Procédé de préparation d'acide ptéroy1glutamique. La présente invention a pour objet un pro cédé de préparation d'acide ptéroylglutamique qui, dans l'une de ses formes tautomères au moins, répond à, la formule suivante:
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ce procédé étant. caractérisé par le fait que l'on fait réagir de la 2,4,5-triamino-6-hydroxy- pyrimidine, du 2,3-dihy droxy acry lal.déhyde et de l'acide p-aminobenzoylglittamique.dont l'une au moins des fonctions acides est bloquée par un groupement susceptible d'être éliminé par hydrolyse en régénérant l'acide, et en ce qu'on hydrolyse le produit de la, réaction pour obte nir l'acide ptéroylglutamique.
L'acide ptéroylglutamique obtenu par le procédé selon la présente invention est un so lide jaune à brun rougeâtre difficilement so luble dans l'eau et les solvants organiques. Cet acide, comme il est connu, possède des pro priétés analogues à celles de vitamines et semble être nécessaire à la vie de certaines bactéries et d'organismes plus développés du domaine animal, ou pour en stimuler la crois sance. Ce composé est en outre utile pour sti muler la formation d'hémoglobine et pour le traitement d'anémies macrocytiques.
On peut préparer les sels d'acides de l'acide ptéroylglutamique en le traitant par des acides minéraux forts tels que l'acide chlor hydrique et l'acide sulfurique. On peut. aussi en obtenir des sels de bases en le traitant au moyen d'un alcali approprié, par exemple au moyen d'un hydroxyde de métal alcalin, d'am moniaque ou d'une amine. A partir de ces sels on peut obtenir d'autres sels métalliques con tenant des cations tels que le zinc, l'argent, le nickel, le cuivre, le magnésium et le baryum, par double décomposition, par exem ple en traitant une solution d'un sel de métal alcalin de l'acide ptéroy1glutamique par un sel soluble du cation voulu.
Le premier réactif, la 2,4,5-triamino-6- hydroxy-pyrimidine, est un composé connu que l'on peut préparer selon les méthodes déjà décrites dans la littérature chimique. Il est en outre bien connu que ce composé existe sous une ou plusieurs formes tautomères telles que la 2,4,5-triamino-pyrimidone-6 ou la 2-imino- 4,5-diamino-pyrimidone-6.
La forme sous laquelle le composé existe, c'est-à-dire la forme cétonique ou la forme énolique, dépend probablement du pH du milieu dans lequel il est dissout. Chacune de ces formes tautomères réagissant dans une même réaction de manière analogue, il est donc indifférent que l'une ou l'autre soit pré sente.
Le second réactif, le 2,3-dihy droxy acryl- aldéhyde, qui sera dénommé par la suite ré- ductone , répond à la formule de constitution suivante:
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Ce composé peut également exister sous une autre forme tautomère, par exemple sous la forme cétonique que l'on désigne par 2-oxo-3- hydroxypropionaldéhyde. Ici aussi la forme sous laquelle ledit réactif est présent n'a pas d'influence sur la réaction.
Le troisième réactif, constitué d'ordinaire par un ester ou un amide de l'acide p-amino- benzoylgiutamique, peut être préparé par ac tion de chlorure de p-nitrobenzoyle sur un ester ou un amide de l'acide ghitamique et par réduction du groupe nitro en groupe amino. Cet ester peut être un ester partiel (a ou y<B>)\</B> ou un ester complet (a, y ), par exemple un ester méthy- liqui,
éthylique ou propy lique. L'amide peut être un a-amide ou un ;-amide ou un a,,,-amide ou encore un amide comprenant plusieurs liai sons amidiques, tels que l'acide p-aminobenzoyl- y-gIutamylglutamique, l'acide p-aminobenzoyl- y-gltitamyl-y-glutamyiglutamique,
l'acide p- aminobenzoyl - y - ghitamy 1- a-glutamy iglutami- que, l'acide p-aminobenzoyl-digIutamyl--hitami- que ou l'acide p-aminobenzoyl-a-gIutamyl-a- glutamylglutamique.
La réaction donnant. lieu à la formation d'acide ptéroylglutamique par le procédé selon la présente invention peut être représentée par l'équation suivante
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où R et R' sont des groupements hydroxyle, alcoxy ou amino, Fun au moins de ces deux symboles toutefois représentant un groupe ment alcoxy ou amino.
On peut effectuer la réaction de synthèse en mélangeant simultanément les trois réactifs ou en faisant premièrement réagir le second réactif avec l'un des deux autres puis en ajou tant, le troisième réactif au mélange réaction nel, sans isoler les intermédiaires. L'hydrolyse du produit. de la réaction peut se faire en milieu acide, en présence par exemple d'acide sulfurique ou chlorhydrique, ou en milieu alcalin, en présence par exemple d'hydroxyde de sodium ou de potassium.
La réaction de synthèse peut être effec tuée clans de l'eau ou dans un solvant orga nique, de préférence dans un liquide organi que hy droxy lé tel que l'alcool éthylique ou le glycol éthylénique. On peut également uti liser d'autres solvants tels que l'acétone, le benzène ou le formamide. La température peut varier entre la température ambiante et 160 C environ, les températures supérieures à 100 C étant préférées. Le temps nécessaire pour ache ver la réaction dépend naturellement de la température et des autres conditions. Pour effectuer l'hydrolyse, il est habituellement nécessaire de chauffer le mélange de la réaction à une température comprise entre 50 et 100 C.
Le groupement ester est. facile ment éliminé par hydrolyse dans un acide ou un alcali, tandis que le groupement amide demande plus de temps pour ôtre éliminé.
On peut effectuer la synthèse dans de larges limites de pH. On obtient. toutefois les meilleurs résultats en utilisant une solution sensiblement aqueuse ayant un pH compris entre 3 et 5.
Différentes manières de mettre en auvre le procédé selon la présente invention sont décrites dans les exemples suivants.
Exemple <I>1:</I> On a dissous 5 g d'ester y-éth@-lique d'acide p-nitro-benzoy iglutamique dans 25 cm' d'éthanol, additionné la solution de 25 cm-' d'eau et effectué la réduction au moyen de 7 g du couple zinc-cuivre, en utilisant de l'acide chlorhydrique pour maintenir le pH à environ 3,0. On élimine le zinc par filtration, on amène le pH de la solution de l'ester-y- éthylique de l'acide p-aminobenzoylglutami- que à 2,5 et on additionne la solution de \?5 cm' d'eau.
On ajoute 1,6 g de réductone et on agite la. solution pendant 20 minutes. La solution est ensuite refroidie. L'ester y-éthylique de L'acide p-(2,3-diliyclroxy-2-ène- propylidène-amino)-benzoyigltttamique obtenu est isolé, lavé à l'eau et séché. Rendement 5,5 g.
3,.5 g de ce produit et 2,8 g de 2,4,5-tri- a.mino-6-hy droxypyrimidine sont mis en sus pension dans 18 cm' de glycol éthylénique et chauffés à 135 C pendant 30 minutes. Le mélange est refroidi, dilué par 2 volumes d'eau et ensuite de nouveau refroidi, l'ester y-éthylique de l'acide ptéroylglutamique étant ensuite isolé. Rendement: 3,7 g. La pureté dé- terminêe par analyse chimique est de 15,8 /o.
On dissout cette substance dans de l'hydroxyde de sodium à 0,1 n et on chauffe la solution à 50 C pendant 30 minutes. L'essai avec S. faecalis R donne la valeur de 17,6 /o- qui indique que l'hydrolyse de l'ester en acide ptéroylglutamique est complète. L'acide ptéroy lglutamique ainsi obtenu est première ment dissous dans une solution d'hydroxyde de sodium 0,2n à une concentration de 400 microgrammes!cm'. On ajoute ensuite du chlorure de baryum en quantité suffisante pour obtenir une normalité de 0,2, le mélange étant ensuite agité pendant 10 minutes et filtré.
On ajoute de l'alcool éthylique au filtrat jusqu'à obtention d'une concentration de 201/o et, après agitation, on filtre de nou veau la, solution et on rejette la matière inso luble, s'il y en a. L'excès de baryum contenu dans le filtrat est alors précipité par addition d'une quantité équivalente d'acide sulfurique en prenant soin de maintenir le mélange nettement alcalin, si nécessaire par addition d'hydroxyde de sodium. Après élimination du. sulfate de baryum, la solution est étendue à 100 microgrammes/em' de composé actif, puis ajustée à pH 7,0.
On filtre de nouveau la solution et on concentre le filtrat à un volume tel que la concentration du composé actif soit de 200 mierogrammesr\cm'. Cette solution est épuisée au moyen de 4 portions de 10 parties en volume de buta.nol. Les extraits butanoli- ques sont rejetés. La. phase aqueuse est alors traitée au moyen d'une quantité -de charbon actif équivalent au poids total de composé actif présent. On filtre la solution et on éli mine le charbon. On ajuste le pII du filtrat à 3,0 et on chauffe pour dissoudre le com posé actif qui peut précipiter à cette acidité. On peut ajouter de l'eau, si nécessaire.
On laisse alors refroidir la .solution, saturée à 4 C environ et on recueille le produit préci pité. On peut le faire recristalliser en le dis solvant clans de l'eau chaude ajustée à pH 3, si on le désire.
Exemple On met en suspension 0,3 g de l'ester di- éthylique d'acide p-(2,3-dihydroxy-2-ène- propylidène-amino)-benzoy1glutamique, ob tenu selon la méthode de l'exemple 1, et 0,25 g de 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine dans 6 cm" de glycol éthylénique et on chauffe la suspension à 1350 C pendant 30 minutes. Ensuite, on la refroidit et on l'additionne de 4 volumes d'eau. Après un nouveau refroi dissement, le solide est recueilli, lavé et séché. Rendement: 0,25 g.
Pureté déterminée par analyse chimique: 17,10/a. On dissout ce pro duit dans de l'hydroxyde de sodium 0,1 n et on chauffe la solution à 500 C pendant 30 mi nutes. L'essai avec S. faecalis R donne une valeur de 21,5 % qui indique que l'hydrolyse de l'ester en acide ptéroylglutamique est complète.
Exemple <I>3:</I> On a dissous 3 g de p-nitrobenzoy@iso- glutaminate éthylique dans 50 cm3 d'éthanol. chaud à 900/0,, additionné la solution de 25 cm' d'eau et effectué la réduction à. une tempé rature de 40-500 C et à pH 3,0 en utilisant 4 g du couple zinc-cuivre.
Après 40 minutes, on élimine le zinc par filtration et on ajoute de l'eau à la solution .du p-aminobenzoyliso- glutaminate pour obtenir un volume de 140 eni3. On ajoute alors 1,2 g de réductone et on agite le mélange à la température am biante pendant plusieurs heures. On laisse bien refroidir le mélange, le produit. étant alors recueilli, lavé et séché. Rendement: 2,8 g de p-(2,3-dihydroxy 2-èiie-prop@-lidène-amino)- benzaylisogluta.minate éthylique.
On met en suspension 2,5 de ce produit et 2 g de 2,4,5-triamino-6-liydroxy pyrimidine dans 13 cm" de glycol éthylénique et on chauffe la suspension à. 135 C pendant. 30 mi nutes. Le ptéroylisoglutaminate éthi-lique est recueilli, lavé et séché. Rendement: 2,3 g. Teneur déterminée par analyse chimique: 22 0/a.
On dissout ce produit dans de l'hydroxyde de sodium 0,25 n et on chauffe la solution à 550 C pendant 1 heure. L'essai avec S. faecalis R .donne alors une valeur de 12,3 % qui in- dique que l'hydrolyse de l'ester en acide ptéroylglutamique est incomplète.
Le produit obtenu, c'est-à-dire l'acide, ptéroylglutamique, est purifié de la maille re suivante: On dissout 2,15; du produit brut dans 400 em d'hydroxyde de sodium 0,2n et on agite la solution à. 50" C pendant 1 heure. On ajoute 14,5 cm" de chlorure de calcium à 30 0/0, on élève la. température à 70" C et. on filtre la solution. On ajoute au filtrat à 50" C une solution diluée de chlorure de zinc jus qu'à ce que le pH soit tombé à 10,5.
On filtre et on ajoute du chlorure de zinc à 30 % jus- qu'à ce que le pH ait atteint 6,75. Ce mé lange est chauffé à. 80" C et filtré. On dissout le gâteau de filtrage dans 3 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, on traite la solution au moyen de charbon actif et on filtre. On ajoute la solution à 30 cm;, d'eau chaude, puis on laisse bien refroidir.
Le produit est recueilli et dissous .de nouveau dans 2,5 cm:\ d'acide chlorhydrique concentré. La solution est traitée par du charbon actif et ensuite filtrée. On ajoute 30 cm" d'eau chaude au filtrat et on laisse bien refroidir. Le produit est recueilli, lavé à l'eau, au méthanol et à l'éther et séché. Rendement: 55 mg. Pureté déterminée par analyse chimique: 840/0.
Le spectre d'absorption ultraviolet est caractéris tique pour l'acide ptéroylglutamique. Sous forme de solution dans de l'hydroxyde de sodium 0,1 n, cet acide présente des maxima d'absorption à 255 :mu, 285 my et 365 mcc. Dans une solution d'acide chlorhydrique<B>0J</B> n, le maximum est à 297,5 my.
<I>Exemple 4:</I> On a. mis en suspension 5 g d'amide d'acide p-nitrobenzoylglutamique dans 125 cm' d'eau et on a réduit ce composé au moyen de 7 g (lu couple zinc-euivre en utilisant de l'acide chlorhydrique concentré pour maintenir le liai de la solution entre 2,5 et 3,0. On élimine le zinc par filtration et on ajoute 1,7 b de réductone à la solution d'amide d'acide p- aininobenzovlglutamique obtenue. Après avoir laissé reposer la solution à la. température ambiante pendant 30 minutes, on la laisse refroidir pendant la nuit.
Rendement: 1,9 g d'un produit solide qui est l'amide de l'acide p- (2,3 - diliydroxy - \)-ène-propylidène- amino )- benzoyl-lutamique. On met en suspension 1,9 g de ce pro duit et 1,6 g de 2,4,5-triamino-6-hydroxy- pyrimidine dans 10 cm' de glycol éthylénique et on chauffe la suspension à 135 C pen dant 30 minutes. Le mélange est alors re froidi et additionné de 3 volumes d'eau. Le produit est recueilli, lavé et séché. Rende ment: 1,5 g.
Pureté déterminée par analyse chimique: 17,7 %, Le produit ainsi obtenu est purifié selon la méthode décrite dans l'exemple 3. De cette manière, on obtient 60 mg d'acide ptéroyl- glutamique. Pureté déterminée par analyse chimique: 83 %. Essai avec S. faecalis R: 16 /u, indiquant une hydrolyse incomplète.
Process for the preparation of pteroy1glutamic acid. The present invention relates to a process for the preparation of pteroylglutamic acid which, in at least one of its tautomeric forms, corresponds to the following formula:
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this process being. characterized in that one reacts 2,4,5-triamino-6-hydroxy-pyrimidine, 2,3-dihy droxy acry lal.déhyde and p-aminobenzoylglittamic acid. at least one of the acid functions is blocked by a group capable of being removed by hydrolysis by regenerating the acid, and in that the product of the reaction is hydrolyzed to obtain pteroylglutamic acid.
The pteroylglutamic acid obtained by the process according to the present invention is a yellow to reddish-brown solid which is difficult to dissolve in water and organic solvents. This acid, as is known, has properties similar to those of vitamins and seems to be necessary for the life of certain bacteria and more developed organisms in the animal world, or to stimulate their growth. This compound is further useful for stimulating hemoglobin formation and for the treatment of macrocytic anemias.
The acid salts of pteroylglutamic acid can be prepared by treating it with strong mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid. We can. also to obtain base salts from it by treating it with a suitable alkali, for example with an alkali metal hydroxide, ammonia or an amine. From these salts one can obtain other metal salts containing cations such as zinc, silver, nickel, copper, magnesium and barium, by double decomposition, for example by treating a solution of an alkali metal salt of pteroylglutamic acid with a soluble salt of the desired cation.
The first reagent, 2,4,5-triamino-6-hydroxy-pyrimidine, is a known compound which can be prepared according to the methods already described in the chemical literature. It is further well known that this compound exists in one or more tautomeric forms such as 2,4,5-triamino-pyrimidone-6 or 2-imino-4,5-diamino-pyrimidone-6.
The form in which the compound exists, i.e. the ketone form or the enol form, probably depends on the pH of the medium in which it is dissolved. Each of these tautomeric forms reacting in the same reaction in an analogous manner, it is therefore immaterial whether one or the other is present.
The second reagent, 2,3-dihy droxy acryl-aldehyde, which will be referred to hereinafter as reductone, has the following constitutional formula:
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This compound can also exist in another tautomeric form, for example in the ketone form which is denoted by 2-oxo-3-hydroxypropionaldehyde. Here also the form in which said reagent is present has no influence on the reaction.
The third reagent, usually consisting of an ester or amide of p-amino-benzoylgiutamic acid, can be prepared by ac tion of p-nitrobenzoyl chloride with an ester or amide of ghitamic acid and reduction. from nitro group to amino group. This ester can be a partial ester (a or y <B>) \ </B> or a complete ester (a, y), for example a methy- liqui ester,
ethyl or propyl. The amide can be an a-amide or an; -amide or an a ,,, - amide or an amide comprising several amide bonds, such as p-aminobenzoyl-y-gIutamylglutamic acid, p- acid. aminobenzoyl- y-gltitamyl-y-glutamyiglutamic,
p- aminobenzoyl - y - ghitamy 1 - α-glutamy iglutamic acid, p-aminobenzoyl-digIutamyl - hitamic acid or p-aminobenzoyl-α-gIutamyl-α-glutamylglutamic acid.
The giving reaction. taking place in the formation of pteroylglutamic acid by the process according to the present invention can be represented by the following equation
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where R and R 'are hydroxyl, alkoxy or amino groups, at least one of these two symbols, however, representing an alkoxy or amino group.
The synthesis reaction can be carried out by simultaneously mixing the three reactants or by first reacting the second reactant with one of the other two and then adding the third reactant to the reaction mixture, without isolating the intermediates. Hydrolysis of the product. of the reaction can be carried out in an acid medium, in the presence for example of sulfuric or hydrochloric acid, or in an alkaline medium, in the presence for example of sodium or potassium hydroxide.
The synthesis reaction can be carried out in water or in an organic solvent, preferably in an organic liquid such as ethyl alcohol or ethylenic glycol. Other solvents such as acetone, benzene or formamide can also be used. The temperature can vary between room temperature and approximately 160 ° C., temperatures above 100 ° C. being preferred. The time required for the reaction to be completed will naturally depend on temperature and other conditions. In order to carry out the hydrolysis, it is usually necessary to heat the reaction mixture to a temperature between 50 and 100 C.
The ester group is. readily removed by hydrolysis in acid or alkali, while the amide group takes longer to remove.
The synthesis can be carried out within wide pH limits. We obtain. however best results when using a substantially aqueous solution having a pH between 3 and 5.
Different ways of carrying out the method according to the present invention are described in the following examples.
Example <I> 1: </I> 5 g of p-nitro-benzoyiglutamic acid γ-eth @ -l ester were dissolved in 25 cm 3 of ethanol, added to the solution of 25 cm 3. 'water and carried out the reduction using 7 g of the zinc-copper pair, using hydrochloric acid to maintain the pH at about 3.0. The zinc was removed by filtration, the pH of the p-aminobenzoylglutamic acid γ-ethyl ester solution was brought to 2.5 and the solution was added to 5 cm 3 of water.
1.6 g of reductone are added and the mixture is stirred. solution for 20 minutes. The solution is then cooled. The p- (2,3-Diliyclroxy-2-en-propylidene-amino) -benzoyigltttamic acid y-ethyl ester obtained is isolated, washed with water and dried. Yield 5.5 g.
3.5 g of this product and 2.8 g of 2,4,5-tri-a.mino-6-hy droxypyrimidine are suspended in 18 cm 'of ethylenic glycol and heated at 135 C for 30 minutes . The mixture is cooled, diluted with 2 volumes of water and then cooled again, the γ-ethyl ester of pteroylglutamic acid then being isolated. Yield: 3.7 g. The purity determined by chemical analysis is 15.8%.
This substance is dissolved in 0.1 n sodium hydroxide and the solution is heated at 50 ° C. for 30 minutes. The test with S. faecalis R gives the value of 17.6 / o- which indicates that the hydrolysis of the ester to pteroylglutamic acid is complete. The pteroylglutamic acid thus obtained is first dissolved in a 0.2n sodium hydroxide solution at a concentration of 400 micrograms! Cm '. Sufficient barium chloride is then added to obtain a normality of 0.2, the mixture then being stirred for 10 minutes and filtered.
Ethyl alcohol is added to the filtrate until a concentration of 201% is obtained and, after stirring, the solution is filtered again and insoluble material is discarded, if any. The excess barium contained in the filtrate is then precipitated by adding an equivalent quantity of sulfuric acid, taking care to keep the mixture distinctly alkaline, if necessary by adding sodium hydroxide. After elimination of. barium sulfate, the solution is extended to 100 micrograms / em 'of active compound, then adjusted to pH 7.0.
The solution is filtered again and the filtrate is concentrated to a volume such that the concentration of the active compound is 200 mg / cm 3. This solution is exhausted by means of 4 portions of 10 parts by volume of buta.nol. The butanol extracts are rejected. The aqueous phase is then treated with an amount of activated carbon equivalent to the total weight of active compound present. The solution is filtered and the charcoal removed. Adjust the pII of the filtrate to 3.0 and heat to dissolve the active compound which may precipitate at this acidity. Water can be added if necessary.
The saturated solution is then allowed to cool to about 4 ° C. and the above product is collected. It can be recrystallized from the dissolvent in hot water adjusted to pH 3, if desired.
Example 0.3 g of p- (2,3-dihydroxy-2-ene-propylidene-amino) -benzoy1glutamic acid diethyl ester, obtained according to the method of Example 1, is suspended. and 0.25 g of 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine in 6 cm 3 of ethylenic glycol and the suspension is heated at 1350 C for 30 minutes. Then, it is cooled and added with 4 volumes of water After cooling again, the solid is collected, washed and dried Yield: 0.25 g.
Purity determined by chemical analysis: 17.10 / a. This product is dissolved in 0.1 n sodium hydroxide and the solution is heated at 500 ° C. for 30 minutes. The test with S. faecalis R gives a value of 21.5% which indicates that the hydrolysis of the ester to pteroylglutamic acid is complete.
Example <I> 3: </I> 3 g of ethyl p-nitrobenzoy® isoglutaminate were dissolved in 50 cm3 of ethanol. hot to 900/0 ,, added the solution of 25 cm 3 of water and carried out the reduction to. a temperature of 40-500 C and at pH 3.0 using 4 g of the zinc-copper couple.
After 40 minutes, the zinc was removed by filtration and water was added to the p-aminobenzoylisoglutaminate solution to give a volume of 140 µl. 1.2 g of reductone are then added and the mixture is stirred at room temperature for several hours. The mixture, the product, is allowed to cool well. then being collected, washed and dried. Yield: 2.8 g of ethyl p- (2,3-dihydroxy 2-elie-prop @ -lidene-amino) - benzaylisogluta.minate ethyl.
2.5 of this product and 2 g of 2,4,5-triamino-6-hydroxy pyrimidine are suspended in 13 cm 3 of ethylenic glycol and the suspension is heated at 135 ° C. for 30 minutes. The pteroylisoglutaminate ethyl alcohol is collected, washed and dried Yield: 2.3 g Content determined by chemical analysis: 22 0 / a.
This product is dissolved in 0.25 n sodium hydroxide and the solution is heated at 550 ° C. for 1 hour. The test with S. faecalis R. Then gives a value of 12.3% which indicates that the hydrolysis of the ester to pteroylglutamic acid is incomplete.
The product obtained, that is to say the acid, pteroylglutamic, is purified from the following mesh: 2.15 is dissolved; of the crude product in 400 em of 0.2n sodium hydroxide and the solution is stirred. 50 ° C for 1 hour. 14.5 cm 3 of 30% calcium chloride is added, raised. temperature at 70 ° C. and the solution is filtered. To the filtrate at 50 ° C., a dilute solution of zinc chloride is added until the pH has fallen to 10.5.
Filter and add 30% zinc chloride until the pH has reached 6.75. This mixture is heated to. 80 ° C and filtered. The filter cake is dissolved in 3 cm3 of concentrated hydrochloric acid, the solution is treated with activated charcoal and filtered. The solution is added to 30 cm 3, hot water, then the solution is treated. let cool well.
The product is collected and dissolved again in 2.5 cm 3 of concentrated hydrochloric acid. The solution is treated with activated carbon and then filtered. 30 cc of hot water are added to the filtrate and the mixture is allowed to cool well. The product is collected, washed with water, methanol and ether and dried. Yield: 55 mg. Purity determined by chemical analysis: 840 / 0.
The ultraviolet absorption spectrum is characteristic for pteroylglutamic acid. In the form of a solution in 0.1 n sodium hydroxide, this acid exhibits absorption maxima at 255: mu, 285 my and 365 mcc. In <B> 0J </B> n hydrochloric acid solution, the maximum is 297.5 my.
<I> Example 4: </I> We have. suspended 5 g of p-nitrobenzoylglutamic acid amide in 125 cm 3 of water and this compound was reduced by means of 7 g (read the zinc-eupair couple using concentrated hydrochloric acid to maintain the bond of the solution between 2.5 and 3.0 The zinc is removed by filtration and 1.7 b of reductone is added to the p-aininobenzovlglutamic acid amide solution obtained. room temperature for 30 minutes, allowed to cool overnight.
Yield: 1.9 g of a solid product which is p- (2,3-diliydroxy- \) -ene-propylidene-amino) -benzoyl-lutamic acid amide. 1.9 g of this product and 1.6 g of 2,4,5-triamino-6-hydroxy-pyrimidine are suspended in 10 cm 3 of ethylenic glycol and the suspension is heated at 135 ° C. for 30 minutes. . The mixture is then cooled again and added with 3 volumes of water. The product is collected, washed and dried. Yield: 1.5 g.
Purity determined by chemical analysis: 17.7%. The product thus obtained is purified according to the method described in Example 3. In this way, 60 mg of pteroyl-glutamic acid are obtained. Purity determined by chemical analysis: 83%. Test with S. faecalis R: 16 / u, indicating incomplete hydrolysis.