JP2022515269A - 細胞外小胞を製造するための流体系および関連方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、細胞外小胞の製造に関する。より具体的には、本発明は、懸濁産生細胞から細胞外小胞を製造するシステム、このような小胞を製造および回収する方法、およびこのようなシステムにより製造された小胞に関し、細胞外小胞は、例えば、治療薬および/またはイメージング剤の媒介物として、細胞療法に対する代替法として、および再生医療において、有用であり得る。
細胞は、それらの環境中で、例えば、インビボで、生物の生体液中で細胞外小胞を放出することが知られている。細胞外小胞は、個別化されたまたは標的化方式での人体中への薬物送達のために効果的な手段であることがわかっている。第1に、それらは、生来の生体適合性および免疫寛容を有する。それらはまた、セラノスティックナノ粒子を内部移行させて、身体の特定の部分をイメージングおよび治療作用を有する有効成分の送達の両方を可能にする。細胞外小胞はまた、細胞間通信の機能も有し、それらは、例えば、脂質、膜および細胞質のタンパク質および/または細胞質のヌクレオチド、例えば、mRNA、マイクロRNAまたは長鎖非コードRNAの異なる細胞間の輸送を可能とする。
あるいは、本発明で使用される産生細胞は、病理学的細胞、例えば、HeLa細胞などの癌細胞である。
-液体培地の攪拌器および容器の寸法は、液体培地の流れを制御して、流れのKolmogorovの長さが50μm以下、好ましくは40μm以下、より好ましくは35μm以下となるよう適合される;
-流体系は、出口および出口に連結された連結器を含み、連結器は、液体培地および細胞外小胞を含むことができる;
-攪拌器は、好ましくは回転または軌道攪拌器であり、容器の形状および寸法と共に、その攪拌器の形状およびサイズは、容器中の液体培地の乱流の生成に適合される;
-容器は、バッチ方式で使用される、または使用でき、すなわち、容器中に含まれる液体は、産生細胞が所定の時間の間細胞外小胞を生成後に取り出される;
-流体系は、細胞外小胞セパレーターを含む;
-流体系は、細胞外小胞(EV)枯渇液体培地を容器中に再導入できるように、容器に流体連結された細胞外小胞セパレーターを含む;
-セパレーターは、容器の内側または外側に配置され、液体は、容器中に含めることができ、容器内部のセパレーターにより小胞が枯渇され、一方、容器中では細胞が保持されるか、または液体は容器中に含むことができ、容器の外部のセパレーターにより小胞が枯渇される;
-セパレーターの入口は、容器に流体連結され、小胞が枯渇した液体培地の形で容器中に再導入できるように、セパレーターの出口は、容器に流体連結される。
-懸濁産生細胞の増殖に好適するように攪拌器の速度を制御する手段、および容器の形状および寸法が、細胞外小胞(EV)の製造を達成するために産生細胞にシェアストレスを作用させるように容器中の液体培地の乱流を生成するように適合され、容器中で流れのKolmogorovの長さが50μm以下、好ましくは40μm以下であり、容器は出口を含み、液体培地は懸濁産生細胞を含むこと、および
-容器の出口で細胞外小胞(EV)を含む液体培地を収集すること。
-液体培地は少なくとも20分間撹拌される;
-攪拌器は、液体培地の定常流または間欠流の強度を増大または低下させて、流れのKolmogorovの長さが40μm以下となるよう制御される;
-セパレーターは、細胞外小胞の容器の出口で収集した液体培地の一部を枯渇させ、液体培地の一部を容器中に再導入する。
-前記方法は、液体培地中に存在する治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を充填する前段ステップを含む;
-液体培地の流れは、産生細胞内の治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種の同時充填、および容器中での細胞外小胞(EV)の製造を可能にする。
(i)産生細胞を液体培地を含む容器中に挿入するステップ;
(ii)液体培地の乱流を起こす攪拌器の制御を作動させて、流れのKolmogorovの長さを50μm以下、好ましくは40μm以下にし、前記流れが前記容器中で細胞外小胞の生成を可能にするステップ;および
(iii)ステップ(ii)で生成されたで細胞外小胞を含む液体培地を収集するステップ。
-容器に産生細胞を含む液体培地および治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を加えるステップ;
-液体培地の乱流を起こす攪拌器の制御を作動させて、流れのKolmogorovの長さを50μm以下、好ましくは40μm以下にし、前記流れが少なくとも1種の治療薬の同時充填、および容器中での細胞外小胞(EV)の生成を可能とし、容器が出口を含むステップ;
-容器の出口で細胞外小胞(EV)を含む液体培地を収集するステップ。
-攪拌器が、液体培地の流れを生じさせて、流れのKolmogorovの長さが40μm以下となるよう制御される;
-容器の出口での細胞外小胞(EV)は、治療薬および/またはイメージング剤または非荷電細胞外小胞の少なくとも1種を充填した細胞外小胞の混合物を含む。
用語「細胞外小胞」は一般に、産生細胞により内在的に放出される小胞を意味し、その直径は、30nm~5000nmである。細胞外小胞は特に、エキソソームおよび/または微小胞および/または細胞のアポトーシス小体に相当する。
その他の特徴および利点は、純粋に例示的で、非限定的であり、添付の図面と合わせて解釈されるべきである、次の記述から明らかになろう。
Kolmogorovの長さ(またはKolmogorovの次元または渦の長さ)は、流体の粘度がこの流体の流れの動力学的エネルギーを消散させることを可能にする長さである。実際には、Kolmogorovの長さは、乱流中の最小流体渦のサイズに相当する。この長さLKは、Kolmogorovの論文(Kolmogorov,A.N.,1941,January,The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers,In Dokl.Akad.Nauk,SSSR,Vol.30,No.4,pp.301-305)で計算されており、次の式(I)により表される:
図1は、細胞外小胞(EV)の製造のための流体系(1)の概略図を示す。細胞外小胞(EV)を製造するための流体系(1)は、容器(4)中での大量の細胞外小胞(EV)の製造を目的とするものである。しかし、本発明はこの特定の実施形態に限定されず、並列または直列に流動連結されている一連の容器(4)を含み得る。
細胞外小胞(EV)を製造するための流体系(1)は、容器(4)中での大量の細胞外小胞(EV)の製造を目的とするものである。しかし、本発明は、この実施形態に限定されず、治療薬および/または多量のイメージング剤の本発明により製造された細胞外小胞(EV)中への充填も可能にする。したがって、懸濁細胞(6)および治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種が同時に液体培地(5)中で懸濁され、容器(4)中で混合される。あるいは、懸濁細胞(6)は、前記液体培地(5)中への治療薬および/またはイメージング剤の添加の前または後で、液体培地(5)中に添加できる。通常、任意のタイプの治療薬またはイメージング剤、好ましくは、感染性、炎症性、代謝性、変性、外傷性、手術後、遺伝的、悪性(腫瘍)、非常にまれな疾患、または血管、リンパ、自発運動、消化、神経、生殖、排出系の疾患を治療するための治療薬分子または粒子、および/または核イメージング、磁性イメージング、光学イメージング、超音波イメージングのための薬剤(分子または粒子)が使用できる。容器(4)はまた、懸濁産生細胞(6)および治療薬またはイメージング剤の少なくとも1種を含む液体培地(5)を撹拌するための上述の攪拌器(7)も含む。好ましくは、流体系(1)は、容器(4)内の液体培地(5)中で産生細胞(6)を均一化し、目的の薬剤を産生細胞(6)中に効率的に投入し、その結果として、細胞外小胞中に充填するために、緩やかな撹拌を生成するように適合される。
-容器(4)中で流れのKolmogorovの長さが50μm以下、好ましくは40μm以下であり、容器が出口(9)を含み、液体培地(5)が懸濁産生細胞(6)および治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を含む、液体培地(5)の乱流を生じさせる攪拌器(7)の制御、および
-容器(4)の出口(9)で細胞外小胞(EV)を含む液体培地(5)の収集。
・容器(4)中に産生細胞(6)を含む液体培地(5)および治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を加えるステップ;
・液体培地(5)の乱流をもたらす攪拌器(7)の制御を作動させて、流れのKolmogorovの長さを50μm以下、好ましくは40μm以下にし、前記流れが少なくとも1種の治療薬の同時充填、および容器(4)中での細胞外小胞(EV)の製造を可能とし、容器が出口(9)を含むステップ;
・容器(4)の出口(9)で細胞外小胞(EV)を含む液体培地(5)を収集するステップ。
容器(4)は、液体培地(5)産生細胞(6)および治療薬またはイメージング剤の少なくとも1種のいずれかの導入前に、使い捨て、または滅菌できる。治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種は、容器(4)中、血清を含む産生細胞(6)の培地中でインキュベートされる。
細胞外小胞(EV)は、例えば、無血清の液体培地(5)、および懸濁産生細胞(6)を含む容器(4)中で製造される。製造の前に、産生細胞(6)の培養のために血清を含む培地が使用され、容器(4)は、液体培地(5)の無血清DMEMで3~4回洗浄され、各洗浄は、例えば、約400mLの体積に相当する。次に、液体培地(5)の撹拌は、容器(4)中で乱流を生ずるように攪拌器(7)により制御される。好ましくは、撹拌は、液体培地(5)の流れを、Kolmogorovの長さLKが、50μm以下、好ましくは40μm以下となるように制御するために調節される。液体培地(5)の撹拌は、少なくとも20分間、好ましくは、1時間超の間、および好ましくは2時間超の間、例えば、約3時間にわたり制御される。細胞外小胞(EV)の生成は、製造中に測定できる。このために、撹拌は、連続的、間欠的、漸増的および漸減的であり得る。産生細胞(6)は、容器(4)の底部に沈降させられ、その後、細胞外小胞(EV)を含む液体培地(5)の試料が採取される。試料の遠心分離が2000Gで10分間実施され、細胞片が除去される。上清は、個別粒子追跡法(またはNTA:ナノ粒子トラッキング解析)により分析されて、細胞外小胞(EV)の数が計数され、それから、試料の細胞外小胞(EV)の濃度が推定される。撹拌の開始時の細胞外小胞(EV)の濃度がほぼゼロまたは無視できる程度であることが確認できる。
容器(4)中で生成した細胞外小胞(EV)は、容器(4)の出口(9)を通って容器(4)から液体培地(5)中の懸濁状態で取り出すことができる。フィルター(18)を出口(9)に配置して、容器(4)から細胞外小胞(EV)を取り出す際に懸濁産生細胞(6)および細胞片を濾別できる。連結器(13)は、出口(9)に流体連結され、生成された細胞外小胞(EV)を含む液体培地(5)の輸送を可能とする。
以下の図では、異なるタイプの産生細胞が使われる。赤血球を除いて、細胞外小胞の製造のために産生細胞を使用する前に、これらの産生細胞は培養される。赤血球の場合は、細胞外小胞の製造のために産生細胞を使用する前の調製は、フェノールレッドなしでDMEM中で所望の濃度で洗浄された赤血球の懸濁液を得ることにある。
-THP-1タイプ産生細胞から、50mLの液体培地(5)を含む100mLスピナーフラスコ中で、500RPMの撹拌、およびKolmogorovの長さLK24μmで3時間生成された細胞外小胞、および
-THP-1タイプの産生細胞から、3D飢餓72時間で生成された細胞外小胞。
THP-1細胞は洗浄後、1体積%のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10μMのドキソルビシン(Merck)を添加したRPMIに再懸濁される。THP-1細胞は、スピナーフラスコに導入され、その液体培地は50mLであり、スピナーフラスコ中のTHP-1細胞の濃度は、8.5x104細胞/mLの液体培地である。THP-1細胞は、400RPMのKolmogorov長さ28μm(ドキソルビシン内部移行条件)、または34RPMのKolmogorov長さ181μm(対照条件=受動的)で2時間撹拌され、その後、THP-1細胞は、洗浄された後、前と同じ条件:400RPM、Kolmogorov長さ28μmを用いて、1体積%のペニシリン/ストレプトマイシンを更に含むRPMI中で再度撹拌される。試料(THP-1細胞および生成された細胞外小胞を含む)はその後、2000Gで5分間遠心分離される。上清が150,000Gで1時間30分超遠心分離された後、小胞の底部をPBS(リン酸緩衝食塩水)中に再懸濁し、0.3%トリトン(登録商標)X-100で溶解する。蛍光が蛍光分光光度計Hitachi F7000(励起波長:485nm、発光波長:560nm)で測定される。
-THP-1タイプ産生細胞;2D飢餓72時間の条件の液体培地;3D飢餓72時間の液体培地;250RPMで3時間撹拌後の液体培地;500RPMで3時間撹拌後の液体培地、からの細胞外小胞を生成する種々の条件の液体培地の上清の均質サンプリング、
-2000Gで5分間の遠心分離、
-ナノ粒子トラッキング解析(Malvern Panalytical社から販売されている装置NanoSight NS300を使用)による細胞外小胞の濃度およびそれらの粒度分布の測定。
Claims (14)
- 懸濁産生細胞(6)から細胞外小胞(EV)を製造するための流体系(1)であって、少なくとも1つの容器(4)、前記容器(4)により含まれる液体培地(5)、懸濁産生細胞(6)、液体培地(5)、攪拌器(7)、前記懸濁産生細胞(6)の増殖に適合された前記攪拌器(7)の速度を制御する手段を含み、前記攪拌器(7)の速度を制御するための前記手段、前記撹拌器(7)および前記容器(4)の形状および寸法が前記容器(4)中の前記液体培地(5)の乱流の生成に適合され、前記産生細胞(6)に対しシェアストレスを作用させて、細胞外小胞(EV)の生成を実現し、流れのKolmogorovの長さが50μm以下であることを特徴とする、流体系(1)。
- 出口(9)および前記出口(9)に連結された連結器(13)を含み、前記連結器(13)は、液体培地(5)および細胞外小胞(EV)を含むことができる、請求項1に記載の流体系(1)。
- 液体培地攪拌器(7)は、回転または軌道攪拌器であり、その回転速度、形状およびサイズが、前記容器(4)の形状および寸法と共に、前記容器中の前記液体培地(5)の乱流の生成に適合されている、請求項1または2に記載の流体系(1)。
- 前記容器(4)に流体連結され、それにより、細胞外小胞(EV)の枯渇した液体培地(5)を前記容器(4)中に再導入できる、細胞外小胞(EV)のセパレーター(15)を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の流体系(1)。
- 懸濁産生細胞(6)からの細胞外小胞(EV)のエクスビボ製造方法であって、
-前記懸濁産生細胞(6)の増殖に好適するように攪拌器(7)の速度を制御する手段、および容器(4)の形状および寸法が、前記細胞外小胞(EV)の生成を達成するために前記産生細胞(6)にシェアストレスを作用させるように前記容器(4)中の液体培地(5)の乱流を生成するように適合され、前記容器(4)中の流れのKolmogorovの長さが50μm以下、好ましくは40μm以下であり、前記容器(4)が出口(9)を含み、前記液体培地(5)が懸濁産生細胞(6)を含むこと、および
-前記容器(4)の前記出口(9)で細胞外小胞(EV)を含む前記液体培地(5)を収集すること、を含む、方法。 - 前記液体培地(5)が少なくとも20分間撹拌される、請求項5に記載の方法。
- セパレーター(15)が、細胞外小胞(EV)の前記容器(4)の前記出口(9)で収集した前記液体培地(5)の一部を枯渇させ、前記液体培地(5)の一部を前記容器(4)中に再導入する、請求項5または6に記載の方法。
- 前記方法が、前記液体培地中に存在する治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を充填する前段ステップを含む、請求項5~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流れが、治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種の前記産生細胞(6)の内部または膜への充填、および前記容器(4)中の前記細胞外小胞(EV)の生成を同時に行うことを可能にする、請求項5~8のいずれか1項に記載の方法。
- 治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を、産生細胞(6)からの細胞外小胞(EV)の内部または膜に充填する方法であって、
-容器(4)中に前記産生細胞(6)を含む液体培地(5)および治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を加えるステップ;
-液体培地(5)の乱流を起こす攪拌器(7)の制御を作動させて、流れのKolmogorovの長さを50μm以下、好ましくは40μm以下にし、前記流れが少なくとも1種の治療薬の充填、および前記容器(4)中での前記細胞外小胞(EV)の生成を同時に可能とし、前記容器が出口(9)を含むステップ;
-前記容器(4)の前記出口(9)で細胞外小胞(EV)を含む前記液体培地(5)を収集するステップ、を含む、方法。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載の流体系(1)を用いることにより、および/または請求項5~9のいずれか1項に記載の懸濁産生細胞(6)からの細胞外小胞(EV)のエクスビボ製造方法により、および/または治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を請求項10に記載の産生細胞(6)からの細胞外小胞(EV)の内部または膜に充填する方法により、得られる、細胞外小胞(EV)。
- 免疫療法、再生医療、細胞療法の代替としてまたは細胞療法に加えて、治療薬および/またはイメージング剤の少なくとも1種を送達するためのベクターとして、および/または腫瘍、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、癌疾患、遺伝性疾患、変性疾患または手術または外傷に続発する疾患の治療での使用のための、請求項11に記載の細胞外小胞。
- 少なくとも1種の医用イメージング剤の投与のためのベクターとしての、請求項11に記載の細胞外小胞の使用。
- 前記少なくとも1種の医用イメージング剤が、蛍光剤、発光剤、放射性同位元素、磁気、プラズモン、超音波または放射線不透過性特性を有する造影剤およびこれら混合物から選択される、請求項13に記載の使用。
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