EP3902904A1 - Système fluidique de production de vésicules extracellulaires et procédé associé - Google Patents

Système fluidique de production de vésicules extracellulaires et procédé associé

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EP3902904A1
EP3902904A1 EP19850769.1A EP19850769A EP3902904A1 EP 3902904 A1 EP3902904 A1 EP 3902904A1 EP 19850769 A EP19850769 A EP 19850769A EP 3902904 A1 EP3902904 A1 EP 3902904A1
Authority
EP
European Patent Office
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extracellular vesicles
container
liquid medium
cells
producer cells
Prior art date
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Pending
Application number
EP19850769.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alice GRANGIER
Amanda SILVA
Florence GAZEAU
Claire WILHELM
Max PIFFOUX
François HESLOT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Paris
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Paris filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • C12M41/42—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of agitation speed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0097—Cells, viruses, ghosts, red blood cells, viral vectors, used for imaging or diagnosis in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the invention relates generally to the production of extracellular vesicles.
  • the invention relates more specifically to a system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension, a method for producing and recovering such vesicles and vesicles produced by such a system, the extracellular vesicles can for example be d interest as vectors of therapeutic and / or imaging agent, as an alternative to cell therapy and in regenerative medicine.
  • Extracellular vesicles are known to release extracellular vesicles into their environment, for example, in vivo, into the biological fluids of an organism. Extracellular vesicles have been identified as effective means of delivering drugs, in a personalized or targeted manner, into the human body. First, they have native biocompatibility and immune tolerance. They can also internalize theranostic nanoparticles, making it possible both to image certain parts of the body and to deliver active principles having therapeutic functions. Extracellular vesicles also have a function of intercellular communication: they allow, for example, to transport lipids, membrane and cytoplasmic proteins and / or nucleotides of the cell cytoplasm, such as non-coding mRNA, microRNA or long RNA , between different cells.
  • Extracellular vesicles also have a function of intercellular communication: they allow, for example, to transport lipids, membrane and cytoplasmic proteins and / or nucleotides of the cell cytoplasm, such as non-coding mRNA, micro
  • extracellular vesicles can make it possible to solve known problems during the therapeutic use of cells, such as cell replication, differentiation, vascular occlusions, the risks of rejection and the difficulties of storage and freezing.
  • cell replication, differentiation, vascular occlusions, the risks of rejection and the difficulties of storage and freezing There is therefore an industrial need for the production of cell vesicles in sufficient quantities for therapeutic use, in particular as a replacement or in addition to cellular therapies.
  • a first method consists in producing extracellular vesicles from endothelial cells of the umbilical cord vein (HUVEC), by subjecting these cells to hydrodynamic stresses mimicking the stresses exerted under physiological conditions within the blood capillaries or under pathological conditions during stenosis of blood vessels. These constraints are caused by the passage of producer cells through microfluidic channels.
  • a microfluidic chip includes two hundred channels in which cells are transported in a laminar flow, to produce vesicles in a parallelized fashion.
  • a second method commonly used in the literature and described by PifFoux et al. consists in cultivating HUVECs in a culture medium of DMEM type (English acronym for Dulbecco's Modified Eagle's Medium) without serum, for three days (technique called starvation in English, or serum deficiency). The absence of serum leads to cellular stress triggering a release of vesicles by the cells producers.
  • This method has a higher yield and makes it possible to produce a larger quantity of vesicles than the method using a microfluidic chip (approximately 4.10 4 vesicles per producing cell).
  • the calculated yield corresponds to a production time much longer than the production time of the previous method.
  • This method does not make it possible to produce a quantity of extracellular vesicles sufficient for the abovementioned applications.
  • this method does not make it possible to produce vesicles continuously since it induces cell death.
  • Watson et al (Watson, DC, Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G. & Jones, JC, 2016, Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) describe a method of producing vesicles which makes it possible to increase the quantity of vesicles produced.
  • This method consists in cultivating adherent cells of HEK293 type in culture flasks, then in hollow fiber membranes. The central passage of the hollow fibers makes it possible to convey the culture medium to the producer cells.
  • the producer cells are first sown around this passage, where they produce vesicles in an inter-fiber space.
  • the liquid medium included in the inter-fiber space is collected three times a week, making it possible to produce approximately 3.10 12 vesicles in several weeks, for very large quantities of seeded cells, for example of the order of 5.10 8 cells, causing a yield of approximately 6000 extracellular vesicles per cell and a very low purity ratio (for example 1.09 ⁇ 10 9 particles per microgram of proteins).
  • This production is however not high enough and too slow with regard to the aforementioned applications.
  • this method is described using producer cells corresponding to a cell line particularly resistant to culture in a medium lacking serum: this method may not be transposable to a production of vesicles by producer cells such as stem cells, for example human, less resistant and particularly suitable for the targeted therapeutic applications.
  • the culture of cells in suspension in 3 dimensions (3D) requires the use of a method with low agitation in order not to induce the death of the cells that one seeks to cultivate.
  • the Kolmogorov length is a criterion which makes it possible to evaluate the turbulence created by the mixing action and to determine when the turbulence is excessive for a 3D culture.
  • an object of the invention is to provide a solution for rapidly producing large quantities of extracellular vesicles from producer cells, more quickly than with known methods, under conditions which can be or can be made to comply with GMP Un standards.
  • Another object of the invention is to propose a solution making it possible to increase the yield of the vesicle production system, that is to say the ratio between the number of vesicles produced and the number of producer cells introduced into the production system. production.
  • Another object of the invention is to propose a system suitable for producing extracellular vesicles from a wide range of producer cells in suspension, regardless of the resistance of the type of cell introduced into the production system and which is resistant or not. serum deficiency.
  • the producing cells in suspension are of human, animal, plant origin or originating from bacteria or other microorganisms.
  • Another object of the invention is to propose a solution for producing and recovering extracellular vesicles continuously or discontinuously.
  • another object of the invention is to simplify the structure of the fluidic system for the production of vesicles and to reduce its manufacturing cost.
  • One of the aims of the invention is also the use of the vesicles produced by the fluidic system according to the invention, and / or obtained by the method of ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention.
  • another object of the invention is to provide a solution for loading the extracellular vesicles produced by the fluidic system of at least one therapeutic agent and / or imaging agent.
  • One of the aims of the invention is also the use of extracellular vesicles loaded with at least one therapeutic agent and / or imaging agent obtained by means of the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent using the inside or at the membrane of extracellular vesicles from producer cells according to the invention.
  • an object of the invention is a fluidic system for producing extracellular vesicles (EV) from producer cells in suspension, comprising at least one container, a liquid medium contained by the container, producer cells in suspension, a liquid agitator, means for controlling the speed of the agitator suitable for the growth of the producing cells in suspension, characterized in that it also comprises means for controlling the speed of the agitator and an agitator, the shape and dimensions of the container are suitable for generating a turbulent flow of the liquid medium in the container to exert shear stresses on the producing cells in order to achieve the production of extracellular vesicles (EV), the length of Kolmogorov from l the flow being less than or equal to 50 mm, preferably less than or equal to 40 mm; more preferably less than or equal to 35 mm.
  • the Kolmogorov length is from 5 to 50 mm, preferably from 5 to 41 mm, more preferably from 5 to 35 mm, even more preferably from 10 to 35 mm.
  • an object of the invention is a fluidic system for the production of extracellular vesicles (EV) from producer cells in suspension, comprising at least one container, a liquid medium contained in the container, producer cells in suspension, a liquid agitator, means for controlling the speed of the agitator suitable for the growth of the producing cells in suspension, characterized in that the means for controlling the speed of the agitator, the agitator and the shape and dimensions of the container are adapted to the generation of a turbulent flow of the liquid medium in the container to exert shear stresses on the producing cells in order to carry out the production of extracellular vesicles (EV), the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 50 mm, preferably less than or equal to 40 mm; more preferably less than or equal to 35 mm.
  • the Kolmogorov length is from 5 to 50 mm, preferably from 5 to 41 mm, preferably from 10 to 41 mm, more preferably from 5 to 35 mm, even more preferably from 10 to 35 mm.
  • the producer cells used in the context of the present invention are human cells, preferably healthy human cells.
  • the producer cells used in the context of the present invention are pathological cells, for example cancer cells such as HeLa cells.
  • the producer cells used in the context of the present invention are animal cells, preferably murine cells, for example murine MSC cells (murine mesenchymal stem cells).
  • the producer cells used in the context of the present invention are non-adherent cells.
  • the producer cells used in the context of the present invention are adherent cells detached from their culture support, for example by suitable treatment, for example enzymatic, for example chemical or for example mechanical or a combination of these means.
  • the producer cells used within the framework of the present invention are stem cells in particular induced pluripotent stem cells, multipotent cells for example multipotent mesenchymal cells, genetically modified cells or endothelial cells of the vein of the umbilical cord (HUVEC).
  • the producer cells used in the context of the present invention are stem cells in particular induced pluripotent stem cells, multipotent cells for example multipotent mesenchymal cells, genetically modified cells or cells endothelial from the umbilical cord vein (HUVEC) or primary cells in general.
  • stem cells in particular induced pluripotent stem cells, multipotent cells for example multipotent mesenchymal cells, genetically modified cells or cells endothelial from the umbilical cord vein (HUVEC) or primary cells in general.
  • the producer cells used within the framework of the present invention are cells of cell line, preferentially of human line of monocytes or of human line of cells of hematopoietic origin derived from B lymphocytes, more preferably it s are THP-1 cells or Raji cells.
  • the producer cells used in the context of the present invention are primary cells, for example red blood cells.
  • the producer cells used in the context of the present invention are cells originating from the subject for which the extracellular vesicles produced by said producer cells will be used, for example by administration or by ex vivo use.
  • the producer cells used in the context of the present invention are cells not originating from the subject for which the extracellular vesicles produced by said producer cells will be used, for example by administration or by ex vivo use.
  • the producer cells used in the context of the present invention are cells originating from the same species as the subject species for which the extracellular vesicles produced by said producer cells will be used.
  • the producer cells used in the context of the present invention are cells originating from a species different from the species of the subject for which the extracellular vesicles produced by said producer cells will be used.
  • the concentration of producer cells in the liquid medium of the fluid system container is between 50,000 and 500,000,000 producer cells per liter of liquid medium, preferably between 50,000,000 and 500,000,000 producer cells per liter , preferably between 50,000,000 and 300,000,000 per liter, more preferably between 200,000,000 and 300,000,000 per liter, even more preferably approximately 250,000,000 per liter of said liquid medium.
  • the concentration of producer cells in the liquid medium of the fluid system container is between 100,000 and 250,000,000 producer cells per liter of liquid medium.
  • the concentration of producer cells in the liquid medium of the fluid system container is between 50,000 and 900,000,000,000,000 producer cells per liter of liquid medium, preferably between 50,000,000 and 100,000,000,000,000 producer cells per liter, preferably between 50,000,000 and 10,000,000,000,000 per liter, even more preferably between 200,000,000 and 1,000,000,000,000 per liter.
  • the concentration of producer cells in the liquid medium of the container of the fluid system is between 100,000,000 and 1,000,000,000,000 producer cells per liter of liquid medium.
  • an object of the invention consists of the vesicles produced by the fluid system according to the invention.
  • an object of the invention is the use of the vesicles produced by the fluid system according to the invention to act on cells.
  • an object of the invention is the use of the vesicles produced by the fluid system according to the invention for imaging purposes and / or for therapeutic purposes.
  • the duration of the turbulent stirring at a Kolmogorov length less than or equal to 50 mm, for example from 17 to 35 mm is greater than or equal to 15 minutes, preferably from approximately 20 minutes to approximately 10 hours , more preferably from approximately 20 minutes to approximately 8 hours, even more preferably from approximately 1 hour to approximately 6 hours, even more preferably between approximately 2 hours and approximately 3 hours, even more preferably approximately 2 hours or alternatively approximately 3 hours or alternately about 4 hours.
  • the agitator of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is consisting of a blade.
  • said agitator consists of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more than 8 blades.
  • the at least one blade of said agitator is a vertical blade.
  • the agitator of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is an agitator of the propeller type, for example marine or propeller with profiled blades, or a turbine, for example turbine of Rushton, or a stirring anchor, or a barrier stirrer, or a helix with helical ribbons, or a paddle wheel, or a toothed wheel, or a magnetic stirrer or a combination of these agitators.
  • static structures may be present in the container, for example baffles, or else structures forming partial barriers to liquid movement, such as those used in a static mixer.
  • the agitator of the liquid medium and the dimensions of the container are adapted to control a flow of the liquid medium, the length of Kolmogorov of the flow being less than or equal to 50 mm, and preferably less than or equal to 40 mm; more preferably less than or equal to 35 mm.
  • the fluidic system comprises an outlet and a connector connected to the outlet, the connector being capable of comprising liquid medium and extracellular vesicles;
  • the agitator is preferably a rotary or orbital agitator whose rotation speed or speeds, shape and size are adapted, with the shape and dimensions of the container, to the generation of a turbulent flow of the liquid medium in the container;
  • the container is used or can be used in batch mode, that is to say that the liquid contained in the container is extracted after the producer cells have produced extracellular vesicles for a given time,
  • the fluidic system comprises a separator of extracellular vesicles
  • the fluidic system comprises a separator of extracellular vesicles fluidly connected to the container so as to be capable of reintroducing into the container a liquid medium depleted in extracellular vesicles (EV).
  • EV extracellular vesicles
  • the separator is positioned inside or outside the container, the liquid can be contained in the container and depleted in vesicles thanks to a separator internal to the container, while the cells are kept in the container or the liquid can be contained in the container and depleted in vesicles thanks to a separator outside the container.
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a stirring flask with a capacity of 100 ml (for example the Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, reference Bellco 505001), comprising a blade with a diameter of 3.8 cm and a working volume of less than 100 mL.
  • the receptacle of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producing cells in suspension according to the invention is a stirring flange whose structural characteristics (capacity, diameter of the blade and working volume) are all increased or decreased proportionally compared to those mentioned above for the shaking flask with a capacity of 100 mL; according to another embodiment, said characteristics structural are all increased or decreased in a non-proportional manner compared to those mentioned above for the flask with agitation of a capacity of 100 ml, in particular during a change of scale.
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a stirring flask with a capacity of 500 mL (for example the Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, reference Bellco 505010), comprising a blade with a diameter of 7.6 cm and a working volume of 200 mL to 500 mL, or a stirred flange with structural characteristics (capacity, blade diameter and volume working) are all increased or decreased proportionally compared to those mentioned above for the stirred flask with a capacity of 500 mL, or a stirred flange whose said structural characteristics are all increased or decreased in a non-proportional manner compared to those mentioned above for the shaking flask with a capacity of 500 mL, especially when changing the scale.
  • 500 mL for example the Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, reference Bellco 505010
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a stirred flask with a capacity of 1000 ml (for example the device Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, reference Bellco 505010), comprising a blade with a diameter of 10.8 cm and a working volume greater than or equal to 300mL and less than IL, or a flange with agitation whose structural characteristics (capacity, diameter of the blade and working volume) are all increased or decreased in proportion to those mentioned above for the stirred flask with a capacity of 1000 mL.
  • a stirred flask with a capacity of 1000 ml for example the device Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, reference Bellco 505010
  • a blade with a diameter of 10.8 cm and a working volume greater than or equal to 300mL and less than IL or a flange with agitation whose structural characteristics (capacity, diameter of the blade and working volume) are
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a bioreactor whose working volume is from 400 ml to 1000 ml and the diameter of the blade is 6 cm.
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a bioreactor whose working volume and the diameter of the blade are increased or decreased proportionally by compared to the respective values of 400 mL and 6 cm.
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a bioreactor with stirring means per blade, which the skilled person can have or design.
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention is a bioreactor whose working volume and the diameter of the blade are increased or decreased in a non-proportional manner compared to the respective values mentioned above, especially when changing the scale.
  • the container of the fluidic system for producing extracellular vesicles from producing cells in suspension according to the invention is a bioreactor or a flask with agitation whose geometric characteristics, working volume, type of mixer and its characteristics, and the operating mode are chosen according to practices accessible to those skilled in the art.
  • Another subject of the invention is a process for the ex vivo production of extracellular vesicles (EV) from producer cells in suspension, comprising:
  • the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 50 mm, preferably less than or equal to 40 mm in a container, the container comprising a outlet, the liquid medium comprising producer cells in suspension, and - a collection of the liquid medium comprising extracellular vesicles (EV) at the outlet of the container.
  • the agitator is controlled to cause a flow of the constant or intermittent liquid medium, of increasing or decreasing intensity, the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 40 mm;
  • a separator depletes part of the liquid medium collected at the outlet of the container in extracellular vesicles, and the part of the liquid medium is reintroduced into the container.
  • the process comprises a prior step of loading at least one therapeutic and / or imaging agent present in the liquid medium ,
  • the invention thus relates to a process for the ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells in suspension, comprising: (i) the insertion of producer cells into a container comprising a liquid medium;
  • the container in which the producer cells are inserted in step (i) is a fluidic system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention as described in the present application.
  • an object of the invention consists of the vesicles obtained by the method of ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention.
  • an object of the invention is the use of vesicles obtained by the method of ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention to act on cells.
  • an object of the invention is the use of vesicles obtained by the method of ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention for imaging purposes and / or for therapeutic purposes .
  • the invention is a method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles (EV) from producer cells, comprising the following steps : add to a container a liquid medium comprising producer cells and at least one therapeutic and / or imaging agent,
  • the agitator is controlled to cause a flow of the liquid medium, the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 40 mm;
  • the extracellular vesicles (EV) leaving the container comprise a mixture of extracellular vesicles loaded with at least one therapeutic and / or imaging agent or uncharged extracellular vesicles.
  • the at least one medical imaging agent is chosen, for example from a fluorescence agent, a luminescence agent, a radioactive isotope, a contrast agent with magnetic, plasmonic, acoustic or radio opaque properties and their mixtures.
  • the preferred characteristics in particular as regards the type of producer cells, their concentration in the liquid medium, the Kolmogorov length ranges, the duration of the turbulent agitation at a Kolmogorov length less than or equal to 50 mm, for example from 5 to 35 mm, and the capacity, working environment, the type of agitator and the diameter of the possible at least one blade of the fluidic system, which are described for the fluidic system above, are also preferred characteristics of the processes. according to the invention, namely the method of producing ex vivo extracellular vesicles from producer cells in suspension and the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles from producer cells.
  • an object of the invention consists of the vesicles obtained by the process of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside G or at the membrane of extracellular vesicles from producer cells according to the invention. 'invention.
  • an object of the invention is the use of vesicles obtained by the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or to the membrane of extracellular vesicles from producer cells according to the invention to act on cells.
  • an object of the invention is the use of vesicles obtained by the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles from producer cells. according to the invention for imaging purposes and / or for therapeutic purposes.
  • the subject of the invention is also the extracellular vesicles produced by the system for producing extracellular vesicles from producer cells in suspension according to the invention.
  • the invention also relates to the extracellular vesicles obtained by the process for the production and recovery of extracellular vesicles according to the invention.
  • the invention also relates to the extracellular vesicles obtained by the method of loading extracellular vesicles according to the invention.
  • the invention also relates to the extracellular vesicles obtained by implementing the fluidic system according to the invention as described in the present application, and / or by the method of ex vivo production of extracellular vesicles (EV) from producer cells. in suspension according to the invention as described in the present application, and / or by the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles (EV) at starting from producer cells according to the invention as described in the present application.
  • the extracellular vesicles varies as a function of the producer cells used and as a function of the production process used, in particular in terms of membrane markers and constituents present on these vesicles.
  • the extracellular vesicles according to the present invention have an average diameter between 40 and 300 nm, preferably between 45 and 90 nm, more preferably between 50 and 65 nm, even more preferably around 60 nm, said mean diameter of the extracellular vesicles being measured by a method interferometry in combination or not with fluorescence, preferably said average diameter is measured using the ExoView TM R100 device marketed by the company NanoView Bioscience.
  • the extracellular vesicles according to the present invention have an average diameter of between 50 and 500 nm, preferably between 100 and 110 nm, more preferably between 105 and 109 nm, even more preferably around 106 nm or alternatively around 108 nm , said mean diameter of the extracellular vesicles being measured by an individual particle tracking method (or NTA for Nanoparticle Tracking Analysis) for example with the NanoSight NS300 device marketed by the company Malvem Panalytical.
  • an individual particle tracking method or NTA for Nanoparticle Tracking Analysis
  • said extracellular vesicles have CD81, CD63, and / or CD9 membrane markers as described in FIG. 11. More advantageously, said extracellular vesicles express the CD81 and / or CD63 markers.
  • the extracellular vesicles produced from the fluid system according to the invention and / or according to the method according to the invention can be cooled to a desired temperature, for example approximately 4 degrees centigrade, or they can be frozen if desired for a transport.
  • the subject of the invention is also the use of the extracellular vesicles produced by the fluid system according to the invention as described in the present application, and / or obtained thanks to the process for the ex vivo production of extracellular vesicles (EV) from producing cells in suspension according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the process of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles ( EV) from producer cells according to the invention as described in the present application, as a vector for the administration of at least one medical imaging agent, for example for performing medical imaging.
  • the at least one medical imaging agent is chosen, for example, from a fluorescence agent, a luminescence agent, a radioactive isotope, a contrast agent with magnetic, plasmonic, acoustic or radio properties opaque and their mixtures.
  • the present invention also relates to the extracellular vesicles produced by the fluid system according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the method of ex vivo production of extracellular vesicles (EV) from producer cells in suspension.
  • the present invention also relates to the extracellular vesicles produced by the fluid system according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the method of ex vivo production of extracellular vesicles (EV) from producer cells in suspension. according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles (EV) from of producer cells according to the invention as described in the present application, for their use in immunotherapy, in regenerative medicine, as an alternative or in addition to cell therapy, as a vector for delivering at least one therapeutic agent and / or d and / or in the treatment of tumors, infectious diseases, inflammatory diseases, immunological diseases, metabolic diseases, cancer diseases, mala genetic diseases, degenerative diseases or diseases secondary to surgery or trauma.
  • the present invention also relates to a method of treatment in immunotherapy, in regenerative medicine, as an alternative or in addition to cell therapy, as vectors of at least one therapeutic and / or imaging agent, and / or of treatment.
  • tumors, infectious diseases, inflammatory diseases, immunological diseases, metabolic diseases, cancer diseases, genetic diseases, degenerative diseases or diseases secondary to surgery or trauma involving administration to a subject in need thereof of extracellular vesicles produced by the fluid system according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the process of ex vivo production of vesicles extracellular (EV) from producer cells in suspension according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the process of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or to the membrane of extracellular vesicles (EV) from producer cells according to the invention as described in the present application.
  • EV extracellular extracellular
  • the present invention also relates to the use of the extracellular vesicles produced by the fluidic system according to the invention as described in the present application, and / or obtained by the process of ex vivo production of extracellular vesicles (EV) from cells.
  • the therapeutic use of the extracellular vesicles, the extracellular vesicles for their therapeutic use, the methods of treatment or the use of the extracellular vesicles for their use for the manufacture of a medicament, as described below. above involves the administration and / or the ex vivo use of said extracellular vesicles.
  • the administration can for example be parenteral or enteral, such as an injectable administration (in particular intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrarachidian ...), oral buccal, cutaneous, local, vaginal, rectal, ocular, auricular, etc.
  • the invention relates to the extracellular vesicles according to the invention, as described in the present application, obtained from THP-1 producing cells or lymphocytes, for their use for example in immunotherapy and / or oncology.
  • the invention relates to the extracellular vesicles according to the invention, as described in the present application, obtained from producer cells which are mesenchymal stem cells (MSC), for their use in regenerative medicine or in the treatment of tumors, infectious diseases, inflammatory diseases, immunological diseases, metabolic diseases, cancer diseases, genetic diseases, degenerative diseases or diseases secondary to surgery or trauma.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • the invention relates to the extracellular vesicles according to the invention, as described in the present application, obtained from any type of cell or from red blood cells, and loaded with at least one therapeutic agent , for their use for delivering the at least one therapeutic agent in the body of a subject.
  • the invention relates to the use of the extracellular vesicles according to the invention, as described in the present application, obtained from any type of cell or from red blood cells, and loaded with at least an imaging agent, to perform a medical imaging examination.
  • the invention relates to the use of the extracellular vesicles according to the invention, as described in the present application, obtained from any type of cell or from red blood cells, and loaded with at least a therapeutic agent and at least one imaging agent, for monitoring the distribution of said extracellular vesicles in the body of a subject by medical imaging and delivering the at least one therapeutic agent in the body of said subject.
  • extracellular vesicle generally designates a vesicle released endogenously by a producer cell, the diameter of which is between 30 nm and 5000 nm.
  • An extracellular vesicle corresponds in particular to an exosome and / or a microvesicle and / or a cellular apoptotic body.
  • the term "suspended producer cell” generally refers to a cell that is not adherent to a medium and can divide and multiply.
  • the term “producer cells in suspension” designates human cells, of animal or vegetable origin, bacteria or other microorganisms capable of secreting extracellular vesicles.
  • the term “producer cells in suspension” designates adherent cells detached from their culture support and suspended. A gentle mixture created by G agitator allows the producer cells in suspension as defined to remain in suspension in the liquid culture medium.
  • the term “producer cells in suspension” denotes cellular aggregates.
  • the term “cellular aggregates" designates an assembly of several producer cells in suspension which adhere to one another. A gentle mixture created by the agitator allows the suspension producing cells as defined to remain in suspension in the liquid culture medium.
  • therapeutic agent or "imaging agent” generally designates any agent, molecule or particle, compound of interest which can be charged, inserted into the extracellular vesicles.
  • agents can be therapeutic agents molecules or particles to treat infectious, inflammatory, metabolic, degenerative, traumatic, post-surgical, genetic, malignant (tumors), orphan, vascular, lymphatic, locomotor, digestive, nervous, reproductive diseases , excretor and / or agents (molecules or particles) of nuclear, magnetic, optical, acoustic, etc.
  • the at least one medical imaging agent according to the present invention can advantageously be chosen from a fluorescence agent, a luminescence agent, a radioactive isotope, a contrast agent with magnetic, plasmonic, acoustic or radio opaque properties and their mixtures.
  • agitator must be understood in an extremely general sense, which is that of a means or a combination of means allowing by action on the liquid to generate at least one flow, to favor the mixing of the liquid or to generate turbulence in this liquid.
  • approximately placed before a number, means more or less 10% of the nominal value of this number.
  • cell refers to the smallest basic structural and functional unit of living organisms, consisting of a protoplasm or cytoplasm, separated from the external environment by a membrane. In the context of the present invention, the term “cell” also includes red blood cells and platelets.
  • healthy cells refers to cells from healthy tissue, as opposed to cells from tissue or pathological organs that is to say, whose functions are impaired.
  • between X and Y relates to the range of values between X and Y, the limits X and Y being included in said range.
  • immunotherapy refers to the treatment of a disease by an intervention on the immune system.
  • regenerative medicine refers to all of the biomedical methods used for the replacement or regeneration of human tissues or organs for therapeutic purposes.
  • subject refers to an animal, including a human being, male or female, regardless of age.
  • a subject may be a patient, namely a person receiving medical care, undergoing or having undergone medical treatment, or being monitored in the context of the development of a disease.
  • cell therapy refers to the use in humans of living somatic cells, manipulated or modified in their biological characteristics, to prevent, treat, or mitigate certain pathologies.
  • FIG. 1 schematically illustrates a fluid system for the production of extracellular vesicles
  • FIG. 2 illustrates the number of extracellular vesicles produced by THP1 cells in a fluid system after 20 minutes of shaking for different shaking intensities
  • FIG. 3 illustrates the number of extracellular vesicles produced by THP1 cells after 3 hours of agitation for different intensities of agitation
  • FIG. 4 illustrates the number of extracellular vesicles produced by THP1 cells in a fluid system after 20 minutes of agitation for different Kolmogorov lengths
  • FIG. 5 illustrates the number of extracellular vesicles produced by THP1 cells in a fluidic system for 200 RPM and 300 RPM agitation as a function of time
  • FIG. 6 illustrates the number of extracellular vesicles produced by C3H / 10T1 / 2 cells in a fluidic system after 20 minutes of agitation for different Kolmogorov lengths
  • FIG. 7 illustrates the number of extracellular vesicles produced by Raji cells and HeLa cells either in a fluid system after 3 hours of turbulent agitation (for HeLa cells the agitation is 250 RPM and Kolmogorov length of 41 mth and for the Raji cells the agitation is 500 RPM and the Kolmogorov length is 24 mm) or under conditions of deficiency;
  • FIG. 8 illustrates in 8a) the number of viable Raji cells before and after either turbulent agitation for 3 hours (500 RPM with Kolmogorov length of 24 mm), or deficiency conditions.
  • 8b) is illustrated the percentage of adenylate kinase in the supernatant of the control test, of the 72h 2D deficiency test and of the test according to the invention;
  • FIG. 9 illustrates the appearance of the Raji producing cells between after 3 hours in the control test and after 3 hours of turbulent agitation (500 RPM with Kolmogorov length of 24 mm), by observation under an optical microscope;
  • FIG. 10 illustrates the number of extracellular vesicles produced by THP-1 cells in 3D deficiency or in 2D deficiency for different times;
  • FIG. 11 illustrates the size distribution of extracellular vesicles produced from THP-1, HeLa or Raji producer cells, in deficiency or turbulence conditions (500 RPM with Kolmogorov length of 24 mm), measured by NTA;
  • FIG. 12 illustrates the size distribution of extracellular vesicles produced from THP-1 producer cells under conditions of deficiency for 72 h or turbulence for 3 hours (500 RPM with Kolmogorov length of 24 mm), measured by the ExoView TM R100;
  • FIG. 13 illustrates the analysis of the membrane markers of extracellular vesicles produced from THP-1 producer cells in conditions of deficiency or turbulence (500 RPM with Kolmogorov length of 24 mm), measured by the ExoView TM R100;
  • FIG. 14 illustrates the number of extracellular vesicles produced by red blood cells after 2 hours of agitation for different Kolmogorov lengths (18.6 mm for the top figure and 10.9 mm for the bottom figure versus a control without agitation) ;
  • the Kolmogorov length (or Kolmogorov dimension or Adeddy length) is the length from which the viscosity of a fluid makes it possible to dissipate the kinetic energy of a flow of this fluid.
  • the Kolmogorov length corresponds to the size of the smallest vortices in a turbulent flow.
  • This length L k is calculated in the publication by Kolmogorov (Kolmogorov, AN, 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) and described by the following formula (I):
  • N P is the number of power (or number of Newton) dimensionless of the agitator in the liquid medium
  • D is the diameter of the agitator (in meters)
  • N is the speed of rotation (in number of revolutions per second)
  • V is the volume of liquid medium (in cubic meters).
  • a person skilled in the art by means of his general knowledge and with alternative calculation methods, can calculate the Kolmogorov length per unit of volume. In any case, the calculation presented above is only one of the many known to those skilled in the art to calculate the length of Kolmogorov.
  • FIG. 1 schematically illustrates a fluidic system (1) for the production of extracellular vesicles (EV).
  • the fluidic system (1) for producing extracellular vesicles (EV) aims at producing a large quantity of extracellular vesicles (EV) in a container (4).
  • the invention is not limited to this embodiment and may include a series of containers (4) fluidly connected in parallel or in series.
  • the container (4) contains a liquid medium (5).
  • the container (4) can in particular be a tank, a flange, for example made of glass or plastic, or any other container adapted to contain a liquid medium (5).
  • the container can be flexible, or contain flexible parts.
  • the volume of the container (4) is one of the factors making it possible to produce extracellular vesicles (EV) in large quantities: this volume can be between 50 mL and 500 L, preferably between 100 mL and 100 L, and preferably between 300 mL and 40 L.
  • the volume of the container (4) illustrated diagrammatically in FIG. 1 is 1 L.
  • the container (4) typically comprises one or more gas inlets and one or more gas outlets, through which an atmosphere can flow including air, O 2 , N 2 and CO 2 concentrations suitable for cell culture, for example comprising 5% CO 2 .
  • This atmosphere can come from a suitable gas injector / mixer or from an oven with a CO 2 controlled atmosphere.
  • a second pump (17) makes it possible to control this gas flow in the container (4).
  • the container (4) also includes an outlet (9) capable of comprising liquid medium (5) and extracellular vesicles (EV). This outlet can be completed with a means of separation and / or filtration of the cells in suspension making it possible not to recover cells in suspension outside the container (4). This outlet (9) makes it possible to extract from the container (4) the extracellular vesicles (EV) produced.
  • the container (4) can also include at least one inlet (8) adapted to introduce the liquid medium (5) into the container (4).
  • the liquid medium (5) can generally be a saline solution, for example isotonic.
  • the liquid medium (5) is a liquid culture medium with the addition of compounds allowing the culture of the cells of interest, or a medium supplemented with serum or platelet lysate previously purified from the extracellular vesicles or a medium without serum, making it possible not to not contaminate the extracellular vesicles (EV) produced by the fluid system (1) with proteins or other vesicles from a platelet serum or lysate.
  • a liquid medium (5) of DMEM type without serum can be used.
  • the maximum volume of liquid medium (5) is partly determined by the container (4).
  • the fluid system (1) also includes suspended producer cells (6), the term suspended producer cells including both suspended cells (non-adherent cells) and suspended cells (adherent cells).
  • Extracellular vesicles (EV) are produced by the fluidic system (1) from these producer cells in suspension (6).
  • the producing cells in suspension (6) can be cultured, before the production of extracellular vesicles (EV) by the fluid system (1) in a suitable cell culture medium.
  • the fluidic system (1) is adapted so as to generate gentle agitation making it possible to homogenize the producer cells (6) in the liquid medium (5) within the container (4), preferably before the production of the extracellular vesicles.
  • any type of producer cells (6) can be used, preferably non-adherent suspension producer cells (6).
  • the container (4) also includes an agitator (7) for agitating the liquid medium (5).
  • the agitator (7) can be an impeller, the blades of which are at least partly immersed in the liquid medium (5), and set in motion by a transmission of magnetic or mechanical forces.
  • the agitator (7) can also be a liquid medium infusion system (5) at a rate sufficient to agitate the liquid medium (5) contained by the container, or a system with rotating walls (for example arranged on rollers) .
  • the agitator (7) can alternatively be of the bottle roller or bottle roller type, orbital agitator for Erlenmeyers, with or without baffles (shaken flask), rocking agitator (wave), biocontainer with pneumatic agitation (air-lift) or a rotary paddle agitator such as a marine propeller type agitator, Rushton turbine, stirring anchors, barrier agitator, helical ribbon propeller.
  • a preferred rotary agitator is a turbine with vertical blades.
  • static structures can be present in the container, for example baffles, or structures forming partial barriers to liquid movement, such as those used in a static mixer, can naturally also be used.
  • the agitator (7) and the dimensions of the container (4) are adapted to control a turbulent flow of the liquid medium (5) in the container (4).
  • the person skilled in the art by his general knowledge knows how to calculate the Kolmogorov length suitable for each type of agitator (7) according to the dimensions of the container (4), the geometry of the agitator (7) and the intensity of the agitation.
  • turbulent flow is meant a flow whose Reynolds number is greater than 2000.
  • the Reynolds number can for example be calculated by formula (IV).
  • the Reynolds Re number of the flow of liquid medium (5) is greater than 7,000, preferably over 10,000 and preferably over 12,000.
  • agitators (7) for controlling a turbulent flow according to the present invention are agitators well known to those skilled in the art and capable of being implanted in the system according to the present invention.
  • the agitator (7) used in the exemplary embodiments of the invention comprises an impeller or a blade arranged in a container (4) and set in motion by a system for transmitting magnetic or mechanical forces.
  • the speed of the impeller or the blade in the liquid medium (5) causes the liquid medium (5) to flow.
  • the agitator is adapted to control a flow, which, taking into account the dimensions of the container (4), is turbulent.
  • the agitator (7) is adapted to control a flow in which the length L k is less than or equal to 50 mm and preferably to 40 mm.
  • the speed of rotation of the agitator (7) can be controlled at 500 rpm (rotations per minute) for example, the diameter of a paddle wheel or the blade is 10.8 cm and the volume of liquid medium contained by the container (4) is 400 mL.
  • the number of NP power measured from the impeller or the blade in the liquid medium (5), by the formula (III), is substantially equal to 3.2.
  • the energy dissipated per unit of mass e, calculated, by formula (11), is equal to 6.80.10 -1 J .kg -1 .
  • the Kolmogorov length L k calculated by formula (I) is thus equal to 11.0 mm.
  • the fluid system (1) for the production of extracellular vesicles (EV) aims at the production in large quantity of extracellular vesicles (EV) in a container (4).
  • the invention is not limited to this embodiment and also makes it possible to load a large quantity of therapeutic agents and / or imaging agents into the extracellular vesicles (EV) produced according to the invention.
  • the suspended cells (6) and the at least one therapeutic and / or imaging agent are simultaneously suspended in the liquid medium (5) and mixed in the container (4).
  • the cells in suspension (6) can be added to the liquid medium (5) before or after the addition of the therapeutic agents and / or imaging agents to the said liquid medium (5).
  • any type of therapeutic or imaging agent can be used, preferably therapeutic agents molecules or particles to treat infectious, inflammatory, metabolic, degenerative, traumatic, post-surgical, genetic, malignant (tumors) diseases , orphans, of the vascular, lymphatic, locomotor, digestive, nervous, reproductive, excretory and / or agents (molecules or particles) of nuclear, magnetic, optical, acoustic imaging.
  • the container (4) also comprises an agitator (7) as described above and making it possible to agitate the liquid medium (5) comprising the producing cells in suspension (6) and the at least one therapeutic or imaging agent.
  • the fluidic system (1) is adapted so as to generate a gentle agitation making it possible to homogenize the producer cells (6) in the liquid medium (5) within the container (4) and this in order to effectively load the agents of interest in producer cells (6) and therefore in extracellular vesicles.
  • the invention is a process for the ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells, comprising: a control of an agitator (7) causing a turbulent flow of a liquid medium (5), the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 50 mm, preferably less than or equal to 40 mm in a container (4 ), the container comprising an outlet (9), the liquid medium (5) comprising producer cells (6) in suspension and the at least one therapeutic and / or imaging agent, and
  • the method according to the invention comprises a step of loading at least one therapeutic and / or imaging agent. More preferably, the step of loading said at least one therapeutic and / or imaging agent is simultaneous with the step of producing extracellular vesicles. Of course, this step can also be prior to the step of producing extracellular vesicles. Alternatively, the loading step may be subsequent to the step of producing extracellular vesicles.
  • This embodiment may be of interest in cases where it is desired to obtain a 1 st generation uncharged vesicles followed by a 2 nd production of extracellular vesicles loaded said at least one therapeutic agent and / or imaging, and this in the context of the establishment of a fluidic system with a collection of the liquid medium (5) continuously.
  • the flow which allows the suspension producing cells (6) to produce extracellular vesicles also makes it possible to simultaneously load at least one therapeutic and / or imaging agent into the suspension producing cells (6) and therefore producing said extracellular vesicles (EV) in a container (4) loaded with the at least one therapeutic and / or imaging agent.
  • the invention is a method of loading at least one therapeutic and / or imaging agent inside or at the membrane of extracellular vesicles (EV) from producer cells (6), comprising the following: following steps :
  • a liquid medium (5) comprising producer cells (6) and at least one therapeutic and / or imaging agent, actuate a control of an agitator (7) causing a turbulent flow of a liquid medium (5), the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 50 mm, preferably less than or equal to 40 mm, said flow allowing simultaneously load the at least one therapeutic agent and produce the extracellular vesicles (EV) in a container (4), the container comprising an outlet (9),
  • the extracellular vesicles (EV) at the outlet (9) of the container (4) comprise a mixture of extracellular vesicles loaded with at least one therapeutic and / or imaging agent and extracellular vesicles not loaded with at least one therapeutic agent. and / or imagery.
  • the container (4) can be for single use or sterilized before any introduction of liquid medium (5), producer cells (6) and at least one therapeutic agent or imaging agent.
  • the at least one therapeutic agent and / or imaging agent is incubated in the culture medium of the producer cells (6), comprising serum, in the container (4).
  • the producing cells (6) before being introduced into the fluidic system 1, are suspended by any means or a combination of means known to those skilled in the art, for example by means of a medium comprising trypsin or any other enzyme allowing the suspension of adherent cells known to those skilled in the art. They can then be centrifuged at 300 G for five minutes to be concentrated in the pellet of a tube, so as to replace the medium comprising trypsin with a DMEM medium.
  • the producer cells (6) are then introduced into the container (4), comprising culture medium and according to an alternative embodiment, the at least one therapeutic agent and / or imaging agent.
  • the producer cells (6) and the therapeutic agents and / or imaging agents are then agitated so as to bring the therapeutic agents and / or imaging agents into contact with the producer cells (6), and favor the loading of the therapeutic agents and / or imaging agents in producer cells (6). Agitation can resume periodically, so as to promote the homogeneity of the producer cells (6) and of the therapeutic agents and / or imaging agents in the liquid medium (5).
  • the homogenization of the elements present in the culture medium (5) is carried out with gentle agitation of the culture medium (for example the rotation of a paddle wheel at a speed of 20 rpm), as well as a regular replacement of the culture medium (for example a replacement of 5% to 40% of the culture medium every day, for example a replacement of 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% or 40% of the culture medium each day).
  • gentle agitation of the culture medium for example the rotation of a paddle wheel at a speed of 20 rpm
  • a regular replacement of the culture medium for example a replacement of 5% to 40% of the culture medium every day, for example a replacement of 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% or 40% of the culture medium each day.
  • Example of production of extracellular vesicles (EV) without loading of therapeutic agent and / or imaging agent The extracellular vesicles (EV) are produced in a container (4) containing a liquid medium (5), for example without serum, producing cells (6) in suspension.
  • the medium used before production for the culture of the producing cells (6) comprising serum, the container (4) is washed three to four times with liquid medium (5) DMEM without serum, each washing corresponding for example to a volume of '' about 400 mL.
  • the stirring of the liquid medium (5) is then controlled by the stirrer (7) so as to cause a turbulent flow in the container (4).
  • the stirring is preferably adjusted so as to control a flow of the liquid medium (5) in which the Kolmogorov length L k is less than or equal to 50 mm and preferably to 40 mm.
  • the agitation of the liquid medium (5) is controlled at least for twenty minutes, preferably for more than an hour, and preferably for more than two hours, for example about three hours.
  • the production of extracellular vesicles (EV) can be measured during production. To this end, the agitation can be continuous, intermittent, increasing or decreasing.
  • the producer cells (6) are left to sediment at the bottom of the container (4), then a sample of liquid medium (5) comprising extracellular EV vesicles is taken. We realize centrifugation of the sample at 2000 G for 10 minutes, so as to remove cellular debris.
  • the supernatant is analyzed by an individual particle tracking method (or NTA, acronym for Nanoparticle Tracking Analysis) so as to count the number of extracellular vesicles (EV) and to deduce the concentration of extracellular vesicles (EV) in the samples. . It can be checked that the concentration of extracellular vesicles (EV) at the start of agitation is close to zero or negligible.
  • NTA acronym for Nanoparticle Tracking Analysis
  • the extracellular vesicles (EV) produced can also be observed and / or counted by cryo-transmission electron microscopy.
  • a drop of 2.7 mL of solution comprising extracellular vesicles (EV) is placed on a grid suitable for cryo-microscopy, then immersed in liquid ethane, causing said drop to be almost instantaneous, avoiding the formation of ice crystals.
  • the grid supporting the extracellular vesicles (EV) is introduced into the microscope and the extracellular vesicles (EV) are observed at a temperature of the order of -170 ° C. Separation of extracellular vesicles
  • the extracellular vesicles (EV) produced in the container (4) can be extracted from the container (4) by the outlet (9) of the container (4), suspended in liquid medium (5).
  • a filter (18) can be arranged at the outlet (9) so as to filter the producing cells (6) in suspension and the cellular debris during the extraction of extracellular vesicles (EV) from the container (4).
  • a connector (13) is fluidly connected to the outlet (9), allowing the transport of the liquid medium (5) comprising the extracellular vesicles (EV) produced.
  • the fluid system (1) may include a separator (15) of extracellular vesicles (EV).
  • the separator (15) comprises an inlet to the separator (10), into which the liquid medium (5) comprising extracellular vesicles (EV) coming from the container (4) can be conveyed directly or indirectly.
  • the separator (15) can also include a first outlet (11) from the separator, through which the liquid medium (5) is capable of leaving the separator (15) with a concentration of extracellular vesicles (EV) smaller than at the inlet ( 10) of the separator (15), or even substantially zero.
  • the separator (15) may also include a second outlet (12) from the separator (15), through which the liquid medium (5) is capable of leaving the separator (15) with a higher concentration of extracellular vesicles (EV) than at the inlet (10) of the separator (15).
  • a second outlet (12) from the separator (15) through which the liquid medium (5) is capable of leaving the separator (15) with a higher concentration of extracellular vesicles (EV) than at the inlet (10) of the separator (15).
  • the separator (15) of extracellular vesicles (EV) can be fluidly connected to the container (4) so as to be capable of reintroducing a liquid medium (5) depleted in vesicles (EV) in the container (4), for example through the inlet (8) of the container (4).
  • the production and / or extraction of extracellular vesicles (EV) can (be) carried out continuously, with a substantially constant volume of liquid medium (5) in the container (4).
  • the fluidic system does not include a separator (15) of extracellular vesicles (EV) or the fluidic system comprises a separator (15) of extracellular vesicles (EV) which can be connected fluidically or not, for example by via a means for closing said separator (15), to the container (4).
  • the production and / or extraction of extracellular vesicles (EV) can (be) carried out discontinuously or continuously depending on the opening or closing of the closure means disposed upstream of the separator (15 ).
  • the container containing the producer cells is agitated and the production time is preferably chosen for a time (Tv) greater than 20 minutes.
  • Tv time
  • the liquid can then be extracted from the container, and can be subjected to one or more subsequent purification steps, in particular to separate the vesicles from the producing cells.
  • This separation can be carried out by means of techniques known to those skilled in the art, for example and taken without limitation, by acoustic techniques, filtration methods such as separation by tangential filtration, the use of rotary filters. or any combination of separation means.
  • the separation system is internal to the container, the vesicles are progressively separated in a sub-compartment of the container.
  • Various technical means are known to those skilled in the art for achieving this type of separation, for example and in a non- limiting, the use of rotary filters, or of acoustic means, or any combination of separation means.
  • the separation system between cells and vesicles can involve a fluid circuit designed to circulate the medium with the producer cells and vesicles between the container on the one hand and a separation system external to the container d 'somewhere else.
  • This separation system external to the container can involve techniques known to those skilled in the art, for example, and without limitation, tangential filtration, or acoustic separation, or any combination of means. separation known.
  • the liquid depleted in vesicles is reinjected into the container, so that the production of vesicles by the producer cells can continue in the container.
  • the liquid medium (5) can be extracted from the container (4) by a first pump (16), via a connector (13), of so as to transport the liquid medium (5) in a collector (19).
  • Another first pump (16 ') allows the liquid medium (5) contained in the collector (19) to be conveyed to the inlet (10) of the separator (15), via another connector.
  • the first outlet (11) of the separator (15) is connected to the container (4) via a connector, so as to reintroduce liquid medium (5) depleted in extracellular vesicles (EV) in the container (4).
  • the second outlet (12) of the separator (15) is connected to the collector (19) via a connector, so as to enrich the liquid medium (5) contained in the collector (19) with extracellular vesicles (EV).
  • the inlet (10) of the separator (15) can be directly connected to the outlet (9) of the container (4) (or via a first pump (16)).
  • the first outlet (11) of the separator (15) is connected to the container (4) and the second outlet (12) of the separator (15) is connected to the collector (19).
  • separators can also be arranged in series to vary the degree of separation into extracellular vesicles (EV) in the liquid medium (5), and / or in parallel to adapt the flow of liquid medium (5) in each separator (15) at the flow of a first pump (16). Influence of agitation on the production of extracellular vesicles (EV)
  • THP-1 cells derived from a human line of monocytes, are cultured in RPMI culture medium (Roswell Park Memorial Institute medium) at a concentration of 2.10 5 to 1.10 6 cells per milliliter of culture medium, at 37 °. C and under an atmosphere comprising 5% CO 2 .
  • the RPMI culture medium contains 10% by volume of fetal bovine serum and 1% by volume of penicillin / streptomycin, the volumes being expressed relative to the total volume of the RPMI culture medium. They are passed every 3 to 5 days by diluting them by a factor of 5 in new medium.
  • the cells of Raji are cultured in RPMI culture medium containing 10% by volume of fetal bovine serum and 1% by volume of penicillin / streptomycin, the volumes being expressed relative to the total volume of RPMI culture medium. They are passed every 3 to 4 days by diluting them by a factor of 10 to 20 in new medium.
  • C3H / 10T1 / 2 cells are multipotent mesenchymal cells from embryonic CH3 mouse cells, which are adherent. They are cultured in DMEM with 10% by volume of fetal bovine serum and 1% by volume of penicillin / streptomycin, the volumes being expressed relative to the total volume of the DMEM culture medium. They are passed every 3 to 5 days by diluting them by a factor between 2 and 10.
  • HeLa cells are a line of cells from cancer of the cervix. They are cultured in DMEM with 10% by volume of fetal bovine serum and 1% by volume of penicillin / streptomycin, the volumes being expressed relative to the volume total of DMEM culture medium. Initially adherent, these HeLa cells are detached with trypsin and then suspended in a bioreactor stirred at 50 RPM, and cultured at a concentration of between 10 5 / ml and 10 6 / ml.
  • FIG. 2 illustrates the number of extracellular vesicles produced by THF 1 cells in a fluidic system (1) for different agitations controlled by the agitator (7). The ordinate corresponds to the numbers of extracellular vesicles (EV) produced per cell in the container (4).
  • Each column corresponds to a production of extracellular vesicles (EV) for different speeds of rotation of the agitator (7) in the container (4).
  • the extracellular vesicles (EV) are produced from producer cells (6) of the THP1 type in the container (4) using a concentration of 100,000,000 cells in suspension (6) in 400 ml of liquid medium (5) in a stirring flask (spiruier flask in English) of 1000 ml.
  • FIG. 3 illustrates the number of extracellular vesicles produced by producer cells (6) of the THP-1 type for different agitations controlled by the agitator (7) in a fluidic system (1) including the container (4) and the quantity of liquid medium (5) are different from those used in the context of the experiment of FIG. 2, and over a longer stirring time, namely 3 hours instead of 20 minutes.
  • a 0.1 L shaking flask comprising 50 mL of liquid medium (5), 3553 extracellular vesicles are produced per producing cell in three hours with stirring at 250 RPM carried out by a blade 3.8 cm in diameter, the Kolmogorav L k length being 41 mm.
  • a 0.1 L stirred flask comprising 50 mL of liquid medium (5), approximately 17,400 extracellular vesicles are produced per producer cell in three hours with 300 RPM stirring carried out by a 3.8 cm diameter blade. , the length of Kolmogorov L k being equal to 35 mm.
  • a 0.1 L stirred flask comprising 50 mL of liquid medium (5), between 30,000 and 40,000 extracellular vesicles are produced per producer cell in three hours with stirring at 500 RPM carried out by a 3.8 cm blade in diameter, the Kolmogorov length L k being equal to
  • FIGS. 2 and 3 illustrate that, whatever the type of container (4), when the Kolmogorov length obtained by stirring the liquid medium (5) is between 5 and 50 mm, preferably between 10 mm and 41 mm, for example 11.4 mm, 13.8 mm, 17 mm, 23 mm, 24 mm, 35 mm and 41 mm, extracellular vesicles are produced by the producer cells in suspension in the liquid medium (5).
  • the more the Kolmogorov length decreases the more the number of extracellular vesicles produced per producer cell increases.
  • FIG. 4 illustrates the number of extracellular vesicles (EV) produced in a fluid system (1) for different lengths of Kolmogorov controlled by the agitator (7).
  • Extracellular vesicles (EVs) are produced from cells that produce (6) type THP1 in the container (4) using a concentration of 100,000,000 cells in suspension (6) in 400 ml of liquid medium (5) in a 1000 ml flash spinner.
  • the abscissa corresponds to the length L k entrained by the agitator (7) during the production of extracellular vesicles (EV), calculated by the formulas (I), (II) and (III).
  • FIG. 5 illustrates the number of extracellular vesicles produced per cell as a function of time, by human producing cells (6) of the THP-1 type in a fluid system by controlling the flow of the liquid medium (5) at 200 RPM stirrings and 300 RPM.
  • the conditions used are 100,000,000 cells in 400 mL in a 1000 mL spinner flask, with a blade of diameter 10.8 cm.
  • the lengths Lk calculated by the formulas (I), (II) and (III) are respectively 23 mm (for 300 RPM) and 17 mm (for 400 RPM).
  • the number of extracellular vesicles (EV) produced is much higher for a flow characterized by a length Lk of 17 mm than by a length Lk of 23 mm.
  • Figure 6 illustrates the number of extracellular vesicles produced by C3H / 10T1 / 2 producer cells (mesenchymal stem cells from mice) in a fluid system for different Kolmogorov lengths controlled by the agitator (7).
  • the abscissa corresponds to the length L k entrained by the agitator (7) during the production of extracellular vesicles EV, calculated by the formulas (I), (II) and (III).
  • the production of vesicles per cell increases significantly by controlling a flow of liquid medium (5) in which the length L k is 17 mm compared to the production of extracellular vesicles (EV) under lower stirring conditions.
  • the production efficiency of extracellular vesicles (EV) per producer cell is higher when the length L k is less than or equal to 50 mm with respect to longer lengths L k , in particular greater than 100 mm from which a plateau in EV / cell efficiency is reached.
  • FIG. 7 illustrates firstly the number of vesicles produced in three hours by producer cells (6) of the Raji type on the one hand according to the method of the prior art 2D 72h deficiency and on the other hand in a fluidic system (1 ) whose container (4) is a stirred flask with a capacity of 100 mL, the liquid medium (5) is 50 mL, the diameter of the blade is 3.8 cm, the stirring is 500 RPM and the length of Kolmogorov L k is 24 mm.
  • this figure illustrates the number of extracellular vesicles produced in three hours by producer cells (6) of the HeLa type on the one hand according to the method of the prior art 3D 72h deficiency and on the other hand in a fluidic system ( 1) whose container (4) is a flask with stirring with a capacity of 100 ml, the liquid medium (5) is 50 ml, the diameter of the blade is 3.8 cm, the stirring is 250 RPM and the length of Kolmogorov L k is 41 mm.
  • This figure illustrates that production of extracellular vesicles in a fluid system according to the present invention and according to the method according to the present invention allows production of extracellular vesicles in much greater quantity and in less time than the prior art.
  • this figure illustrates that any type of producer cell can be used to produce extracellular vesicles in a fluid system according to the present invention and according to the method according to the present invention.
  • FIG. 8a illustrates the number of viable Raji type producing cells in suspension over time, ie after 72 hours in conventional flasks in the liquid medium (5) without stirring (conditions called 2D deficiency or 2D deficiency 72 h in the present application ), or after 3 hours in the presence of turbulent agitation in a fluid system according to the invention.
  • the fluidic system according to the invention which is used in this figure is a flask with stirring of 100 ml comprising a liquid medium (5) of 50 ml, a diameter of the blade of 3.8 cm, a stirring of 500 RPM and a Kolmogorov L k length of 24 mm.
  • a control test is carried out and corresponds to a flask with stirring of 100 ml comprising a liquid medium (5) of 50 ml, a diameter of the blade of 3.8 cm, a stirring of 34 RPM and a length of Kolmogorov L k of 181 mm.
  • FIG. 8b illustrates the percentage of adenylate kinase in the supernatant between the control test, the 2D 72h deficiency test and the test according to the invention.
  • FIG. 9 illustrates the appearance of the Raji type producing cells between after 3 hours in the control test and after 3 hours in the fluid system according to the invention (the control tests and according to the invention are the same as those in figure 8), by observation under an optical microscope at a magnification x4.
  • FIG. 10 illustrates the number of extracellular vesicles produced by human THP-1 cells in conventional flasks in the liquid medium (5) without stirring for 72 h (called 2D deficiency 72 h), and in a fluid system by controlling a flow of the medium liquid (5) in which the length L k is greater than 200 mm (called 3D deficiency).
  • 2D deficiency 72 h the standard conditions for the production of EV extracellular vesicles.
  • the production of extracellular vesicles (EV) by cells in these different conditions is significantly lower than the production in a flow where the length Lk is less than 17 mm.
  • FIG. 11 illustrates the size distribution of the extracellular vesicles, produced from THP-1, HeLa or Raji producer cells, in conditions of deficiency or turbulence by agitation at a speed of 500 RPM.
  • the supernatants of the various tests are removed homogeneously and centrifuged for 5 min at 2000 g, then the concentration of vesicles and the distribution in particle size are measured by Nanoparticle Tracking Analysis (on the NanoSight NS300 device marketed by Malvem Panalytical).
  • Figures 12 and 13 correspond to the results of analysis of the size distribution of extracellular vesicles and membrane markers of extracellular vesicles. These analyzes are carried out using the ExoView TM R100 device marketed by the company NanoView Bioscience. The extracellular vesicles are incubated on a chip containing spots marked with different antibodies (anti-CD81, anti-CD9, anti-CD63); after washing, secondary anti-CD81 Alexa Fluor® 555, anti-CD9 Alexa Fluor® 647 and anti-CD63 Alexa Fluor® 488 antibodies are added. The collection of fluorescence and interferometry images makes it possible to obtain measurements of the sizes and concentrations of the extracellular vesicles in the liquid medium.
  • FIG. 12 illustrates the size distribution of extracellular vesicles produced according to the invention during 3 hours (turbulence) or according to the 3D deficiency method for 72 hours, in both cases from producer cells of the THP1 type.
  • the extracellular vesicles produced according to the invention are produced from producer cells of the THP1 type in a flask with stirring of 100 ml, a liquid medium (5) of 50 ml, a stirring speed of 500 RPM, a length of Kolmogorov Lk 24 mm and a blade diameter of 3.8 cm.
  • the extracellular vesicles produced according to the 72 h 3D deficiency method are produced from producer cells of the THP1 type in a 100 ml shaking flask, a 50 ml liquid medium, a stirring speed of 34 RPM, a length of Kolmogorov Lk of 181 mm and a diameter of the blade of 3.8 cm.
  • the results give values of average diameters of the extracellular vesicles smaller than those given in Figure 11, because the analysis method is not the same (measurement by NTA in Figure 11, which does not allow the detection of extracellular vesicles small, countermeasured by ExoView TM RI 00 in figure 12).
  • the results obtained in FIG. 12 by the ExoView TM RI 00 relate to the analysis of vesicles which attach to anti-CD9, CD63 and CD81 capture antibodies.
  • the two types of extracellular vesicles are analyzed with ExoView TM RI 00 as follows: the vesicles are captured by antibodies (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81) on a chip, where the spots of each antibody are separated. Then, the vesicles captured are incubated with a secondary antibody (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81 also) associated with a fluorophore, which makes it possible to co-locate these markers. On the graph, the capture antibodies are represented on the abscissa axis while the three different columns by abscissa point represent the fluorescent secondary antibodies. Thus, for the capture antibody CD81, all the captured vesicles should be labeled with the fluorophore Alexa Fluor® 555, unless there is no longer an epitope available.
  • Figure 14 illustrates the number of extracellular vesicles produced by red blood cells after 2 hours of agitation for different lengths of Kolmogorov.
  • the count of the extracellular vesicles, after 2 hours of stirring (conditions according to the invention: BR 500mL and BR 1 L) or 2 hours of maintenance without stirring (control condition), is carried out by homogeneous removal of the supernatants (before experiment and after experiment) then centrifugation of these supernatants for 5 minutes at 2000 G, then measurement of the concentration of vesicles by Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight NS300, Malvem Panalytical). The details of the operating conditions and the results are presented below.
  • red blood cells 1.5.10 11 red blood cells are introduced into 150 ml of white DMEM in a stirred flask with a capacity of 500 ml and having a blade with a diameter of 7.6 cm. Stirring is carried out at 350 RPM for 2 hours, the length of Kolmogorov L k being 18.6 mm.
  • a control is carried out in a screw cap tube, using 5.1 ⁇ 10 10 red blood cells in 50 ml of white DMEM, this control tube being kept fixed and not being agitated.
  • results illustrate that agitation of red blood cells at a Kolmogorov length of less than 50 mm such as 18.6 mm results in the production of extracellular vesicles by these cells red in a yield of 10.4 extracellular vesicles per red blood cell.
  • red blood cells are introduced into 300 ml of white DMEM. Stirring is carried out at 500 RPM for 2 hours, the length of Kolmogorov L k being 10.9 mm.
  • a control is carried out in a screw cap tube, using 1.15 ⁇ 10 10 red blood cells in 50 ml of white DMEM, this control tube being kept fixed and not being agitated.
  • results illustrate that agitation of red blood cells at a Kolmogorov length of less than 50 mm such as 10.9 mm results in the production of extracellular vesicles by these red blood cells according to a yield of approximately 100 extracellular vesicles per red blood cell.
  • FIG. 15 illustrates the loading of extracellular vesicles with doxorubicin in the presence of turbulent agitation.
  • THP-1 cells are washed and then re-suspended in RPMI in which 1% by volume of penicillin / streptomycin and 10 mM of doxorubicin (Merck) have been added.
  • THP-1 cells are introduced into a stirring flask whose liquid medium is 50 mL, the concentration of THP-1 cells in the shaking flask being 8.5 ⁇ 10 4 cells / mL of liquid medium.
  • the THP-1 cells are agitated for 2 hours, ie at 400 RPM, the Kolmogorov length being 28 mm (condition for internalization of doxorubicin).
  • the samples (comprising the THP-1 cells and the extracellular vesicles produced) are then centrifuged for 5 minutes at 2000G.
  • the supernatant is ultracentrifuged for 1 h 30 min at 150,000 G, then the vesicle pellets are resuspended in PBS (phosphate bujfered satine, phosphate buffered saline), and lysed with 0.3% of Triton® X-100. Fluorescence is measured with a Hitachi F7000 fluorescence spectrophotometer (excitation wavelength: 485nm, emission wavelength: 560nm).
  • a ratio called purity has been determined; this is the ratio of the concentration of extracellular vesicles measured by NTA by the protein concentration (in mg / mL).
  • the NTA measurement of the concentration of extracellular vesicles is carried out using the following protocol:
  • liquid medium of the 2D deficiency conditions 72 h liquid medium of 3D 72 h deficiency, liquid medium after 3 hours of stirring at 250 RPM, liquid medium after 3 hours of stirring at 500 RPM; then - centrifugation for 5 minutes at 2000 G; then

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Abstract

L'invention concerne un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l'agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de Γ agitateur, l'agitateur et la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 50 µm.

Description

SYSTÈME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VÉSICULES
EXTRACELLULAIRES ET PROCÉDÉ ASSOCIÉ
DOMAINE DE L’INVENTION L’invention concerne de manière générale la production de vésicules extracellulaires. L’invention se rapporte plus précisément à un système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, un procédé de production et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, les vésicules extracellulaires peuvent par exemple être d’intérêt comme vecteurs d’agent thérapeutiques et/ou d’imagerie, comme alternative à la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo , dans les fluides biologiques d’un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour délivrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d’abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également internaliser des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d’imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules.
En particulier, l’utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l’utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. 11 existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires.
A cet effet, PifFoux et al. (PifFoux, M., Silva, A. K., Lugagne, J. B., Hersen, P., Wilhelm, C., & Gazeau, F., 2017, Extracellular Vesicle Production Loaded with Nanoparticles and Drugs in a Trade-off between Loading, Yield and Purity: Towards a Personalized Drug Delivery System, Advanced Biosystems) décrivent la comparaison de différentes méthodes de production de vésicules extracellulaires.
Une première méthode consiste à produire des vésicules extracellulaires à partir de cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC), en soumettant ces cellules à des contraintes hydrodynamiques mimant les contraintes exercées dans des conditions physiologiques au sein des capillaires sanguins ou dans des conditions pathologiques lors de sténose des vaisseaux sanguins. Ces contraintes sont entraînées par le passage des cellules productrices dans des canaux microfluidiques. Une puce microfluidique comprend deux cents canaux dans lesquels les cellules sont transportées dans un écoulement laminaire, pour produire des vésicules de manière parallélisée.
Toutefois, cette méthode présente des problèmes de dimensionnement : les quantités de vésicules produites par une puce microfluidique ne sont pas adaptées aux quantités requises pour les applications susmentionnées. De plus, le rendement de vésicules extracellulaires produites par cellule introduite dans une telle puce (environ 2.104 vésicules par cellule) est très inférieur au rendement théorique maximum de vésicules produites par une cellule, par exemple de l’ordre de 3,5.106 vésicules par cellule pour une cellule de type MSC (acronyme de cellule souche mésenchymateuse en anglais). Enfin, cette méthode nécessite une conformité aux normes dite G.M.P. (acronyme anglais de Bonnes Pratiques de Fabrication), nécessaires à la fabrication de médicaments. Une deuxième méthode couramment utilisée dans la littérature et décrite par PifFoux et al. consiste à cultiver des HUVEC dans un milieu de culture de type DMEM (acronyme anglais de Dulbecco’s Modified Eagle's Medium ) sans sérum, pendant trois jours (technique dite de starvation en anglais, ou carence en sérum). L’absence de sérum entraîne un stress cellulaire déclenchant une libération de vésicules par les cellules productrices. Cette méthode présente un rendement plus élevé et permet de produire une plus grande quantité de vésicules que la méthode utilisant une puce microfluidique (environ 4.104 vésicules par cellule productrice). Toutefois, le rendement calculé correspond à une durée de production beaucoup plus longue que la durée de production de la méthode précédente. Cette méthode ne permet pas de produire une quantité de vésicules extracellulaires suffisante pour les applications susmentionnées. Enfin, cette méthode ne permet pas de produire des vésicules de manière continue car elle induit la mort des cellules.
Watson et al (Watson, D. C., Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G . & Jones, J. C., 2016, Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) décrivent une méthode de production des vésicules permettant d’augmenter la quantité de vésicules produites. Cette méthode consiste à cultiver des cellules adhérentes de type HEK293 dans des flasques de culture, puis dans des membranes à fibres creuses (Hollow Fiber Membrane en anglais). Le passage central des fibres creuses permet d’ acheminer le milieu de culture aux cellules productrices. Les cellules productrices sont au préalable ensemencées autour de ce passage, où elles produisent des vésicules dans un espace inter-fibre. Le milieu liquide compris dans l’espace inter-fibre est collecté trois fois par semaine, permettant de produire environ 3.1012 vésicules en plusieurs semaines, pour des quantités de cellules ensemencées très grandes, par exemple de l’ordre de 5.108 cellules, entraînant un rendement d’environ 6000 vésicules extracellulaires par cellule et un ratio de pureté très bas (par exemple 1,09.109 particules par microgramme de protéines). Cette production n’est toutefois pas assez élevée et trop lente au regard des applications susmentionnées. De plus, cette méthode est décrite en utilisant des cellules productrices correspondant à une lignée cellulaire particulièrement résistante à la culture en milieu dépourvu en sérum : cette méthode peut ne pas être transposable à une production de vésicules par des cellules productrices telles que des cellules souches, par exemple humaines, moins résistantes et particulièrement appropriées aux applications thérapeutiques visées.
Il est également bien connu de l’homme du métier que la culture de cellules en suspension en 3 dimensions (3D) nécessite d’utiliser une méthode à faible agitation afin de ne pas induire la mort des cellules qu’on cherche à cultiver. Il est notamment connu de l’homme du métier que la longueur de Kolmogorov est un critère qui permet d’évaluer la turbulence créée par l’action de mélange et de déterminer quand la turbulence est excessive pour une culture 3D.
RÉSUMÉ DE L’INVENTION
De façon surprenante et inattendue et contrairement aux idées communément acceptées dans le domaine de la culture de cellules à 3D, les inventeurs ont découvert que la génération d’un écoulement turbulent dans le milieu de culture permet d’obtenir une production rapide de vésicules en grande quantité et d’obtenir leur chargement.
Ainsi, un but de l’invention est de proposer une solution pour produire rapidement des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement qu’avec les méthodes connues, dans des conditions conformes ou pouvant être rendues conformes aux normes G.M.P. Un autre but de l’invention est de proposer une solution permettant d’augmenter le rendement du système de production de vésicules, c’est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules produites et le nombre de cellules productrices introduites dans le système de production. Un autre but de l’invention est de proposer un système adapté à produire des vésicules extracellulaires à partir d’une large gamme de cellules productrices en suspension, quelle que soit la résistance du type de cellule introduite dans le système de production et résistante ou non à une carence en sérum. Selon un autre aspect de l’invention, les cellules productrices en suspension sont d’origine humaine, animale, végétale ou provenant des bactéries ou d’autres microorganismes. Un autre but de l’invention est de proposer une solution pour produire et récupérer des vésicules extracellulaires en continu ou en discontinu. Enfin, un autre but de l’invention est de simplifier la structure du système fluidique pour la production de vésicules et de réduire son coût de fabrication. Un des buts de l’invention est encore l’utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l’invention, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention. Alternativement, un autre but de l’invention est de proposer une solution pour charger les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique d’au moins un agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie. Un des buts de l’invention est encore l’utilisation des vésicules extracellulaires chargées avec au moins un agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’ intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l’invention.
En particulier, un objet de l’invention est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce qu’il comprend également des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur et un agitateur dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 mm. Selon un mode de réalisation, la longueur de Kolmogorov est de 5 à 50 mm, préférentiellement de 5 à 41 mm, plus préférentiellement de 5 à 35 mm, encore plus préférentiellement de 10 à 35 mm.
Autrement exprimé, un objet de l’invention est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient, des cellules productrices en suspension, un agitateur de milieu liquide, des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de l’agitateur, l’agitateur et la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 mm. Selon un mode de réalisation, la longueur de Kolmogorov est de 5 à 50 mm, préférentiellement de 5 à 41 mm, préférentiellement de 10 à 41 mm, plus préférentiellement de 5 à 35 mm, encore plus préférentiellement de 10 à 35 mm. Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules humaines, préférentiellement des cellules humaines saines.
Alternativement, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules pathologiques, par exemple des cellules cancéreuses telles que des cellules HeLa.
Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules animales, de préférence des cellules murines, par exemple des cellules MSC murines (cellules souches mésenchymateuses murines).
Selon une caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules non-adhérentes.
Selon une autre caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules adhérentes détachées de leur support de culture, par exemple par traitement approprié, par exemple enzymatique, par exemple chimique ou par exemple mécanique ou une combinaison de ces moyens. Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules souches notamment des cellules souches pluripotentes induites, des cellules multipotentes par exemple des cellules mésenchymateuses multipotentes, des cellules génétiquement modifiées ou des cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC). Selon un mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules souches notamment des cellules souches pluripotentes induites, des cellules multipotentes par exemple des cellules mésenchymateuses multipotentes, des cellules génétiquement modifiées ou des cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC) ou des cellules primaires en général.
Selon un autre mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules de lignée cellulaire, préférentiellement de lignée humaine de monocytes ou de lignée humaine de cellules d’origine hématopoïétique dérivées de lymphocytes B, plus préférentiellement il s’agit de cellules THP-1 ou de cellules de Raji.
Selon un autre mode de réalisation, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules primaires, par exemple des globules rouges. Selon une caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées, par exemple par administration ou par utilisation ex vivo.
Selon une autre caractéristique préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules ne provenant pas du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées, par exemple par administration ou par utilisation ex vivo. Selon une caractéristique plus préférée, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant de la même espèce que l’espèce du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées. Alterativement, les cellules productrices utilisées dans le cadre de la présente invention sont des cellules provenant d’une espèce différente de l’espèce du sujet pour lequel les vésicules extracellulaires produites par lesdites cellules productrices seront utilisées.
Selon une caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 50 000 et 500 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide, de préférence entre 50 000 000 et 500 000 000 cellules productrices par litre, préférentiellement entre 50 000 000 et 300 000 000 par litre, plus préférentiellement entre 200 000 000 et 300 000 000 par litre, encore plus préférentiellement environ 250 000 000 par litre dudit milieu liquide. Selon une autre caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 100 000 et 250 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide.
Selon une caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 50 000 et 900 000 000 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide, de préférence entre 50 000 000 et 100 000 000 000 000 cellules productrices par litre, préférentiellement entre 50 000 000 et 10 000 000 000 000 par litre, encore plus préférentiellement entre 200 000 000 et 1 000 000 000 000 par litre. Selon une autre caractéristique préférée, la concentration des cellules productrices dans le milieu liquide du récipient du système fluidique est comprise entre 100 000 000 et 1 000 000 000 000 cellules productrices par litre de milieu liquide.
En particulier, un objet de l’invention est constitué par les vésicules produites par le système fluidique selon l’invention. En particulier, un objet de l’invention est l’utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l’invention pour agir sur des cellules.
En particulier, un objet de l’invention est l’utilisation des vésicules produites par le système fluidique selon l’invention à des fins d’imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
Selon un mode de réalisation, la durée de l’agitation turbulente à une longueur de Kolmogorov inférieure ou égale à 50 mm par exemple de 17 à 35 mm, est supérieure ou égale à 15 minutes, préférentiellement d’environ 20 minutes à environ 10 heures, plus préférentiellement d’environ 20 minutes à environ 8 heures, encore plus préférentiellement d’environ 1 heure à environ 6 heures, encore plus préférentiellement entre environ 2 heures et environ 3 heures, encore plus préférentiellement environ 2 heures ou alternativement environ 3 heures ou alternativement environ 4 heures.
Selon un mode de réalisation, l’agitateur du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est constitué d’une pale. Alternativement, ledit agitateur est constitué de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou plus de 8 pales.
Selon une caractéristique préférée, l’au moins une pale dudit agitateur est une pale verticale. Selon un mode de réalisation, l’agitateur du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est un agitateur du type hélice par exemple marine ou hélice à pales profilées, ou une turbine par exemple turbine de Rushton, ou une ancre d’agitation, ou un agitateur barrière, ou une hélice à rubans hélicoïdaux, ou une roue à aubes, ou une roue dentée, ou un agitateur magnétique ou une combinaison de ces agitateurs.
Dans un mode de réalisation, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique.
On comprend qu’avec un tel système, il est possible de produire des vésicules en grande quantité, et dans un système adapté ou qui peut être adapté aux normes G.M.P. On comprend également qu’un tel système est plus simple et moins coûteux à fabriquer que les systèmes connus pour produire des vésicules extracellulaires.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : l’agitateur du milieu liquide et les dimensions du récipient sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale 50 mm, et préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm ; plus préférentiellement inférieure ou égale à 35 mm.
le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ; l’agitateur est préférentiellement un agitateur rotatif ou orbital dont la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ;
le récipient est utilisé ou peut être utilisé en mode discontinu, c’est-à-dire que le liquide contenu dans le récipient est extrait après que les cellules productrices ont produit des vésicules extracellulaires pendant un temps donné,
le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires, le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires relié fluidiquement au récipient de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules extracellulaires (EV).
Le séparateur est positionné à l’intérieur ou à l’extérieur du récipient, le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri en vésicules grâce à un séparateur interne au récipient, tandis que les cellules sont maintenues dans le récipient ou le liquide peut être contenu dans le récipient et appauvri en vésicules grâce à un séparateur extérieur au récipient.
l’entrée du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient, la sortie du séparateur étant reliée fluidiquement au récipient de manière à être susceptible d’être réintroduit dans le récipient sous la forme d’un milieu liquide appauvri en vésicules. Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est une flasque à agitation d’une contenance de 100 mL (par exemple l’appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Bellco 505001), comprenant une pale d’un diamètre de 3,8 cm et un volume de travail inférieur à 100 mL. Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à agitation d’une contenance de 100 mL ; selon un autre mode de réalisation, lesdites caractéristiques structurelles sont toutes augmentées ou diminuées de manière non proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à agitation d’une contenance de 100 mL, notamment lors d’un changement d’échelle.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est une flasque à agitation d’une contenance de 500 mL (par exemple l’appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Bellco 505010), comprenant une pale d’un diamètre de 7,6 cm et un volume de travail de 200 mL à 500 mL, ou une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-avant pour la flasque à agitation d’une contenance de 500 mL, ou une flasque à agitation dont lesdites caractéristiques structurelles sont toutes augmentées ou diminuées de manière non proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-dessus pour la flasque à agitation d’une contenance de 500 mL, notamment lors d’un changement d’échelle.
Selon un mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est une flasque à agitation d’une contenance de 1000 mL (par exemple l’appareil Spinner stirring flask Bellco for cell suspensions, référence Bellco 505010), comprenant une pale d’un diamètre de 10,8 cm et un volume de travail supérieur ou égal à 300mL et inférieur à IL, ou une flasque à agitation dont les caractéristiques structurelles (contenance, diamètre de la pale et volume de travail) sont toutes augmentées ou diminuées de manière proportionnelle par rapport à celles mentionnées ci-avant pour la flasque à agitation d’une contenance de 1000 mL. Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est un bioréacteur dont le volume de travail est de 400 mL à 1000 mL et le diamètre de la pale est de 6 cm. Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est un bioréacteur dont le volume de travail et le diamètre de la pale sont augmentés ou diminués de manière proportionnelle par rapport aux valeurs respectives de 400 mL et 6 cm.
Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est un bioréacteur avec moyen d’agitation par pale, dont l’homme de l’art peut disposer ou concevoir. Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est un bioréacteur dont le volume de travail et le diamètre de la pale sont augmentés ou diminués de manière non proportionnelle par rapport aux valeurs respectives mentionnées ci-dessus, notamment lors d’un changement d’échelle. Selon un autre mode de réalisation, le récipient du système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention est un bioréacteur ou une flasque à agitation dont les caractéristiques géométriques, le volume de travail, le type de mélangeur et ses caractéristiques, et le mode de fonctionnement sont choisis selon des pratiques accessibles par l'homme de l'art. Un autre objet de l’invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension, comprenant :
- un moyen de commande de la vitesse d’un agitateur adaptés pour la croissance des cellules productrices en suspension, et dont la forme et les dimensions du récipient sont adaptés à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant des cellules productrices en suspension, et - une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient.
Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on agite le milieu liquide pendant au moins vingt minutes ;
- on commande l’agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide constant ou intermittent, d’intensité croissante ou décroissante, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 40 mm ;
- un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient.
Le procédé est alternativement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : le procédé comprend une étape préalable de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie présent dans le milieu liquide,
l’écoulement du milieu liquide permet de simultanément charger l’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur des cellules productrices et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient. L’invention porte ainsi sur un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension, comprenant : (i) l’insertion de cellules productrices dans un récipient comprenant un milieu liquide ;
(ii) l’actionnement d’une commande d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm, ledit écoulement permettant de produire les vésicules extracellulaires dans ledit récipient ; et
(iii) la collecte du milieu liquide comprenant les vésicules extracellulaires produites à l’étape (ii). Selon un mode de réalisation, le récipient dans lequel les cellules productrices sont insérées à l’étape (i) est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande. En particulier, un objet de l’invention est constitué par les vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention.
En particulier, un objet de l’invention est l’utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention pour agir sur des cellules.
En particulier, un objet de l’invention est l’utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention à des fins d’imagerie et/ou à des fins thérapeutiques. Selon un objet similaire, l’invention est un procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices, comprenant les étapes suivantes : ajouter dans un récipient un milieu liquide comprenant des cellules productrices et au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie,
actionner une commande d’un agitateur entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm, ledit écoulement permettant de simultanément charger l’au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient, le récipient comprenant une sortie, collecter le milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient. Le procédé est alterativement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l’une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles : on commande l’agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 40 mm ;
les vésicules extracellulaires (EV) en sortie du récipient comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie ou des vésicules extracellulaires non chargées.
Selon un mode de réalisation, l’au moins un agent d’imagerie médicale est choisi, par exemple parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Les caractéristiques préférées notamment quant au type de cellules productrices, à leur concentration dans le milieu liquide, aux gammes de longueur de Kolmogorov, à la durée de l’agitation turbulente à une longueur de Kolmogorov inférieure ou égale à 50 mm par exemple de 5 à 35 mm, et à la contenance, milieu de travail, au type d’agitateur et au diamètre de l’éventuelle au moins une pale du système fluidique, qui sont décrites pour le système fluidique ci-dessus, sont également des caractéristiques préférées des procédés selon l’invention, à savoir le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension et le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices.
En particulier, un objet de l’invention est constitué par les vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à G intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l’invention.
En particulier, un objet de l’invention est l’utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l’invention pour agir sur des cellules.
En particulier, un objet de l’invention est l’utilisation des vésicules obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices selon l’invention à des fins d’imagerie et/ou à des fins thérapeutiques.
L’invention a également pour objet les vésicules extracellulaires produites par le système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention.
L’invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires obtenues grâce au procédé de production et de récupération de vésicules extracellulaires selon l’invention.
L’invention porte également sur les vésicules extracellulaires obtenues grâce au procédé de chargement de vésicules extracellulaires selon l’invention.
L’invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires obtenues par mise en œuvre du système fluidique selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou par le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou par le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l’invention tel que décrit dans la présente demande.
Il est bien connu de l’homme du métier que la structure des vésicules extracellulaires varie en fonction des cellules productrices utilisées et en fonction du procédé d’obtention utilisé, notamment en termes de marqueurs membranaires et constituants présents sur ces vésicules. Selon un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires selon la présente invention présentent un diamètre moyen compris entre 40 et 300 nm, préférentiellement entre 45 et 90 nm, plus préférentiellement entre 50 et 65 nm, encore plus préférentiellement environ 60 nm, ledit diamètre moyen des vésicules extracellulaires étant mesuré par une méthode d’interférométrie en combinaison ou non avec de la fluorescence, de préférence ledit diamètre moyen est mesuré grâce à l’appareil ExoView™ R100 commercialisé par l’entreprise NanoView Bioscience.
Selon un mode de réalisation, les vésicules extracellulaires selon la présente invention présentent un diamètre moyen compris entre 50 et 500 nm, préférentiellement entre 100 et 110 nm, plus préférentiellement entre 105 et 109 nm, encore plus préférentiellement environ 106 nm ou alterativement environ 108 nm, ledit diamètre moyen des vésicules extracellulaires étant mesuré par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA pour Nanoparticle Tracking Analysis) par exemple avec l’appareil NanoSight NS300 commercialisé par l’entreprise Malvem Panalytical.
Avantageusement, lesdites vésicules extracellulaires présentent des marqueurs membranaires CD81, CD63, et/ou CD9 tel que décrit dans la figure 11. Plus avantageusement, lesdites vésicules extracellulaires expriment les marqueurs CD81 et/ou CD63. Les vésicules extracellulaires produites à partir du système fluidique selon l’invention et/ou selon le procédé selon l’invention peuvent être refroidies à une température souhaitée, par exemple environ 4 degrés centigrades, ou encore elles peuvent être congelées si on le souhaite pour un transport.
L’invention a aussi pour objet l’utilisation des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, en tant que vecteur pour l’administration d’au moins un agent d’imagerie médicale, par exemple pour réaliser une imagerie médicale. Selon un mode de réalisation, l’au moins un agent d’imagerie médicale est choisi, par exemple, parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges. La présente invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, pour leur utilisation thérapeutique.
La présente invention porte aussi sur les vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, pour leur utilisation en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteur pour délivrer au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie et/ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
La présente invention porte aussi sur une méthode de traitement en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteurs d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie, et/ou de traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes, impliquant l’administration à un sujet en ayant besoin de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’ intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l’invention tel que décrit dans la présente demande.
La présente invention porte aussi sur l’ utilisation des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, et/ou obtenues grâce au procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices selon l’invention tel que décrit dans la présente demande, en vue de la fabrication d'un médicament utilisé en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément à la thérapie cellulaire, en tant que vecteur d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie, et/ou utilisé dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes. Selon un mode de réalisation, l’utilisation thérapeutique des vésicules extracellulaires, les vésicules extracellulaires pour leur utilisation thérapeutique, les méthodes de traitement ou l’utilisation des vésicules extracellulaires pour leur utilisation en vue de la fabrication d’un médicament, telles que décrites ci-dessus, implique l’administration et/ou l’utilisation ex vivo desdites vésicules extracellulaires. L’administration peut par exemple être parentérale ou entérale, telles qu’une administration injectable (notamment intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrarachidienne...), orale buccale, cutanée, locale, vaginale, rectale, oculaire, auriculaire, etc.
Selon une caractéristique préférée, l’invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l’invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de cellules productrices THP-1 ou de lymphocytes, pour leur utilisation par exemple en immunothérapie et/ou cancérologie.
Selon une autre caractéristique préférée, l’invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l’invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de cellules productrices qui sont des cellules souches mésenchymateuses (MSC), pour leur utilisation en médecine régénérative ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
Selon une autre caractéristique préférée, l’invention porte sur les vésicules extracellulaires selon l’invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellules ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent thérapeutique, pour leur utilisation pour délivrer l’au moins un agent thérapeutique dans le corps d’un sujet. Selon une autre caractéristique préférée, l’invention porte sur l’utilisation des vésicules extracellulaires selon l’invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellules ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent d’imagerie, pour réaliser un examen d’imagerie médicale.
Selon une autre caractéristique préférée, l’invention porte sur l’utilisation des vésicules extracellulaires selon l’invention, telles que décrites dans la présente demande, obtenues à partir de tout type de cellule ou à partir de globules rouges, et chargées en au moins un agent thérapeutique et au moins un agent d’imagerie, pour réaliser le suivi de la distribution desdites vésicules extracellulaires dans le corps d’un sujet par imagerie médicale et délivrer l’au moins un agent thérapeutique dans le corps dudit sujet.
DÉFINITIONS
Le terme « vésicule extracellulaire » désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule extracellulaire correspond en particulier à un exosome et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire.
Le terme « cellule productrice en suspension » désigne de manière générale une cellule qui n’est pas adhérente sur un milieu et peut se diviser et se multiplier. Selon un autre aspect de l’invention, le terme « cellules productrices en suspension » désigne des cellules humaines, d’origine animale ou végétale, des bactéries ou autres micro-organismes capables de sécréter des vésicules extracellulaires. Selon un autre aspect de l’invention, le terme « cellules productrices en suspension » désigne des cellules adhérentes détachées de leur support de culture et mises en suspension. Un mélange doux créé par G agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture. Selon un autre aspect de l’invention, le terme « cellules productrices en suspension » désigne des agrégats cellulaires. Le terme « agrégats cellulaires » désigne un assemblage de plusieurs cellules productrices en suspension qui adhèrent entre elles. Un mélange doux créé par l’agitateur permet aux cellules productrices en suspension telles que définies de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.
Le terme « agent thérapeutique » ou « agent d’imagerie » désigne de manière générale tout agent, molécule ou particule, composé d’intérêt pouvant être chargé, inséré dans les vésicules extracellulaires. Ces agents peuvent être des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d’imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques, etc. Ainsi, l’au moins un agent d’imagerie médicale selon la présente invention peut avantageusement être choisi parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
Le terme « agitateur » doit être compris selon un sens extrêmement général, qui est celui d’un moyen ou d’une combinaison de moyens permettant par action sur le liquide de générer au moins un écoulement, de favoriser le mélange du liquide ou de générer de la turbulence dans ce liquide. Le terme « environ », placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.
Le terme « cellule » désigne la plus petite unité structurale et fonctionnelle fondamentale des organismes vivants, constituée d’un protoplasme ou cytoplasme, séparée du milieu externe par une membrane. Dans le cadre de la présente invention, le terme « cellule » englobe aussi les globules rouges et les plaquettes.
Le terme « cellules saines » désigne des cellules issues de tissus sains, par opposition à des cellules issues de tissus ou organes pathologiques c’est-à-dire dont les fonctions sont altérées.
Le terme « entre X et Y » concerne la gamme de valeurs comprises entre X et Y, les bornes X et Y étant incluses dans ladite gamme.
Le terme « immunothérapie » désigne le traitement d'une maladie par une intervention sur le système immunitaire.
Le terme « médecine régénérative » désigne l’ensemble des méthodes biomédicales utilisées pour le remplacement ou la régénération de tissus ou organes humains dans un but thérapeutique.
Le terme « sujet » désigne un animal, y compris un être humain, masculin ou féminin, quel que soit l’âge. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, à savoir une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie.
Le terme « thérapie cellulaire » désigne l’utilisation chez l'homme de cellules somatiques vivantes, manipulées ou modifiées en leurs caractéristiques biologiques, pour prévenir, traiter, ou atténuer certaines pathologies.
PRÉSENTATION DES FIGURES
D’autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles : [Fig. 1] illustre schématiquement un système fluidique pour la production de vésicules extracellulaires ;
[Fig. 2] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d’agitation pour différentes intensités d’agitations ;
[Fig. 3] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 après 3 heures d’agitation pour différentes intensités d’agitations ;
[Fig. 4] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique après 20 minutes d’agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ;
[Fig. 5] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP1 dans un système fluidique pour les agitations 200 RPM et 300 RPM en fonction du temps ;
[Fig. 6] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules C3H/10T1/2 dans un système fluidique après 20 minutes d’agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov ;
[Fig. 7] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules de Raji et des cellules HeLa soit dans un système fluidique après 3 heures d’agitation turbulente (pour les cellules HeLa l’agitation est de 250 RPM et longueur de Kolmogorov de 41 mth et pour les cellules de Raji l’agitation est de 500 RPM et longueur de Kolmogorov est de 24 mm) soit en conditions de carence ;
[Fig. 8] illustre en 8a) le nombre de cellules de Raji viables avant et après soit une agitation turbulente de 3 heures (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 mm), soit des conditions de carence. En 8b) est illustré le pourcentage d’adénylate kinase dans le surnageant de l’essai contrôle, de l’essai en carence 2D 72h et de l’essai selon l’invention ; [Fig. 9] illustre l’aspect des cellules productrices de Raji entre après 3 heures dans l’essai contrôle et après 3 heures d’agitation turbulente (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 mm), par observation au microscope optique ;
[Fig. 10] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP-1 en carence 3D ou en carence 2D pour différents temps ;
[Fig. 11] illustre la distribution de taille de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1, HeLa ou de Raji, en conditions de carence ou de turbulence (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 mm), mesurée par NTA ;
[Fig. 12] illustre la distribution de taille de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1 en conditions de carence pendant 72 h ou de turbulence pendant 3 heures (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 mm), mesurée par l’ExoView™ R100 ;
[Fig. 13] illustre l’analyse des marqueurs membranaires de vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices THP-1 en conditions de carence ou de turbulence (500 RPM avec longueur de Kolmogorov de 24 mm), mesurée par l’ExoView™ R100 ;
[Fig. 14] illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des globules rouges après 2 heures d’agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov (18,6 mm pour la figure du haut et 10,9 mm pour la figure du bas versus un contrôle sans agitation) ; et [Fig. 15] illustre le chargement de vésicules extracellulaires en doxorubicine à partir de cellules productrices THP-1 via un chargement passif (incubation avec la doxorubicine à 10 mM à 34 RPM avec longueur de Kolmogorov de 181 mm pendant 2h, suivie des lavages puis agitation à 2h à 400RPM avec longueur de Kolmogorov 28 mm) ou bien via un chargement et production en présence d’une agitation turbulente (pendant 2h à 400 RPM avec longueur de Kolmogorov de 28 mm avec la doxorubicine à 10 mM) suivie des lavages. DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Eléments théoriques
La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d’eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d’un fluide permet de dissiper l’énergie cinétique d’un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur Lk est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers , In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305) et décrite par la formule (I) suivante :
dans laquelle v est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et e est le taux moyen de dissipation d’énergie dans le fluide par unité de masse (ou taux d’injection d’énergie dans le fluide). Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impelle rs, AIChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre e moyen et la géométrie d’un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (II) suivante :
dans laquelle NP est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l’agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l’agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de e moyen correspondant à la géométrie d’un récipient et d’un agitateur utilisés pour la mise en œuvre de l’invention. Le nombre de puissance NP est donné de manière connue par la formule (III) : dans laquelle P est la puissance apportée par l’agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (III) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., & Miles, D., 1971, Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1), 41-43) ou Zhou et al (Zhou, G., Kresta, S. M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de Reynolds de l’écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (IV) suivante :
Alternativement, l’homme du métier de par ses connaissances générales et avec des modes de calcul alternatifs peut calculer la longueur de Kolmogorov par unité de volume. En tout état, le calcul présenté ci-dessus n’est qu’une façon parmi tant d’autres connues de l’homme du métier de calculer la longueur de Kolmogorov.
Architecture générale du système fluidique La figure 1 illustre schématiquement un système fluidique (1) pour la production de vésicules extracellulaires (EV). Le système fluidique (1) de production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4). Toutefois, l’invention n’est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients (4) reliés fluidiquement en parallèle ou en série.
Le récipient (4) contient un milieu liquide (5). Le récipient (4) peut notamment être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide (5). Le récipient peut être souple, ou contenir des parties souples. Le volume du récipient (4) est l’un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires (EV) en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume du récipient (4) illustré schématiquement dans la figure 1 est de 1 L. Le récipient (4) comprend typiquement une ou plusieurs entrées gazeuses et une ou plusieurs sorties gazeuses, par lesquelles peut s’écouler une atmosphère comprenant des concentrations en air, O2, N2 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d’un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d’une étuve à atmosphère contrôlée en CO2. Une deuxième pompe (17) permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient (4). Le récipient (4) comprend également une sortie (9) susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV). Cette sortie peut être complétée d’un moyen de séparation et/ou de filtration des cellules en suspension permettant de ne pas récupérer des cellules en suspension en dehors du récipient (4). Cette sortie (9) permet d’extraire hors du récipient (4) les vésicules extracellulaires (EV) produites. Le récipient (4) peut également comprendre au moins une entrée (8) adaptée à introduire le milieu liquide (5) dans le récipient (4).
Le milieu liquide (5) peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide (5) est un milieu liquide de culture avec adjonction de composés permettant la culture des cellules d’intérêt, ou un milieu complémenté en sérum ou lysat plaquettaire préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires (EV) produites par le système fluidique (1) par des protéines ou d’autres vésicules provenant d’un sérum ou lysat plaquettaire. Un milieu liquide (5) de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide (5) est déterminé en partie par le récipient (4). Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 300 mL et 40 L. Le volume minimum de milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) est en partie déterminé par le choix de l’agitateur (7) permettant d’agiter le milieu liquide (5). Le système fluidique (1) comprend également des cellules productrices en suspension (6), le terme cellules productrices en suspension incluant à la fois les cellules en suspension (cellules non-adhérentes) et les cellules mises en suspension (cellules adhérentes). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites par le système fluidique (1) à partir de ces cellules productrices en suspension (6). Les cellules productrices en suspension (6) peuvent être cultivées, avant la production de vésicules extracellulaires (EV) par le système fluidique (1) dans un milieu de culture cellulaire adapté. Ainsi, aucun transfert de cellules n’est nécessaire entre la culture des cellules productrices en suspension (6) et la production des vésicules extracellulaires (EV), ce qui permet d’éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. La majorité des cellules productrices en suspension (6) est en suspension de manière homogène dans le milieu, même si une proportion minoritaire de cellules productrices en suspension (6) peut être sédimentée au fond du récipient (4) ou collée sur la paroi du récipient (4), par exemple par l’agitation du milieu liquide (5). Préférentiellement, le système fluidique (1) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d’homogénéiser les cellules productrices (6) dans le milieu liquide (5) au sein du récipient (4), préférentiellement avant la production des vésicules extracellulaires. De manière générale, tout type de cellules productrices (6) peut être utilisé, de préférence des cellules productrices (6) en suspension non adhérentes.
Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) permettant d’agiter le milieu liquide (5). L’agitateur (7) peut être une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide (5), et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques ou mécaniques. L’agitateur (7) peut également être un système de perfusion de milieu liquide (5) à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide (5) contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L’agitateur (7) peut alterativement être du type rouleur à bouteilles ou rollers à bouteilles, agitateur orbital pour Erlenmeyers, avec ou sans baffles (shaken flask), agitateur à bascule (wave), biorécipient avec agitation pneumatique (air-lift) ou un agitateur rotatif à pales tel qu’un agitateur de type hélice marine, turbine de Rushton, ancres d’agitation, agitateur barrière, hélice rubans hélicoïdaux. Un agitateur rotatif préféré est une turbine à pales verticales. Enfin, des structures statiques peuvent être présentes dans le récipient, par exemple des baffles, ou encore des structures formant barrières partielles au mouvement liquide, telles celles utilisées dans un mélangeur statique, peuvent naturellement aussi être utilisées. L’agitateur (7) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4). L’homme du métier de par ses connaissances générales sait calculer la longueur de Kolmogorov adaptée pour chaque type d’agitateur (7) en fonction des dimensions du récipient (4), de la géométrie de l’agitateur (7) et de l’intensité de l’agitation. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (IV). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l’écoulement de milieu liquide (5) est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000.
D’autres agitateurs (7) permettant de commander un écoulement turbulent selon la présente invention sont des agitateurs bien connus de l’homme du métier et susceptibles d’être implantés dans le système selon la présente invention. L’agitateur (7) utilisé dans les exemples de réalisation de l’ invention comprend une roue à aube ou une pale agencée dans un récipient (4) et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques ou mécaniques. La vitesse de la roue à aube ou de la pale dans le milieu liquide (5) entraîne un écoulement du milieu liquide (5). L’agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient (4), est turbulent. Dans le cas de l’agitateur (7) illustré en figure 1, plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide (5), en particulier la viscosité cinématique v du milieu liquide (5), les dimensions du récipient (4) et en particulier le volume V de milieu liquide (5) contenu dans le récipient (4), le nombre de puissance NP correspondant à la partie immergée de la roue à aube ou de la pale, le diamètre D de l’agitateur et en particulier de la roue ou de la pale, la vitesse N de rotation de la roue ou de la pale. L’utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l’écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov Lk, telle que donnée par les équations (I), (II) et (III). En particulier, l’agitateur (7) est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur Lk est inférieure ou égale à 50 mm et préférentiellement à 40 mm.
Dans un exemple de réalisation du système fluidique (1), la vitesse de rotation de l’agitateur (7) est susceptible d’être commandée à 500 rpm (rotations par minute) par exemple, le diamètre d’une roue à aube ou de la pale est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient (4) est de 400 mL. Le nombre de puissance NP mesuré de la roue à aube ou de la pale dans le milieu liquide (5), par la formule (III), est sensiblement égal à 3,2. L’énergie dissipée par unité de masse e, calculée, par la formule (11), est égale à 6,80.10-1 J .kg-1. La longueur de Kolmogorov Lk calculée par la formule (I) est ainsi égale à 11,0 mm.
Aspect chargement d’agent thérapeutique ou d’imagerie Le système fluidique (1) pour la production de vésicules extracellulaires (EV) vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4). Toutefois, l’invention n’est pas limitée à ce mode de réalisation et permet également de charger en grande quantité des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie dans les vésicules extracellulaires (EV) produites selon l’invention. Ainsi, les cellules en suspension (6) et l’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie sont simultanément en suspension dans le milieu liquide (5) et mélangés dans le récipient (4). Alternativement, les cellules en suspension (6) peuvent être ajoutées dans le milieu liquide (5) avant ou après l’ajout des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie dans ledit milieu liquide (5). De manière générale, tout type d’agent thérapeutique ou d’imagerie peut être utilisé, de préférence des agents thérapeutiques molécules ou particules pour traiter les maladies infectieuses, inflammatoires, métaboliques, dégénératives, traumatiques, post-chirurgicales, génétiques, malignes (tumeurs), orphelines, du système vasculaire, lymphatique, locomoteur, digestif, nerveux, reproducteur, excréteur et/ou des agents (molécules ou particules) d’imagerie nucléaire, magnétique, optiques, acoustiques. Le récipient (4) comprend également un agitateur (7) tel que décrit précédemment et permettant d’agiter le milieu liquide (5) comprenant les cellules productrices en suspension (6) et l’au moins un agent thérapeutique ou d’imagerie. Préférentiellement, le système fluidique (1) est adapté de manière à générer une agitation douce permettant d’homogénéiser les cellules productrices (6) dans le milieu liquide (5) au sein du récipient (4) et ce afin de charger efficacement les agents d’intérêt dans les cellules productrices (6) et par conséquent dans les vésicules extracellulaires.
Selon un autre objet, l’invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant : une commande d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) en suspension et l’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie, et
une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend une étape de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie. Plus préférentiellement, l’étape de chargement dudit au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie est simultanée à l’étape de production de vésicules extracellulaires. Bien entendu, cette étape peut également être préalable à l’étape de production de vésicules extracellulaires. Alterativement, l’étape de chargement peut être postérieure à l’étape de production de vésicules extracellulaires. Ce mode de réalisation peut être d’intérêt dans le cas où l’on souhaite obtenir une 1ère production de vésicules non chargées suivie d’une 2ème production de vésicules extracellulaire chargées dudit au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie, et ce dans le cadre de la mise en place d’un système fluidique avec une collecte du milieu liquide (5) en continu. De manière surprenante, l’écoulement qui permet aux cellules productrices en suspension (6) de produire des vésicules extracellulaires permet également et simultanément de charger l’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie dans les cellules productrices en suspension (6) et par conséquent produire lesdites vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4) chargé de l’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie.
De manière préféré, l’invention est un procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant les étapes suivantes :
• ajouter dans un récipient (4), un milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) et au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie, actionner une commande d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm, ledit écoulement permettant de simultanément charger l’au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9),
collecter le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
Préférentiellement les vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4) comprennent un mélange de vésicules extracellulaires chargées d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie et de vésicules extracellulaires non chargées d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie.
Préparation du milieu de culture, des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie et des cellules productrices
Le récipient (4) peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide (5), de cellules productrices (6) et de l’au moins un agent thérapeutique ou agent d’imagerie. L’au moins un agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie est incubé dans le milieu de culture des cellules productrices (6), comprenant du sérum, dans le récipient (4).
Les cellules productrices (6), avant d’être introduites dans le système fluidique 1, sont mises en suspension par un moyen quelconque ou une combinaison de moyens connus de l’homme de l’art, par exemple au moyen d’un milieu comprenant de la trypsine ou toute autre enzyme permettant la mise en suspension de cellules adhérentes connue de l’homme du métier. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d’un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices (6) ensuite sont introduites dans le récipient (4), comprenant du milieu de culture et selon un mode de réalisation alternatif l’au moins un agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie. Les cellules productrices (6) et les agents thérapeutique et/ou agents d’imagerie sont ensuite agités de manière à mettre en contact les agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie et les cellules productrices (6), et favoriser le chargement des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie dans les cellules productrices (6). L’agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l 'homogénéité des cellules productrices (6) et des agents thérapeutiques et/ou agents d’imagerie dans le milieu liquide (5). Par exemple, l’homogénéisation des éléments présents dans le milieu de culture (5) est réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d’une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu’un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour, par exemple un remplacement de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% du milieu de culture chaque jour).
Exemple de production des vésicules extracellulaires (EV) sans chargement d’agent thérapeutique et/ou agent d’imagerie Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites dans un récipient (4) contenant un milieu liquide (5), par exemple sans sérum, des cellules productrices (6) en suspension. Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices (6) comprenant du sérum, on lave trois à quatre fois le récipient (4) avec du milieu liquide (5) DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d’environ 400 mL. On commande ensuite l’agitation du milieu liquide (5) par l’agitateur (7) de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient (4). L’agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur de Kolmogorov Lk est inférieure ou égale à 50 mm et préférentiellement à 40 mm. L’agitation du milieu liquide (5) est commandée au moins pendant vingt minutes, préférentiellement pendant plus d’une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures, par exemple environ trois heures. La production de vésicules extracellulaires (EV) peut être mesurée pendant la production. A cet effet, l’agitation peut être continue, intermittente, croissante ou décroissante. On laisse sédimenter les cellules productrices (6) au fond du récipient (4), puis on prélève un échantillon de milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation de l’échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticle Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires (EV) et d’en déduire la concentration en vésicules extracellulaires (EV) des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires (EV) au début de l’agitation est proche de zéro ou négligeable.
Les vésicules extracellulaires (EV) produites peuvent également être observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 mL de solution comprenant des vésicules extracellulaires (EV) est déposée sur une grille adaptée à la cryo-microscopie, puis plongée dans l’éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires (EV) est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires (EV) sont observées à une température de l’ordre de -170°C. Séparation des vésicules extracellulaires
Les vésicules extracellulaires (EV) produites dans le récipient (4) sont susceptibles d’être extraites du récipient (4) par la sortie (9) du récipient (4), suspendues dans du milieu liquide (5). Un filtre (18) peut être agencé à la sortie (9) de manière à filtrer les cellules productrices (6) en suspension et les débris cellulaires lors de l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) du récipient (4). Une connectique (13) est fluidiquement reliée à la sortie (9), permettant le transport du milieu liquide (5) comprenant les vésicules extracellulaires (EV) produites.
Le système fluidique (1) peut comprendre un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV). Le séparateur (15) comprend une entrée du séparateur (10), dans laquelle le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) issu du récipient (4) peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur (15) peut également comprendre une première sortie (11) du séparateur, par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus petite qu’en entrée (10) du séparateur (15), voire sensiblement nulle. Le séparateur (15) peut également comprendre une deuxième sortie (12) du séparateur (15), par laquelle le milieu liquide (5) est susceptible de sortir du séparateur (15) avec une concentration en vésicules extracellulaires (EV) plus élevée qu’en entrée (10) du séparateur (15).
De manière générale, le séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) peut être relié fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide (5) appauvri en vésicules (EV) dans le récipient (4), par exemple par l’entrée (8) du récipient (4). Ainsi, la production et/ou l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) peu(ven)t être réalisée(s) de manière continue, à volume de milieu liquide (5) sensiblement constant dans le récipient (4). Selon un mode de réalisation alternatif, le système fluidique ne comprend pas de séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) ou le système fluidique comprend un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV) pouvant être relié fluidiquement ou non, par exemple par l’intermédiaire d’un moyen de fermeture dudit séparateur (15), au récipient (4). Ainsi, la production et/ou l’extraction de vésicules extracellulaires (EV) peu(ven)t être réalisée(s) de manière discontinue ou continue en fonction de l’ouverture ou fermeture du moyen de fermeture disposé en amont du séparateur (15).
Dans le cas d’un fonctionnement en discontinu, le récipient contenant les cellules productrices est agité et la durée de production est choisie de préférence pour un temps (Tv) supérieur à 20 minutes. Le liquide peut ensuite être extrait du récipient, et peut être soumis à une ou plusieurs étapes de purification ultérieures, pour notamment séparer les vésicules des cellules productrices. Cette séparation peut être réalisée au moyen de techniques connues de l’homme de l’art, par exemple et pris de façon non limitative, par des techniques acoustiques, des méthodes de filtration telle la séparation par filtration tangentielle, l’utilisation de filtres rotatifs ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation.
Dans le cas d’un fonctionnement en continu et selon un mode de réalisation préféré, le système de séparation est interne au récipient, les vésicules sont séparées progressivement dans un sous-compartiment du récipient. Divers moyens techniques sont connus de l’homme de l’art pour réaliser ce type de séparation, par exemple et de façon non limitative, l’utilisation de filtres rotatifs, ou encore de moyens acoustiques, ou des combinaisons quelconques de moyens de séparation. Selon un autre mode de réalisation, le système de séparation entre cellules et vésicules peut faire intervenir un circuit fluidique conçu pour faire circuler le milieu avec les cellules productrices et les vésicules entre le récipient d’une part et un système de séparation extérieur au récipient d’autre part. Ce système de séparation extérieur au récipient peut faire intervenir des techniques connues de l’homme de l’art, par exemple, et de façon non-limitative, de la filtration tangentielle, ou de la séparation acoustique, ou encore des combinaisons quelconques de moyens de séparation connus. A la sortie du système de séparation, le liquide appauvri en vésicules est réinjecté dans le récipient, de façon à ce que la production de vésicules par les cellules productrices puisse continuer dans le récipient.
Dans l’exemple de réalisation d’un système fluidique (1) illustré dans la figure 1, le milieu liquide (5) peut être extrait du récipient (4) par une première pompe (16), via une connectique (13), de manière à transporter le milieu liquide (5) dans un collecteur (19). Une autre première pompe (16’) permet d’acheminer le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) à l’entrée (10) du séparateur (15), via une autre connectique. La première sortie (11) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4). La deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19) via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide (5) contenu dans le collecteur (19) en vésicules extracellulaires (EV). Dans une variante, l’entrée (10) du séparateur (15) peut être directement reliée à la sortie (9) du récipient (4) (ou par l’intermédiaire d’une première pompe (16)). La première sortie (11) du séparateur (15) est reliée au récipient (4) et la deuxième sortie (12) du séparateur (15) est reliée au collecteur (19). Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires (EV) dans le milieu liquide (5), et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide (5) dans chaque séparateur (15) au débit d’une première pompe (16). Influence de l’agitation sur la production des vésicules extracellulaires (EV)
Dans les figures qui suivent, différents types de cellules productrices sont utilisés. Avant leur utilisation pour la production de vésicules extracellulaires, ces cellules productrices sont mises en culture, à l’exception des globules rouges dont la préparation avant leur utilisation pour la production de vésicules extracellulaires consiste en l’obtention d’une suspension de globules rouges lavés à la concentration souhaitée dans du DMEM sans rouge de phénol.
Les cellules THP-1, issues d’une lignée humaine de monocytes, sont cultivées dans du milieu de culture RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) à une concentration de 2.105 à 1.106 cellules par millilitre de milieu de culture, à 37°C et sous une atmosphère comprenant 5% de CO2. Le milieu de culture RPMI contient 10% en volume de sérum bovin fœtal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture RPMI. Elles sont passées tous les 3 à 5 jours en les diluant d’un facteur 5 dans du milieu neuf. Les cellules de Raji, une lignée humaine de cellules d’origine hématopoïétique dérivées de lymphocytes B, sont cultivées dans du milieu de culture RPMI contenant 10% en volume de sérum bovin fœtal et 1 % en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture RPMI. Elles sont passées tous les 3 à 4 jours en les diluant d’un facteur de 10 à 20 dans du milieu neuf. Les cellules C3H/10T1/2 sont des cellules mésenchymateuses multipotentes issues des cellules embryonnaires de souris CH3, qui sont adhérentes. Elles sont cultivées dans du DMEM avec 10% en volume de sérum bovin fœtal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture DMEM. Elles sont passées tous les 3 à 5 jours en les diluant d’un facteur entre 2 et 10.
Les cellules HeLa sont une lignée de cellules issues d’un cancer du col de l’utérus. Elles sont cultivées dans du DMEM avec 10% en volume de sérum bovin fœtal et 1% en volume de pénicilline/streptomycine, les volumes étant exprimés par rapport au volume total du milieu de culture DMEM. Initialement adhérentes, ces cellules HeLa sont détachées avec de la trypsine puis mises en suspension dans un bioréacteur agité à 50 RPM, et cultivées à une concentration comprise entre 105/mL et 106/mL.
Avant d’utiliser les cellules productrices pour la production de vésicules extracellulaires, les cellules qui ont été mises en culture sont lavées puis re-suspendues dans du DMEM blanc, avec 1% en volume de pénicilline/streptomycine par rapport au volume du milieu DMEM, dans le contenant dans lequel la production de vésicules extracellulaires aura lieu (flasque, flasque à agitation ou bioréacteur, de préférence conformes aux normes G.M.P). La figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THF 1 dans un système fluidique (1) pour différentes agitations commandées par l’agitateur (7). L’ordonnée correspond aux nombres de vésicules extracellulaires (EV) produites par cellule dans le récipient (4). Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires (EV) pour différentes vitesses de rotation de l’agitateur (7) dans le récipient (4). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites à partir de cellules productrices (6) de type THP1 dans le récipient (4) en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension (6) dans 400 mL de milieu liquide (5) dans une flasque à agitation (spiruier flask en anglais) de 1000 ml. Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires (EV) est observable en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la production correspond à la colonne 300 RPM soit une longueur Lk égale ou inférieure à 17 mm par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d’agitation plus faible dans lequel la vitesse d’agitation est de 200 RPM soit une longueur Lk égale à 23 mm. De plus, dans des conditions d’agitation encore plus importantes, à savoir respectivement 400 RPM et 515 RPM, correspondant à l’obtention de longueurs Lk égales respectivement à 13,8 mm et 11,4 mm, la production de vésicules extracellulaires par cellule productrice augmente encore, de façon inversement proportionnelle à la longueur Lk. Cela illustre que plus l’agitation est importante, plus les cellules productrices produisent des vésicules extracellulaires. La figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices (6) de type THP-1 pour différentes agitations commandées par l’agitateur (7) dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) et la quantité de milieu liquide (5) sont différents de ceux utilisés dans le cadre de l’expérience de la figure 2, et sur une durée d’agitation plus longue à savoir 3 heures au lieu de 20 minutes. Dans une flasque à agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), 3553 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de 250 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorav Lk étant égale à 41 mm. Dans une flasque à agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), environ 17 400 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de 300 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov Lk étant égale à 35 mm. Dans une flasque à agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), entre 30 000 et 40000 vésicules extracellulaires sont produites par cellule productrice en trois heures sous une agitation de 500 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov Lk étant égale à
24 mm. Un essai contrôle correspondant à l’utilisation d’une flasque à agitation de 0,1 L comprenant 50 mL de milieu liquide (5), sous une agitation de 34 RPM réalisée par une pale de 3,8 cm de diamètre, la longueur de Kolmogorov Lk étant égale à 181 mm, conduit à la production d’environ 1 400 vésicules extracellulaires par cellule productrice en trois heures.
Les résultats des figures 2 et 3 illustrent que, quel que soit le type de récipient (4), lorsque la longueur de Kolmogorov obtenue par agitation du milieu liquide (5) est comprise entre 5 et 50 mm, de préférence entre 10 mm et 41 mm, par exemple 11,4 mm, 13,8 mm, 17 mm, 23 mm, 24 mm, 35 mm et 41 mm, des vésicules extracellulaires sont produites par les cellules productrices en suspension dans le milieu liquide (5). De plus, plus la longueur de Kolmogorov diminue, plus il y a augmentation du nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule productrice.
La figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires (EV) produites dans un système fluidique (1) pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l’agitateur (7). Les vésicules extracellulaires (EV) sont produites à partir de cellules productrices (6) de type THP1 dans le récipient (4) en utilisant une concentration de 100 000 000 de cellules en suspension (6) dans 400 mL de milieu liquide (5) dans une spinner flash de 1000 ml. L’abscisse correspond à la longueur Lk entraînée par l’agitateur (7) pendant la production de vésicules extracellulaires (EV), calculée par les formules (I), (II) et (III). Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires (EV) est observable en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la longueur Lk est inférieure à 17 mm par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d’agitation plus faible. Le rendement de production de vésicules extracellulaires (EV) par cellule productrice est plus important lorsque la longueur Lk est inférieure ou égale à 50 mm par rapport à des longueurs Lkplus grandes, notamment supérieures à 100 mm.
La figure 5 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par cellule en fonction du temps, par des cellules productrices (6) de type THP-1 humaines dans un système fluidique en commandant l’écoulement du milieu liquide (5) à des agitations 200 RPM et 300 RPM. Les conditions utilisées sont 100 000 000 cellules dans 400 mL dans une spinner flask de 1000 mL, avec une pale de diamètre 10,8 cm. Les longueurs Lk calculées par les formules (I), (II) et (III) sont respectivement de 23 mm (pour 300 RPM) et 17 mm (pour 400 RPM). Le nombre de vésicules extracellulaires (EV) produites est bien supérieur pour un écoulement caractérisé par une longueur Lk de 17 mm que par une longueur Lk de 23 mm. La figure 6 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules productrices C3H/10T1/2 (cellules souches mésenchymateuses issues de souris) dans un système fluidique pour différentes longueurs de Kolmogorov commandées par l’agitateur (7). Une concentration de 100 000 000 cellules productrices (6) dans 400 mL de milieu liquide (5) dans une spinner flask de 1000 mL a été utilisée. L’abscisse correspond à la longueur Lk entraînée par l’agitateur (7) pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (I), (II) et (III). La production de vésicules par cellule augmente de façon importante en commandant un écoulement de milieu liquide (5) dans lequel la longueur Lk est de 17 mm par rapport à la production en vésicules extracellulaires (EV) dans des conditions d’agitation plus faible. Le rendement de production de vésicules extracellulaires (EV) par cellule productrice est plus important lorsque la longueur Lk est inférieure ou égale à 50 mm par rapport à des longueurs Lkplus grandes, notamment supérieures à 100 mm à partir de laquelle un plateau du rendement EV/cellule est atteint.
La figure 7 illustre premièrement le nombre de vésicules produites en trois heures par des cellules productrices (6) de type Raji d’une part selon la méthode de l’art antérieur de carence 2D 72h et d’autre part dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) est une flasque à agitation d’une contenance de 100 mL, le milieu liquide (5) est de 50 mL, le diamètre de la pale est de 3,8 cm, l’agitation est de 500 RPM et la longueur de Kolmogorov Lk est de 24 mm. Deuxièmement, cette figure illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites en trois heures par des cellules productrices (6) de type HeLa d’une part selon la méthode de l’art antérieur de carence 3D 72h et d’autre part dans un système fluidique (1) dont le récipient (4) est une flasque à agitation d’une contenance de 100 mL, le milieu liquide (5) est de 50 mL, le diamètre de la pale est de 3,8 cm, l’agitation est de 250 RPM et la longueur de Kolmogorov Lk est de 41 mm. Cette figure illustre qu’une production de vésicules extracellulaires dans un système fluidique selon la présente invention et selon le procédé selon la présente invention, permet une production de vésicules extracellulaires en bien plus grande quantité et en moins de temps que l’art antérieur. De plus, cette figure illustre que tout type de cellules productrices peut être utilisé pour produire des vésicules extracellulaires dans un système fluidique selon la présente invention et selon le procédé selon la présente invention.
La figure 8a) illustre le nombre de cellules productrices du type Raji viables en suspension au cours du temps, soit après 72 heures en flasques classiques dans le milieu liquide (5) sans agitation (conditions appelées carence 2D ou carence 2D 72h dans la présente demande), soit après 3 heures en présence d’une agitation turbulente dans un système fluidique selon l’invention. Le système fluidique selon l’invention qui est utilisé dans cette figure est une flasque à agitation de 100 mL comprenant un milieu liquide (5) de 50 mL, un diamètre de la pale de 3,8 cm, une agitation de 500 RPM et une longueur de Kolmogorov Lk de 24 mm. Un essai contrôle est réalisé et correspond à une flasque à agitation de 100 mL comprenant un milieu liquide (5) de 50 mL, un diamètre de la pale de 3,8 cm, une agitation de 34 RPM et une longueur de Kolmogorov Lk de 181 mm. Les concentrations et viabilités cellulaires sont mesurées au NucleoCountei® (NC-200™ commercialisé par l’entreprise Chemometec) aux temps t=0h et soit t=3h soit t=72h.
Les résultats obtenus démontrent que le nombre de cellules productrices ne diminue pas significativement au cours de l’agitation turbulente selon l’invention, les cellules productrices résistent aux contraintes de cisaillement.
La figure 8b) illustre le pourcentage d’adénylate kinase dans le surnageant entre l’essai contrôle, l’essai en carence 2D 72h et l’essai selon l’invention. L’adénylate kinase est dosée dans le surageant aux temps t=0h et soit t=3h soit t=72h pour mesurer l’intégrité des membranes grâce au ToxiLight® Assay kit commercialisé par l’entreprise Lonza ; le contrôle positif (100% de lyse) est réalisé avec 0,3% en volume de Triton® X-100 par rapport au volume du milieu liquide du contrôle.
Il apparaît que la concentration d’adénylate kinase dans le surnageant ne varie pas significativement entre les différents essais, ce qui démontre l’absence d’endommagement des cellules et notamment le maintien de l’intégrité de leurs membranes cellulaires malgré le cisaillement.
De plus, la figure 9 illustre l’aspect des cellules productrices de type Raji entre après 3 heures dans l’essai contrôle et après 3 heures dans le système fluidique selon l’invention (les essais contrôle et selon l’invention sont les mêmes que ceux en figure 8), par observation au microscope optique à un grossissement x4. Ces images illustrent le fait que même après l’action de la turbulence, il y a peu voire pas d’endommagement des cellules productrices, maintien de l’intégrité des cellules et identité de leur aspect avec les cellules de l’essai contrôle.
La figure 10 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules THP-1 humaines en flasques classiques dans le milieu liquide (5) sans agitation pendant 72 h (appelé carence 2D 72h), et dans un système fluidique en commandant un écoulement du milieu liquide (5) dans lequel la longueur Lk est supérieure à 200 mm (appelé carence 3D). Ces conditions sont les conditions classiques de production de vésicules extracellulaires EV. La production de vésicules extracellulaires (EV) par cellules dans ces différentes conditions est significativement inférieure à la production dans un écoulement où la longueur Lk est inférieure à 17 mm.
La figure 11 illustre la distribution de taille des vésicules extracellulaires, produites à partir de cellules productrices THP-1, HeLa ou de Raji, en conditions de carence ou de turbulence par agitation à une vitesse de 500 RPM. Pour établir ces distributions, les surnageants des différents essais sont prélevés de manière homogène et centrifugés 5 min à 2000 g, puis la concentration en vésicules et la distribution en taille des particules sont mesurées par Nanoparticle Tracking Analysis (sur l’appareil NanoSight NS300 commercialisé par l’entreprise Malvem Panalytical). Ces résultats illustrent que les diamètres moyens et médians des vésicules extracellulaires produites selon l’invention sont similaires à la fois entre eux et avec ceux des vésicules extracellulaires produites selon les méthodes de l’art antérieur (carence).
Les figures 12 et 13 qui suivent correspondent aux résultats d’analyse de la distribution en taille de vésicules extracellulaires et des marqueurs membranaires de vésicules extracellulaires. Ces analyses sont effectuées grâce à l’appareil ExoView™ R100 commercialisé par l’entreprise NanoView Bioscience. Les vésicules extracellulaires sont incubées sur une puce contenant des spots marqués avec différents anticorps (anti-CD81, anti-CD9, anti-CD63) ; après lavage, des anticorps secondaires anti-CD81 Alexa Fluor® 555, anti-CD9 Alexa Fluor® 647 et anti-CD63 Alexa Fluor® 488 sont ajoutés. Le recueil des images de fluorescence et d’interférométrie permettent d’obtenir les mesures des tailles et concentrations des vésicules extracellulaires dans le milieu liquide.
La figure 12 illustre la distribution en taille de vésicules extracellulaires produites selon l’invention durant 3 heures (turbulence) ou selon la méthode de carence 3D durant 72 heures, dans les deux cas à partir de cellules productrices du type THP1. Les vésicules extracellulaires produites selon l’invention sont produites à partir de cellules productrices de type THP1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide (5) de 50 mL, une vitesse d’agitation de 500 RPM, une longueur de Kolmogorov Lk de 24 mm et un diamètre de la pale de 3,8 cm. Les vésicules extracellulaires produites selon la méthode de carence 3D 72 h sont produites à partir de cellules productrices de type THP1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide de 50 mL, une vitesse d’agitation de 34 RPM, une longueur de Kolmogorov Lk de 181 mm et un diamètre de la pale de 3,8 cm. Les résultats donnent des valeurs de diamètres moyens des vésicules extracellulaires inférieurs à ceux donnés dans la figure 11, car la méthode d’analyse n’est pas la même (mesure par NTA dans la figure 11, qui ne permet pas la détection des vésicules extracellulaires de petite taille, contre mesure par l’ExoView™ RI 00 dans la figure 12). Les résultats obtenus dans la figure 12 par l’ExoView™ RI 00 concernent l'analyse des vésicules qui s'attachent à des anticorps de capture anti CD9, CD63 et CD81.
Les résultats obtenus sont les suivants :
[Table 1]
Ces résultats illustrent d’une part que les diamètres moyens des vésicules extracellulaires produites selon l’invention ou selon la méthode de carence 3D sont identiques et d’autre part que la distribution des marqueurs de membrane n’est pas la même en fonction de la méthode de production des vésicules extracellulaires (c’est-à-dire selon l’invention ou selon la méthode de carence 3D). La figure 13 illustre l’analyse des marqueurs membranaires de deux types de vésicules extracellulaires :
- des vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices du type THP-1 dans une flasque à agitation de 100 mL, un milieu liquide (5) de 50 mL, une vitesse d’agitation de 500 RPM et une longueur de Kolmogorov de 24 mm, durant 3 heures ; et
- des vésicules extracellulaires produites à partir de cellules productrices du type THP-1 en carence 3D 72h.
Les deux types de vésicules extracellulaires sont analysés avec l’ExoView™ RI 00 de la manière suivante : les vésicules sont capturées par des anticorps (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81) sur une puce, où les spots de chaque anticorps sont séparés. Puis, les vésicules capturées sont incubées avec un anticorps secondaire (anti-CD9, anti-CD63, anti-CD81 également) associé à un fluorophore, ce qui permet de faire de la colocalisation de ces marqueurs. Sur le graphique, les anticorps de capture sont représentés sur l’axe des abscisses tandis que les trois différentes colonnes par point d’abscisse représentent les anticorps secondaires fluorescents. Ainsi, pour l’anticorps de capture CD81, toutes les vésicules capturées devraient être marquées par le fluorophore Alexa Fluor® 555, sauf s’il n’y a plus d’épitope disponible.
Les résultats montrent d’une part que les marqueurs membranaires typiques de vésicules extracellulaires, à savoir CD81 et CD63 essentiellement, sont présents sur les vésicules extracellulaires produites en présence d’une longueur de Kolmogorov de 24 mm. Cela démontre que les particules produites par le procédé selon l’invention sont bien des vésicules extracellulaires, et qu’elles disposent des marqueurs spécifiques de leurs cellules productrices mères.
D’autre part, ces résultats montrent que pour les vésicules produites à 500 RPM, il y a le même nombre de particules marquées par les fluorophores en CD81 et en CD63 sur l’anticoips de capture CD81 , et à peu près la moitié des vésicules capturées par l’anticorps de capture CD63 sont marquées par fluorescence en CD81. 11 y a donc présence de ces deux marqueurs membranaires CD63 et CD81 sur les vésicules extracellulaires produites en présence d’une longueur de Kolmogorov de 24 mm. On retrouve la même tendance de présence et de colocalisation significative des deux marqueurs membranaires CD63 et CD81 sur les vésicules extracellulaires produites en carence 3D, mais les distributions relatives diffèrent de celles des vésicules extracellulaires produites en présence d’une longueur de Kolmogorov de 24 mm.
La figure 14 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des globules rouges après 2 heures d’agitation pour différentes longueurs de Kolmogorov. Le décompte des vésicules extracellulaires, après 2 heures d’agitation (conditions selon l’invention : BR 500mL et BR 1 L) ou 2 heures de maintien sans agitation (condition contrôle), est réalisé par prélèvement homogène des surnageants (avant expérience et après expérience) puis centrifugation de ces surnageants pendant 5 minutes à 2000G, puis mesure de la concentration en vésicules par Nanoparticle Tracking Analysis (NanoSight NS300, Malvem Panalytical). Le détail des conditions opératoires et les résultats sont présentés ci-après.
Dans une flasque à agitation d’une contenance de 500 mL et possédant une pale d’un diamètre de 7,6 cm, 1,5.1011 globules rouges sont introduits dans 150 mL de DMEM blanc. Une agitation est réalisée à 350 RPM pendant 2 heures, la longueur de Kolmogorov Lk étant de 18,6 mm. Un contrôle est réalisé dans un tube à bouchon vissant, en utilisant 5,1.1010 globules rouges dans 50 mL de DMEM blanc, ce tube contrôle étant maintenu fixe et n’étant pas agité. Les résultats (colonnes de résultats BR 500 mL - T0 et BR 500 mL - T2h) illustrent qu’une agitation de globules rouges à une longueur de Kolmogorov inférieure à 50 mm telle que 18,6 mm engendre la production de vésicules extracellulaires par ces globules rouges selon un rendement de 10,4 vésicules extracellulaires par globule rouge.
Dans une flasque à agitation d’une contenance de 1 L et possédant une pale d’un diamètre de 10,8 cm, 1,05.1011 globules rouges sont introduits dans 300 mL de DMEM blanc. Une agitation est réalisée à 500 RPM pendant 2 heures, la longueur de Kolmogorov Lk étant de 10,9 mm. Un contrôle est réalisé dans un tube à bouchon vissant, en utilisant 1,15.1010 globules rouges dans 50 mL de DMEM blanc, ce tube contrôle étant maintenu fixe et n’étant pas agité. Les résultats (colonnes de résultats BR IL - T0 et BR IL - T2h) illustrent qu’une agitation de globules rouges à une longueur de Kolmogorov inférieure à 50 mm telle que 10,9 mm engendre la production de vésicules extracellulaires par ces globules rouges selon un rendement d’environ 100 vésicules extracellulaires par globule rouge.
Ainsi, plus la vitesse d’agitation augmente et la longueur de Kolmogorov diminue, plus la quantité de vésicules extracellulaires produites par globule rouge augmente.
La figure 15 illustre le chargement de vésicules extracellulaires en doxorubicine en présence d’une agitation turbulente.
Des cellules THP-1 sont lavées puis re-suspendues dans du RPMI dans lequel a été ajouté 1% en volume de pénicilline/streptomycine et 10 mM de doxorubicine (Merck). Les cellules THP-1 sont introduites dans une flasque à agitation dont le milieu liquide est de 50 mL, la concentration en cellules THP-1 dans la flasque à agitation étant de 8,5.104cellules/mL de milieu liquide. Les cellules THP-1 sont agitées pendant 2 heures soit à 400 RPM, la longueur de Kolmogorov étant de 28 mm (condition d’internalisation de la doxorubicine). Soit à 34 RPM, la longueur de Kolmogorov étant de 181 mm (condition contrôle = passif) ; les cellules THP-1 sont ensuite lavées puis à nouveau agitées dans les mêmes conditions que précédemment à 400 RPM et longueur de Kolmogorov de 28 mm, dans du RPMI comprenant en outre 1% en volume de pénicilline/streptomycine. Les échantillons (comprenant les cellules THP-1 et les vésicules extracellulaires produites) sont ensuite centrifugés 5 minutes à 2000G. Le surnageant est ultracentrifugé lh30 à 150 000G, puis les culots de vésicules sont resuspendus dans du PBS (phosphate bujfered satine , tampon phosphate salin), et lysés avec 0,3% de Triton® X-100. La fluorescence est mesurée avec un spectrophotomètre à fluorescence Hitachi F7000 (longueur d’onde d’excitation : 485nm, longueur d’onde d’émission : 560nm). Les résultats illustrent que pour un nombre de cellules de départ égal, la quantité de doxorubicine mesurée dans les vésicules extracellulaires après chargement et production par turbulence (condition turbulence) est bien plus élevée qu’après un chargement sans turbulence suivie d’une production en turbulence (condition contrôle = passif) : le chargement en doxorubicine passe de 0,08 nmol pour la fraction contenant les vésicules extracellulaires en condition contrôle (=passif) à 0,78 nmol pour la fraction contenant les vésicules extracellulaires en condition de turbulence.
Par ailleurs, un ratio appelé pureté a été déterminé ; il s’agit du ratio de la concentration en vésicules extracellulaires mesurée par NTA par la concentration en protéines (en mg/mL). La mesure par NTA de la concentration en vésicules extracellulaires est réalisée grâce au protocole suivant :
- prélèvement homogène du surnageant du milieu liquide des différentes conditions de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices de type THP-1 : milieu liquide des conditions de carence 2D 72h, milieu liquide de carence 3D 72h, milieu liquide après 3 heures d’agitation à 250 RPM, milieu liquide après 3 heures d’agitation à 500 RPM ; puis - centrifugation pendant 5 minutes à 2000 G ; puis
- mesure de la concentration en vésicules extracellulaires et de leur distribution en taille par Nanoparticle Tracking Analysis (sur l’appareil NanoSight NS300 commercialisé par l’entreprise Malvem Panalytical). La mesure de la concentration en protéines est réalisée par le test de Bradford (ThermoFisher Scientific).
La mesure de la concentration en protéines se faisant sans lyser les vésicules, on considère que le ratio de la concentration en vésicules extracellulaires par la concentration en protéines (=pureté) est une indication des contaminants présents dans l’échantillon. Les résultats sont les suivants :
[Table 2]
Ces résultats démontrent que les échantillons de vésicules extracellulaires produites selon l’invention présentent une pureté similaire à celle des échantillons de vésicules extracellulaires produites en carence 2D et 3D. Cela illustre que le procédé de production de vésicules extracellulaires selon la présente invention permet une augmentation de la quantité de vésicules extracellulaires produites et du rendement de production des vésicules extracellulaires, tout en maintenant le niveau de pureté par rapport aux méthodes de l’art antérieur.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système fluidique (1) de production de vésicules extracellulaires (EV) 4 partir de cellules productrices en suspension (6), comprenant au moins un récipient (4), un milieu liquide (5) contenu par le récipient (4), des cellules productrices en suspension (6), un agitateur (7) de milieu liquide (5), des moyens de commande de la vitesse de l’agitateur (7) adaptés pour la croissance des cellules productrices (6) en suspension, caractérisé en ce que les moyens de commande de la vitesse de l’agitateur (7), l’agitateur (7) et la forme et les dimensions du récipient (4) sont adaptés 4 la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale 450 mm.
2. Système fluidique (1) selon la revendication 1, comprenant une sortie (9) et une connectique (13) reliée 4 la sortie (9), la connectique (13) étant susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV).
3. Système fluidique (1) selon l’une des revendications 1 42, dans lequel un agitateur (7) de milieu liquide est un agitateur rotatif ou orbital dont la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient (4), à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient.
4. Système fluidique (1) selon l’une des revendications 143 comprenant un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV), relié fluidiquement au récipient (4) de manière 4 être susceptible de réintroduire dans le récipient (4) un milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV).
5. Procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension (6), comprenant :
un moyen de commande de la vitesse d’un agitateur (7) adapté pour la croissance des cellules productrices (6) en suspension, et dont la forme et les dimensions d’un récipient (4) sont adaptées à la génération d’un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4) pour exercer des contraintes de cisaillement sur les cellules productrices (6) afin de réaliser la production de vésicules extracellulaires (EV), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm dans le récipient (4), le récipient (4) comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) en suspension, et - une collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
6. Procédé selon la revendication 5 dans lequel on agite le milieu liquide (5) pendant au moins vingt minutes.
7. Procédé selon l’une des revendications 5 à 6 dans lequel un séparateur (15) appauvrit une partie du milieu liquide (5) collecté en sortie (9) du récipient (4) en vésicule extracellulaire (EV), et dans lequel on réintroduit la partie du milieu liquide (5) dans le récipient (4).
8. Procédé selon l’une des revendications 5 à 7 dans lequel le procédé comprend une étape préalable de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie présent dans le milieu liquide.
9. Procédé selon l’une des revendications 5 à 8, dans lequel ledit écoulement permet de simultanément charger l’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane des cellules productrices (6) et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4).
10. Procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant les étapes suivantes :
- ajouter dans un récipient (4), un milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) et au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie, actionner une commande d’un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d’un milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l’écoulement étant inférieure ou égale à 50 mm, préférentiellement inférieure ou égale à 40 mm, ledit écoulement permettant de simultanément charger l’au moins un agent thérapeutique et produire les vésicules extracellulaires (EV) dans le récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9),
- collecter le milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
11. Vésicules extracellulaires obtenues par mise en œuvre du système fluidique (1) selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, et/ou par le procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices en suspension (6) selon l’une quelconque des revendications 5 à 9, et/ou par le procédé de chargement d’au moins un agent thérapeutique et/ou d’imagerie à l’intérieur ou à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6) selon la revendication 10.
12. Vésicules extracellulaires selon la revendication 11, pour leur utilisation en immunothérapie, en médecine régénérative, en alternative ou en complément de la thérapie cellulaire, en tant que vecteur pour délivrer au moins un agent thérapeutique, et/ou dans le traitement de tumeurs, de maladies infectieuses, de maladies inflammatoires, de maladies immunologiques, de maladies métaboliques, de maladies cancéreuses, de maladies génétiques, de maladies dégénératives ou de maladies secondaires à des chirurgies ou traumatismes.
13. Utilisation des vésicules extracellulaires selon la revendication 11 en tant que vecteur pour l’administration d’au moins un agent d’imagerie médicale.
14. Utilisation selon la revendication 13, dans laquelle l’au moins un agent d’imagerie médicale est choisi parmi un agent de fluorescence, un agent de luminescence, un isotope radioactif, un agent de contraste aux propriétés magnétiques, plasmoniques, acoustiques ou radio opaques et leurs mélanges.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458055B (zh) * 2020-11-24 2023-12-29 重庆大学 一种基于切应力刺激作用下制备细胞微囊泡的方法
US20240084300A1 (en) 2020-12-21 2024-03-14 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Mirna composition comprising 11 specific mirnas and its use in the treatment of cancer

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2870348B1 (fr) * 2004-05-14 2010-08-27 Univ Angers Methode pour diagnostiquer la presence et/ou la severite d'une pathologie hepathique chez un sujet
US7771988B2 (en) * 2005-03-24 2010-08-10 Hitachi, Ltd. Control device for fermenter
JP2006296423A (ja) * 2005-03-24 2006-11-02 Hitachi Ltd 培養槽の制御装置及び培養装置
US9567559B2 (en) * 2012-03-15 2017-02-14 Flodesign Sonics, Inc. Bioreactor using acoustic standing waves
JP5913084B2 (ja) * 2012-12-26 2016-04-27 株式会社日立製作所 培養制御方法、細胞培養装置及び細胞特性評価装置
EP3310365B1 (fr) * 2015-06-16 2023-08-23 Fondazione Città Della Speranza - Onlus Vésicules extracellulaires issues de cellules de lignée ostéoblastique, à usage thérapeutique et diagnostique
CN108883138A (zh) * 2015-12-30 2018-11-23 加利福利亚大学董事会 增强细胞衍生的囊泡的生产和分离的方法
WO2017193075A1 (fr) * 2016-05-05 2017-11-09 Terumo Bct, Inc. Production et collecte automatisés
US11717480B2 (en) * 2016-11-30 2023-08-08 The Regents Of The University Of California Extracellular vesicles and methods and uses thereof
FR3068361B1 (fr) * 2017-06-30 2021-10-15 Univ Paris Diderot Paris 7 Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe

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