Procédé de préparation d'acide ptéroy1glutamique. La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'acide ptéroylgluta- inique qui, au moins dans l'une de ses formes tautomères, présente la formule
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Selon la présente invention, on prépare l'acide ptéroylglutamique en faisant réagir de la 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine avec un propionaldéhyde de formule
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dans laquelle X est un halogène et Y repré sente un élément non métallique s'éliminant au cours de la réaction, tel que, par exemple, de l'hydrogène ou un halogène, et de l'acide p-aminobenzoylglutamique.
L'acide ptéroylglutamique obtenu par le procédé suivant la présente invention est une substance d'une couleur variant entre le jaune et le brun rouge, difficilement soluble dans l'eau et les solvants organiques. Il possède des propriétés vitaminiques et paraît être né cessaire à la croissance de certaines bactéries et d'autres formes animales plus élevées ou pour stimuler cette croissance. Il est, en outre, utile pour stimuler la formation de l'hémo globine et dans le traitement de l'agranulo cytose.
Les sels d'acides de l'acide ptéroy1gluta- mique peuvent être préparés par traitement de cet acide au moyen d'acides minéraux forts, par exemple les acides chlorhydrique, sulfu rique et analogues. Les sels de bases peuvent également être obtenus par traitement dtt com posé au moyen d'un agent alcalin approprié, par exemple un hydroxyde de métal alcalin, de l'ammoniaque, une amine ou autres subs tances analogues.
D'autres sels métalliques contenant comme cations le zinc, l'argent, le nickel, le cuivre, le magnésium, le baryum, etc., peuvent être obtenus par double décom position, par exemple par traitement d'une solution d'un sel de métal alcalin de l'acide ptéroylglutamique par un sel soluble du ca- tion désiré. Ces sels sont utilisables aux mêmes fins que l'acide folique lui-même.
Le premier réactif, la 2,4,5-triamino-6-hy- droxy-pyrimidine, qui est un composé connu, peut être préparé par des méthodes qui ont été décrites dans la littérature chimique.
Comme on le sait également, ce composé peut exister sous lune 0,u plusieurs formes tautomères comme:
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L'existence de ce composé sous la forme cétonique ou énolique dépend probablement du pg du milieu dans lequel il est dissous.
Ce composé est très probablement présent. sous forme cétonique en milieu acide et sous forme énolique en milieu alcalin. On notera égale ment que le groupe 2-amino peut être aussi tautomérisé en groupe imino. Comme on le sait, toutes les formes tautomères peuvent être employées indifféremment dans les mêmes réactions chimiques.
Dans la suite, toutes les indications concernant l'utilisation de l'une des formes tautomères se rapportent égale ment aux autres formes tautomères. Le pro duit final manifestera naturellement la même sorte de tautomérie.
Le deuxième réactif peut être notamment a) un a,f-dihalopropionaldéhyde de for <B>mule-</B>
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dans laquelle X est un, halogène. L'a,, l-dihalo- propionaldéhy de préféré est.
l'a,j#-dibromo- propionaldéhyde bien que, ainsi que le mon treront les exemples, l'on puisse employer d'autres propionaldéhydes .dihalogénés. Il faut également noter que les acétals des dihalopro- pionaldéhydes et autres propanals substitués tels que ceux qui seront indiqués dans la suite peuvent également être utilisés dans le procédé selon la présente invention.
Etant donné qu'il existe dans la solution un équilibre entre l'aldéhyde libre et son acétal, le réactif réel est l'aldéhyde lui-même. Par conséquent., les indications, données dans la suite, concer nant l'emploi de propanals substitués, se rap portent également à l'emploi des acétals cor respondants en quantité équivalente.
b) un a,a,f-trihalopropionaldéhyde de for mule:
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dans laquelle X est un halogène. On utilise, de préférence, le dérivé bromé bien qu'on puisse également employer d'autres a,a,fi-tri- halopropionaldéhydes, tels que les a,a,13-tri- chloropropionaldéhydes et les a,a,fl-triiodopro- pionaldéhydes.
Le troisième réactif peut être préparé en faisant réagir le chloriue de p-nitrobenzoyle avec l'acide glutamique et en réduisant le groupe nitro en un groupe amino.
La réaction conduisant à la formation de l'acide ptéroylglutamique peut être représen tée par l'équation suivante
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Dans les formules susmentionnées X et. Y ont les valeurs déjà spécifiées.
Le premier produit de la réaction peut être une forme dihydro instable. Le passage à la forme aromatique s'effectue par élimina tion de deux atomes d'hydrogène du noyau pyrazinique; cette oxydation se produit spon tanément en très peu de temps en présence de l'air ambiant.
On peut effectuer la réaction conduisant à la formation de l'acide ptéroylglutamique en mélangeant les trois réactifs indiqués en même temps, ou en faisant premièrement réagir le second réactif avec l'un quelconque des deux autres, avant d'ajouter le troisième réactif au mélange réactionnel, sans isolement des produits intermédiaires.
Ainsi qu'il ressort des exemples suivants, la réaction peut. être effectuée dans de larges limites de températures, par exemple entre 2 et 100 C ou plus. De même, la réaction se produit dans de larges limites de pH, les meil leurs résultats paraissant. toutefois être obte nus à un pH compris entre 3 et 5.
On opère habituellement en présence d'un solvant ou autre liquide de dispersion tel que l'eau, l'alcool éthylique, l'acétone, le benzène, le tétrachlorure de carbone, le chloroforme, etc., ou leurs mélanges. Dans les exemples suivants sont exposés quelques modes de mise en aeuvre du procédé selon l'invention.
Les parties sont des parties en poids, sauf indications contraires.
<I>Exemple</I> I: On fait bouillir an reflux pendant 4 heures sous une atmosphère d'azote un mélange formé de 1 p. de 2,4,5-triamino-6-liydroxypyrimidine, 2,06 parties d'a,,B dibromopropionacétal, 0,58 parties d'actétate de sodium et 24 parties d'alcool éthylique.
On ajoute alors 0.58 par tie d'acétate de sodium et 1.,88 partie d'acide p-aminobenzoylglutamique préparé à partir de l'acide p-aminobenzoïque et de l'acide glu tamique naturel lévogyre (-f-), et on fait bouillir au reflux le mélange obtenu pendant 3 heures, toujours sous atmosphère d'azote. Le mélange est refroidi, étendu de 10 parties d'eau, acidifié au moyen de 3 parties d'acide chlorhydrique concentré, chauffé au reflux au bain-marie pendant 1 heure, refroidi, puis abandonné à la température ordinaire pen dant une nuit.
La solution obtenue est filtrée pour élimi ner les produits insolubles et chauffée pour éliminer la majeure partie de l'alcool. On précipite le produit à un pH compris entre 3 et 5, on le réunit, on le dissout dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, on traite par le charbon actif, on filtre, on pré cipite à nouveau à un pH compris entre 3 et 5, on lave à l'eau, à l'alcool et à l'éther, puis on sèche. Le rendement en produit brut est de 0,37 p.
Les essais biologiques effectués sur lactobacilhLs easei et streptocoecus fecalis R montrent que le produit brut contient la subs tance biologiquement active désirée, l'acide N- [4- 1 [ (2î-amino-4-hydroxy-6-ptéi-idyl)-mé- thyl]-amino 1 -benzoyl] -glutamique.
Le produit purifié se présente sous la forme de .cristaux jaunes dont l'indice de ré fraction dans le sens parallèle à la longueur des cristaux est de 1,559 0,003 et de 1,774 0,003 dans le sens parallèle à la lar geur des cristaux. Les cristaux examinés indi viduellement ont la forme d'une lentille mince.
Le produit se décompose à la chaleur sans fondre.
L'acide libre se .dissout facilement dans les solutions aqueuses alcalines avec formation du sel correspondant. Il est également soluble dans les solutions aqueuses d'acides forts, le minimum. de solubilité se trouvant à environ pH 3.
<I>Exemple 2:</I> On fait bouillir au reflux pendant 1 heure avec, 75 parties en volume d'alcool éthylique un mélange de 3 p. -d'a,f-dibromopropionacétal et 3 parties d'acide p-aminobenzoylglutami- que. On ajoute alors 1,5 p. de 2,4,5-triamino- 6-hydroxypyrimidine et 1,7 p. d'acétate de sodium dans 75 parties en volume d'alcool éthylique et on fait bouillir le mélange au reflux pendant 4 heures.
Le mélange est alors refroidi, étendu de 30 parties d'eau, puis aci difié au moyen d'acide chlorhydrique à un pH inférieur à 2 et chauffé à la température de reflux au bain-marie pendant 1 heure. Le mélange réactionnel est alors refroidi et aban donné à la température ordinaire pendant une nuit.
On sépare le produit de sa solution par précipitation à un pH compris entre 3 et 5, on le rassemble, on le redissout, on traite la solu tion au moyen de charbon actif et on repréci- pite comme dans l'exemple précédent. Ce mode de faire donne des rendements un peu meilleurs en acide ptéroylglutamique.
Exemple <I>3:</I> On fait bouillir au reflux pendant 1 heure dans 75 volumes d'alcool éthylique un mé lange de 3 parties en poids d'aldéhyde di- bromopropionique et 7,4 parties d'acide p-aminobenzoylglutamique. On ajoute alors 2 parties en poids de 2,4,5-triamino-6-hydroxy- pyrimidine et 2,3 parties d'acétate de sodium dans 75 parties en volume d'alcool éthylique, et on fait bouillir le mélange au reflux pen dant 4 heures. Le mélange réactionnel est re froidi, étendu d'eau, soumis à l'ébullition au reflux pendant encore une heure, refroidi, puis abandonné au repos.
Le mélange réactionnel est filtré, traité pour éliminer l'excès d'alcool, et le produit est précipité à un pH compris entre 3 et 5. On redissout le produit brut dans une solution alcaline aqueuse, on traite la solution au moyen de charbon actif et on précipite le pro duit qui est ensuite filtré et séché. On ob tient le même produit que dans l'exemple 1.
Exemple On dissout une partie de 2,4,5-triamino-6- hydroxypyrimidine dans 100 parties en vo lume d'une solution chaude à 10 afo d'acétate de sodium. On filtre alors la solution et on la refroidit à la température ordinaire. On ajoute alors simultanément 1,6 p. d'a,fl-di- bromopropionaldéhyde dans 50 parties en v o- lume d'alcool éthylique et 1,9 p. d'acide p-aminobenzoylglutamique dans 50 parties en volume d'eau.
Au bout d'une heure à la tem pérature ordinaire, on filtre la solution, le produit précipité étant ensuite lavé et séché. Aux essais biologiques, le produit brut mani feste une activité à l'égard de lactobacillus ca- sei et de streptococcus fecalis R de 20 % de celle du produit purifié de l'exemple 1.
<I>Exemple 5:</I> On effectue une série d'essais suivant le processus de l'exemple 1 à cela près que l'agent tampon acétate de sodium est omis et que le pi, du mélange réactionnel est ajusté par addition d'un acide ou d'un alcali, suivant besoin. Les essais sont effectués aux pi, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 et 10. On obtient dans tous les cas le même produit que dans l'exemple 1, le rendement. maximum étant obtenu à un pH compris entre 3 et 5, mais des rendements encore appréciables étant obtenus aux pli de 2 et 10.
Exemple <I>6:</I> On dissout 5 parties de 2,4,5-t.ria.miiio-6- hydroxypyrimidine dans 500 parties d'eau contenant une trace d'hydrosulfite de sodium et<B>11.,6</B> parties d'acétate de sodium. On pré pare une solution de 7,6 parties d'a,a,@-tri- bromopropionaldéhyde (suivant Bull. Soc. Chim. [4] 37, 1390 [1925]) dans environ 400 parties d'alcool éthylique et une solution de 12 parties d'acide p-aminobenzoylglutamique dans 500 parties d'eau.
Ces deux solutions sont ajoutées simultanément à la solution de 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine sous agi tation, à la température ordinaire. Au bout d'une heure, on récupère par filtration le pré- cipité formé. L'examen révèle qu'il contient l'acide N-[4-i[(2-amino-4-hydroxy-6-ptéri- dyl)-méthyl]-aniino 1 -benzoyl]-glutamique.
Ce produit peut être purifié par le pro cédé décrit dans l'exemple 1.
<I>Exemple</I> La réaction de l'exemple précédent peut aussi être réalisée en dissolvant la. 2,4,5-tri- amino-6-hy droxypy rimidine et l'acide p-amino- benzoylglutamique dans l'eau et en ajoutant lentement l'a,a,l-tribromopropionaldéhydedis- sous dans l'alcool.
On maintient le pli à 4 en ajoutant de la soude caustique, quand cela de vient nécessaire, ce qui est. déterminé au moyen d'un dispositif de mesure du pli à électrode de verre. Le produit brut de lu, réaction contient également une quantité importante d'acide N- [4-1[ (2 - amino- 4 -liydroxy- 6 -ptérid@-1) -mé- thyl] amino }-benzoyl] -glutamique.
Process for the preparation of pteroy1glutamic acid. The present invention relates to a process for the preparation of pteroylglutaminic acid which, at least in one of its tautomeric forms, has the formula
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According to the present invention, pteroylglutamic acid is prepared by reacting 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine with a propionaldehyde of formula
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wherein X is halogen and Y represents a non-metallic element which is eliminated during the reaction, such as, for example, hydrogen or halogen, and p-aminobenzoylglutamic acid.
The pteroylglutamic acid obtained by the process according to the present invention is a substance of a color varying between yellow and red-brown, hardly soluble in water and organic solvents. It has vitamin properties and appears to be necessary for the growth of certain bacteria and other higher animal forms or to stimulate this growth. It is, moreover, useful for stimulating the formation of hemoglobin and in the treatment of agranulocytosis.
Acid salts of pteroylglutamic acid can be prepared by treating this acid with strong mineral acids, for example hydrochloric, sulfuric and the like. The base salts can also be obtained by treating the compound with a suitable alkaline agent, for example an alkali metal hydroxide, ammonia, an amine or the like.
Other metal salts containing zinc, silver, nickel, copper, magnesium, barium, etc. as cations, can be obtained by double decomposition, for example by treating a solution of a salt. alkali metal of pteroylglutamic acid with a soluble salt of the desired cation. These salts can be used for the same purposes as folic acid itself.
The first reagent, 2,4,5-triamino-6-hydroxy-pyrimidine, which is a known compound, can be prepared by methods which have been described in the chemical literature.
As is also known, this compound can exist under moon 0, u several tautomeric forms such as:
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The existence of this compound in the keto or enol form probably depends on the µg of the medium in which it is dissolved.
This compound is most likely present. in ketone form in acidic medium and in enolic form in alkaline medium. It will also be noted that the 2-amino group can also be tautomerized into an imino group. As is known, all the tautomeric forms can be used interchangeably in the same chemical reactions.
In the following, all the indications concerning the use of one of the tautomeric forms also relate to the other tautomeric forms. The end product will naturally exhibit the same kind of tautomerism.
The second reagent can be in particular a) an a, f-dihalopropionaldehyde for <B> mule- </B>
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wherein X is halogen. The preferred α ,, 1-dihalopropionaldehy is.
a, j # -dibromopropionaldehyde although, as the examples will show, other dihalogenated propionaldehydes can be employed. It should also be noted that the acetals of the dihalopropionaldehydes and other substituted propanals such as those which will be indicated below can also be used in the process according to the present invention.
Since there is an equilibrium between the free aldehyde and its acetal in the solution, the real reactant is the aldehyde itself. Consequently, the indications given below concerning the use of substituted propanals also refer to the use of the corresponding acetals in equivalent quantity.
b) an a, a, f-trihalopropionaldehyde of the formula:
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where X is halogen. The brominated derivative is preferably used although other a, a, fi-tri-halopropionaldehydes, such as a, a, 13-trichloropropionaldehydes and a, a, fl-triiodopro, can also be used. - pionaldehydes.
The third reagent can be prepared by reacting p-nitrobenzoyl chlorine with glutamic acid and reducing the nitro group to an amino group.
The reaction leading to the formation of pteroylglutamic acid can be represented by the following equation
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In the aforementioned formulas X and. Y have the values already specified.
The first product of the reaction can be an unstable dihydro form. The change to the aromatic form is effected by eliminating two hydrogen atoms from the pyrazine nucleus; this oxidation occurs spontaneously in a very short time in the presence of ambient air.
The reaction leading to the formation of pteroylglutamic acid can be carried out by mixing the three reagents indicated at the same time, or by first reacting the second reagent with any of the other two, before adding the third reagent to the mixture. reaction, without isolation of the intermediates.
As can be seen from the following examples, the reaction can. be carried out within wide temperature limits, for example between 2 and 100 C or more. Likewise, the reaction takes place over wide pH limits, the best results appearing. however, be obtained at a pH between 3 and 5.
The operation is usually carried out in the presence of a solvent or other dispersing liquid such as water, ethyl alcohol, acetone, benzene, carbon tetrachloride, chloroform, etc., or their mixtures. In the following examples, a few embodiments of the process according to the invention are given.
Parts are parts by weight, unless otherwise stated.
<I> Example </I> I: A mixture formed of 1% is boiled at reflux for 4 hours under a nitrogen atmosphere. of 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine, 2.06 parts of α ,, B dibromopropionacetal, 0.58 parts of sodium acetate and 24 parts of ethyl alcohol.
0.58 part of sodium acetate and 1.88 part of p-aminobenzoylglutamic acid prepared from p-aminobenzoic acid and levorotatory natural glutamic acid (-f-) are then added, and one boils the resulting mixture at reflux for 3 hours, still under a nitrogen atmosphere. The mixture is cooled, diluted with 10 parts of water, acidified with 3 parts of concentrated hydrochloric acid, refluxed in a water bath for 1 hour, cooled, then left at room temperature overnight.
The resulting solution is filtered to remove insoluble products and heated to remove most of the alcohol. The product is precipitated at a pH between 3 and 5, it is combined, dissolved in an aqueous solution of sodium hydroxide, treated with activated carbon, filtered, and again precipitated at a pH between 3 and 5, washed with water, alcohol and ether, then dried. The yield of crude product is 0.37%.
The bioassays carried out on lactobacilhLs easei and streptocoecus fecalis R show that the crude product contains the desired biologically active substance, N- [4- 1 [(2î-amino-4-hydroxy-6-ptéi-idyl) - acid. methyl] -amino 1 -benzoyl] -glutamic.
The purified product is in the form of yellow crystals with a refraction index in the direction parallel to the crystal length is 1.559 0.003 and 1.774 0.003 in the direction parallel to the crystal width. The crystals examined individually have the shape of a thin lens.
The product decomposes with heat without melting.
The free acid readily dissolves in aqueous alkaline solutions with formation of the corresponding salt. It is also soluble in aqueous solutions of strong acids, the minimum. of solubility being at approximately pH 3.
<I> Example 2: </I> A mixture of 3% is boiled under reflux for 1 hour with 75 parts by volume of ethyl alcohol. -d'a, f-dibromopropionacetal and 3 parts of p-aminobenzoylglutamic acid. Then 1.5 p. 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine and 1.7 p. of sodium acetate in 75 parts by volume of ethyl alcohol and the mixture is boiled under reflux for 4 hours.
The mixture is then cooled, diluted with 30 parts of water, then acidified with hydrochloric acid to a pH below 2 and heated to reflux temperature on a water bath for 1 hour. The reaction mixture is then cooled and left at room temperature overnight.
The product is separated from its solution by precipitation at a pH of between 3 and 5, it is combined, it is redissolved, the solution is treated with activated carbon and the mixture is reprecipitated as in the previous example. This method gives slightly better yields of pteroylglutamic acid.
Example <I> 3: </I> A mixture of 3 parts by weight of di-bromopropionic aldehyde and 7.4 parts of p-aminobenzoylglutamic acid is boiled under reflux for 1 hour in 75 volumes of ethyl alcohol. . Then 2 parts by weight of 2,4,5-triamino-6-hydroxy-pyrimidine and 2.3 parts of sodium acetate in 75 parts by volume of ethyl alcohol are added, and the mixture is boiled under reflux. within 4 hours. The reaction mixture is cooled again, diluted with water, boiled under reflux for a further hour, cooled, then left to stand.
The reaction mixture is filtered, treated to remove excess alcohol, and the product is precipitated at a pH between 3 and 5. The crude product is redissolved in an aqueous alkaline solution, the solution is treated with activated carbon. and the product is precipitated which is then filtered and dried. The same product is obtained as in Example 1.
Example One part of 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine is dissolved in 100 parts by volume of a hot 10% solution of sodium acetate. The solution is then filtered and cooled to room temperature. 1.6 p. of a, fl-dibromopropionaldehyde in 50 parts by volume of ethyl alcohol and 1.9 p. p-aminobenzoylglutamic acid in 50 parts by volume of water.
After one hour at room temperature, the solution is filtered, the precipitated product then being washed and dried. In biological tests, the crude product shows an activity with regard to lactobacillus casei and streptococcus fecalis R of 20% of that of the purified product of Example 1.
<I> Example 5: </I> A series of tests are carried out following the procedure of Example 1 except that the buffering agent sodium acetate is omitted and that the pI of the reaction mixture is adjusted by addition an acid or an alkali, as needed. The tests are carried out at pi, of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 10. In all cases the same product is obtained as in Example 1, the yield. maximum being obtained at a pH between 3 and 5, but still appreciable yields being obtained at folds of 2 and 10.
Example <I> 6: </I> 5 parts of 2,4,5-t.ria.miiio-6-hydroxypyrimidine are dissolved in 500 parts of water containing a trace of sodium hydrosulphite and <B> 11. , 6 </B> parts sodium acetate. A solution of 7.6 parts of a, a, @ - tri-bromopropionaldehyde (according to Bull. Soc. Chim. [4] 37, 1390 [1925]) is prepared in approximately 400 parts of ethyl alcohol and a solution of 12 parts of p-aminobenzoylglutamic acid in 500 parts of water.
These two solutions are added simultaneously to the solution of 2,4,5-triamino-6-hydroxypyrimidine with stirring, at room temperature. After one hour, the precipitate formed is recovered by filtration. Examination reveals that it contains N- [4-i [(2-amino-4-hydroxy-6-pteridyl) -methyl] -aniino 1 -benzoyl] -glutamic acid.
This product can be purified by the process described in Example 1.
<I> Example </I> The reaction of the previous example can also be carried out by dissolving it. 2,4,5-tri-amino-6-hy droxypy rimidine and p-amino-benzoylglutamic acid in water and slowly adding the α, α, 1-tribromopropionaldehyde in alcohol.
We keep the fold at 4 by adding caustic soda, when necessary, that is. determined using a glass electrode bend measuring device. The crude reaction product also contains a substantial amount of N- [4-1 [(2 - amino- 4 -liydroxy- 6 -pterid @ -1) -methyl] amino} -benzoyl] -glutamic acid. .