg. Pureté déterminée par analyse chimique: 840/0.
Le spectre d'absorption ultraviolet est caractéris tique pour l'acide ptéroylglutamique. Sous forme de solution dans de l'hydroxyde de sodium 0,1 n, cet acide présente des maxima d'absorption à 255 :mu, 285 my et 365 mcc. Dans une solution d'acide chlorhydrique<B>0J</B> n, le maximum est à 297,5 my.
<I>Exemple 4:</I> On a. mis en suspension 5 g d'amide d'acide p-nitrobenzoylglutamique dans 125 cm' d'eau et on a réduit ce composé au moyen de 7 g (lu couple zinc-euivre en utilisant de l'acide chlorhydrique concentré pour maintenir le liai de la solution entre 2,5 et 3,0. On élimine le zinc par filtration et on ajoute 1,7 b de réductone à la solution d'amide d'acide p- aininobenzovlglutamique obtenue. Après avoir laissé reposer la solution à la. température ambiante pendant 30 minutes, on la laisse refroidir pendant la nuit.
Rendement: 1,9 g d'un produit solide qui est l'amide de l'acide p- (2,3 - diliydroxy - \)-ène-propylidène- amino )- benzoyl-lutamique. On met en suspension 1,9 g de ce pro duit et 1,6 g de 2,4,5-triamino-6-hydroxy- pyrimidine dans 10 cm' de glycol éthylénique et on chauffe la suspension à 135 C pen dant 30 minutes. Le mélange est alors re froidi et additionné de 3 volumes d'eau. Le produit est recueilli, lavé et séché. Rende ment: 1,5 g.
Pureté déterminée par analyse chimique: 17,7 %, Le produit ainsi obtenu est purifié selon la méthode décrite dans l'exemple 3. De cette manière, on obtient 60 mg d'acide ptéroyl- glutamique. Pureté déterminée par analyse chimique: 83 %. Essai avec S. faecalis R: 16 /u, indiquant une hydrolyse incomplète.