CA3124605A1 - Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe - Google Patents
Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe Download PDFInfo
- Publication number
- CA3124605A1 CA3124605A1 CA3124605A CA3124605A CA3124605A1 CA 3124605 A1 CA3124605 A1 CA 3124605A1 CA 3124605 A CA3124605 A CA 3124605A CA 3124605 A CA3124605 A CA 3124605A CA 3124605 A1 CA3124605 A1 CA 3124605A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- cells
- container
- vesicles
- extracellular
- liquid medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 84
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 167
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 117
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 79
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 60
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 42
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 35
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 34
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 33
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 claims description 32
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 31
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 6
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 claims description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 5
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 305
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 138
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 52
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 42
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 42
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 22
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 14
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 11
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 9
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 9
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 101001074035 Homo sapiens Zinc finger protein GLI2 Proteins 0.000 description 8
- 102100035558 Zinc finger protein GLI2 Human genes 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 7
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000002281 Adenylate kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020000543 Adenylate kinase Proteins 0.000 description 4
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000021715 photosynthesis, light harvesting Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 2
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 2
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 2
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000891 luminescent agent Substances 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 2-[(E)-N-[2-(4-chlorophenoxy)propoxy]-C-propylcarbonimidoyl]-3-hydroxy-5-(thian-3-yl)cyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCC\C(=N/OCC(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1)C1=C(O)CC(CC1=O)C1CCCSC1 KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 0.000 description 1
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001649012 Cypselea humifusa Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100010166 Mus musculus Dok3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004320 controlled atmosphere Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- HOMBCMTVOCZMMX-UHFFFAOYSA-N panal Natural products CC1CC(=O)C(C2C=C(CC(O)C12)C(=O)O)C(=C)C=O HOMBCMTVOCZMMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/42—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of agitation speed
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/34—Internal compartments or partitions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0635—B lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
- A61K49/0097—Cells, viruses, ghosts, red blood cells, viral vectors, used for imaging or diagnosis in vivo
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
L'invention concerne un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de G agitateur, l'agitateur et la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 µm.
Description
2 PCT/FR2019/053309 SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VÉSICULES
EXTRACELLULAIRES ET PROCÉDÉ ASSOCIÉ
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires.
L'invention se rapporte plus précisément à un système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, un procédé
de production et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d'intérêt comme vecteurs d'agent thérapeutiques et/ou d'imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d'un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain.
Elles présentent d'abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire.
Elles peuvent également intemaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à
la fois d'imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasm.e cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre .. différentes cellules.
En particulier, l'utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l'utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires.
A cet effet, Piffoux et al. (Piffoux, M., Silva, A. K., Lugagne, J. B., Hersen, P., Wilhelm, C., & Gazeau, F., 2017, Extracellular Vesicle Production Loaded with Nanoparticles and Drugs in a Trade-off between Loading, Yield and Purity: Towards a Personalized Drug Deliver), System, Advanced Biosystems) décrivent la comparaison de différentes méthodes de production de vésicules extracellulaires.
Une première méthode consiste à produire des vésicules extracellulaires à
partir de cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC), en soumettant ces cellules à des contraintes hydrodynamiques mimant les contraintes exercées dans des conditions physiologiques au sein des capillaires sanguins ou dans des conditions pathologiques lors de sténose des vaisseaux sanguins. Ces contraintes sont entraînées par le passage des cellules productrices dans des canaux microfluidiques. Une puce microfluidique comprend deux cents canaux dans lesquels les cellules sont transportées dans un écoulement laminaire, pour produire des vésicules de manière parallélisée.
Toutefois, cette méthode présente des problèmes de dimensionnement : les quantités de vésicules produites par une puce microfluidique ne sont pas adaptées aux quantités requises pour les applications susmentionnées. De plus, le rendem.ent de vésicules extracellulaires produites par cellule introduite dans une telle puce (environ 2.104 vésicules par cellule) est très inférieur au rendement théorique maximum de vésicules produites par une cellule, par exemple de l'ordre de 3,5.106 vésicules par cellule pour une cellule de type MSC (acronyme de cellule souche m.ésench.ym.ateuse en anglais). Enfin, cette méthode nécessite une conformité aux normes dite G.M.P. (acronyme anglais de Bonnes Pratiques de Fabrication), nécessaires à la fabrication de médicaments.
Une deuxième méthode couramment utilisée dans la littérature et décrite par Piffoux et al. consiste à cultiver des HUVEC dans un milieu de culture de type DMEM
(acronyme anglais de Dulbecco 's Modeied Eagle's Medium) sans sérum, pendant trois jours (technique dite de starvation en anglais, ou carence en sérum). L'absence de sérum entraîne un stress cellulaire déclenchant une libération de vésicules par les cellules
EXTRACELLULAIRES ET PROCÉDÉ ASSOCIÉ
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires.
L'invention se rapporte plus précisément à un système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, un procédé
de production et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d'intérêt comme vecteurs d'agent thérapeutiques et/ou d'imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d'un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain.
Elles présentent d'abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire.
Elles peuvent également intemaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à
la fois d'imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasm.e cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre .. différentes cellules.
En particulier, l'utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l'utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires.
A cet effet, Piffoux et al. (Piffoux, M., Silva, A. K., Lugagne, J. B., Hersen, P., Wilhelm, C., & Gazeau, F., 2017, Extracellular Vesicle Production Loaded with Nanoparticles and Drugs in a Trade-off between Loading, Yield and Purity: Towards a Personalized Drug Deliver), System, Advanced Biosystems) décrivent la comparaison de différentes méthodes de production de vésicules extracellulaires.
Une première méthode consiste à produire des vésicules extracellulaires à
partir de cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC), en soumettant ces cellules à des contraintes hydrodynamiques mimant les contraintes exercées dans des conditions physiologiques au sein des capillaires sanguins ou dans des conditions pathologiques lors de sténose des vaisseaux sanguins. Ces contraintes sont entraînées par le passage des cellules productrices dans des canaux microfluidiques. Une puce microfluidique comprend deux cents canaux dans lesquels les cellules sont transportées dans un écoulement laminaire, pour produire des vésicules de manière parallélisée.
Toutefois, cette méthode présente des problèmes de dimensionnement : les quantités de vésicules produites par une puce microfluidique ne sont pas adaptées aux quantités requises pour les applications susmentionnées. De plus, le rendem.ent de vésicules extracellulaires produites par cellule introduite dans une telle puce (environ 2.104 vésicules par cellule) est très inférieur au rendement théorique maximum de vésicules produites par une cellule, par exemple de l'ordre de 3,5.106 vésicules par cellule pour une cellule de type MSC (acronyme de cellule souche m.ésench.ym.ateuse en anglais). Enfin, cette méthode nécessite une conformité aux normes dite G.M.P. (acronyme anglais de Bonnes Pratiques de Fabrication), nécessaires à la fabrication de médicaments.
Une deuxième méthode couramment utilisée dans la littérature et décrite par Piffoux et al. consiste à cultiver des HUVEC dans un milieu de culture de type DMEM
(acronyme anglais de Dulbecco 's Modeied Eagle's Medium) sans sérum, pendant trois jours (technique dite de starvation en anglais, ou carence en sérum). L'absence de sérum entraîne un stress cellulaire déclenchant une libération de vésicules par les cellules
3 productrices. Cette méthode présente un. rendement plus élevé et permet de produire une plus grande quantité de vésicules que la méthode utilisant une puce microfluidique (environ 4.104 vésicules par cellule productrice). Toutefois, le rendement calculé
correspond à une durée de production beaucoup plus longue que la durée de production de la méthode précédente. Cette méthode ne permet pas de produire une quantité
de vésicules extracellulaires suffisante pour les applications susmentionnées.
Enfin, cette méthode ne permet pas de produire des vésicules de manière continue car elle induit la mort des cellules.
Watson et al. (Watson, D. C., Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G., ... & Jones, J. C., 2016, efficient production and enhanced tumor delivety of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) décrivent une méthode de production des vésicules permettant d'augmenter la quantité de vésicules produites. Cette méthode consiste à cultiver des cellules adhérentes de type FIEK293 dans des flasques de culture, puis dans des membranes à fibres creuses (Hollow Fiber Membrane en anglais).
Le passage central des fibres creuses permet d'acheminer le milieu de culture aux cellules productrices. Les cellules productrices sont au préalable ensemencées autour de ce passage, où elles produisent des vésicules dans un espace inter-fibre. Le milieu liquide compris dans l'espace inter-fibre est collecté trois fois par semaine, permettant de produire environ 3.10' vésicules en plusieurs semaines, pour des quantités de cellules ensemencées très grandes, par exemple de l'ordre de 5.108 cellules, entraînant un rendement d'environ 6000 vésicules extracellulaires par cellule et un ratio de pureté très bas (par exem.ple 1,09.1e particules par m.icrogramme de protéines). Cette production n'est toutefois pas assez élevée et trop lente au regard des applications susmentionnées.
De plus, cette méthode est décrite en util.isant des cellules productrices correspondant à
une lignée cellulaire particulièrement résistante à la culture en milieu dépourvu en sérum : cette méthode peut ne pas être transposable à une production de vésicul.es par des cellul.es productrices telles que des cellules souches, par exemple humaines, moins résistantes et particulièrement appropriées aux applications thérapeutiques visées.
Il est également bien connu de l'homme du métier que la culture de cellules en suspension en 3 dimensions (3D) nécessite d'utiliser une méthode à faible agitation afin de ne pas
correspond à une durée de production beaucoup plus longue que la durée de production de la méthode précédente. Cette méthode ne permet pas de produire une quantité
de vésicules extracellulaires suffisante pour les applications susmentionnées.
Enfin, cette méthode ne permet pas de produire des vésicules de manière continue car elle induit la mort des cellules.
Watson et al. (Watson, D. C., Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G., ... & Jones, J. C., 2016, efficient production and enhanced tumor delivety of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) décrivent une méthode de production des vésicules permettant d'augmenter la quantité de vésicules produites. Cette méthode consiste à cultiver des cellules adhérentes de type FIEK293 dans des flasques de culture, puis dans des membranes à fibres creuses (Hollow Fiber Membrane en anglais).
Le passage central des fibres creuses permet d'acheminer le milieu de culture aux cellules productrices. Les cellules productrices sont au préalable ensemencées autour de ce passage, où elles produisent des vésicules dans un espace inter-fibre. Le milieu liquide compris dans l'espace inter-fibre est collecté trois fois par semaine, permettant de produire environ 3.10' vésicules en plusieurs semaines, pour des quantités de cellules ensemencées très grandes, par exemple de l'ordre de 5.108 cellules, entraînant un rendement d'environ 6000 vésicules extracellulaires par cellule et un ratio de pureté très bas (par exem.ple 1,09.1e particules par m.icrogramme de protéines). Cette production n'est toutefois pas assez élevée et trop lente au regard des applications susmentionnées.
De plus, cette méthode est décrite en util.isant des cellules productrices correspondant à
une lignée cellulaire particulièrement résistante à la culture en milieu dépourvu en sérum : cette méthode peut ne pas être transposable à une production de vésicul.es par des cellul.es productrices telles que des cellules souches, par exemple humaines, moins résistantes et particulièrement appropriées aux applications thérapeutiques visées.
Il est également bien connu de l'homme du métier que la culture de cellules en suspension en 3 dimensions (3D) nécessite d'utiliser une méthode à faible agitation afin de ne pas
4 induire la mort des cellules qu'on cherche à cultiver. 11 est notamment connu de 1 'homm.e du métier que la longueur de Kolmogorov est un critère qui permet d'évaluer la turbulence créée par l'action de mélange et de déterminer quand la turbulence est excessive pour une culture 3D.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
De façon surprenante et inattendue et contrairement aux idées communément acceptées dans le domaine de la culture de cellules à 3D, les inventeurs ont découvert que la génération d'un écoulement turbulent dans le milieu de culture permet d'obtenir une production rapide de vésicules en grande quantité et d'obtenir leur chargement.
Ainsi, un but de l'invention est de proposer une solution pour produire rapidement des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement qu'avec les méthodes connues, dans des conditions conformes ou pouvant être rendues conformes aux normes G.M.P. Un autre but de l'invention est de proposer une solution permettant d'augmenter le rendement du système de production de vésicules, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules produites et le nombre de cellules productrices introduites dans le système de production. Un autre but de l'invention est de proposer un système adapté à produire des vésicules extracellulaires à partir d'une large gamme de cellules productrices en suspension, quelle que soit la résistance du type de cellule introduite dans le systèm.e de production et résistante ou non à une carence en sérum. Selon un autre aspect de l'invention, les cellules productrices en suspension sont d'origine humaine, animale, végétale ou provenant des bactéries ou d'autres micro-organismes. Un autre but de l'invention est de proposer une solution pour produire et récupérer des vésicules extracellulaires en. continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l'invention est de simplifier la structure du système fluidique pour la production de vésicules et de réduire son coût de fabrication. Un des buts de l'invention est encore l'utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l'invention, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention. Alternativement, un autre but de l'invention est de proposer une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d'au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie. Un des buts de l'invention est encore l'utilisation des vésicules extracellulaires chargées avec au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
De façon surprenante et inattendue et contrairement aux idées communément acceptées dans le domaine de la culture de cellules à 3D, les inventeurs ont découvert que la génération d'un écoulement turbulent dans le milieu de culture permet d'obtenir une production rapide de vésicules en grande quantité et d'obtenir leur chargement.
Ainsi, un but de l'invention est de proposer une solution pour produire rapidement des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement qu'avec les méthodes connues, dans des conditions conformes ou pouvant être rendues conformes aux normes G.M.P. Un autre but de l'invention est de proposer une solution permettant d'augmenter le rendement du système de production de vésicules, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules produites et le nombre de cellules productrices introduites dans le système de production. Un autre but de l'invention est de proposer un système adapté à produire des vésicules extracellulaires à partir d'une large gamme de cellules productrices en suspension, quelle que soit la résistance du type de cellule introduite dans le systèm.e de production et résistante ou non à une carence en sérum. Selon un autre aspect de l'invention, les cellules productrices en suspension sont d'origine humaine, animale, végétale ou provenant des bactéries ou d'autres micro-organismes. Un autre but de l'invention est de proposer une solution pour produire et récupérer des vésicules extracellulaires en. continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l'invention est de simplifier la structure du système fluidique pour la production de vésicules et de réduire son coût de fabrication. Un des buts de l'invention est encore l'utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l'invention, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention. Alternativement, un autre but de l'invention est de proposer une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d'au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie. Un des buts de l'invention est encore l'utilisation des vésicules extracellulaires chargées avec au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou
5 .. d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à
partir de cellules productrices selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé
en ce qu'il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur et un agitateur dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de .. cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 lm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 gm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 m. Selon un mode de réalisation, la longueur de Kolmogorov est de 5 à 50 gm, préférentiellement de 5 à 41 p,m, plus préférentiellement de 5 à 35 lm, encore plus préférentiellement de 10 à 35 gm.
Autrement exprimé, un objet de l'invention est un systèm.e fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de .. la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de l'agitateur, l'agitateur et la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires .. (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à
50 pm,
partir de cellules productrices selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé
en ce qu'il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur et un agitateur dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de .. cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 lm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 gm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 m. Selon un mode de réalisation, la longueur de Kolmogorov est de 5 à 50 gm, préférentiellement de 5 à 41 p,m, plus préférentiellement de 5 à 35 lm, encore plus préférentiellement de 10 à 35 gm.
Autrement exprimé, un objet de l'invention est un systèm.e fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de .. la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de l'agitateur, l'agitateur et la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires .. (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à
50 pm,
6 préférentiellement inférieure ou égale à 40 itm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 m. Selon un mode de réalisation, la longueur de Kolmogorov est de 5 à 50 gm, préférentiellement de 5 à 41 p.m, préférentiellement de 10 à 41 i.im, plus préférentiellement de 5 à 35 m, encore plus préférentiellement de 10 à 35 m.
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules humaines, préférentiellement des cellules humaines saines.
Alternativement, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules pathologiques, par exemple des cellules cancéreuses telles que des cellules HeLa.
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules animales, de préférence des cellules murines, par exemple des cellules MSC murines (cellules souches mésenchymateuses murines).
Selon une caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules non-adhérentes.
Selon une autre caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules adhérentes détachées de leur support de culture, par exemple par traitement approprié, par exemple enzymatique, par exemple chimique ou par exemple mécanique ou une combinaison de ces moyens.
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules souches notamment des cellules souches pluripotentes induites, des cellules multipotentes par exemple des cellules mésenchymateuses multipotentes, des cellules génétiquement modifiées ou des cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC).
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules souches notamment des cellules souches pluripotentes induites, des cellules multipotentes par exemple des cellules mésenchymateuses multipotentes, des cellules génétiquement modifiées ou des cellules
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules humaines, préférentiellement des cellules humaines saines.
Alternativement, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules pathologiques, par exemple des cellules cancéreuses telles que des cellules HeLa.
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules animales, de préférence des cellules murines, par exemple des cellules MSC murines (cellules souches mésenchymateuses murines).
Selon une caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules non-adhérentes.
Selon une autre caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules adhérentes détachées de leur support de culture, par exemple par traitement approprié, par exemple enzymatique, par exemple chimique ou par exemple mécanique ou une combinaison de ces moyens.
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules souches notamment des cellules souches pluripotentes induites, des cellules multipotentes par exemple des cellules mésenchymateuses multipotentes, des cellules génétiquement modifiées ou des cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC).
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules souches notamment des cellules souches pluripotentes induites, des cellules multipotentes par exemple des cellules mésenchymateuses multipotentes, des cellules génétiquement modifiées ou des cellules
7 endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC) ou des cellules primaires en général.
Selon un autre mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules de lignée cellulaire, préférentiellement de lignée humaine de monocytes ou de lignée humaine de cellules d'origine hématopoïétique dérivées de lymphocytes B, plus préférentiellement il s'agit de cellules THP-1 ou de cellules de Raji.
Selon un autre mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules primaires, par exemple des globules rouges.
Selon une caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées, par exemple par administration ou par utilisation ex vivo.
Selon une autre caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules ne provenant pas du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées, par exemple par administration ou par utilisation ex vivo. Selon une caractéristique plus préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant de la même espèce que l'espèce du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées.
Alternativement, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant d'une espèce différente de l'espèce du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées.
Selon une caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 50 000 et cellules productrices par litre de milieu liquide, de préférence entre 50 000 000 et 500 000 000 cellules productrices par litre, préférentiellement entre 50 000 000 et 300 000 000 par litre, plus préférentiellement entre 200 000 000 et 300 000 000 par litre, encore plus préférentiellement environ 250 000 000 par litre dudit milieu liquide. Selon
Selon un autre mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules de lignée cellulaire, préférentiellement de lignée humaine de monocytes ou de lignée humaine de cellules d'origine hématopoïétique dérivées de lymphocytes B, plus préférentiellement il s'agit de cellules THP-1 ou de cellules de Raji.
Selon un autre mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules primaires, par exemple des globules rouges.
Selon une caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées, par exemple par administration ou par utilisation ex vivo.
Selon une autre caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules ne provenant pas du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées, par exemple par administration ou par utilisation ex vivo. Selon une caractéristique plus préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant de la même espèce que l'espèce du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées.
Alternativement, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant d'une espèce différente de l'espèce du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées.
Selon une caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 50 000 et cellules productrices par litre de milieu liquide, de préférence entre 50 000 000 et 500 000 000 cellules productrices par litre, préférentiellement entre 50 000 000 et 300 000 000 par litre, plus préférentiellement entre 200 000 000 et 300 000 000 par litre, encore plus préférentiellement environ 250 000 000 par litre dudit milieu liquide. Selon
8 une autre caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 100 000 et 250 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide.
Selon une caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 50 000 et 900 000 000 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide, de préférence entre 50 000 000 et 100 000 000 000 000 cellules productrices par litre, préférentiellement entre 50 000 000 et 10 000 000 000 000 par litre, encore plus préférentiellement entre 200 000 000 et 1 000 000 000 000 par litre. Selon une autre caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 100 000 000 et 1 000 000 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide.
En particulier, un objet de l'invention est constitué par les vésicules produites par le système fluidique selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l'invention pour agir sur des cellules.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l'invention à des fins d'imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
Selon un mode de réalisation, la durée de l'agitation turbulente à une longueur de Kolmogorov inférieure ou égale à 50 i.tm par exemple de 17 à 35 im, est supérieure ou égale à 15 minutes, préférentiellement d'environ 20 minutes à environ 10 heures, plus préférentiellement d'environ 20 minutes à environ 8 heures, encore plus préférentiellement d'environ 1 heure à environ 6 heures, encore plus préférentiellement entre environ. 2 heures et environ 3 heures, encore plus préférentiellement environ 2 heures ou alternativement environ 3 heures ou alternativement environ 4 heures.
Selon un mode de réalisation, l'agitateur du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est
Selon une caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 50 000 et 900 000 000 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide, de préférence entre 50 000 000 et 100 000 000 000 000 cellules productrices par litre, préférentiellement entre 50 000 000 et 10 000 000 000 000 par litre, encore plus préférentiellement entre 200 000 000 et 1 000 000 000 000 par litre. Selon une autre caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 100 000 000 et 1 000 000 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide.
En particulier, un objet de l'invention est constitué par les vésicules produites par le système fluidique selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l'invention pour agir sur des cellules.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l'invention à des fins d'imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
Selon un mode de réalisation, la durée de l'agitation turbulente à une longueur de Kolmogorov inférieure ou égale à 50 i.tm par exemple de 17 à 35 im, est supérieure ou égale à 15 minutes, préférentiellement d'environ 20 minutes à environ 10 heures, plus préférentiellement d'environ 20 minutes à environ 8 heures, encore plus préférentiellement d'environ 1 heure à environ 6 heures, encore plus préférentiellement entre environ. 2 heures et environ 3 heures, encore plus préférentiellement environ 2 heures ou alternativement environ 3 heures ou alternativement environ 4 heures.
Selon un mode de réalisation, l'agitateur du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est
9 constitué d'une pale. Alternativement, ledit agitateur est constitué de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou plus de 8 pales.
Selon une caractéristique préférée, l'au moins une pale dudit agitateur est une pale verticale.
Selon un mode de réalisation, l'agitateur du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un agitateur du type hélice par exemple marine ou hélice à pales profilées, ou une turbine par exemple turbine de Rushton, ou une ancre d'agitation, ou un agitateur barrière, ou un.e hélice à rubans hélicoïdaux, ou une roue à aubes, ou une roue dentée, ou un agitateur magnétique ou une combinaison de ces agitateurs.
Dans un mode de réalisation, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique.
On comprend qu'avec un tel système, il est possible de produire des vésicules en grande quantité, et dans un système adapté ou qui peut être adapté aux normes G.M.P.
On comprend également qu'un tel système est plus simple et moins coûteux à
fabriquer que les systèmes connus pour produire des vésicules extracellulaires.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- l'agitateur du milieu liquide et les dimensions du récipient sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale 50 rn, et préférentiellement inférieure ou égale à 40 gm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 m.
- le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la conn.ectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires;
-l'agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif ou orbital dont la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ;
5 - le récipient est utilisé ou peut être utilisé en mode discontinu, c'est-à-dire que le liquide contenu dans le récipient est extrait après que les cellules productrices ont produit des vésicules extracellulaires pendant un temps donné.
- le système fluidique comprend un. séparateur de vésicules extracellulaires.
- le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires relié
Selon une caractéristique préférée, l'au moins une pale dudit agitateur est une pale verticale.
Selon un mode de réalisation, l'agitateur du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un agitateur du type hélice par exemple marine ou hélice à pales profilées, ou une turbine par exemple turbine de Rushton, ou une ancre d'agitation, ou un agitateur barrière, ou un.e hélice à rubans hélicoïdaux, ou une roue à aubes, ou une roue dentée, ou un agitateur magnétique ou une combinaison de ces agitateurs.
Dans un mode de réalisation, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique.
On comprend qu'avec un tel système, il est possible de produire des vésicules en grande quantité, et dans un système adapté ou qui peut être adapté aux normes G.M.P.
On comprend également qu'un tel système est plus simple et moins coûteux à
fabriquer que les systèmes connus pour produire des vésicules extracellulaires.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- l'agitateur du milieu liquide et les dimensions du récipient sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale 50 rn, et préférentiellement inférieure ou égale à 40 gm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 m.
- le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la conn.ectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires;
-l'agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif ou orbital dont la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ;
5 - le récipient est utilisé ou peut être utilisé en mode discontinu, c'est-à-dire que le liquide contenu dans le récipient est extrait après que les cellules productrices ont produit des vésicules extracellulaires pendant un temps donné.
- le système fluidique comprend un. séparateur de vésicules extracellulaires.
- le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires relié
10 fluidiquement au récipient de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules extracellulaires (EV).
- Le séparateur est positionné à l'intérieur ou à l'extérieur du récipient, le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri en vésicules grâce à un. séparateur interne au récipient, tandis que les cellules sont maintenues dans le récipient ou le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri, en vésicules grâce à un séparateur extérieur au récipient.
- l'entrée du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient, la sortie du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient de manière à être susceptible d'être réintroduit dans le récipient sous la forme d'un milieu liquide appauvri en vésicules.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation d'une contenance de 100 mi: (par exemple l'appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Belle 505001), comprenant une pale d'un diamètre de 3,8 cm et un volume de travail inférieur à 100 mL.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à
agitation d'une contenance de 100 mL ; selon un autre mode de réalisation, lesdites caractéristiques
- Le séparateur est positionné à l'intérieur ou à l'extérieur du récipient, le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri en vésicules grâce à un. séparateur interne au récipient, tandis que les cellules sont maintenues dans le récipient ou le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri, en vésicules grâce à un séparateur extérieur au récipient.
- l'entrée du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient, la sortie du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient de manière à être susceptible d'être réintroduit dans le récipient sous la forme d'un milieu liquide appauvri en vésicules.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation d'une contenance de 100 mi: (par exemple l'appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Belle 505001), comprenant une pale d'un diamètre de 3,8 cm et un volume de travail inférieur à 100 mL.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à
agitation d'une contenance de 100 mL ; selon un autre mode de réalisation, lesdites caractéristiques
11 structurel les sont toutes augmentées ou diminuées de manière non proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à agitation d'une contenance de 100 mL, notamment lors d'un changement d'échelle.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation d'une contenance de 500 nit (par exemple l'appareil Spinner stirring flask Belle for cell suspensions, référence Belle 505010), comprenant une pale d'un diamètre de 7,6 cm et un volume de travail de 200 mL: à 500 mL, ou une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à
celles mentionnées ci-avant pour la flasque à agitation d'une contenance de 500 mL, ou une flasque à agitation dont lesdites caractéristiques structurelles sont toutes augmentées ou diminuées de manière non proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à agitation d'une contenance de 500 mL, notamment lors d'un changement d'échelle.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation d'une contenance de 1000 mL (par exemple l'appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Belle 505010), comprenant une pale d'un diamètre de 10,8 cm et un volume de travail supérieur ou égal à 300mL et inférieur à IL, ou une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-avant pour la flasque à
agitation d'une contenance de 1000 mL.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur dont le volume de travail est de 400 mL à 1000 mi, et le diamètre de la pale est de 6 cm.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation d'une contenance de 500 nit (par exemple l'appareil Spinner stirring flask Belle for cell suspensions, référence Belle 505010), comprenant une pale d'un diamètre de 7,6 cm et un volume de travail de 200 mL: à 500 mL, ou une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à
celles mentionnées ci-avant pour la flasque à agitation d'une contenance de 500 mL, ou une flasque à agitation dont lesdites caractéristiques structurelles sont toutes augmentées ou diminuées de manière non proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à agitation d'une contenance de 500 mL, notamment lors d'un changement d'échelle.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est une flasque à agitation d'une contenance de 1000 mL (par exemple l'appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Belle 505010), comprenant une pale d'un diamètre de 10,8 cm et un volume de travail supérieur ou égal à 300mL et inférieur à IL, ou une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-avant pour la flasque à
agitation d'une contenance de 1000 mL.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur dont le volume de travail est de 400 mL à 1000 mi, et le diamètre de la pale est de 6 cm.
12 Selon un. autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur dont le volume de travail et le diamètre de la pale sont augmentés ou diminués de manière proportionnelle par rapport aux valeurs respectives de 400 rriL et .. 6 cm.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur avec moyen d'agitation par pale, dont l'homme de l'art peut disposer ou concevoir.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur dont le volume de travail et le diamètre de la pale sont augm.en tés ou diminués de manière non proportionnelle par rapport aux valeurs respectives mentionnées ci-dessus, notamment lors d'un changement d'échelle.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur ou une flasque à agitation dont les caractéristiques géométriques, le volume de travail, le type de mélangeur et ses caractéristiques, et le mode de fonctionnement sont choisis selon des pratiques accessibles par l'homme de l'art.
Un autre objet de l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant :
- un moyen de commande de la vitesse d'un agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, et dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 m., préférentiellement inférieure ou égale à
40 lm dans un. récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant des cellules productrices en suspension, et
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur avec moyen d'agitation par pale, dont l'homme de l'art peut disposer ou concevoir.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur dont le volume de travail et le diamètre de la pale sont augm.en tés ou diminués de manière non proportionnelle par rapport aux valeurs respectives mentionnées ci-dessus, notamment lors d'un changement d'échelle.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention est un bioréacteur ou une flasque à agitation dont les caractéristiques géométriques, le volume de travail, le type de mélangeur et ses caractéristiques, et le mode de fonctionnement sont choisis selon des pratiques accessibles par l'homme de l'art.
Un autre objet de l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant :
- un moyen de commande de la vitesse d'un agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, et dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 m., préférentiellement inférieure ou égale à
40 lm dans un. récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant des cellules productrices en suspension, et
13 - une collecte du mi lieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient.
Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on agite le milieu liquide pendant au moins vingt minutes ;
- on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant ou intermittent, d'intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 pm ;
.. - un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient.
Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- le procédé comprend une étape préalable de chargement d'au moins un. agent thérapeutique et/ou d'imagerie présent dans le milieu liquide.
- l'écoulement du milieu liquide permet de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur des cellules productrices et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient.
L'invention porte ainsi sur un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, comprenant :
(i) l'insertion de cellules productrices dans un récipient comprenant un milieu liquide:
(ii) l'actionnement d'une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm, ledit écoulement permettant de produire les vésicules extracellulaires dans ledit récipient ; et (iii) la collecte du milieu liquide comprenant les vésicules extracellulaires produites à
l'étape (ii).
Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on agite le milieu liquide pendant au moins vingt minutes ;
- on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant ou intermittent, d'intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 pm ;
.. - un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient.
Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- le procédé comprend une étape préalable de chargement d'au moins un. agent thérapeutique et/ou d'imagerie présent dans le milieu liquide.
- l'écoulement du milieu liquide permet de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur des cellules productrices et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient.
L'invention porte ainsi sur un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, comprenant :
(i) l'insertion de cellules productrices dans un récipient comprenant un milieu liquide:
(ii) l'actionnement d'une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm, ledit écoulement permettant de produire les vésicules extracellulaires dans ledit récipient ; et (iii) la collecte du milieu liquide comprenant les vésicules extracellulaires produites à
l'étape (ii).
14 Selon un mode de réalisation, le récipient dans lequel les cellules productrices sont insérées à l'étape (i) est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande.
En particulier, un objet de l'invention est constitué par les vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention pour agir sur des cellules.
En particulier, mi objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention à des fins d'imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
Selon un objet similaire, l'invention est un procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant les étapes suivantes :
- ajouter dans un récipient un milieu liquide comprenant des cellules productrices et au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, - actionner une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 itm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 itm, ledit écoulement permettant de simultanément charger ['au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient, le récipient comprenant une sortie, - collecter le milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient.
Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide, la longueur 5 de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 itm ;
- les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées.
Selon un mode de réalisation, l'au moins un agent d'imagerie médicale est choisi, par 10 exemple parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Les caractéristiques préférées notamment quant au type de cellules productrices, à leur concentration dans le milieu liquide, aux gammes de longueur de Kolmogorov, à
la durée
En particulier, un objet de l'invention est constitué par les vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention pour agir sur des cellules.
En particulier, mi objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention à des fins d'imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
Selon un objet similaire, l'invention est un procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant les étapes suivantes :
- ajouter dans un récipient un milieu liquide comprenant des cellules productrices et au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, - actionner une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 itm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 itm, ledit écoulement permettant de simultanément charger ['au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient, le récipient comprenant une sortie, - collecter le milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient.
Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide, la longueur 5 de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 40 itm ;
- les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées.
Selon un mode de réalisation, l'au moins un agent d'imagerie médicale est choisi, par 10 exemple parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Les caractéristiques préférées notamment quant au type de cellules productrices, à leur concentration dans le milieu liquide, aux gammes de longueur de Kolmogorov, à
la durée
15 .. de l'agitation turbulente à une longueur de Kolmogorov inférieure ou égale à 50 itm par exemple de 5 à 35 itm, et à la contenance, milieu de travail, au type d'agitateur et au diamètre de l'éventuelle au moins une pale du système fluidique, qui sont décrites pour le système fluidique ci-dessus, sont également des caractéristiques préférées des procédés selon l'invention, à savoir le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension et le procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices.
En particulier, un objet de l'invention est constitué par les vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur
En particulier, un objet de l'invention est constitué par les vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l'invention.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur
16 ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l'invention pour agir sur des cellules.
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l'invention à des fins d'imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
L'invention a également pour objet les vésicules extracellulaires produites par le systèm.e de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention.
L'invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires obtenues grâce au procédé de production et de récupération de vésicules extracellulaires selon l'invention.
L'invention porte également sur les vésicules extracellulaires obtenues grâce au procédé
de chargement de vésicules extracellulaires selon l'invention.
L'invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires obtenues par mise en oeuvre du système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou par le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou par le procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande.
Il est bien connu de l'homme du métier que la structure des vésicules extracellulaires varie en fonction des cellules productrices utilisées et en fonction du procédé d'obtention utilisé, notamment en termes de marqueurs membran.aires et constituants présents sur ces vésicules.
Selon un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires selon la présente invention présentent un diamètre moyen compris entre 40 et 300 nm, préférentiellement entre 45 et 90 nm, plus préférentiellement entre 50 et 65 nm, encore plus préférentiellement environ 60 nm, ledit diamètre moyen des vésicules extracellulaires étant mesuré par une méthode
En particulier, un objet de l'invention est l'utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l'invention à des fins d'imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
L'invention a également pour objet les vésicules extracellulaires produites par le systèm.e de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention.
L'invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires obtenues grâce au procédé de production et de récupération de vésicules extracellulaires selon l'invention.
L'invention porte également sur les vésicules extracellulaires obtenues grâce au procédé
de chargement de vésicules extracellulaires selon l'invention.
L'invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires obtenues par mise en oeuvre du système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou par le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou par le procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande.
Il est bien connu de l'homme du métier que la structure des vésicules extracellulaires varie en fonction des cellules productrices utilisées et en fonction du procédé d'obtention utilisé, notamment en termes de marqueurs membran.aires et constituants présents sur ces vésicules.
Selon un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires selon la présente invention présentent un diamètre moyen compris entre 40 et 300 nm, préférentiellement entre 45 et 90 nm, plus préférentiellement entre 50 et 65 nm, encore plus préférentiellement environ 60 nm, ledit diamètre moyen des vésicules extracellulaires étant mesuré par une méthode
17 d'interférom.étrie en combinaison ou non avec de la fluorescence, de préférence ledit diamètre moyen est mesuré grâce à l'appareil ExoViewTM R100 commercialisé par l'entreprise NanoView Bioscience.
Selon un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires selon la présente invention présentent un diamètre moyen compris entre 50 et 500 nm, préférentiellement entre 100 et 110 nm, plus préférentiellement entre 105 et 109 nm, encore plus préférentiellement environ 106 nm ou alternativement environ 108 nm, ledit diamètre moyen des vésicules extracellulaires étant mesuré par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA pour Nanoparticle Tracking An.alysis) par exemple avec l'appareil NanoSight NS300 commercialisé par l'entreprise Malvem Panalytical.
Avantageusement, lesdites vésicules extracellulaires présentent des marqueurs membran.aires CD81, CD63, et/ou CD9 tel que décrit dans la figure 11. Plus avantageusement, lesdites vésicules extracellulaires expriment les marqueurs CD81 et/ou CD63. Les vésicules extracellulaires produites à partir du système fluidique selon l'invention et/ou selon le procédé selon l'invention peuvent être refroidies à
une température souhaitée, par exemple environ 4 degrés centigrades, ou encore elles peuvent être congelées si on le souhaite pour un transport.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique etiou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, en tant que vecteur pour l'administration d'au moins un agent d'imagerie médicale, par exemple pour réaliser une imagerie médicale. Selon un mode de réalisation, l'au moins un agent d'imagerie médicale est choisi, par exemple, parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires selon la présente invention présentent un diamètre moyen compris entre 50 et 500 nm, préférentiellement entre 100 et 110 nm, plus préférentiellement entre 105 et 109 nm, encore plus préférentiellement environ 106 nm ou alternativement environ 108 nm, ledit diamètre moyen des vésicules extracellulaires étant mesuré par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA pour Nanoparticle Tracking An.alysis) par exemple avec l'appareil NanoSight NS300 commercialisé par l'entreprise Malvem Panalytical.
Avantageusement, lesdites vésicules extracellulaires présentent des marqueurs membran.aires CD81, CD63, et/ou CD9 tel que décrit dans la figure 11. Plus avantageusement, lesdites vésicules extracellulaires expriment les marqueurs CD81 et/ou CD63. Les vésicules extracellulaires produites à partir du système fluidique selon l'invention et/ou selon le procédé selon l'invention peuvent être refroidies à
une température souhaitée, par exemple environ 4 degrés centigrades, ou encore elles peuvent être congelées si on le souhaite pour un transport.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique etiou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, en tant que vecteur pour l'administration d'au moins un agent d'imagerie médicale, par exemple pour réaliser une imagerie médicale. Selon un mode de réalisation, l'au moins un agent d'imagerie médicale est choisi, par exemple, parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
18 La présente invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique etiou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, pour leur utilisation thérapeutique.
La présente invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, pour leur utilisation en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteur pour délivrer au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie et/ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
La présente invention porte aussi sur une méthode de traitement en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en. tant que vecteurs d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et/ou de traitement de tumeurs, de m.aladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes, impliquant l'administration à un sujet en ayant besoin de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules
La présente invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, pour leur utilisation en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteur pour délivrer au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie et/ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
La présente invention porte aussi sur une méthode de traitement en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en. tant que vecteurs d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et/ou de traitement de tumeurs, de m.aladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes, impliquant l'administration à un sujet en ayant besoin de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules
19 extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande.
La présente invention porte aussi sur l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, en vue de la fabrication d'un médicament utilisé en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteur d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et/ou utilisé
dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
Selon un mode de réalisation, l'utilisation thérapeutique des vésicules extracellulaires, les vésicules extracellulaires pour leur utilisation thérapeutique, les méthodes de traitement ou l'utilisation des vésicules extracellulaires pour leur utilisation en vue de la fabrication d'un médicament, telles que décrites ci-dessus, implique l'administration et/ou l'utilisation ex vivo desdites vésicules extracellulaires. L'administration peut par exemple être parentérale ou en.téral.e, telles qu'une administration injectable (notamment intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrarachidienne...), orale buccale, cutanée, locale, vaginale, rectale, oculaire, auriculaire, etc.
Selon une caractéristique préférée, l'invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à
partir de cellules productrices TUP-I ou de lymphocytes, pour leur utilisation par exemple en immunothérapie et/ou cancérologie.
Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues 5 à partir de cellules productrices qui sont des cellules souches mésenchymateuses (MSC), pour leur utilisation en médecine régénérative ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
10 Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellules ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent thérapeutique, pour leur utilisation pour délivrer ['au moins un agent thérapeutique dans le corps d'un sujet.
15 Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur l'utilisation des vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellules ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent d'imagerie, pour réaliser un examen d'imagerie médicale.
Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur l'utilisation des vésicules
La présente invention porte aussi sur l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l'invention tel que décrit dans la présente demande, en vue de la fabrication d'un médicament utilisé en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteur d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et/ou utilisé
dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
Selon un mode de réalisation, l'utilisation thérapeutique des vésicules extracellulaires, les vésicules extracellulaires pour leur utilisation thérapeutique, les méthodes de traitement ou l'utilisation des vésicules extracellulaires pour leur utilisation en vue de la fabrication d'un médicament, telles que décrites ci-dessus, implique l'administration et/ou l'utilisation ex vivo desdites vésicules extracellulaires. L'administration peut par exemple être parentérale ou en.téral.e, telles qu'une administration injectable (notamment intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrarachidienne...), orale buccale, cutanée, locale, vaginale, rectale, oculaire, auriculaire, etc.
Selon une caractéristique préférée, l'invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à
partir de cellules productrices TUP-I ou de lymphocytes, pour leur utilisation par exemple en immunothérapie et/ou cancérologie.
Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues 5 à partir de cellules productrices qui sont des cellules souches mésenchymateuses (MSC), pour leur utilisation en médecine régénérative ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
10 Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellules ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent thérapeutique, pour leur utilisation pour délivrer ['au moins un agent thérapeutique dans le corps d'un sujet.
15 Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur l'utilisation des vésicules extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellules ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent d'imagerie, pour réaliser un examen d'imagerie médicale.
Selon une autre caractéristique préférée, l'invention porte sur l'utilisation des vésicules
20 extracellulaires selon l'invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellule ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent thérapeutique et au moins un agent d'imagerie, pour réaliser le suivi de la distribution desdites vésicules extracellulaires dans le corps d'un sujet par imagerie médicale et délivrer l'au moins un agent thérapeutique dans le corps dudit sujet.
DÉFINITIONS
Le terme vésicule extracel.lulaire désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm
DÉFINITIONS
Le terme vésicule extracel.lulaire désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm
21 et 5000 nm. Une vésicule extracellulai.re correspond en particulier à un exosotne et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire.
Le terme cellule productrice en suspension désigne de manière générale une cellule qui n'est pas adhérente sur un milieu et peut se diviser et se multiplier.
Selon un autre aspect de l'invention, le terme cellules productrices en suspension désigne des cellules humaines, d'origine animale ou végétale, des bactéries ou autres micro-organismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Selon un autre aspect de l'invention, le terme cellules productrices en suspension désigne des cellules adhérentes détachées de leur support de culture et mises en suspension. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de l'invention, le terme cellules productrices en suspension désigne des agrégats cellulaires. Le terme agrégats cellulaires désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices en suspension qui adhèrent entre elles. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.
Le terme agent thérapeutique ou agent d'imagerie désigne de manière générale tout agent, molécule ou particule, composé d'intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur etlou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques, etc. Ainsi, l'au moins un agent d'imagerie médicale selon la présente invention peut avantageusement être choisi parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Le terme agitateur doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d'un moyen ou d'une combinaison de moyens permettant par action sur le liquide de .. générer au moins un écoulement, de favoriser le mélange du liquide ou de générer de la turbulence dans ce liquide.
Le terme cellule productrice en suspension désigne de manière générale une cellule qui n'est pas adhérente sur un milieu et peut se diviser et se multiplier.
Selon un autre aspect de l'invention, le terme cellules productrices en suspension désigne des cellules humaines, d'origine animale ou végétale, des bactéries ou autres micro-organismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Selon un autre aspect de l'invention, le terme cellules productrices en suspension désigne des cellules adhérentes détachées de leur support de culture et mises en suspension. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de l'invention, le terme cellules productrices en suspension désigne des agrégats cellulaires. Le terme agrégats cellulaires désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices en suspension qui adhèrent entre elles. Un mélange doux créé par l'agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.
Le terme agent thérapeutique ou agent d'imagerie désigne de manière générale tout agent, molécule ou particule, composé d'intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur etlou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques, etc. Ainsi, l'au moins un agent d'imagerie médicale selon la présente invention peut avantageusement être choisi parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Le terme agitateur doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d'un moyen ou d'une combinaison de moyens permettant par action sur le liquide de .. générer au moins un écoulement, de favoriser le mélange du liquide ou de générer de la turbulence dans ce liquide.
22 Le terme environ , placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.
Le terme cellule désigne la plus petite unité structurale et fonctionnelle fondamentale des organismes vivants, constituée d'un protoplasme ou cytoplasme, séparée du milieu externe par une membrane. Dans le cadre de la présente invention, le terme cellule englobe aussi les globules rouges et les plaquettes.
Le terme cellules saines désigne des cellules issues de tissus sains, par opposition à
des cellules issues de tissus ou organes pathologiques c'est-à-dire dont les fonctions sont altérées.
Le terme entre X et Y concerne la gamme de valeurs comprises entre X et Y, les bornes X et Y étant incluses dans ladite gamme.
Le terme immunothérapie désigne le traitement d'une maladie par une intervention sur le système immunitaire.
Le terme médecine régénérative désigne l'ensemble des méthodes biomédicales utilisées pour le remplacement ou la régénération de tissus ou organes humains dans un but thérapeutique.
Le terme sujet désigne un animal, y compris un être humain, masculin ou féminin, quel que soit l'âge. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, à savoir une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie.
Le terme thérapie cellulaire désigne l'utilisation chez l'homme de cellules somatiques vivantes, manipulées ou modifiées en leurs caractéristiques biologiques, pour prévenir, traiter, ou atténuer certaines pathologies.
PRÉSENTATION DES FIGURES
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement ill.ustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles :
Le terme cellule désigne la plus petite unité structurale et fonctionnelle fondamentale des organismes vivants, constituée d'un protoplasme ou cytoplasme, séparée du milieu externe par une membrane. Dans le cadre de la présente invention, le terme cellule englobe aussi les globules rouges et les plaquettes.
Le terme cellules saines désigne des cellules issues de tissus sains, par opposition à
des cellules issues de tissus ou organes pathologiques c'est-à-dire dont les fonctions sont altérées.
Le terme entre X et Y concerne la gamme de valeurs comprises entre X et Y, les bornes X et Y étant incluses dans ladite gamme.
Le terme immunothérapie désigne le traitement d'une maladie par une intervention sur le système immunitaire.
Le terme médecine régénérative désigne l'ensemble des méthodes biomédicales utilisées pour le remplacement ou la régénération de tissus ou organes humains dans un but thérapeutique.
Le terme sujet désigne un animal, y compris un être humain, masculin ou féminin, quel que soit l'âge. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, à savoir une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie.
Le terme thérapie cellulaire désigne l'utilisation chez l'homme de cellules somatiques vivantes, manipulées ou modifiées en leurs caractéristiques biologiques, pour prévenir, traiter, ou atténuer certaines pathologies.
PRÉSENTATION DES FIGURES
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement ill.ustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles :
23 [Fig. 1] illustre schématiquement un système fluidique pour la production de vésicules extracellulaires;
[Fig. 2] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes intensités d'agitations ;
[Fig. 3] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 après 3 heures d'agitation pour différentes intensités d'agitations ;
[Fig. 4] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ;
[Fig. 5] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique pour les agitations 200 RPM et 300 RPM en fonction du temps ;
[Fig. 6] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules C3H/10T1/2 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ;
[Fig. 7] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules de Raji et des cellules HeLa soit dans un système fluidique après 3 heures d'agitation turbulente (pour les cellules HeLa l'agitation est de 250 RPM et longueur de Kolmogorov de 41 p.m et pour les cellules de Raji l'agitation est de 500 RPM et longueur de Kolmogorov est de
[Fig. 2] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes intensités d'agitations ;
[Fig. 3] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 après 3 heures d'agitation pour différentes intensités d'agitations ;
[Fig. 4] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ;
[Fig. 5] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique pour les agitations 200 RPM et 300 RPM en fonction du temps ;
[Fig. 6] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules C3H/10T1/2 dans un système fluidique après 20 minutes d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ;
[Fig. 7] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules de Raji et des cellules HeLa soit dans un système fluidique après 3 heures d'agitation turbulente (pour les cellules HeLa l'agitation est de 250 RPM et longueur de Kolmogorov de 41 p.m et pour les cellules de Raji l'agitation est de 500 RPM et longueur de Kolmogorov est de
24 itm) soit en conditions de carence ;
[Fig. 8] illustre en 8a) le nombre de cellules de Raji viables avant et après soit une agitation turbulente de 3 heures (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 m), soit des conditions de carence. En 8b) est illustré le pourcentage d'adénylate kinase dans le surnageant de l'essai contrôle, de l'essai en carence 2D 72h et de l'essai selon l'invention ;
[Fig. 9] illustre l'aspect des cellules productrices de Raji entre après 3 heures dans l'essai contrôle et après 3 heures d'agitation turbulente (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 gm), par observation au microscope optique ;
[Fig. 10] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP-1 en carence 3D ou en carence 2D pour différents temps ;
[Fig. 11] illustre la distribution de taille de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1, Hel,a ou de Raji, en conditions de carence ou de turbulence (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 gm), mesurée par NTA ;
[Fig. 12] illustre la distribution de taille de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1 en conditions de carence pendant 72 h ou de turbulence pendant 3 heures (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 itm), mesurée par l'ExoViewTM R100;
[Fig. 13] illustre l'analyse des marqueurs membranaires de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1 en conditions de carence ou de turbulence (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 m), mesurée par l'ExoViewTM R100 ;
[Fig. 14] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des globules rouges après 2 heures d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov (18,6 i.tm pour la figure du haut et 10,9 pm pour la figure du bas versus un contrôle sans agitation) ; et [Fig. 15] illustre le chargement de vésicules extracellulaires en doxorubicine à partir de cellules productrices THP-1 via un chargement passif (incubation avec la doxorubicine à
10 j.IM à 34 RPM avec longueur de Kolmogorov de 181 ium pendant 2h, suivie des lavages puis agitation à 2h à 400RPM avec longueur de Kolmogorov 28 pin) ou bien via un chargement et production en présence d'une agitation turbulente (pendant 2h à
avec longueur de Kolmogorov de 28 1.1m avec la doxorubicine à 10 }LM) suivie des lavages.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Eléments théoriques La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d'eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d'un fluide permet de dissiper l'énergie cinétique 5 d'un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur Li( est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) et décrite par la 10 formule (I) suivante :
[Math 1] Lk = v3/ . e-1/ (I) dans laquelle y est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et s est le taux moyen de dissipation d'énergie dans le fluide par unité de masse (ou taux d'injection d'énergie dans le fluide).
15 Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre c moyen et la géométrie d'un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (II) suivante :
P
20 [Math 2] e =ND5N3 . = (II) dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné
de l'agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l'agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de s moyen correspondant à la
[Fig. 8] illustre en 8a) le nombre de cellules de Raji viables avant et après soit une agitation turbulente de 3 heures (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 m), soit des conditions de carence. En 8b) est illustré le pourcentage d'adénylate kinase dans le surnageant de l'essai contrôle, de l'essai en carence 2D 72h et de l'essai selon l'invention ;
[Fig. 9] illustre l'aspect des cellules productrices de Raji entre après 3 heures dans l'essai contrôle et après 3 heures d'agitation turbulente (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 gm), par observation au microscope optique ;
[Fig. 10] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP-1 en carence 3D ou en carence 2D pour différents temps ;
[Fig. 11] illustre la distribution de taille de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1, Hel,a ou de Raji, en conditions de carence ou de turbulence (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 gm), mesurée par NTA ;
[Fig. 12] illustre la distribution de taille de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1 en conditions de carence pendant 72 h ou de turbulence pendant 3 heures (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 itm), mesurée par l'ExoViewTM R100;
[Fig. 13] illustre l'analyse des marqueurs membranaires de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1 en conditions de carence ou de turbulence (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 m), mesurée par l'ExoViewTM R100 ;
[Fig. 14] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des globules rouges après 2 heures d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov (18,6 i.tm pour la figure du haut et 10,9 pm pour la figure du bas versus un contrôle sans agitation) ; et [Fig. 15] illustre le chargement de vésicules extracellulaires en doxorubicine à partir de cellules productrices THP-1 via un chargement passif (incubation avec la doxorubicine à
10 j.IM à 34 RPM avec longueur de Kolmogorov de 181 ium pendant 2h, suivie des lavages puis agitation à 2h à 400RPM avec longueur de Kolmogorov 28 pin) ou bien via un chargement et production en présence d'une agitation turbulente (pendant 2h à
avec longueur de Kolmogorov de 28 1.1m avec la doxorubicine à 10 }LM) suivie des lavages.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Eléments théoriques La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d'eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d'un fluide permet de dissiper l'énergie cinétique 5 d'un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur Li( est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) et décrite par la 10 formule (I) suivante :
[Math 1] Lk = v3/ . e-1/ (I) dans laquelle y est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et s est le taux moyen de dissipation d'énergie dans le fluide par unité de masse (ou taux d'injection d'énergie dans le fluide).
15 Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre c moyen et la géométrie d'un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (II) suivante :
P
20 [Math 2] e =ND5N3 . = (II) dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné
de l'agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l'agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de s moyen correspondant à la
25 géométrie d'un récipient et d'un agitateur utilisés pour la mise en oeuvre de l'invention.
Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (III) :
P
[Math 3] = e N-, D5 p (111)
Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (III) :
P
[Math 3] = e N-, D5 p (111)
26 dans laquelle P est la puissance apportée par l'agitateur, et p est la densité
du milieu liquide. La formule (III) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al.
(Nienow, A.
W., & Miles, D., 1971, Impeller power numbers in closed vessels, in.dustrial &
Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1), 41-43) ou Zhou et al.
(Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de R.eynolds de l'écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (IV) suivante :
N.D2 õ
[Math 4] Re =¨ (1V) Alternativement, l'homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov par unité
de volume.
En tout état, le calcul présenté ci-dessus n'est qu'une façon parmi tant d'autres connues de l'homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov.
Architecture générale du système fluidique La figure 1 illustre schématiquement un systèm.e fluidique (1) pour la production de vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique (1) de production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4). Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients (4) reliés fluidiquem.ent en parallèle ou en série.
Le récipient (4) contient un milieu liquide (5). Le récipient (4) peut notamment être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide (5). Le récipient peut être souple, ou contenir des parties souples. Le volume du récipient (4) est l'un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires (EV) en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mi, et 40 L. Le volum.e du récipient (4) illustré schématiquement dans la figure 1 est de 1 L. Le récipient (4) comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s'écouler une atmosphère comprenant
du milieu liquide. La formule (III) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al.
(Nienow, A.
W., & Miles, D., 1971, Impeller power numbers in closed vessels, in.dustrial &
Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1), 41-43) ou Zhou et al.
(Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de R.eynolds de l'écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (IV) suivante :
N.D2 õ
[Math 4] Re =¨ (1V) Alternativement, l'homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov par unité
de volume.
En tout état, le calcul présenté ci-dessus n'est qu'une façon parmi tant d'autres connues de l'homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov.
Architecture générale du système fluidique La figure 1 illustre schématiquement un systèm.e fluidique (1) pour la production de vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique (1) de production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4). Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients (4) reliés fluidiquem.ent en parallèle ou en série.
Le récipient (4) contient un milieu liquide (5). Le récipient (4) peut notamment être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide (5). Le récipient peut être souple, ou contenir des parties souples. Le volume du récipient (4) est l'un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires (EV) en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mi, et 40 L. Le volum.e du récipient (4) illustré schématiquement dans la figure 1 est de 1 L. Le récipient (4) comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s'écouler une atmosphère comprenant
27 des concentrations en air, 02, N2 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d'un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d'une étuve à atmosphère contrôlée en CO2. Une deuxième pompe (17) permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient (4). Le récipient (4) comprend également une sortie (9) susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV). Cette sortie peut être complétée d'un moyen de séparation et/ou de filtration des cellules en suspension perm.ettant de ne pas récupérer des cellules en suspension en dehors du récipient (4). Cette sortie (9) permet d'extraire hors du récipient (4) les vésicules extracellulaires (EV) produites. Le récipient (4) peut également .. comprendre au moins une entrée (8) adaptée à introduire le milieu liquide (5) dans le récipient (4).
Le milieu liquide (5) peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide (5) est un milieu liquide de culture avec adjonction de composés permettant la culture des cellules d'intérêt, ou un milieu complémenté en sérum ou I.ysat plaqu.ettaire préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires (EV) produites par le système fluidique (1) par des protéines ou d'autres vésicules provenant d'un sérum ou I.ysat plaquettaire. Un milieu liquide (5) de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide (5) est déterminé en partie par le récipient (4). Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) est en partie déterminé par le choix de l'agitateur (7) permettant d'agiter le milieu liquide (5).
Le système fluidique (1) comprend également des cellules productrices en suspension (6), le terme cellules productrices en suspension incluant à la fois les cellules en suspension (cellules non-adhérentes) et les cellules mises en suspension (cellules adhérentes). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites par le système fluidique (1) à
partir de ces cellules productrices en suspension (6). Les cellules productrices en suspension (6) peuvent être cultivées, avant la production de vésicules extracellulaires (EV) par le
Le milieu liquide (5) peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide (5) est un milieu liquide de culture avec adjonction de composés permettant la culture des cellules d'intérêt, ou un milieu complémenté en sérum ou I.ysat plaqu.ettaire préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires (EV) produites par le système fluidique (1) par des protéines ou d'autres vésicules provenant d'un sérum ou I.ysat plaquettaire. Un milieu liquide (5) de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide (5) est déterminé en partie par le récipient (4). Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) est en partie déterminé par le choix de l'agitateur (7) permettant d'agiter le milieu liquide (5).
Le système fluidique (1) comprend également des cellules productrices en suspension (6), le terme cellules productrices en suspension incluant à la fois les cellules en suspension (cellules non-adhérentes) et les cellules mises en suspension (cellules adhérentes). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites par le système fluidique (1) à
partir de ces cellules productrices en suspension (6). Les cellules productrices en suspension (6) peuvent être cultivées, avant la production de vésicules extracellulaires (EV) par le
28 système fluidique (1) dans un milieu de culture cellulaire adapté. Ainsi, aucun transfert de cellules n'est nécessaire entre la culture des cellules productrices en suspension (6) et la production des vésicules extracellulai.res (EV), ce qui permet d'éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. La majorité des cellules productrices en suspension (6) est en suspension de manière homogène dans le milieu, même si une proportion minoritaire de cellules productrices en suspension (6) peut être sédimentée au fond du récipient (4) ou collée sur la paroi du récipient (4), par exemple par l'agitation du milieu liquide (5). Préférentiellement, le système fluidique (1) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices (6) dans le milieu liquide (5) au sein du récipient (4), préférentiellement avant la production des vésicules extracellulaires. De manière générale, tout type de cellules productrices (6) peut être utilisé, de préférence des cellules productrices (6) en suspension non adhérentes.
Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) permettant d'agiter le milieu liquide (5). L'agitateur (7) peut être une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide (5), et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L'agitateur (7) peut également être un système de perfiision de milieu liquide (5) à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide (5) contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux).
L'agitateur (7) peut alternativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers à
bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles (shaken flask), agitateur à bascule (wave), biorécipient avec agitation pneumatique (air-lift) ou un agitateur rotatif à pales tel qu'un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d'agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant baiTières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L'agitateur (7) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4). L'homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov adaptée pour chaque type d'agitateur (7) en fonction des
Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) permettant d'agiter le milieu liquide (5). L'agitateur (7) peut être une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide (5), et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L'agitateur (7) peut également être un système de perfiision de milieu liquide (5) à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide (5) contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux).
L'agitateur (7) peut alternativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers à
bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles (shaken flask), agitateur à bascule (wave), biorécipient avec agitation pneumatique (air-lift) ou un agitateur rotatif à pales tel qu'un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d'agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant baiTières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L'agitateur (7) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4). L'homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov adaptée pour chaque type d'agitateur (7) en fonction des
29 dimensions du récipient (4), de la géométrie de l'agitateur (7) et de l'intensité de l'agitation. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (IV). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l'écoulement de milieu liquide (5) est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à
12 000.
D'autres agitateurs (7) permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l'homme du métier et susceptibles d'être implantés dans le système selon la présente invention.
L'agitateur (7) utilisé dans les exemples de réalisation de l'invention comprend une roue à aube ou une pale agencée dans un récipient (4) et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques ou mécaniques. La vitesse de la roue à
aube ou de la pale dans le milieu liquide (5) entraine un écoulement du milieu liquide (5). L'agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient .. (4), est turbulent. Dans le cas de l'agitateur (7) illustré en figure 1, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide (5), en particulier la viscosité cinématique y du milieu liquide (5), les dimensions du récipient (4) et en particulier le volume V de milieu liquide (5) contenu dans le récipient (4), le nombre de puissance Np correspondant à la partie immergée de la roue à aube ou de la pale, le diamètre D de l'agitateur et en particulier de la roue ou de la pale, la vitesse N de rotation de la roue ou de la pale. L'utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l'écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov Lx, telle que donnée par les équations (I), (II) et (III). En particulier, l'agitateur (7) est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur .. Lx est inférieure ou égale à 50 gm et préférentiellement à 40 m..
Dans un exemple de réalisation du systèm.e fluidique (1), la vitesse de rotation de l'agitateur (7) est susceptible d'être commandée à 500 ITom (rotations par minute) par exemple, le diamètre d'une roue à aube ou de la pale est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient (4) est de 400 mL. Le nombre de puissance Ni' mesuré de la roue à aube ou de la pale dans le milieu liquide (5), par la formule (III), est sensiblement égal à 3,2. L'énergie dissipée par unité de masse 6, calculée, par la formule (11), est égale à 6,80.10 J.kg-1. La longueur de Kolmogorov Lx calculée par la formule (I) est ainsi égale à 11,0 m.
Aspect chargement d'agent thérapeutique ou d'imagerie 5 .. Le système fluidique (1) pour la production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4).
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans les vésicules extracellulaires (EV) produites selon l'invention. Ainsi, les cellules en 10 .. suspension (6) et l'au moins un. agent thérapeutique et/ou d'imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide (5) et mélangés dans le récipient (4).
Alternativement, les cellules en suspension (6) peuvent être ajoutées dans le milieu liquide (5) avant ou après l'ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans ledit milieu liquide (5). De manière générale, tout type d'agent thérapeutique ou 15 d'imagerie peut être utilisé, de préférence des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, 20 magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) tel que décrit précédemment et permettant d'agiter le milieu liquide (5) comprenant les cellules productrices en suspension (6) et l'au moins un agent thérapeutique ou d'imagerie. Préférentiellement, le système fluidique (1) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices (6) dans le 25 milieu liquide (5) au sein du récipient (4) et ce afin de charger efficacement les agents d'intérêt dans les cellules productrices (6) et par conséquent dans les vésicules extracellulaires.
Selon un autre objet, l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant :
- une commande d'un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à
50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) en suspension et l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et - une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend une étape de chargem.ent d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie. Plus préférentiellement, l'étape de chargement dudit au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie est simultanée à
l'étape de production de vésicules extracellulaires. Bien entendu, cette étape peut également être préalable à l'étape de production de vésicules extracellulaires.
Alternativement, l'étape de chargement peut être postérieure à l'étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d'intérêt dans le cas où l'on souhaite obtenir une 1ère production de vésicules non chargées suivie d'une 21"
production de vésicules extracellulaire chargées dudit au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et ce dans le cadre de la mise en place d'un système fluidique avec une collecte du milieu liquide (5) en continu. De manière surprenante, l'écoulement qui permet aux cellules productrices en suspension (6) de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans les cellules productrices en suspension (6) et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4) chargé
de l'au moins un agent thérapeutique et/ou. d'imagerie.
De manière préféré, l'invention est un procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant les étapes suivantes :
= ajouter dans un récipient (4), un milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) et au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, = actionner une commande d'un agitateur (7) entraînant un. écoulement turbulent d'un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 p.m, préférentiellement inférieure ou égale à 40 p,m, ledit écoulement permettant de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), = collecter le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en. sortie (9) du récipient (4) comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie.
Préparation du milieu de culture, des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie et des cellules productrices Le récipient (4) peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide (5), de cellules productrices (6) et de l'au moins un agent thérapeutique ou agent d'imagerie. L'au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie est incubé
dans le milieu de culture des cellules productrices (6), comprenant du sérum., dans le récipient (4).
Les cellules productrices (6), avant d'être introduites dans le système fluidique 1, sont mises en suspension par un moyen quelconque ou une combinaison de moyens connus de l'homme de l'art, par exemple au moyen d'un. milieu comprenant de la trypsine ou toute autre enzyme permettant la mise en suspension de cellules adhérentes connue de l'homme du métier. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d'un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices (6) ensuite sont introduites dans le récipient (4), comprenant du milieu de culture et selon un mode de réalisation, alternatif l'au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie. Les cellules productrices (6) et les agents thérapeutique et/ou agents d'imagerie sont ensuite agités de manière à mettre en contact les agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie et les cellules productrices (6), et favoriser le chargement des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans les cellules productrices (6). L'agitation peut reprendre .. périodiquement, de manière à favoriser l'homogénéité des cellules productrices (6) et des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans le milieu liquide (5). Par exemple, l'homogénéisation des éléments présents dans le milieu de culture (5) est réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d'une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu'un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour, par exem.ple un remplacement de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% du milieu de culture chaque jour).
Exemple de production des vésicules extracellulaires (EV) sans chargement d'agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites dans un récipient (4) contenant un milieu liquide (5), par exemple sans sérum, des cellules productrices (6) en suspension.
Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices (6) comprenant du sérum, on lave trois à quatre fois le récipient (4) avec du milieu liquide (5) DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d'environ 400 mL. On commande ensuite l'agitation du milieu liquide (5) par l'agitateur (7) de manière à entraîner un. écoulement turbulent dans le récipient (4).
L'agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur de Kolmogorov Li( est inférieure ou égale à 50 m. et préférentiellement à 40 m. L'agitation du milieu liquide (5) est commandée au moins pendant vingt minutes, préférentiellement pendant plus d'une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures, par exemple environ trois heures. La production de vésicules extracellulaires (EV) peut être mesurée pendant la production. A
cet effet, l'agitation peut être continue, intermittente, croissante ou décroissante. On laisse sédimenter les cellules productrices (6) au fond du récipient (4), puis on prélève un échantillon de milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation de l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à
éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NIA, acronyme anglais de Nanoparacle Tracking Analysis) de manière à
compter le nombre de vésicules extracellulaires (EV) et d'en déduire la concentration en vésicules extracellulaires (EV) des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires (EV) au début de l'agitation est proche de zéro ou négligeable.
Les vésicules extracellulaires (EV) produites peuvent également être observées etlou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 de solution comprenant des vésicules extracellulaires (EV) est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l'éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace.
La grille supportant les vésicules extracellulaires (EV) est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires (EV) sont observées à une température de l'ordre de -170 C.
Séparation des vésicules extracellulaires Les vésicules extracellulaires (EV) produites dans le récipient (4) sont susceptibles d'être extraites du récipient (4) par la sortie (9) du récipient (4), suspendues dans du milieu liquide (5). Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à
filtrer les cellules productrices (6) en suspension et les débris cellulaires lors de l'extraction de vésicules extracellulaires (EV) du récipient (4). Une connectique (13) est fluidiquement reliée à la sortie (9), permettant le transport du milieu liquide (5) comprenant les vésicules extracellulaires (EV) produites.
Le système fluidique (1) peut comprendre un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV). Le séparateur (15) comprend une entrée du séparateur (10), dans laquelle le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) issu du récipient (4) peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur (15) peut également comprendre une première sortie (11) du séparateur, par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus petite qu'en entrée (10) du séparateur (15), voire sensiblement nulle. Le séparateur (15) peut également comprendre une deuxième sortie (12) du séparateur (15), par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus élevée qu'en entrée (10) du séparateur (15).
De manière générale, le séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) peut être relié
5 fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide (5) appauvri en vésicules (EV) dans le récipient (4), par exemple par l'entrée (8) du récipient (4). Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires (EV) peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide (5) sensiblement constant dans le récipient (4). Selon un mode de réalisation alternatif, le 10 système fluidique ne comprend pas de séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) ou le système fluidique comprend un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l'intermédiaire d'un moyen de fermeture dudit séparateur (15), au récipient (4). Ainsi, la production. et/ou l'extraction. de vésicules extracellulaires (EV) peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou 15 continue en fonction de l'ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en amont du séparateur (15).
Dans le cas d'un fonctionnement en discontinu, le récipient contenant les cellules productrices est agité et la durée de production est choisie de préférence pour un temps (Tv) supérieur à 20 minutes.
20 Le liquide peut ensuite être extrait du récipient, et peut être soumis à
une ou plusieurs étapes de purification ultérieures, pour notamment séparer les vésicules des cellules productrices. Cette séparation peut être réalisée au moyen de techniques connues de l'homme de l'art, par exemple et pris de façon non limitative, par des techniques acoustiques, des méthodes de filtration telle la séparation par filtration tangentielle, 25 l'utilisation de filtres rotatifs ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation.
Dans le cas d'un fonctionnement en continu et selon un mode de réalisation préféré, le système de séparation est interne au récipient, les vésicules sont séparées progressivement dans un sous-compartiment du récipient. Divers moyens techniques sont connus de l'homme de l'art pour réaliser ce type de séparation, par exemple et de façon non limitative, l'utilisation de filtres rotatifs, ou encore de moyens acoustiques, ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation. Selon un autre mode de réalisation, le système de séparation entre cellules et vésicules peut faire intervenir un circuit fluidique conçu pour faire circuler le milieu avec les cellules productrices et les vésicules entre le récipient d'une part et un système de séparation extérieur au récipient d'autre part. Ce système de séparation extérieur au récipient peut faire intervenir des techniques connues de l'homme de l'art, par exemple, et de façon non-limitative, de la filtration tangentielle, ou de la séparation acoustique, ou encore des combinaisons quelconques de moyens de séparation connus. A la sortie du système de séparation, le liquide appauvri en vésicules est réinjecté dans le récipient, de façon à ce que la production de vésicules par les cellules productrices puisse continuer dans le récipient.
Dans l'exemple de réalisation d'un système fluidique (1) illustré dans la figure 1, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient (4) par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19).
Une autre première pompe (16') permet d'acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l'entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La première sortie (11) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) vi.a une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l'entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l'intermédiaire d'une première pompe (16)). La première sortie (11) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19). Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires (EV) dans le milieu liquide (5), et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide (5) dans chaque séparateur (15) au débit d'une première pompe (16).
Influence de l'agitation sur la production des vésicules extracellulaires (EV) Dans les figures qui suivent, différents types de cellules productrices sont utilisés. Avant leur utilisation pour la production de vésicules extracellulaires, ces cellules productrices sont mises en culture, à l'exception des globules rouges dont la préparation avant leur utilisation pour la production de vésicules extracellulaires consiste en l'obtention d'une suspension de globules rouges lavés à la concentration souhaitée dans du DMEM
sans rouge de phénol.
Les cellules THP-1, issues d'une lignée humaine de monocytes, sont cultivées dans du milieu de culture ICA: (Roswell Park Memorial :Institute medium) à une concentration de 2.105 à 1.106 cellules par millilitre de milieu de culture, à 37 C et sous une atmosphère comprenant 5% de CO2. Le milieu de culture RPMI contient 10% en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture RPMI. Elles sont passées tous les 3 à
5 jours en les diluant d'un facteur 5 dans du milieu neuf.
Les cellules de Raji, une lignée humaine de cellules d'origine hématopoïétique dérivées de lymphocytes B, sont cultivées dans du milieu de culture RPMI contenant 10%
en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture RPMI. Elles sont passées tous les 3 à 4 jours en les diluant d'un facteur de 10 à 20 dans du milieu neuf.
Les cellules C3H/10T1/2 sont des cellules mésenchymateuses multipotentes issues des cellules embryonnaires de souris CH3, qui sont adhérentes. Elles sont cultivées dans du DMEM avec 10% en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture DMEM. Elles sont passées tous les 3 à 5 jours en les diluant d'un facteur entre 2 et 10.
Les cellules HeLa sont une lignée de cellules issues d'un cancer du col de l'utérus. Elles sont cultivées dans du DMEM avec 10% en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture DMEM. Initialement adhérentes, ces cellules HeLa sont détachées avec de la trypsine puis mises en suspension dans un bioréacteur agité à
50 RPM, et cultivées à une concentration comprise entre 105/mL et 106/mL.
Avant d'utiliser les cellules productrices pour la production de vésicules extracellulaires, les cellules qui ont été mises en culture sont lavées puis re-suspendues dans du DMEM
blanc, avec 1% en volume de pénicilline/streptomycine par rapport au volume du milieu DMEM, dans le contenant dans lequel la production de vésicules extracellulaires aura lieu (flasque, flasque à agitation ou bioréacteur, de préférence conformes aux normes G.:M. P).
La figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique (1) pour différentes agitations commandées par l'agitateur (7).
L'ordonnée correspond aux nombres de vésicules extracellulaires (EV) produites par cellule dans le récipient (4). Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires (EV) pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur (7) dans le récipient (4). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites à partir de cellules productrices (6) de type TFEP1 dans le récipient (4) en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension (6) dans 400 niL de milieu liquide (5) dans une flasque à agitation (spinner flask en anglais) de 1000 ml. Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires (EV) est observable en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la production correspond à
la colonne 300 RPM soit une longueur LK égale ou inférieure à 17 um par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la vitesse d'agitation est de 200 RPM soit une longueur LK égale à
23 pm. De plus, dans des conditions d'agitation encore plus importantes, à savoir respectivement 400 RPM et 515 RPM, correspondant à l'obtention de longueurs LK égales respectivement à 13,8 um et 11,4 pm, la production de vésicules extracellulaires par cellule productrice augmente encore, de façon inversement proportionnelle à la longueur LK. Cela illustre que plus l'agitation est importante, plus les cellules productrices produisent des vésicules extracellulaires.
La figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices (6) de type THP-1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur (7) dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) et la quantité de milieu liquide (5) sont différents de ceux utilisés dans le cadre de l'expérience de la figure 2, et sur une durée d'agitation plus longue à savoir 3 heures au lieu de 20 minutes. Dans une flasque à
agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), 3553 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov LK
étant égale à
41 m. Dans une flasque à agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), environ 17 400 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de 300 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov LK étant égale à 35 m. Dans une flasque à agitation de 0,1 L
comprenant 50 mL de milieu liquide (5), entre 30 000 et 40 000 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov Li( étant égale à
24 m. Un essai contrôle correspondant à l'utilisation d'une flasque à
agitation de 0,1 L
comprenant 50 mL de milieu liquide (5), sous une agitation de 34 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov LK étant égale à 181 lm, conduit à la production d'environ 1 400 vésicules extracellulaires par cellule productrice en trois heures.
Les résultats des figures 2 et 3 illustrent que, quel que soit le type de récipient (4), lorsque la longueur de Kol.mogorov obtenue par agitation du milieu liquide (5) est comprise entre 5 et 50 m, de préférence entre 10 gm et 41 gm, par exemple 11,4 m, 13,8 gm, 17 ;lm, 23 pin, 24 pin, 35 tm et 41 ;lm, des vésicules extracellulaires sont produites par les cellules productrices en suspension dans le milieu liquide (5). De plus, plus la longueur de Kolmogorov diminue, plus il y a augmentation du nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule productrice.
La figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires (EV) produites dans un. système fluidique (1) pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l'agitateur (7).
Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites à partir de cellules productrices (6) de type THP1 dans le récipient (4) en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension (6) dans 400 mi: de milieu liquide (5) dans une spinner flask de 1000 ml.
L'abscisse correspond à la longueur LK entraînée par l'agitateur (7) pendant la production de vésicules extracellulaires (EV), calculée par les formules (I), (II) et (III). Une 5 production significativement élevée de vésicules extracellulaires (EV) est observable en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la longueur LK est inférieure à 17 m. par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d'agitation plus faible. Le rendement de production de vésicules extracellulaires (EV) par cellule productrice est plus important lorsque la longueur LK est inférieure ou égale à
10 .. 50 gm par rapport à des longueurs iLK plus grandes, notamment supérieures à 100 m.
La figure 5 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule en fonction du temps, par des cellules productrices (6) de type THP-1 humaines dans un système fluidique en commandant l'écoulement du milieu liquide (5) à des agitations 200 RPM et 300 RPM. Les conditions utilisées sont 100 000 000 cellules dans 400 mL
dans 15 une spi.nner fiask de 1000 ml.õ avec une pale de diamètre 10,8 cm. Les longueurs Lk calculées par les formules (I), (II) et (III) sont respectivement de 23 m (pour 300 RPM) et 17 pm (pour 400 RPM). Le nombre de vésicules extracellulaires (EV) produites est bien supérieur pour un écoulement caractérisé par une longueur Lk de 17 itm que par une longueur Lk de 23 m.
20 La figure 6 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices C3F1/10T1/2 (cellules souches mésenchymateuses issues de souris) dans mi système fluidique pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l'agitateur (7). Une concentration de 100 000 000 cellules productrices (6) dans 400 mL de milieu liquide (5) dans une spinner flask de 1000 mL a été utilisée. L'abscisse correspond à la 25 .. longueur LK entraînée par l'agitateur (7) pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (I), (II) et (III). La production de vésicules par cellule augmente de façon importante en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la longueur LK est de 17 m. par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d'agitation plus faible.
Le rendement
12 000.
D'autres agitateurs (7) permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l'homme du métier et susceptibles d'être implantés dans le système selon la présente invention.
L'agitateur (7) utilisé dans les exemples de réalisation de l'invention comprend une roue à aube ou une pale agencée dans un récipient (4) et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques ou mécaniques. La vitesse de la roue à
aube ou de la pale dans le milieu liquide (5) entraine un écoulement du milieu liquide (5). L'agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient .. (4), est turbulent. Dans le cas de l'agitateur (7) illustré en figure 1, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide (5), en particulier la viscosité cinématique y du milieu liquide (5), les dimensions du récipient (4) et en particulier le volume V de milieu liquide (5) contenu dans le récipient (4), le nombre de puissance Np correspondant à la partie immergée de la roue à aube ou de la pale, le diamètre D de l'agitateur et en particulier de la roue ou de la pale, la vitesse N de rotation de la roue ou de la pale. L'utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l'écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov Lx, telle que donnée par les équations (I), (II) et (III). En particulier, l'agitateur (7) est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur .. Lx est inférieure ou égale à 50 gm et préférentiellement à 40 m..
Dans un exemple de réalisation du systèm.e fluidique (1), la vitesse de rotation de l'agitateur (7) est susceptible d'être commandée à 500 ITom (rotations par minute) par exemple, le diamètre d'une roue à aube ou de la pale est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient (4) est de 400 mL. Le nombre de puissance Ni' mesuré de la roue à aube ou de la pale dans le milieu liquide (5), par la formule (III), est sensiblement égal à 3,2. L'énergie dissipée par unité de masse 6, calculée, par la formule (11), est égale à 6,80.10 J.kg-1. La longueur de Kolmogorov Lx calculée par la formule (I) est ainsi égale à 11,0 m.
Aspect chargement d'agent thérapeutique ou d'imagerie 5 .. Le système fluidique (1) pour la production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4).
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans les vésicules extracellulaires (EV) produites selon l'invention. Ainsi, les cellules en 10 .. suspension (6) et l'au moins un. agent thérapeutique et/ou d'imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide (5) et mélangés dans le récipient (4).
Alternativement, les cellules en suspension (6) peuvent être ajoutées dans le milieu liquide (5) avant ou après l'ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans ledit milieu liquide (5). De manière générale, tout type d'agent thérapeutique ou 15 d'imagerie peut être utilisé, de préférence des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d'imagerie nucléaire, 20 magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) tel que décrit précédemment et permettant d'agiter le milieu liquide (5) comprenant les cellules productrices en suspension (6) et l'au moins un agent thérapeutique ou d'imagerie. Préférentiellement, le système fluidique (1) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d'homogénéiser les cellules productrices (6) dans le 25 milieu liquide (5) au sein du récipient (4) et ce afin de charger efficacement les agents d'intérêt dans les cellules productrices (6) et par conséquent dans les vésicules extracellulaires.
Selon un autre objet, l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant :
- une commande d'un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à
50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) en suspension et l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et - une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Préférentiellement, le procédé selon l'invention comprend une étape de chargem.ent d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie. Plus préférentiellement, l'étape de chargement dudit au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie est simultanée à
l'étape de production de vésicules extracellulaires. Bien entendu, cette étape peut également être préalable à l'étape de production de vésicules extracellulaires.
Alternativement, l'étape de chargement peut être postérieure à l'étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d'intérêt dans le cas où l'on souhaite obtenir une 1ère production de vésicules non chargées suivie d'une 21"
production de vésicules extracellulaire chargées dudit au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, et ce dans le cadre de la mise en place d'un système fluidique avec une collecte du milieu liquide (5) en continu. De manière surprenante, l'écoulement qui permet aux cellules productrices en suspension (6) de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie dans les cellules productrices en suspension (6) et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4) chargé
de l'au moins un agent thérapeutique et/ou. d'imagerie.
De manière préféré, l'invention est un procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant les étapes suivantes :
= ajouter dans un récipient (4), un milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) et au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, = actionner une commande d'un agitateur (7) entraînant un. écoulement turbulent d'un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 p.m, préférentiellement inférieure ou égale à 40 p,m, ledit écoulement permettant de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), = collecter le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en. sortie (9) du récipient (4) comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie.
Préparation du milieu de culture, des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie et des cellules productrices Le récipient (4) peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide (5), de cellules productrices (6) et de l'au moins un agent thérapeutique ou agent d'imagerie. L'au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie est incubé
dans le milieu de culture des cellules productrices (6), comprenant du sérum., dans le récipient (4).
Les cellules productrices (6), avant d'être introduites dans le système fluidique 1, sont mises en suspension par un moyen quelconque ou une combinaison de moyens connus de l'homme de l'art, par exemple au moyen d'un. milieu comprenant de la trypsine ou toute autre enzyme permettant la mise en suspension de cellules adhérentes connue de l'homme du métier. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d'un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices (6) ensuite sont introduites dans le récipient (4), comprenant du milieu de culture et selon un mode de réalisation, alternatif l'au moins un agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie. Les cellules productrices (6) et les agents thérapeutique et/ou agents d'imagerie sont ensuite agités de manière à mettre en contact les agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie et les cellules productrices (6), et favoriser le chargement des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans les cellules productrices (6). L'agitation peut reprendre .. périodiquement, de manière à favoriser l'homogénéité des cellules productrices (6) et des agents thérapeutiques et/ou agents d'imagerie dans le milieu liquide (5). Par exemple, l'homogénéisation des éléments présents dans le milieu de culture (5) est réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d'une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu'un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour, par exem.ple un remplacement de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% du milieu de culture chaque jour).
Exemple de production des vésicules extracellulaires (EV) sans chargement d'agent thérapeutique et/ou agent d'imagerie Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites dans un récipient (4) contenant un milieu liquide (5), par exemple sans sérum, des cellules productrices (6) en suspension.
Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices (6) comprenant du sérum, on lave trois à quatre fois le récipient (4) avec du milieu liquide (5) DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d'environ 400 mL. On commande ensuite l'agitation du milieu liquide (5) par l'agitateur (7) de manière à entraîner un. écoulement turbulent dans le récipient (4).
L'agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur de Kolmogorov Li( est inférieure ou égale à 50 m. et préférentiellement à 40 m. L'agitation du milieu liquide (5) est commandée au moins pendant vingt minutes, préférentiellement pendant plus d'une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures, par exemple environ trois heures. La production de vésicules extracellulaires (EV) peut être mesurée pendant la production. A
cet effet, l'agitation peut être continue, intermittente, croissante ou décroissante. On laisse sédimenter les cellules productrices (6) au fond du récipient (4), puis on prélève un échantillon de milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation de l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à
éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NIA, acronyme anglais de Nanoparacle Tracking Analysis) de manière à
compter le nombre de vésicules extracellulaires (EV) et d'en déduire la concentration en vésicules extracellulaires (EV) des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires (EV) au début de l'agitation est proche de zéro ou négligeable.
Les vésicules extracellulaires (EV) produites peuvent également être observées etlou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 de solution comprenant des vésicules extracellulaires (EV) est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l'éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace.
La grille supportant les vésicules extracellulaires (EV) est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires (EV) sont observées à une température de l'ordre de -170 C.
Séparation des vésicules extracellulaires Les vésicules extracellulaires (EV) produites dans le récipient (4) sont susceptibles d'être extraites du récipient (4) par la sortie (9) du récipient (4), suspendues dans du milieu liquide (5). Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à
filtrer les cellules productrices (6) en suspension et les débris cellulaires lors de l'extraction de vésicules extracellulaires (EV) du récipient (4). Une connectique (13) est fluidiquement reliée à la sortie (9), permettant le transport du milieu liquide (5) comprenant les vésicules extracellulaires (EV) produites.
Le système fluidique (1) peut comprendre un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV). Le séparateur (15) comprend une entrée du séparateur (10), dans laquelle le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) issu du récipient (4) peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur (15) peut également comprendre une première sortie (11) du séparateur, par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus petite qu'en entrée (10) du séparateur (15), voire sensiblement nulle. Le séparateur (15) peut également comprendre une deuxième sortie (12) du séparateur (15), par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus élevée qu'en entrée (10) du séparateur (15).
De manière générale, le séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) peut être relié
5 fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide (5) appauvri en vésicules (EV) dans le récipient (4), par exemple par l'entrée (8) du récipient (4). Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires (EV) peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide (5) sensiblement constant dans le récipient (4). Selon un mode de réalisation alternatif, le 10 système fluidique ne comprend pas de séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) ou le système fluidique comprend un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l'intermédiaire d'un moyen de fermeture dudit séparateur (15), au récipient (4). Ainsi, la production. et/ou l'extraction. de vésicules extracellulaires (EV) peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou 15 continue en fonction de l'ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en amont du séparateur (15).
Dans le cas d'un fonctionnement en discontinu, le récipient contenant les cellules productrices est agité et la durée de production est choisie de préférence pour un temps (Tv) supérieur à 20 minutes.
20 Le liquide peut ensuite être extrait du récipient, et peut être soumis à
une ou plusieurs étapes de purification ultérieures, pour notamment séparer les vésicules des cellules productrices. Cette séparation peut être réalisée au moyen de techniques connues de l'homme de l'art, par exemple et pris de façon non limitative, par des techniques acoustiques, des méthodes de filtration telle la séparation par filtration tangentielle, 25 l'utilisation de filtres rotatifs ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation.
Dans le cas d'un fonctionnement en continu et selon un mode de réalisation préféré, le système de séparation est interne au récipient, les vésicules sont séparées progressivement dans un sous-compartiment du récipient. Divers moyens techniques sont connus de l'homme de l'art pour réaliser ce type de séparation, par exemple et de façon non limitative, l'utilisation de filtres rotatifs, ou encore de moyens acoustiques, ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation. Selon un autre mode de réalisation, le système de séparation entre cellules et vésicules peut faire intervenir un circuit fluidique conçu pour faire circuler le milieu avec les cellules productrices et les vésicules entre le récipient d'une part et un système de séparation extérieur au récipient d'autre part. Ce système de séparation extérieur au récipient peut faire intervenir des techniques connues de l'homme de l'art, par exemple, et de façon non-limitative, de la filtration tangentielle, ou de la séparation acoustique, ou encore des combinaisons quelconques de moyens de séparation connus. A la sortie du système de séparation, le liquide appauvri en vésicules est réinjecté dans le récipient, de façon à ce que la production de vésicules par les cellules productrices puisse continuer dans le récipient.
Dans l'exemple de réalisation d'un système fluidique (1) illustré dans la figure 1, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient (4) par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19).
Une autre première pompe (16') permet d'acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l'entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La première sortie (11) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) vi.a une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l'entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l'intermédiaire d'une première pompe (16)). La première sortie (11) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19). Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires (EV) dans le milieu liquide (5), et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide (5) dans chaque séparateur (15) au débit d'une première pompe (16).
Influence de l'agitation sur la production des vésicules extracellulaires (EV) Dans les figures qui suivent, différents types de cellules productrices sont utilisés. Avant leur utilisation pour la production de vésicules extracellulaires, ces cellules productrices sont mises en culture, à l'exception des globules rouges dont la préparation avant leur utilisation pour la production de vésicules extracellulaires consiste en l'obtention d'une suspension de globules rouges lavés à la concentration souhaitée dans du DMEM
sans rouge de phénol.
Les cellules THP-1, issues d'une lignée humaine de monocytes, sont cultivées dans du milieu de culture ICA: (Roswell Park Memorial :Institute medium) à une concentration de 2.105 à 1.106 cellules par millilitre de milieu de culture, à 37 C et sous une atmosphère comprenant 5% de CO2. Le milieu de culture RPMI contient 10% en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture RPMI. Elles sont passées tous les 3 à
5 jours en les diluant d'un facteur 5 dans du milieu neuf.
Les cellules de Raji, une lignée humaine de cellules d'origine hématopoïétique dérivées de lymphocytes B, sont cultivées dans du milieu de culture RPMI contenant 10%
en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture RPMI. Elles sont passées tous les 3 à 4 jours en les diluant d'un facteur de 10 à 20 dans du milieu neuf.
Les cellules C3H/10T1/2 sont des cellules mésenchymateuses multipotentes issues des cellules embryonnaires de souris CH3, qui sont adhérentes. Elles sont cultivées dans du DMEM avec 10% en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture DMEM. Elles sont passées tous les 3 à 5 jours en les diluant d'un facteur entre 2 et 10.
Les cellules HeLa sont une lignée de cellules issues d'un cancer du col de l'utérus. Elles sont cultivées dans du DMEM avec 10% en volume de sérum bovin foetal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture DMEM. Initialement adhérentes, ces cellules HeLa sont détachées avec de la trypsine puis mises en suspension dans un bioréacteur agité à
50 RPM, et cultivées à une concentration comprise entre 105/mL et 106/mL.
Avant d'utiliser les cellules productrices pour la production de vésicules extracellulaires, les cellules qui ont été mises en culture sont lavées puis re-suspendues dans du DMEM
blanc, avec 1% en volume de pénicilline/streptomycine par rapport au volume du milieu DMEM, dans le contenant dans lequel la production de vésicules extracellulaires aura lieu (flasque, flasque à agitation ou bioréacteur, de préférence conformes aux normes G.:M. P).
La figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique (1) pour différentes agitations commandées par l'agitateur (7).
L'ordonnée correspond aux nombres de vésicules extracellulaires (EV) produites par cellule dans le récipient (4). Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires (EV) pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur (7) dans le récipient (4). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites à partir de cellules productrices (6) de type TFEP1 dans le récipient (4) en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension (6) dans 400 niL de milieu liquide (5) dans une flasque à agitation (spinner flask en anglais) de 1000 ml. Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires (EV) est observable en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la production correspond à
la colonne 300 RPM soit une longueur LK égale ou inférieure à 17 um par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la vitesse d'agitation est de 200 RPM soit une longueur LK égale à
23 pm. De plus, dans des conditions d'agitation encore plus importantes, à savoir respectivement 400 RPM et 515 RPM, correspondant à l'obtention de longueurs LK égales respectivement à 13,8 um et 11,4 pm, la production de vésicules extracellulaires par cellule productrice augmente encore, de façon inversement proportionnelle à la longueur LK. Cela illustre que plus l'agitation est importante, plus les cellules productrices produisent des vésicules extracellulaires.
La figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices (6) de type THP-1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur (7) dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) et la quantité de milieu liquide (5) sont différents de ceux utilisés dans le cadre de l'expérience de la figure 2, et sur une durée d'agitation plus longue à savoir 3 heures au lieu de 20 minutes. Dans une flasque à
agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), 3553 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov LK
étant égale à
41 m. Dans une flasque à agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), environ 17 400 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de 300 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov LK étant égale à 35 m. Dans une flasque à agitation de 0,1 L
comprenant 50 mL de milieu liquide (5), entre 30 000 et 40 000 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov Li( étant égale à
24 m. Un essai contrôle correspondant à l'utilisation d'une flasque à
agitation de 0,1 L
comprenant 50 mL de milieu liquide (5), sous une agitation de 34 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov LK étant égale à 181 lm, conduit à la production d'environ 1 400 vésicules extracellulaires par cellule productrice en trois heures.
Les résultats des figures 2 et 3 illustrent que, quel que soit le type de récipient (4), lorsque la longueur de Kol.mogorov obtenue par agitation du milieu liquide (5) est comprise entre 5 et 50 m, de préférence entre 10 gm et 41 gm, par exemple 11,4 m, 13,8 gm, 17 ;lm, 23 pin, 24 pin, 35 tm et 41 ;lm, des vésicules extracellulaires sont produites par les cellules productrices en suspension dans le milieu liquide (5). De plus, plus la longueur de Kolmogorov diminue, plus il y a augmentation du nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule productrice.
La figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires (EV) produites dans un. système fluidique (1) pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l'agitateur (7).
Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites à partir de cellules productrices (6) de type THP1 dans le récipient (4) en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension (6) dans 400 mi: de milieu liquide (5) dans une spinner flask de 1000 ml.
L'abscisse correspond à la longueur LK entraînée par l'agitateur (7) pendant la production de vésicules extracellulaires (EV), calculée par les formules (I), (II) et (III). Une 5 production significativement élevée de vésicules extracellulaires (EV) est observable en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la longueur LK est inférieure à 17 m. par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d'agitation plus faible. Le rendement de production de vésicules extracellulaires (EV) par cellule productrice est plus important lorsque la longueur LK est inférieure ou égale à
10 .. 50 gm par rapport à des longueurs iLK plus grandes, notamment supérieures à 100 m.
La figure 5 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule en fonction du temps, par des cellules productrices (6) de type THP-1 humaines dans un système fluidique en commandant l'écoulement du milieu liquide (5) à des agitations 200 RPM et 300 RPM. Les conditions utilisées sont 100 000 000 cellules dans 400 mL
dans 15 une spi.nner fiask de 1000 ml.õ avec une pale de diamètre 10,8 cm. Les longueurs Lk calculées par les formules (I), (II) et (III) sont respectivement de 23 m (pour 300 RPM) et 17 pm (pour 400 RPM). Le nombre de vésicules extracellulaires (EV) produites est bien supérieur pour un écoulement caractérisé par une longueur Lk de 17 itm que par une longueur Lk de 23 m.
20 La figure 6 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices C3F1/10T1/2 (cellules souches mésenchymateuses issues de souris) dans mi système fluidique pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l'agitateur (7). Une concentration de 100 000 000 cellules productrices (6) dans 400 mL de milieu liquide (5) dans une spinner flask de 1000 mL a été utilisée. L'abscisse correspond à la 25 .. longueur LK entraînée par l'agitateur (7) pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (I), (II) et (III). La production de vésicules par cellule augmente de façon importante en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la longueur LK est de 17 m. par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d'agitation plus faible.
Le rendement
30 de production de vésicules extracellulaires (EV) par cellule productrice est plus important lorsque la longueur LK est inférieure ou égale à 50 gm par rapport à des longueurs LK plus grandes, notamment supérieures à 100 m à partir de laquelle un plateau du rendement EV/cellule est atteint.
La figure 7 illustre premièrement le nombre de vésicules produites en trois heures par des cellules productrices (6) de type Raji d'une part selon la méthode de l'art antérieur de carence 2D 72h et d'autre part dans un systèrne fluidique (1) dont le récipient (4) est une flasque à agitation d'une contenance de 100 mL, le milieu liquide (5) est de 50 mL, le diamètre de la pale est de 3,8 cm, l'agitation est de 500 RPM et la longueur de Kolmogorov LK est de 24 gm. Deuxièmement, cette figure illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites en trois heures par des cellules productrices (6) de type HeLa d'une part selon la m.éthode de l'art antérieur de carence 3D 72h et d'autre part dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) est une flasque à agitation d'une contenance de 100 mL, le milieu liquide (5) est de 50 mlõ le diamètre de la pale est de 3,8 cm, l'agitation est de 250 RPM et la longueur de Kolmogorov LK est de 41 m.
Cette figure illustre qu'une production de vésicules extracellulaires dans un système fluidique selon la présente invention et selon le procédé selon la présente invention, permet une production de vésicules extracellulaires en bien plus grande quantité et en moins de temps que l'art antérieur. De plus, cette figure illustre que tout type de cellules productrices peut être utilisé pour produire des vésicules extracellulaires dans un système fluidique selon la présente invention et selon le procédé selon la présente invention.
La figure 8a) illustre le nombre de cellules productrices du type Raji viables en suspension au cours du temps, soit après 72 heures en flasques classiques dans le milieu liquide (5) sans agitation (conditions appelées carence 2D ou carence 2D 72h dans la présente demande), soit après 3 heures en présence d'une agitation turbulente dans un système fluidique selon l'invention. Le système fluidique selon l'invention qui est utilisé dans cette figure est une flasque à agitation de 100 mL comprenant un milieu liquide (5) de 50 mL, un diamètre de la pale de 3,8 cm, une agitation de 500 RPM et une longueur de Kolmogorov LK de 24 iLtm. Un essai contrôle est réalisé et correspond à une flasque à
agitation de 100 mL comprenant un milieu liquide (5) de 50 mL, un diamètre de la pale de 3,8 cm, une agitation de 34 RPM et une longueur de Kolmogorov LK de 181 m.
Les concentrations et viabilités cellulaires sont mesurées au NucleoCountee (NC-2001m commercialisé par l'entreprise Chemometec) aux temps t=Oh et soit t=3h soit t=72h.
Les résultats obtenus démontrent que le nombre de cellules productrices ne diminue pas significativement au cours de l'agitation turbulente selon l'invention, les cellules productrices résistent aux contraintes de cisaillement.
La figure 8b) illustre le pourcentage d'adénylate kinase dans le surnageant entre l'essai contrôle, l'essai en carence 2D 72h et l'essai selon l'invention. L'adénylate kinase est dosée dans le surnageant aux temps t=Oh et soit t=3h soit t=72h pour mesurer l'intégrité
des membranes grâce au ToxiLight Assay kit commercialisé par l'entreprise Lanza ; le contrôle positif (100% de lyse) est réalisé avec 0,3% en volume de Triton X-100 par rapport au volume du milieu liquide du contrôle.
Il apparait que la concentration d'adénylate kinase dans le surnageant ne varie pas significativement entre les différents essais, ce qui démontre l'absence d'endommagement des cellules et notamment le maintien de l'intégrité de leurs membranes cellulaires malgré le cisaillement.
De plus, la figure 9 illustre l'aspect des cellules productrices de type R.aji entre après 3 heures dans l'essai contrôle et après 3 heures dans le système fluidique selon l'invention (les essais contrôle et selon l'invention sont les mêmes que ceux en figure 8), par observation au microscope optique à un grossissement x4. Ces images illustrent le fait que même après l'action de la turbulence, il y a peu voire pas d'endommagement des cellules productrices, maintien de l'intégrité des cellules et identité de leur aspect avec les cellules de l'essai contrôle.
La figure 10 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules TFIP-1 humaines en flasques classiques dans le milieu liquide (5) sans agitation pendant 72 h (appelé carence 2D 72h), et dans un système fluidique en commandant un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur Li( est supérieure à
200 1.1m (appelé carence 3D). Ces conditions sont les conditions classiques de production de vésicules extracellulaires EV. La production de vésicules extracellulaires (EV) par cellules dans ces différentes conditions est significativement inférieure à la production dans un écoulement où la longueur Lk est inférieure à 17 pm.
La figure 11 illustre la distribution de taille des vésicules extracellulaires, produites à
partir de cellules productrices TI-1P-1, HeLa ou de Raji, en conditions de carence ou de .. turbulence par agitation à une vitesse de 500 RPM. Pour établir ces distributions, les surnageants des différents essais sont prélevés de manière homogène et centrifugés 5 min à 2000 g, puis la concentration en vésicules et la distribution en taille des particules sont mesurées par Nanoparticle Tracking Analysis (sur l'appareil NanoSight NS300 commercialisé par l'entreprise Malvern Panal.ytical). Ces résultats illustrent que les diamètres moyens et médians des vésicules extracellulaires produites selon l'invention sont similaires à la fois entre eux et avec ceux des vésicules extracellulaires produites selon les méthodes de l'art antérieur (carence).
Les figures 12 et 13 qui suivent correspondent aux résultats d'analyse de la distribution en taille de vésicules extracellulaires et des marqueurs membranaires de vésicules extracellulaires. Ces analyses sont effectuées grâce à l'appareil ExoViewTM
commercialisé par l'entreprise NanoView Bioscience. Les vésicules extracellulaires sont incubées sur une puce contenant des spots marqués avec différents anticorps (anti-CD81, anti-CD9, anti-CD63) ; après lavage, des anticorps secondaires anti-CD81 Alexa Fluor 555, anti-CD9 Alexa Fluor 647 et anti-CD63 Alexa Fluor 488 sont ajoutés.
Le recueil des images de fluorescence et d'interférométrie permettent d'obtenir les mesures des tailles et concentrations des vésicules extracellulaires dans le milieu liquide.
La figure 12 illustre la distribution en taille de vésicules extracellulaires produites selon l'invention durant 3 heures (turbulence) ou selon la méthode de carence 3D
durant 72 heures, dans les deux cas à partir de cellules productrices du type THP1.
Les vésicules extracellulaires produites selon l'invention sont produites à partir de cellules productrices de type THP1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide (5) de 50 mL, une vitesse d'agitation de 500 RPM, une longueur de Kol.mogorov Lk de 24 gm et un diamètre de la pale de 3,8 cm. Les vésicules extracellulaires produites selon la méthode de carence 3D 72 h sont produites à partir de cellules productrices de type THP1 dans une .. fiasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide de 50 mL, une vitesse d'agitation de 34 RPM, une longueur de Kol.mogorov Lk de 181 i.tm et un diamètre de la pale de 3,8 cm.
Les résultats donnent des valeurs de diamètres moyens des vésicules extracellulaires inférieurs à ceux donnés dans la figure 11, car la méthode d'analyse n'est pas la même (mesure par NTA dans la figure 11, qui ne permet pas la détection des vésicules extracellulaires de petite taille, contre mesure par l'ExoViewTM R.100 dans la figure 12).
Les résultats obtenus dans la figure 12 par l'ExoViewTM R100 concernent l'analyse des vésicules qui s'attachent à des anticorps de capture anti. CD9, CD63 et CD81.
Les résultats obtenus sont les suivants :
[Table 1]
Marqueurs membranaires Diamètre moyen des vésicules extracellulaires produites en fonction des conditions Carence 3D Turbulence (Lk = 24 1.1m) CD81 62,6 nm 63,6 mn CD63 59,0 nm 59,8 mn CD9 59,9 nm 60,9 nrn Ces résultats illustrent d'une part que les diamètres moyens des vésicules extracellulaires produites selon l'invention ou selon la méthode de carence 3D sont identiques et d'autre part que la distribution des marqueurs de membrane n'est pas la même en fonction de la méthode de production des vésicules extracellulaires (c'est-à-dire selon l'invention ou selon la méthode de carence 3D).
La figure 13 illustre l'analyse des marqueurs membranaires de deux types de vésicules extracellulaires:
- des vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices du type THP-1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide (5) de 50 mL, mie vitesse d'agitation de 500 RPM et une longueur de Kolmogorov de 24 itm, durant 3 heures ; et - des vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices du type en carence 3D 72h.
Les deux types de vésicules extracellulaires sont analysés avec l'ExoViewTm R100 de la manière suivante : les vésicules sont capturées par des anticorps (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81.) sur une puce, où les spots de chaque anticorps sont séparés. Puis, les vésicules capturées sont incubées avec un anticorps secondaire (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81 également) associé à un fluorophore, ce qui permet de faire de la colocalisation de ces marqueurs. Sur le graphique, les anticorps de capture sont représentés sur l'axe des abscisses tandis que les trois différentes colonnes par point d'abscisse représentent les 5 anticorps secondaires fluorescents. Ainsi, pour l'anticorps de capture CD81, toutes les vésicules capturées devraient être marquées par le fluorophore Alexa Fluor 555, sauf s'il n'y a plus d'épitope disponible.
Les résultats montrent d'une part que les marqueurs membranaires typiques de vésicules extracellulaires, à savoir CD81 et CD63 essentiellement, sont présents sur les vésicules 10 extracellulaires produites en présence d'une longueur de Kolmogorov de 24 m. Cela démontre que les particules produites par le procédé selon l'invention sont bien des vésicules extracellulaires, et qu'elles disposent des marqueurs spécifiques de leurs cellules productrices mères.
D'autre part, ces résultats montrent que pour les vésicules produites à 500 RPM, il y a le 15 même nombre de particules marquées par les fluorophores en CD81 et en CD63 sur l'anticorps de capture CD81, et à peu près la moitié des vésicules capturées par l'anticorps de capture CD63 sont marquées par fluorescence en CD81. III ya donc présence de ces deux marqueurs membranaires CD63 et CD81 sur les vésicules extracellulaires produites en présence d'une longueur de Kolmogorov de 24 m. On retrouve la même tendance de 20 présence et de colocalisation significative des deux marqueurs membranaires CD63 et CD81 sur les vésicules extracellulaires produites en carence 3D, mais les distributions relatives diffèrent de celles des vésicules extracellulaires produites en présence d'une longueur de Kolmogorov de 24 p.m.
La figure 14 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des globules 25 rouges après 2 heures d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov.
Le décompte des vésicules extracellulaires, après 2 heures d'agitation (conditions selon l'invention : BR. 500mL et BR 1L) ou 2 heures de maintien sans agitation (condition contrôle), est réalisé par prélèvement homogène des surnageants (avant expérience et après expérience) puis centrifugation de ces surnageants pendant 5 minutes à
2000G, puis 30 mesure de la concentration en vésicules par Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight NS300, M:alvern Panalytical). Le détail des conditions opératoires et les résultats sont présentés ci-après.
Dans une flasque à agitation d'une contenance de 500 mL et possédant une pale d'un diamètre de 7,6 cm., 1,5.10' globules rouges sont introduits dans 150 mi, de DMEM
blanc. Une agitation est réalisée à 350 RPM pendant 2 heures, la longueur de Kolmogorov LK étant de 18,6 gm. Un contrôle est réalisé dans un tube à bouchon vissant, en utilisant 5,1.10' globules rouges dans 50 mL de DMEM blanc, ce tube contrôle étant maintenu fixe et n'étant pas agité. Les résultats (colonnes de résultats BR 500 mL ¨ TO
et BR
500 mL T2h) illustrent qu'une agitation de globules rouges à une longueur de Kolmogorov inférieure à 50 um telle que 18,6 um engendre la production de vésicules extracellulaires par ces globules rouges selon un rendement de 10,4 vésicules extracellulaires par globule rouge.
Dans une flasque à agitation d'une contenance de 1 L et possédant une pale d'un diamètre de 10,8 cm, 1,05.1011 globules rouges sont introduits dans 300 mlõ de DMEM
blanc. Une agitation est réalisée à 500 RPM pendant 2 heures, la longueur de Kolmogorov LK étant de 10,9 m. Un contrôle est réalisé dans un tube à bouchon vissant, en utilisant 1,15.10' globules rouges dans 50 mL de DMEM blanc, ce tube contrôle étant maintenu fixe et n'étant pas agité. Les résultats (colonnes de résultats BR IL ¨ TO et BR IL ¨
T2h) illustrent qu'une agitation de globules rouges à une longueur de Kolmogorov inférieure à
50 m telle que 10,9 um engendre la production de vésicules extracellulaires par ces globules rouges selon un rendement d'environ 100 vésicules extracellulaires par globule rouge.
Ainsi, plus la vitesse d'agitation augmente et la longueur de Kolmogorov diminue, plus la quantité de vésicules extracellulaires produites par globule rouge augmente.
La figure 15 illustre le chargement de vésicules extracellulaires en doxorubicine en présence d'une agitation turbulente.
Des cellules THP-1 sont lavées puis re-suspendues dans du RPMI dans lequel a été ajouté
I% en volume de pénicilline/streptomycine et 10 M de doxonlicine (Merck). Les cellules THP-1 sont introduites dans une flasque à agitation dont le milieu liquide est de 50 mL, la concentration en cellules THP-1 dans la flasque à agitation étant de cellules/mL de milieu liquide. Les cellules THP-1 sont agitées pendant 2 heures soit à 400 RPM, la longueur de Kolmogorov étant de 28 Itin (condition d'internalisation de la doxorubicine). Soit à 34 RPM, la longueur de Kolmogorov étant de 181 (condition contrôle = passif) ; les cellules TFIP-1 sont ensuite lavées puis à
nouveau agitées dans les mêmes conditions que précédemment à 400 RPM et longueur de Kolmogorov de 28 jim, dans du RPMI comprenant en outre 1% en volum.e de pénicilline/streptomycine. Les échantillons (comprenant les cellules THP-1 et les vésicules extracellulaires produites) sont ensuite centrifugés 5 minutes à
2000G. Le surnageant est ultracentriftigé 1h30 à 150 000G, puis les culots de vésicules sont re-suspendus dans du PBS (phosphate buffered saline, tampon phosphate salin), et lysés avec 0,3% de Triton X-100. La fluorescence est mesurée avec un spectrophotomètre à
fluorescence Hitachi F7000 (longueur d'onde d'excitation : 485nm, longueur d'onde d'émission : 560nm.).
Les résultats illustrent que pour un nombre de cellules de départ égal, la quantité de doxorubicine mesurée dans les vésicules extracellulaires après chargement et production par turbulence (condition turbulence) est bien plus élevée qu'après un chargement sans turbulence suivie d'une production en turbulence (condition contrôle = passif) : le chargement en doxorubicine passe de 0,08 nmol pour la fraction contenant les vésicules extracellulaires en condition contrôle (=passif) à 0,78 nmol pour la fraction contenant les vésicules extracellulaires en condition de turbulence.
Par ailleurs, un ratio appelé pureté a été déterminé ; il s'agit du ratio de la concentration en vésicules extracellulaires mesurée par NTA par la concentration en protéines (en gg/mL). La mesure par NTA de la concentration en vésicules extracellulaires est réalisée grâce au protocole suivant :
- prélèvement homogène du surnageant du milieu liquide des différentes conditions de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices de type THP-1 : milieu liquide des conditions de carence 2D 72h, milieu liquide de carence 3D 72h, milieu liquide après 3 heures d'agitation à 250 RPM, milieu liquide après 3 heures d'agitation à 500 RPM ; puis - centrifugation pendant 5 minutes à 2000 G ; puis - mesure de la concentration en vésicules extracellulaires et de leur distribution en taille par Nanoparticle Tracking Analysis (sur l'appareil NanoSight NS300 commercialisé par l'entreprise Malvem Panalytical).
La mesure de la concentration en protéines est réalisée par le test de Bradford (ThermoFisher S cientific).
La mesure de la concentration en protéines se faisant sans lyser les vésicules, on considère que le ratio de la concentration en vésicules extracellulaires par la concentration en protéines (¨pureté) est une indication des contaminants présents dans l'échantillon. Les résultats sont les suivants [Table 2]
Carence 2D Carence 3D 250 RPM 500 RPM
THP-1 4,83.108 9,928.108 3,67.108 1, .-HeLa N/A .2,71.108 6,74.108 6,55.108 Ces résultats démontrent que les échantillons de vésicules extracellulaires produites selon l'invention présentent une pureté similaire à celle des échantillons de vésicules extracellulaires produites en carence 2D et 3D. Cela illustre que le procédé
de production de vésicules extracellulaires selon la présente invention permet une augmentation de la quantité de vésicules extracellulaires produites et du rendement de production des vésicules extracellulaires, tout en maintenant le niveau de pureté par rapport aux méthodes de l'art antérieur.
La figure 7 illustre premièrement le nombre de vésicules produites en trois heures par des cellules productrices (6) de type Raji d'une part selon la méthode de l'art antérieur de carence 2D 72h et d'autre part dans un systèrne fluidique (1) dont le récipient (4) est une flasque à agitation d'une contenance de 100 mL, le milieu liquide (5) est de 50 mL, le diamètre de la pale est de 3,8 cm, l'agitation est de 500 RPM et la longueur de Kolmogorov LK est de 24 gm. Deuxièmement, cette figure illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites en trois heures par des cellules productrices (6) de type HeLa d'une part selon la m.éthode de l'art antérieur de carence 3D 72h et d'autre part dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) est une flasque à agitation d'une contenance de 100 mL, le milieu liquide (5) est de 50 mlõ le diamètre de la pale est de 3,8 cm, l'agitation est de 250 RPM et la longueur de Kolmogorov LK est de 41 m.
Cette figure illustre qu'une production de vésicules extracellulaires dans un système fluidique selon la présente invention et selon le procédé selon la présente invention, permet une production de vésicules extracellulaires en bien plus grande quantité et en moins de temps que l'art antérieur. De plus, cette figure illustre que tout type de cellules productrices peut être utilisé pour produire des vésicules extracellulaires dans un système fluidique selon la présente invention et selon le procédé selon la présente invention.
La figure 8a) illustre le nombre de cellules productrices du type Raji viables en suspension au cours du temps, soit après 72 heures en flasques classiques dans le milieu liquide (5) sans agitation (conditions appelées carence 2D ou carence 2D 72h dans la présente demande), soit après 3 heures en présence d'une agitation turbulente dans un système fluidique selon l'invention. Le système fluidique selon l'invention qui est utilisé dans cette figure est une flasque à agitation de 100 mL comprenant un milieu liquide (5) de 50 mL, un diamètre de la pale de 3,8 cm, une agitation de 500 RPM et une longueur de Kolmogorov LK de 24 iLtm. Un essai contrôle est réalisé et correspond à une flasque à
agitation de 100 mL comprenant un milieu liquide (5) de 50 mL, un diamètre de la pale de 3,8 cm, une agitation de 34 RPM et une longueur de Kolmogorov LK de 181 m.
Les concentrations et viabilités cellulaires sont mesurées au NucleoCountee (NC-2001m commercialisé par l'entreprise Chemometec) aux temps t=Oh et soit t=3h soit t=72h.
Les résultats obtenus démontrent que le nombre de cellules productrices ne diminue pas significativement au cours de l'agitation turbulente selon l'invention, les cellules productrices résistent aux contraintes de cisaillement.
La figure 8b) illustre le pourcentage d'adénylate kinase dans le surnageant entre l'essai contrôle, l'essai en carence 2D 72h et l'essai selon l'invention. L'adénylate kinase est dosée dans le surnageant aux temps t=Oh et soit t=3h soit t=72h pour mesurer l'intégrité
des membranes grâce au ToxiLight Assay kit commercialisé par l'entreprise Lanza ; le contrôle positif (100% de lyse) est réalisé avec 0,3% en volume de Triton X-100 par rapport au volume du milieu liquide du contrôle.
Il apparait que la concentration d'adénylate kinase dans le surnageant ne varie pas significativement entre les différents essais, ce qui démontre l'absence d'endommagement des cellules et notamment le maintien de l'intégrité de leurs membranes cellulaires malgré le cisaillement.
De plus, la figure 9 illustre l'aspect des cellules productrices de type R.aji entre après 3 heures dans l'essai contrôle et après 3 heures dans le système fluidique selon l'invention (les essais contrôle et selon l'invention sont les mêmes que ceux en figure 8), par observation au microscope optique à un grossissement x4. Ces images illustrent le fait que même après l'action de la turbulence, il y a peu voire pas d'endommagement des cellules productrices, maintien de l'intégrité des cellules et identité de leur aspect avec les cellules de l'essai contrôle.
La figure 10 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules TFIP-1 humaines en flasques classiques dans le milieu liquide (5) sans agitation pendant 72 h (appelé carence 2D 72h), et dans un système fluidique en commandant un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur Li( est supérieure à
200 1.1m (appelé carence 3D). Ces conditions sont les conditions classiques de production de vésicules extracellulaires EV. La production de vésicules extracellulaires (EV) par cellules dans ces différentes conditions est significativement inférieure à la production dans un écoulement où la longueur Lk est inférieure à 17 pm.
La figure 11 illustre la distribution de taille des vésicules extracellulaires, produites à
partir de cellules productrices TI-1P-1, HeLa ou de Raji, en conditions de carence ou de .. turbulence par agitation à une vitesse de 500 RPM. Pour établir ces distributions, les surnageants des différents essais sont prélevés de manière homogène et centrifugés 5 min à 2000 g, puis la concentration en vésicules et la distribution en taille des particules sont mesurées par Nanoparticle Tracking Analysis (sur l'appareil NanoSight NS300 commercialisé par l'entreprise Malvern Panal.ytical). Ces résultats illustrent que les diamètres moyens et médians des vésicules extracellulaires produites selon l'invention sont similaires à la fois entre eux et avec ceux des vésicules extracellulaires produites selon les méthodes de l'art antérieur (carence).
Les figures 12 et 13 qui suivent correspondent aux résultats d'analyse de la distribution en taille de vésicules extracellulaires et des marqueurs membranaires de vésicules extracellulaires. Ces analyses sont effectuées grâce à l'appareil ExoViewTM
commercialisé par l'entreprise NanoView Bioscience. Les vésicules extracellulaires sont incubées sur une puce contenant des spots marqués avec différents anticorps (anti-CD81, anti-CD9, anti-CD63) ; après lavage, des anticorps secondaires anti-CD81 Alexa Fluor 555, anti-CD9 Alexa Fluor 647 et anti-CD63 Alexa Fluor 488 sont ajoutés.
Le recueil des images de fluorescence et d'interférométrie permettent d'obtenir les mesures des tailles et concentrations des vésicules extracellulaires dans le milieu liquide.
La figure 12 illustre la distribution en taille de vésicules extracellulaires produites selon l'invention durant 3 heures (turbulence) ou selon la méthode de carence 3D
durant 72 heures, dans les deux cas à partir de cellules productrices du type THP1.
Les vésicules extracellulaires produites selon l'invention sont produites à partir de cellules productrices de type THP1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide (5) de 50 mL, une vitesse d'agitation de 500 RPM, une longueur de Kol.mogorov Lk de 24 gm et un diamètre de la pale de 3,8 cm. Les vésicules extracellulaires produites selon la méthode de carence 3D 72 h sont produites à partir de cellules productrices de type THP1 dans une .. fiasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide de 50 mL, une vitesse d'agitation de 34 RPM, une longueur de Kol.mogorov Lk de 181 i.tm et un diamètre de la pale de 3,8 cm.
Les résultats donnent des valeurs de diamètres moyens des vésicules extracellulaires inférieurs à ceux donnés dans la figure 11, car la méthode d'analyse n'est pas la même (mesure par NTA dans la figure 11, qui ne permet pas la détection des vésicules extracellulaires de petite taille, contre mesure par l'ExoViewTM R.100 dans la figure 12).
Les résultats obtenus dans la figure 12 par l'ExoViewTM R100 concernent l'analyse des vésicules qui s'attachent à des anticorps de capture anti. CD9, CD63 et CD81.
Les résultats obtenus sont les suivants :
[Table 1]
Marqueurs membranaires Diamètre moyen des vésicules extracellulaires produites en fonction des conditions Carence 3D Turbulence (Lk = 24 1.1m) CD81 62,6 nm 63,6 mn CD63 59,0 nm 59,8 mn CD9 59,9 nm 60,9 nrn Ces résultats illustrent d'une part que les diamètres moyens des vésicules extracellulaires produites selon l'invention ou selon la méthode de carence 3D sont identiques et d'autre part que la distribution des marqueurs de membrane n'est pas la même en fonction de la méthode de production des vésicules extracellulaires (c'est-à-dire selon l'invention ou selon la méthode de carence 3D).
La figure 13 illustre l'analyse des marqueurs membranaires de deux types de vésicules extracellulaires:
- des vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices du type THP-1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide (5) de 50 mL, mie vitesse d'agitation de 500 RPM et une longueur de Kolmogorov de 24 itm, durant 3 heures ; et - des vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices du type en carence 3D 72h.
Les deux types de vésicules extracellulaires sont analysés avec l'ExoViewTm R100 de la manière suivante : les vésicules sont capturées par des anticorps (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81.) sur une puce, où les spots de chaque anticorps sont séparés. Puis, les vésicules capturées sont incubées avec un anticorps secondaire (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81 également) associé à un fluorophore, ce qui permet de faire de la colocalisation de ces marqueurs. Sur le graphique, les anticorps de capture sont représentés sur l'axe des abscisses tandis que les trois différentes colonnes par point d'abscisse représentent les 5 anticorps secondaires fluorescents. Ainsi, pour l'anticorps de capture CD81, toutes les vésicules capturées devraient être marquées par le fluorophore Alexa Fluor 555, sauf s'il n'y a plus d'épitope disponible.
Les résultats montrent d'une part que les marqueurs membranaires typiques de vésicules extracellulaires, à savoir CD81 et CD63 essentiellement, sont présents sur les vésicules 10 extracellulaires produites en présence d'une longueur de Kolmogorov de 24 m. Cela démontre que les particules produites par le procédé selon l'invention sont bien des vésicules extracellulaires, et qu'elles disposent des marqueurs spécifiques de leurs cellules productrices mères.
D'autre part, ces résultats montrent que pour les vésicules produites à 500 RPM, il y a le 15 même nombre de particules marquées par les fluorophores en CD81 et en CD63 sur l'anticorps de capture CD81, et à peu près la moitié des vésicules capturées par l'anticorps de capture CD63 sont marquées par fluorescence en CD81. III ya donc présence de ces deux marqueurs membranaires CD63 et CD81 sur les vésicules extracellulaires produites en présence d'une longueur de Kolmogorov de 24 m. On retrouve la même tendance de 20 présence et de colocalisation significative des deux marqueurs membranaires CD63 et CD81 sur les vésicules extracellulaires produites en carence 3D, mais les distributions relatives diffèrent de celles des vésicules extracellulaires produites en présence d'une longueur de Kolmogorov de 24 p.m.
La figure 14 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des globules 25 rouges après 2 heures d'agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov.
Le décompte des vésicules extracellulaires, après 2 heures d'agitation (conditions selon l'invention : BR. 500mL et BR 1L) ou 2 heures de maintien sans agitation (condition contrôle), est réalisé par prélèvement homogène des surnageants (avant expérience et après expérience) puis centrifugation de ces surnageants pendant 5 minutes à
2000G, puis 30 mesure de la concentration en vésicules par Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight NS300, M:alvern Panalytical). Le détail des conditions opératoires et les résultats sont présentés ci-après.
Dans une flasque à agitation d'une contenance de 500 mL et possédant une pale d'un diamètre de 7,6 cm., 1,5.10' globules rouges sont introduits dans 150 mi, de DMEM
blanc. Une agitation est réalisée à 350 RPM pendant 2 heures, la longueur de Kolmogorov LK étant de 18,6 gm. Un contrôle est réalisé dans un tube à bouchon vissant, en utilisant 5,1.10' globules rouges dans 50 mL de DMEM blanc, ce tube contrôle étant maintenu fixe et n'étant pas agité. Les résultats (colonnes de résultats BR 500 mL ¨ TO
et BR
500 mL T2h) illustrent qu'une agitation de globules rouges à une longueur de Kolmogorov inférieure à 50 um telle que 18,6 um engendre la production de vésicules extracellulaires par ces globules rouges selon un rendement de 10,4 vésicules extracellulaires par globule rouge.
Dans une flasque à agitation d'une contenance de 1 L et possédant une pale d'un diamètre de 10,8 cm, 1,05.1011 globules rouges sont introduits dans 300 mlõ de DMEM
blanc. Une agitation est réalisée à 500 RPM pendant 2 heures, la longueur de Kolmogorov LK étant de 10,9 m. Un contrôle est réalisé dans un tube à bouchon vissant, en utilisant 1,15.10' globules rouges dans 50 mL de DMEM blanc, ce tube contrôle étant maintenu fixe et n'étant pas agité. Les résultats (colonnes de résultats BR IL ¨ TO et BR IL ¨
T2h) illustrent qu'une agitation de globules rouges à une longueur de Kolmogorov inférieure à
50 m telle que 10,9 um engendre la production de vésicules extracellulaires par ces globules rouges selon un rendement d'environ 100 vésicules extracellulaires par globule rouge.
Ainsi, plus la vitesse d'agitation augmente et la longueur de Kolmogorov diminue, plus la quantité de vésicules extracellulaires produites par globule rouge augmente.
La figure 15 illustre le chargement de vésicules extracellulaires en doxorubicine en présence d'une agitation turbulente.
Des cellules THP-1 sont lavées puis re-suspendues dans du RPMI dans lequel a été ajouté
I% en volume de pénicilline/streptomycine et 10 M de doxonlicine (Merck). Les cellules THP-1 sont introduites dans une flasque à agitation dont le milieu liquide est de 50 mL, la concentration en cellules THP-1 dans la flasque à agitation étant de cellules/mL de milieu liquide. Les cellules THP-1 sont agitées pendant 2 heures soit à 400 RPM, la longueur de Kolmogorov étant de 28 Itin (condition d'internalisation de la doxorubicine). Soit à 34 RPM, la longueur de Kolmogorov étant de 181 (condition contrôle = passif) ; les cellules TFIP-1 sont ensuite lavées puis à
nouveau agitées dans les mêmes conditions que précédemment à 400 RPM et longueur de Kolmogorov de 28 jim, dans du RPMI comprenant en outre 1% en volum.e de pénicilline/streptomycine. Les échantillons (comprenant les cellules THP-1 et les vésicules extracellulaires produites) sont ensuite centrifugés 5 minutes à
2000G. Le surnageant est ultracentriftigé 1h30 à 150 000G, puis les culots de vésicules sont re-suspendus dans du PBS (phosphate buffered saline, tampon phosphate salin), et lysés avec 0,3% de Triton X-100. La fluorescence est mesurée avec un spectrophotomètre à
fluorescence Hitachi F7000 (longueur d'onde d'excitation : 485nm, longueur d'onde d'émission : 560nm.).
Les résultats illustrent que pour un nombre de cellules de départ égal, la quantité de doxorubicine mesurée dans les vésicules extracellulaires après chargement et production par turbulence (condition turbulence) est bien plus élevée qu'après un chargement sans turbulence suivie d'une production en turbulence (condition contrôle = passif) : le chargement en doxorubicine passe de 0,08 nmol pour la fraction contenant les vésicules extracellulaires en condition contrôle (=passif) à 0,78 nmol pour la fraction contenant les vésicules extracellulaires en condition de turbulence.
Par ailleurs, un ratio appelé pureté a été déterminé ; il s'agit du ratio de la concentration en vésicules extracellulaires mesurée par NTA par la concentration en protéines (en gg/mL). La mesure par NTA de la concentration en vésicules extracellulaires est réalisée grâce au protocole suivant :
- prélèvement homogène du surnageant du milieu liquide des différentes conditions de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices de type THP-1 : milieu liquide des conditions de carence 2D 72h, milieu liquide de carence 3D 72h, milieu liquide après 3 heures d'agitation à 250 RPM, milieu liquide après 3 heures d'agitation à 500 RPM ; puis - centrifugation pendant 5 minutes à 2000 G ; puis - mesure de la concentration en vésicules extracellulaires et de leur distribution en taille par Nanoparticle Tracking Analysis (sur l'appareil NanoSight NS300 commercialisé par l'entreprise Malvem Panalytical).
La mesure de la concentration en protéines est réalisée par le test de Bradford (ThermoFisher S cientific).
La mesure de la concentration en protéines se faisant sans lyser les vésicules, on considère que le ratio de la concentration en vésicules extracellulaires par la concentration en protéines (¨pureté) est une indication des contaminants présents dans l'échantillon. Les résultats sont les suivants [Table 2]
Carence 2D Carence 3D 250 RPM 500 RPM
THP-1 4,83.108 9,928.108 3,67.108 1, .-HeLa N/A .2,71.108 6,74.108 6,55.108 Ces résultats démontrent que les échantillons de vésicules extracellulaires produites selon l'invention présentent une pureté similaire à celle des échantillons de vésicules extracellulaires produites en carence 2D et 3D. Cela illustre que le procédé
de production de vésicules extracellulaires selon la présente invention permet une augmentation de la quantité de vésicules extracellulaires produites et du rendement de production des vésicules extracellulaires, tout en maintenant le niveau de pureté par rapport aux méthodes de l'art antérieur.
Claims (13)
1. Système fluidique (1) de production de vésicules extracellulaires (EV) à
partir de cellules productrices en suspension (6), com.prenant au moins un récipient (4), un milieu liquide (5) contenu par le récipient (4), des cellules productrices en suspension (6), un agitateur (7) de milieu liquide (5), des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur (7) adaptés pour la croissance des cellules productrices (6) en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de l'agitateur (7), l'agitateur (7) et la form.e et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cel iules productrices (6) afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 len.
partir de cellules productrices en suspension (6), com.prenant au moins un récipient (4), un milieu liquide (5) contenu par le récipient (4), des cellules productrices en suspension (6), un agitateur (7) de milieu liquide (5), des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur (7) adaptés pour la croissance des cellules productrices (6) en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de l'agitateur (7), l'agitateur (7) et la form.e et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cel iules productrices (6) afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 len.
2. Systèm.e fluidique (1) selon la revendication 1., com.prenant une sortie (9) et une connectique (13) reliée à la sortie (9), la connectique (13) étant susceptible de com.prendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV).
3. Système fluidique (1) selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel un agitateur (7) de milieu liquide est un. agitateur rotatif ou orbital dont la ou les vi.tesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient (4), à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient.
4. Système fluidique (1) selon l'une des revendications 1 à 3 comprenant un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV), relié fluidiquem.ent au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient (4) un milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV).
5. Procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à
partir de cellules productrices en suspension (6), comprenant :
- un moyen de commande de la vitesse d'un agitateur (7) adapté pour la croissance des cellules productrices (6) en suspension, et dont la form.e et les dimensions d'un récipient (4) sont adaptées à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant 5 inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm dans le récipient (4), le récipient (4) comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) en suspension, et - une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
partir de cellules productrices en suspension (6), comprenant :
- un moyen de commande de la vitesse d'un agitateur (7) adapté pour la croissance des cellules productrices (6) en suspension, et dont la form.e et les dimensions d'un récipient (4) sont adaptées à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant 5 inférieure ou égale à 50 pm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 pm dans le récipient (4), le récipient (4) comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) en suspension, et - une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
10 6. Procédé selon la revendication 5 dans lequel on agite le milieu liquide (5) pendant au moins vingt minutes.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 à 6 dans lequel un séparateur (15) appauvrit une partie du milieu liquide (5) collecté en sortie (9) du récipient (4) en vésicule extracellulaire (EV), et dans lequel on réintroduit la partie du milieu liquide 15 (5) dans le récipient (4).
8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7 dans lequel le procédé
comprend une étape préalable de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie présent dans le milieu liquide.
comprend une étape préalable de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie présent dans le milieu liquide.
9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8, dans lequel ledit écoulement permet 20 de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la m.embrane des cellules productrices (6) et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4).
l'intérieur ou à la m.embrane des cellules productrices (6) et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4).
10. Procédé de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules 25 productrices (6), comprenant les étapes suivantes :
- ajouter dans un récipient (4), un milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) et au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, - actionner une commande d'un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 itm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 ittn, ledit écoulement permettant de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), - collecter le milieu liquide (5) com.pren.ant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules 25 productrices (6), comprenant les étapes suivantes :
- ajouter dans un récipient (4), un milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) et au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie, - actionner une commande d'un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 itm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 ittn, ledit écoulement permettant de simultanément charger l'au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), - collecter le milieu liquide (5) com.pren.ant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
11. Vésicules extracellulaires obtenues par mise en oeuvre du système fluidique (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, et/ou par le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension (6) selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, et/ou par le procédé
de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6) selon la revendication 10.
de chargement d'au moins un agent thérapeutique et/ou d'imagerie à l'intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6) selon la revendication 10.
12. Vésicules extracellulaires selon la revendication 11, pour leur utilisation en imrnunothérapie, en rnédecine régénérative, en alternative ou en complément de la th.érapie cellulaire, en tant que vecteur pour délivrer au m.oins un agent thérapeutique, etiou dans le traitement de tum.eurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
13. Utilisation des vésicules extracellulaires selon la revendication 11 en tant que vecteur pour l'administration d'au moins un agent d'imagerie médicale.
1.4. Utilisation selon la revendication 13, dans laquelle l'au moins un agent d'irnagerie rnédicale est choisi parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
1.4. Utilisation selon la revendication 13, dans laquelle l'au moins un agent d'irnagerie rnédicale est choisi parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1874295 | 2018-12-28 | ||
| FR1874295A FR3091295B1 (fr) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe |
| PCT/FR2019/053309 WO2020136362A1 (fr) | 2018-12-28 | 2019-12-27 | Système fluidique de production de vésicules extracellulaires et procédé associé |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA3124605A1 true CA3124605A1 (fr) | 2020-07-02 |
Family
ID=67001928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA3124605A Pending CA3124605A1 (fr) | 2018-12-28 | 2019-12-27 | Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220119748A1 (fr) |
| EP (1) | EP3902904A1 (fr) |
| JP (1) | JP2022515269A (fr) |
| KR (1) | KR20210134611A (fr) |
| CN (1) | CN113748198B (fr) |
| CA (1) | CA3124605A1 (fr) |
| FR (1) | FR3091295B1 (fr) |
| MX (1) | MX2021007776A (fr) |
| WO (1) | WO2020136362A1 (fr) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112458055B (zh) * | 2020-11-24 | 2023-12-29 | 重庆大学 | 一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法 |
| US20240084300A1 (en) | 2020-12-21 | 2024-03-14 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Mirna composition comprising 11 specific mirnas and its use in the treatment of cancer |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2870348B1 (fr) * | 2004-05-14 | 2010-08-27 | Univ Angers | Methode pour diagnostiquer la presence et/ou la severite d'une pathologie hepathique chez un sujet |
| US7771988B2 (en) * | 2005-03-24 | 2010-08-10 | Hitachi, Ltd. | Control device for fermenter |
| JP2006296423A (ja) * | 2005-03-24 | 2006-11-02 | Hitachi Ltd | 培養槽の制御装置及び培養装置 |
| US9567559B2 (en) * | 2012-03-15 | 2017-02-14 | Flodesign Sonics, Inc. | Bioreactor using acoustic standing waves |
| JP5913084B2 (ja) * | 2012-12-26 | 2016-04-27 | 株式会社日立製作所 | 培養制御方法、細胞培養装置及び細胞特性評価装置 |
| EP3310365B1 (fr) * | 2015-06-16 | 2023-08-23 | Fondazione Città Della Speranza - Onlus | Vésicules extracellulaires issues de cellules de lignée ostéoblastique, à usage thérapeutique et diagnostique |
| CN108883138A (zh) * | 2015-12-30 | 2018-11-23 | 加利福利亚大学董事会 | 增强细胞衍生的囊泡的生产和分离的方法 |
| WO2017193075A1 (fr) * | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Terumo Bct, Inc. | Production et collecte automatisés |
| US11717480B2 (en) * | 2016-11-30 | 2023-08-08 | The Regents Of The University Of California | Extracellular vesicles and methods and uses thereof |
| FR3068361B1 (fr) * | 2017-06-30 | 2021-10-15 | Univ Paris Diderot Paris 7 | Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe |
-
2018
- 2018-12-28 FR FR1874295A patent/FR3091295B1/fr active Active
-
2019
- 2019-12-27 CA CA3124605A patent/CA3124605A1/fr active Pending
- 2019-12-27 JP JP2021537118A patent/JP2022515269A/ja active Pending
- 2019-12-27 CN CN201980093099.5A patent/CN113748198B/zh active Active
- 2019-12-27 EP EP19850769.1A patent/EP3902904A1/fr active Pending
- 2019-12-27 KR KR1020217023047A patent/KR20210134611A/ko unknown
- 2019-12-27 US US17/418,970 patent/US20220119748A1/en active Pending
- 2019-12-27 WO PCT/FR2019/053309 patent/WO2020136362A1/fr unknown
- 2019-12-27 MX MX2021007776A patent/MX2021007776A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113748198A (zh) | 2021-12-03 |
| US20220119748A1 (en) | 2022-04-21 |
| FR3091295B1 (fr) | 2023-05-26 |
| KR20210134611A (ko) | 2021-11-10 |
| EP3902904A1 (fr) | 2021-11-03 |
| FR3091295A1 (fr) | 2020-07-03 |
| CN113748198B (zh) | 2024-04-12 |
| JP2022515269A (ja) | 2022-02-17 |
| WO2020136362A1 (fr) | 2020-07-02 |
| MX2021007776A (es) | 2021-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109078176B (zh) | 肿瘤细胞膜包覆的纳米材料及其制备方法与应用 | |
| Alzhrani et al. | Exosomes: Isolation, characterization, and biomedical applications | |
| JP5667180B2 (ja) | 哺乳類の有核細胞に由来するマイクロベシクル及びその用途 | |
| CN103079592B (zh) | 使用来自细胞的微泡治疗和诊断癌症的方法 | |
| Kim et al. | Extracellular vesicle mimetics: novel alternatives to extracellular vesicle-based theranostics, drug delivery, and vaccines | |
| CN109666695B (zh) | 一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用 | |
| CN109078183B (zh) | 一种基于癌细胞膜的仿生多功能纳米制剂及其制备方法和应用 | |
| CA3068614A1 (fr) | Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe | |
| CA3124605A1 (fr) | Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe | |
| CN103002879A (zh) | 来自细胞原生质体的微泡及其应用 | |
| CN112494495B (zh) | 一种癌细胞膜嵌合脂质体纳米给药体系的制备方法 | |
| Ko et al. | Isolation of bovine milk exosome using electrophoretic oscillation assisted tangential flow filtration with antifouling of micro-ultrafiltration membrane filters | |
| CN113416693A (zh) | 一种间充质干细胞外泌体的制备方法 | |
| CN109576206A (zh) | 一种基于联合法分离外泌体的方法 | |
| CN109312285A (zh) | 非酶促方法和研磨装置 | |
| Kuruvinashetti et al. | Algal extracellular vesicles for therapeutic applications | |
| CA3124611A1 (fr) | Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires comprenant un agent therapeutique ou d'imagerie et procede associe | |
| CN113398135A (zh) | 一种用于hili原位检测与释药的纳米系统 | |
| CN102813942A (zh) | 脂质超声微泡介导的腺相关病毒基因转染制剂及制备工艺 | |
| FR3112147A1 (fr) | Procédé de calibration d’un système fluidique pour la production de vésicules extracellulaires et système fluidique de production associé | |
| WO2019157316A2 (fr) | Procédés et dispositifs pour l'isolement de composants subcellulaires | |
| CN114934010B (zh) | 红细胞膜在增加外泌体产量中的应用 | |
| He et al. | Revisiting the advances and challenges in the clinical applications of extracellular vesicles in cancer | |
| EP2087093B1 (fr) | Integration de molecules actives dans des micro algues | |
| CN114854667A (zh) | 一种猕猴桃来源的植物纳米囊泡及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request |
Effective date: 20231222 |