CA2470442A1 - Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires - Google Patents
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Abstract
La présente demande concerne des compositions et méthodes pour letraitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette, plus particulièrement des composés inhibant la contraction de la chaîne légère de la myosine des cellules épithéliales pulmonaires, notamment des entérocytes. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifères, notamment les humains.
Description
2 PCT/FR02/04506 METHODES ET COMPOSITIONS POUR LE TRAITEMENT DE
PATHOLOGIES RESPIRATOIRES
La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l' épithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifères, notaxninent les humains.
L'épithélium pulmonaire est le centre d'échanges très importants entre le milieu extérieur et l'organisme. Ces échanges peuvent s'effectuer soit à travers les cellules de l'épithélium, soit par des réseaux parallèles. Ainsi, le transport d'eau ou d'électrolytes, ou encore l'absorption de petites molécules (poids moléculaire généralement inférieur à 1000 Da environ) au niveau de la muqueuse gastrique, intestinale ou colique, s' effectue par voie transcellulaire, à travers les cellules épithéliales ou entérocytes. Par contre, l'absorption de grosses molécules et le passage de toxines ou de cellules immunitaires se fait principalement par voie paracellulaire, au niveau de « jonctions serrées », qui sont disposées entre les cellules épithéliales.
Les jonctions serrées épithéliales (ou « tight junction », « TJ ») sont des structures de liaison entre les cellules bordant les épithéliums muqueux (tube digestif, poumons). Ces structures assurent et contrôlent le transport trans-épithélial paracellulaire, de l' extérieur vers la sous-muqueuse, de macromolécules variées (irritants, microorganismes). Ces structures permettent également la migration de cellules immunitaires (e.g., immunocytes) vers l'extérieur. Les jonctions serrées sont des structures souples constituées d'un assemblage complexe de protéines transmembranaires (occludines, claudines) et de protéines cytoplasmiques (protéines zona ocludens ZO-1, ZO-2, ZO-3, protéines AF7, cinguline ou 7H6, etc.), variable selon les épithéliums considérés, qui sont associées à des éléments du cytosquelette (filaments de myosine, d'actine, étc.). En outre, des agents désorganisant le cytosquelette d'actine ont été montrées comme augmentant l'activité de la NO synthase dans les cellules endothéliales (WO00/03746).
Dans des conditions physiologiques, le degré d'ouverture « partielle » de ces j onctions serrées permet au système immunitaire local d' être renseigné sur la nature ou sur la « qualité » du contenu des voies aériennes.
Si l'épithélium intestinal et la structure des jonctions serrées de celui-ci ont été
étudiés dans l'art antérieur, il existe aujourd'hui moins d'informations concernant l'épithélium pulmonaire et le fonctionnement de ses jonctions serrées.
Le processus de sensibilisation aux allergènes est un facteur de risque très important dans le développement des allergies et de l' asthme. Toutefois, les mécanismes par lesquels des allergènes sont capables d'initier le phénomène de sensibilisation ne sont pas clairement documentés in vivo. Lorsque des allergènes sont inhalés, ils entrent en contact avec la paroi épithéliale pulmonaire qui empêche leur introduction dans l'organisme et leur mise en contact avec les cellules de l'immunité. Toutefois, pour qu'une sensibilité se développe, cela implique que certains allergènes sont capables de traverser cet épithélium pour interagir avec les cellules immunitaires. Les conditions dans lesquelles ce transfert est possible demeurent peu documentées in vivo. Ainsi, bien que certains rapports suggèrent, sur des cultures de cellules in vitro, un rôle des jonctions serrées dans ce processus, aucune démonstration n'a été apportée de l'implication de ces jonctions in vivo dans le développement d'une sensibilisation. De même, si Gordon et al (Exp. Lung Res. 24 (1998) 659)
PATHOLOGIES RESPIRATOIRES
La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l' épithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifères, notaxninent les humains.
L'épithélium pulmonaire est le centre d'échanges très importants entre le milieu extérieur et l'organisme. Ces échanges peuvent s'effectuer soit à travers les cellules de l'épithélium, soit par des réseaux parallèles. Ainsi, le transport d'eau ou d'électrolytes, ou encore l'absorption de petites molécules (poids moléculaire généralement inférieur à 1000 Da environ) au niveau de la muqueuse gastrique, intestinale ou colique, s' effectue par voie transcellulaire, à travers les cellules épithéliales ou entérocytes. Par contre, l'absorption de grosses molécules et le passage de toxines ou de cellules immunitaires se fait principalement par voie paracellulaire, au niveau de « jonctions serrées », qui sont disposées entre les cellules épithéliales.
Les jonctions serrées épithéliales (ou « tight junction », « TJ ») sont des structures de liaison entre les cellules bordant les épithéliums muqueux (tube digestif, poumons). Ces structures assurent et contrôlent le transport trans-épithélial paracellulaire, de l' extérieur vers la sous-muqueuse, de macromolécules variées (irritants, microorganismes). Ces structures permettent également la migration de cellules immunitaires (e.g., immunocytes) vers l'extérieur. Les jonctions serrées sont des structures souples constituées d'un assemblage complexe de protéines transmembranaires (occludines, claudines) et de protéines cytoplasmiques (protéines zona ocludens ZO-1, ZO-2, ZO-3, protéines AF7, cinguline ou 7H6, etc.), variable selon les épithéliums considérés, qui sont associées à des éléments du cytosquelette (filaments de myosine, d'actine, étc.). En outre, des agents désorganisant le cytosquelette d'actine ont été montrées comme augmentant l'activité de la NO synthase dans les cellules endothéliales (WO00/03746).
Dans des conditions physiologiques, le degré d'ouverture « partielle » de ces j onctions serrées permet au système immunitaire local d' être renseigné sur la nature ou sur la « qualité » du contenu des voies aériennes.
Si l'épithélium intestinal et la structure des jonctions serrées de celui-ci ont été
étudiés dans l'art antérieur, il existe aujourd'hui moins d'informations concernant l'épithélium pulmonaire et le fonctionnement de ses jonctions serrées.
Le processus de sensibilisation aux allergènes est un facteur de risque très important dans le développement des allergies et de l' asthme. Toutefois, les mécanismes par lesquels des allergènes sont capables d'initier le phénomène de sensibilisation ne sont pas clairement documentés in vivo. Lorsque des allergènes sont inhalés, ils entrent en contact avec la paroi épithéliale pulmonaire qui empêche leur introduction dans l'organisme et leur mise en contact avec les cellules de l'immunité. Toutefois, pour qu'une sensibilité se développe, cela implique que certains allergènes sont capables de traverser cet épithélium pour interagir avec les cellules immunitaires. Les conditions dans lesquelles ce transfert est possible demeurent peu documentées in vivo. Ainsi, bien que certains rapports suggèrent, sur des cultures de cellules in vitro, un rôle des jonctions serrées dans ce processus, aucune démonstration n'a été apportée de l'implication de ces jonctions in vivo dans le développement d'une sensibilisation. De même, si Gordon et al (Exp. Lung Res. 24 (1998) 659)
3 suggèrent un effet protecteur de la taurine sur les jonctions serrées, aucun résultat présenté n'établit de corrélation entre les jonctions serrées et un processus de sensibilisation ou de transfert d'allergènes à travers l'épithélium pulmonaire.
Une corrélation entre l'état d'ouverture des jonctions serrées et la réponse à
des allergènes d'origine aérienne a été suggérée au travers d'études expérimentales (WAN, H et al. J. Clin. Invest, 1999 ; 104(1) : 123-33) et par la mise en évidence chez le sujet asthmatique d'une corrélation entre la largeur des espaces extracellulaires et le seuil de réponse respiratoire à l'inhalation d'acétylcholine (OHASHI et al. Aerugi 1990 Nov ; 39(11) : 1541-5). Cependant, ces observations préliminaires n'ont pas été confirmées ou n'ont pas donné lieu à
de nouvelles approches thérapeutiques.
La présente demande résulte de la mise en évidence d'un rôle in vivo des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire dans le processus de sensibilisation aux allergènes. La présente demande découle également de la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de pathologies respiratoires, basées sur une modulation de la perméabilité para-cellulaire de l'épithélium pulmonaire. En particulier, la présente demande propose, pour la première fois, une approche thérapeutique des pathologies respiratoires basée sur l'emploi de composés ou conditions permettant de moduler la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. Cette approche permet notamment de contrôler l'ouverture et ~la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium. Cette stratégie permet de réguler la perméabilité de l'épithélium pulmonaire de manière spécifique, fine et réactive, et ainsi d'agir sur le transfert d'allergènes vers les cellules de l'inununité. Cette stratégie est particulièrement adaptée à l' obtention d'un effet biologique rapide et contrôlable dans le temps (réversible).
Une corrélation entre l'état d'ouverture des jonctions serrées et la réponse à
des allergènes d'origine aérienne a été suggérée au travers d'études expérimentales (WAN, H et al. J. Clin. Invest, 1999 ; 104(1) : 123-33) et par la mise en évidence chez le sujet asthmatique d'une corrélation entre la largeur des espaces extracellulaires et le seuil de réponse respiratoire à l'inhalation d'acétylcholine (OHASHI et al. Aerugi 1990 Nov ; 39(11) : 1541-5). Cependant, ces observations préliminaires n'ont pas été confirmées ou n'ont pas donné lieu à
de nouvelles approches thérapeutiques.
La présente demande résulte de la mise en évidence d'un rôle in vivo des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire dans le processus de sensibilisation aux allergènes. La présente demande découle également de la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de pathologies respiratoires, basées sur une modulation de la perméabilité para-cellulaire de l'épithélium pulmonaire. En particulier, la présente demande propose, pour la première fois, une approche thérapeutique des pathologies respiratoires basée sur l'emploi de composés ou conditions permettant de moduler la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. Cette approche permet notamment de contrôler l'ouverture et ~la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium. Cette stratégie permet de réguler la perméabilité de l'épithélium pulmonaire de manière spécifique, fine et réactive, et ainsi d'agir sur le transfert d'allergènes vers les cellules de l'inununité. Cette stratégie est particulièrement adaptée à l' obtention d'un effet biologique rapide et contrôlable dans le temps (réversible).
4 A cet égard, les résultats présentés dans la demande montrent que des substances susceptibles de relâcher les jonctions serrées épithéliales (peptide activateur du récepteur PAR-2, LPS) favorisent l'accumulation alvéolaire de neutrophiles et éôsiriophiles, comme cela est observé dans les maladies broncho-pulmonaires telles que l'asthme. Les résultats obtenus montrent également qu'une substance chimique capable de réduire la perméabilité des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire empéche l'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles. Ces résultats apportent la preuve que des molécules, agents, conditions ou procédés susceptibles de réduire ou supprimer l' ouverture des j onctions serrées de l' épithélium alvéolaire ou bronchique pulmonaire offrent un intérêt dans le traitement des affections pulmonaires, notamment celles caractérisées par l'accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, en particulier l'asthme.
Un premier obj et de l' invention réside donc plus particulièrement dans l'utilisation d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, de préférence à
l'exclusion de l'hypoxie causée par ces pathologies, en particulier à
l'exclusion de l'hypoxie causée par un dysfonctionnement pulmonaire. A ce titre, un dysfonctionnement pulmonaire peut être causée par un emphysème, la fumée de cigarettes, bronchite chronique, asthme, agents infectieux, pneumonite (infectieuse ou chimique), lupus, arthrite rhumatoïde, désordres congénitaux tels que fibrose cystique, obésité et déficit héréditaire en a 1-antitrypsine.
L'hypoxie est définie dans la présente demande comme la diminution en dessous du niveau normal d'oxygène dans un tissu.
Un autre obj et de l' invention réside dans une méthode de traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires.
L'invention repose ainsi sur l'utilisation de composés modulant la tension et
Un premier obj et de l' invention réside donc plus particulièrement dans l'utilisation d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, de préférence à
l'exclusion de l'hypoxie causée par ces pathologies, en particulier à
l'exclusion de l'hypoxie causée par un dysfonctionnement pulmonaire. A ce titre, un dysfonctionnement pulmonaire peut être causée par un emphysème, la fumée de cigarettes, bronchite chronique, asthme, agents infectieux, pneumonite (infectieuse ou chimique), lupus, arthrite rhumatoïde, désordres congénitaux tels que fibrose cystique, obésité et déficit héréditaire en a 1-antitrypsine.
L'hypoxie est définie dans la présente demande comme la diminution en dessous du niveau normal d'oxygène dans un tissu.
Un autre obj et de l' invention réside dans une méthode de traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires.
L'invention repose ainsi sur l'utilisation de composés modulant la tension et
5 l'état de contraction du cytosquelette des cellules de l'épithélium pulmonaire.
Comme indiqué plus avant, cette approche permet de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium.
Les protéines composant les jonctions serrées sont associées au cytosquelette des cellules qu'elles relient. Il est proposé dans le cadre de l'invention que la tension du cytosquelette puisse être modulée chez des sujets atteints de maladies ou désordres respiratoires pour agir de manière non destructrice et transitoire sur la perméabilité de leur épithélium pulmonaire. Ainsi, la contraction du cytosquelette doit favoriser l'ouverture des jonctions serrées, tandis qu'un relâchement du cytosquelette (ou qu'une inhibition de la contraction) doit favoriser la fermeture des jonctions.
On utilise donc préférentiellement dans le cadre de l'invention des composés (ou conditions) qui modulent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires (notamment humaines), de préférence sans moduler de façon importante (substantiellement) la perméabilité de l'endothélium vasculaire et/ou l'hémodynamique circulatoire pulmonaire. Selon la condition à traiter, on utilise des composés qui inhibent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, ou qui activent ou favorisent celle-ci.
L'activité du composé sur la tension du cytosquelette peut être directe ou indirecte, c' est-à-dire dirigée sur les constituants mêmes du cytosquelette ou sur des régulateurs de sa tension. Bien que non limitatif, on préfère les composés
Comme indiqué plus avant, cette approche permet de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium.
Les protéines composant les jonctions serrées sont associées au cytosquelette des cellules qu'elles relient. Il est proposé dans le cadre de l'invention que la tension du cytosquelette puisse être modulée chez des sujets atteints de maladies ou désordres respiratoires pour agir de manière non destructrice et transitoire sur la perméabilité de leur épithélium pulmonaire. Ainsi, la contraction du cytosquelette doit favoriser l'ouverture des jonctions serrées, tandis qu'un relâchement du cytosquelette (ou qu'une inhibition de la contraction) doit favoriser la fermeture des jonctions.
On utilise donc préférentiellement dans le cadre de l'invention des composés (ou conditions) qui modulent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires (notamment humaines), de préférence sans moduler de façon importante (substantiellement) la perméabilité de l'endothélium vasculaire et/ou l'hémodynamique circulatoire pulmonaire. Selon la condition à traiter, on utilise des composés qui inhibent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, ou qui activent ou favorisent celle-ci.
L'activité du composé sur la tension du cytosquelette peut être directe ou indirecte, c' est-à-dire dirigée sur les constituants mêmes du cytosquelette ou sur des régulateurs de sa tension. Bien que non limitatif, on préfère les composés
6 agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette. En outre, on préfère également des composés présentant une activité sélective sur la tension du cytosquelette, c'est-à-dire typiquement des composés qui n'affectent pas directement la structure des protéines constitutives des jonctions serrées.
Un composé est considéré comme modulant la tension du cytosquelette lorsqu'il module l'ouverture des jonctions serrées. Un effet inhibiteur de la contraction ne doit pas nécessairement être complet ou total, mais il suffit qu'il diminue la contraction suffisamment pour réduire (ouverture des jonctions serrées correspondant à une diminution minimale d'environ 30% de la perméabilité
paracellulaire de l'épithélium pulmonaire, préférentiellement d'environ 40%, de façon plus préférée d'environ 50%.
Différents types de composés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente demande. Ainsi, au sens de l'invention, le terme « composé » doit être pris dans un sens large, c'est-à-dire comme désignant tout agent, substance, composition, condition, traitement ou procédé permettant de moduler la tension du cytosquelette. Il s'agit avantageusement d'un agent (e.g., d'une molécule) ou d'une combinaison ou association de molécules.
Selon un premier mode de réalisation préféré, on utilise des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la dégradation de l'actine.
Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de l'invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de la contraction de la chaîne légère de la myosine ou de la dégradation de l'actine, préférentiellement des composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
Un composé est considéré comme modulant la tension du cytosquelette lorsqu'il module l'ouverture des jonctions serrées. Un effet inhibiteur de la contraction ne doit pas nécessairement être complet ou total, mais il suffit qu'il diminue la contraction suffisamment pour réduire (ouverture des jonctions serrées correspondant à une diminution minimale d'environ 30% de la perméabilité
paracellulaire de l'épithélium pulmonaire, préférentiellement d'environ 40%, de façon plus préférée d'environ 50%.
Différents types de composés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente demande. Ainsi, au sens de l'invention, le terme « composé » doit être pris dans un sens large, c'est-à-dire comme désignant tout agent, substance, composition, condition, traitement ou procédé permettant de moduler la tension du cytosquelette. Il s'agit avantageusement d'un agent (e.g., d'une molécule) ou d'une combinaison ou association de molécules.
Selon un premier mode de réalisation préféré, on utilise des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la dégradation de l'actine.
Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de l'invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de la contraction de la chaîne légère de la myosine ou de la dégradation de l'actine, préférentiellement des composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
7 De tels composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine peuvent être des inhibiteurs de la kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCK).
Un exemple particulier d'inhibiteur sélectif de MLCK est le composé ML-7 {1 (5-i~donaphtalène-1-sulfonyl)=1H-hexahydro-1,4-diazepine} (Makishima -M. et al. FEBS Lett. 1991; 287:175). D'autres exemples de tels inhibiteurs sont notamment le composé ML-9 (Wilson DP.et al. J Biol Chem. 2001;13: 165) ou d'autres non sélectifs: Wortmannin (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93), H-7 (Piao Zf et al. Mol Cell Biol Res Commun 2001;4: 307-12) et KT 7692 (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93). Un objet préféré de l'invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de MLCK choisis parmi ML-7, ML-9, Wortmannin, H-7 et KT 7692, seuls ou en combinaison. Des composés préférés de l'invention sont des composés n'ayant pas d'effet significatif ou substantiel sur la perméabilité vasculaire et/ou l'hémodynamique circulatoire pulmonaire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise des composés inhibiteurs de MLCK à l'exception de BDM [2,3-butanedione 2-monoxime], ML-7, ML-9 [1- (5-chloronaphthalene-1- sulfonyl) -1H-hexahydro-1, 4-diazepine hydrochloride], wortmannin, H-7 [1- (5-isoquinoline sulphonyl) -2-methylpiperazine dihydro-chloride], Fasudil (HA1077) [Hexahydro 1- (5-isoquinolinesulphonyl) - 1 H- 1, 4- diazepine], W-7 [N- (6-Aminohexyl) -5-chloro- 1-naphthalenesulfonamide] and A-3 [N- (6-Aminoethyl) -5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]. D'autres composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine peuvent être des activateurs de la myosine phosphatase.
D'autres cibles agissant sur la tension du cytosquelette sont notamment les protéines de liaison à la myosine, telles que par exemple la cinguline, ou les molécules de jonction, telles que la cadherine-E, la catenine-a ou les desmosomes. La modulation de l'activité ou de l'expression de ces protéines
Un exemple particulier d'inhibiteur sélectif de MLCK est le composé ML-7 {1 (5-i~donaphtalène-1-sulfonyl)=1H-hexahydro-1,4-diazepine} (Makishima -M. et al. FEBS Lett. 1991; 287:175). D'autres exemples de tels inhibiteurs sont notamment le composé ML-9 (Wilson DP.et al. J Biol Chem. 2001;13: 165) ou d'autres non sélectifs: Wortmannin (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93), H-7 (Piao Zf et al. Mol Cell Biol Res Commun 2001;4: 307-12) et KT 7692 (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93). Un objet préféré de l'invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de MLCK choisis parmi ML-7, ML-9, Wortmannin, H-7 et KT 7692, seuls ou en combinaison. Des composés préférés de l'invention sont des composés n'ayant pas d'effet significatif ou substantiel sur la perméabilité vasculaire et/ou l'hémodynamique circulatoire pulmonaire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise des composés inhibiteurs de MLCK à l'exception de BDM [2,3-butanedione 2-monoxime], ML-7, ML-9 [1- (5-chloronaphthalene-1- sulfonyl) -1H-hexahydro-1, 4-diazepine hydrochloride], wortmannin, H-7 [1- (5-isoquinoline sulphonyl) -2-methylpiperazine dihydro-chloride], Fasudil (HA1077) [Hexahydro 1- (5-isoquinolinesulphonyl) - 1 H- 1, 4- diazepine], W-7 [N- (6-Aminohexyl) -5-chloro- 1-naphthalenesulfonamide] and A-3 [N- (6-Aminoethyl) -5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]. D'autres composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine peuvent être des activateurs de la myosine phosphatase.
D'autres cibles agissant sur la tension du cytosquelette sont notamment les protéines de liaison à la myosine, telles que par exemple la cinguline, ou les molécules de jonction, telles que la cadherine-E, la catenine-a ou les desmosomes. La modulation de l'activité ou de l'expression de ces protéines
8 permet de réguler la tension du cytosquelette, dans le cadre de la présente invention.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un modulateur (notamment d'un inhibiteur) de l'activité ou de la structure ou de-(expression des molécules du cytosquelette. Le composé peut être par exemple un acide nucléique antisens, une molécule synthétique, un fragment d'anticorps, etc.
Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des composés inhibiteurs de la synthèse de protéines ou autres molécules assurant la liaison entre les protéines du cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. Parmi les protéines des jonctions serrées, on peut citer notamment les protéines occludines, claudines, ZO-1, ZO-2, ZO-3, AF7 et 7H6. Un moyen selon l'invention de moduler l'ouverture ou la fermeture des jonctions serrées réside donc dans la régulation de la synthèse des protéines de liaison entre le cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. En stimulant cette synthèse, il est attendu un renforcement des liaisons entre les jonctions serrées et le cytosquelette, conduisant à une plus faible perméabilité de l'épithélium.
D'autres composés utilisables dans le cadre de l'invention sont par exemple des inhibiteurs de kinases activées par les mitogènes (MAPI~K), notamment de la kinase MEK1 ou de la kinase-PI3, tels que les composés PD098,059 f 2-(Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one}(Alessi et al. J.Biol.Chem.1995; 270, 27589) ou LY294002 {2-(4-Morpholinyl)-8phenil-1(4H)-benzopyran-4-one}
(Vlahos et aI.J.Biol.Chem 1994;269: 5241).
D' autres molécules utilisables pour réguler, de manière indirecte, la tension du cytosquelette, sont des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance hépatique (HGF), le facteur de croissance endothélial (EGF) ou certaines
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un modulateur (notamment d'un inhibiteur) de l'activité ou de la structure ou de-(expression des molécules du cytosquelette. Le composé peut être par exemple un acide nucléique antisens, une molécule synthétique, un fragment d'anticorps, etc.
Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des composés inhibiteurs de la synthèse de protéines ou autres molécules assurant la liaison entre les protéines du cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. Parmi les protéines des jonctions serrées, on peut citer notamment les protéines occludines, claudines, ZO-1, ZO-2, ZO-3, AF7 et 7H6. Un moyen selon l'invention de moduler l'ouverture ou la fermeture des jonctions serrées réside donc dans la régulation de la synthèse des protéines de liaison entre le cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. En stimulant cette synthèse, il est attendu un renforcement des liaisons entre les jonctions serrées et le cytosquelette, conduisant à une plus faible perméabilité de l'épithélium.
D'autres composés utilisables dans le cadre de l'invention sont par exemple des inhibiteurs de kinases activées par les mitogènes (MAPI~K), notamment de la kinase MEK1 ou de la kinase-PI3, tels que les composés PD098,059 f 2-(Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one}(Alessi et al. J.Biol.Chem.1995; 270, 27589) ou LY294002 {2-(4-Morpholinyl)-8phenil-1(4H)-benzopyran-4-one}
(Vlahos et aI.J.Biol.Chem 1994;269: 5241).
D' autres molécules utilisables pour réguler, de manière indirecte, la tension du cytosquelette, sont des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance hépatique (HGF), le facteur de croissance endothélial (EGF) ou certaines
9 cytokines susceptibles d' être libérées par les immunocytes, telles que les interleukines-l, -4, -13, ou les facteurs tels que IGF-1 ou l'interféron gamma.
Une autre approche permettant de réguler de manière indirecte la tension du cytosquelette repose sur l'utilisation de la taurine ou du peptide GLP2 (« glucagon-like peptide 2 ») ou encore des dérivés de ces derniers, qui peuvent permettre d'altérer la perméabilité de l'épithélium pulmonaire par un effet indirect sur la contraction du cytosquelette. De même, certaines molécules agissant sur des récepteurs situés au pôle apical des cellules épithéliales (ex:
récepteurs aux protéinases; PAR-2) peuvent agir indirectement sur le cytosquelette.
Un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention comprend l'utilisation d'agents agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette, notamment de molécules inhibitrices de la contraction du cytosquelette, en particulier de molécules inhibitrices de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou inhibitrices de la dégradation de l'actine, préférentiellement des composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
Comme indiqué ci-avant, les composés utilisés sont avantageusement des molécules, qui peuvent être sous forme isolée ou sous forme de combinaison, d'extraits biologiques, etc. Ces molécules peuvent être synthétiques, semi-synthétiques ou biologiques, notamment d' origine animale, virale, végétale ou bactérienne.
La présente invention peut être utilisée pour le traitement ou la prise en charge de pathologies ou désordres du système respiratoire, notamment de l' asthme, des allergies, des pathologies obstructives (bronchites, bronchiolites, emphysème, etc), notamment lorsque ces pathologies ont un caractère chronique ou sévère.
Elle est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif de l'asthme ou de diverses allergies (poussières, pollens, pollution, etc.) ainsi qu'au traitement local d'inflammations pulmonaires. Elle est utilisable de manière préventive chez des suj ets présentant des prédispositions ou une sensibilité
à ce type de désordres, ou de manière curative, par exemple lors de crises ou sur des 5 périôdes plus longues. Lés compositions et méthodes de l'invention permettent de réduire la souffrance ou les difficultés respiratoires des sujets, d'atténuer les symptômes ou la cause de ces désordres.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que
Une autre approche permettant de réguler de manière indirecte la tension du cytosquelette repose sur l'utilisation de la taurine ou du peptide GLP2 (« glucagon-like peptide 2 ») ou encore des dérivés de ces derniers, qui peuvent permettre d'altérer la perméabilité de l'épithélium pulmonaire par un effet indirect sur la contraction du cytosquelette. De même, certaines molécules agissant sur des récepteurs situés au pôle apical des cellules épithéliales (ex:
récepteurs aux protéinases; PAR-2) peuvent agir indirectement sur le cytosquelette.
Un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention comprend l'utilisation d'agents agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette, notamment de molécules inhibitrices de la contraction du cytosquelette, en particulier de molécules inhibitrices de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou inhibitrices de la dégradation de l'actine, préférentiellement des composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
Comme indiqué ci-avant, les composés utilisés sont avantageusement des molécules, qui peuvent être sous forme isolée ou sous forme de combinaison, d'extraits biologiques, etc. Ces molécules peuvent être synthétiques, semi-synthétiques ou biologiques, notamment d' origine animale, virale, végétale ou bactérienne.
La présente invention peut être utilisée pour le traitement ou la prise en charge de pathologies ou désordres du système respiratoire, notamment de l' asthme, des allergies, des pathologies obstructives (bronchites, bronchiolites, emphysème, etc), notamment lorsque ces pathologies ont un caractère chronique ou sévère.
Elle est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif de l'asthme ou de diverses allergies (poussières, pollens, pollution, etc.) ainsi qu'au traitement local d'inflammations pulmonaires. Elle est utilisable de manière préventive chez des suj ets présentant des prédispositions ou une sensibilité
à ce type de désordres, ou de manière curative, par exemple lors de crises ou sur des 5 périôdes plus longues. Lés compositions et méthodes de l'invention permettent de réduire la souffrance ou les difficultés respiratoires des sujets, d'atténuer les symptômes ou la cause de ces désordres.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que
10 défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler, notamment à réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithelium pulmonaire chez des suj ets atteints de maladies respiratoires, notamment d' affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires, notamment aux affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d' éosinophiles, par exemple d' asthme ou d' allergie.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire, notamment d'une affection pulmonaire caractérisée par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires, notamment aux affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d' éosinophiles, par exemple d' asthme ou d' allergie.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire, notamment d'une affection pulmonaire caractérisée par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.
11 L'invention est également relative à des méthodes de traitement des conditions indiquées ci-dessus, comprenant l'administration à un sujet atteint d'une pathologie respiratoire ou sensible aux pathologies respiratoires, d'un composé
ou traitement tel que défini ci-avant. De préférence, le composé ou traitement est administré dans une dose efficace pour-réduire la perméabilité-paracellulaire de l'épithelium pulmonaire et/ou pour réduire la sensibilisation aux allergènes et/ou pour réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon.
Le composé peut être administré par différentes voies et sous différentes formes.
Ainsi, le composé peut être sous forme liquide, solide ou en aérosol, typiquement sous forme de comprimé, gélule, aérosol, ampoule ou soluté buvable, solution injectable, etc. On préfère des composés formulés sous une forme administrable par voie locale (e.g., dans les voies aériennes (e.g., respiratoires)) ou par voie orale (solutés buvables, comprimés, ampoules, sirops, sprays, etc.). Le conditionnement en aérosol est particulièrement préféré, lorsque cela est possible. Bien entendu, d'autres formes d'administration sont possibles, comme des injections (intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrapéritonéale, etc.), des pâtes, gels, suppositoires, etc.
Les composés peuvent être utilisés seuls ou en combinaisons et/ou en association avec d' autres agents actifs, comme par exemple d' autres substances actives utilisées dans le traitement des maladies respiratoires. On peut citer par exemple les agonistes-[32 et les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes, les anti-leulcotrienes, etc. Ces différents agents peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.
Un autre objet de l'invention réside dans un produit ou une association pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du
ou traitement tel que défini ci-avant. De préférence, le composé ou traitement est administré dans une dose efficace pour-réduire la perméabilité-paracellulaire de l'épithelium pulmonaire et/ou pour réduire la sensibilisation aux allergènes et/ou pour réduire la migration transépithéliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon.
Le composé peut être administré par différentes voies et sous différentes formes.
Ainsi, le composé peut être sous forme liquide, solide ou en aérosol, typiquement sous forme de comprimé, gélule, aérosol, ampoule ou soluté buvable, solution injectable, etc. On préfère des composés formulés sous une forme administrable par voie locale (e.g., dans les voies aériennes (e.g., respiratoires)) ou par voie orale (solutés buvables, comprimés, ampoules, sirops, sprays, etc.). Le conditionnement en aérosol est particulièrement préféré, lorsque cela est possible. Bien entendu, d'autres formes d'administration sont possibles, comme des injections (intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrapéritonéale, etc.), des pâtes, gels, suppositoires, etc.
Les composés peuvent être utilisés seuls ou en combinaisons et/ou en association avec d' autres agents actifs, comme par exemple d' autres substances actives utilisées dans le traitement des maladies respiratoires. On peut citer par exemple les agonistes-[32 et les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes, les anti-leulcotrienes, etc. Ces différents agents peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.
Un autre objet de l'invention réside dans un produit ou une association pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du
12 cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires et au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-(32, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotriènes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires selon l' invention, préférentiellement un composé inhibant la contraction de la chaîne légère de la myosine, plus particulièrement un composé inhibant la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine, plus particulièrement un inhibiteur de la MLCK ou un activateur de la myosine phosphatase, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, ladite composition étant formulée préférentiellement pour une administration par voie orale ou aérienne. De préférence, la composition est sous forme d'aérosol et comporte un gaz porteur, ou sous forme de solution buvable.
Le composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires utilisé à titre d' actif pharmaceutique est mis en oeuvre dans des quantités thérapeutiquement efficaces. Il est entendu que la dose achninistrée peut être adaptée par l'homme du métier en fonction du sujet (patient) à traiter, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc. Les quantités ou doses des composés administrées ou utilisées dans les compositions selon l'invention peuvent être déterminées en fonction de leur capacité à moduler la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires. Cette capacité et donc l' évaluation de la dose à administrer peuvent notamment être déterminées par le protocole expérimental décrit dans l'exemple 7.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires selon l' invention, préférentiellement un composé inhibant la contraction de la chaîne légère de la myosine, plus particulièrement un composé inhibant la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine, plus particulièrement un inhibiteur de la MLCK ou un activateur de la myosine phosphatase, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, ladite composition étant formulée préférentiellement pour une administration par voie orale ou aérienne. De préférence, la composition est sous forme d'aérosol et comporte un gaz porteur, ou sous forme de solution buvable.
Le composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires utilisé à titre d' actif pharmaceutique est mis en oeuvre dans des quantités thérapeutiquement efficaces. Il est entendu que la dose achninistrée peut être adaptée par l'homme du métier en fonction du sujet (patient) à traiter, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc. Les quantités ou doses des composés administrées ou utilisées dans les compositions selon l'invention peuvent être déterminées en fonction de leur capacité à moduler la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires. Cette capacité et donc l' évaluation de la dose à administrer peuvent notamment être déterminées par le protocole expérimental décrit dans l'exemple 7.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
13 LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Influence du ML-7 sur l'augmentation de la perméabilité
paracellulaire pulmonaire -de la serunu albumine humaine marquée à-l' Iazs induite par la perfusion infra-trachéale de LPS de Pseudomonas aeruginosa. Le LPS diminue les taux de radioactivité mesurés au niveau des liquides de lavage bronchoalvéolaires (LBAs) alors que, comparés aux témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons. Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un pré-traitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité tant au niveau des LBAs que des poumons ont été mesurées chez ces animaux.
Figure 2 : Western blot des formes phosphorylées de la chaîne légère de myosine (p-MLC) et de la forme native (MLC) à la suite du traitement des cellules bronchiques humaines NCI-H292 en culture par le LPS. Les temps d'incubation sont indiqués sur chaque blot (T correspondant au témoin).
EXEMPLES
Exemple 1 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par la taurine L'épithélium bronchique et alvéolaire possède des structures de liaison des cellules épithéliales qui assurent un passage contrôlé des immunocytes dans les voies aériennes. Cet exemple montre que certaines molécules connues pour leur effet d' augmentation de la perméabilité paracellulaire au niveau intestinal tel que le SLIGRL favorisent l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes
Figure 1 : Influence du ML-7 sur l'augmentation de la perméabilité
paracellulaire pulmonaire -de la serunu albumine humaine marquée à-l' Iazs induite par la perfusion infra-trachéale de LPS de Pseudomonas aeruginosa. Le LPS diminue les taux de radioactivité mesurés au niveau des liquides de lavage bronchoalvéolaires (LBAs) alors que, comparés aux témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons. Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un pré-traitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité tant au niveau des LBAs que des poumons ont été mesurées chez ces animaux.
Figure 2 : Western blot des formes phosphorylées de la chaîne légère de myosine (p-MLC) et de la forme native (MLC) à la suite du traitement des cellules bronchiques humaines NCI-H292 en culture par le LPS. Les temps d'incubation sont indiqués sur chaque blot (T correspondant au témoin).
EXEMPLES
Exemple 1 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par la taurine L'épithélium bronchique et alvéolaire possède des structures de liaison des cellules épithéliales qui assurent un passage contrôlé des immunocytes dans les voies aériennes. Cet exemple montre que certaines molécules connues pour leur effet d' augmentation de la perméabilité paracellulaire au niveau intestinal tel que le SLIGRL favorisent l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes
14 (neutrophiles, macrophage) et que cet effet peut être prévenu (e.g., inhibé, réduit) par un traitement oral par la taurine.
Pour ce faire, quatre lots de ~ rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu pendant jours unè eau de boisson contenant (lots l et 2) ou-ne contenant pas (lots 3 et 4) de la taurine (5 %).
Au temps t = 10 j, les 4 lots d'animaux sont soumis à l'instillation intranasale lente de 200 ~.l de sérum physiologique contenant (lots 2 et 4) ou ne contenant (lots 1 et 3) 0,2 mg de SLIGRL.
Au temps t = 3 h après l'instillation infra-nasale, les animaux ont été
anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 1 ci-après.
Ces résultats montrent que l'instillation intranasale du SLIGRL entraîne, à t = 3 h., l'accumulation d'éosinophiles et de neutrophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL) chez les animaux contrôles mais pas chez ceux ayant reçu la taurine (tableau 1). Ces résultats confirment in vivo l'implication des jonctions serrées dans la perméabilité aux immunocytes de l'épithélium pulmonaire.
Tableau 1 : Influence de la Taurine sur le niveau d'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intrasanale de SLIGRL chez le rat (moyennes + SD ; n = 10) PAR Z (0,2 Taurine 10 mg/kg IN % + PAR
(mean ~
NaCI 0,9 PAR 2 NaCI 0,9 PAR 2 % %
SEM
Tot.
Leucocytes 960 + 112 6464 + 1728 + 111 2086 + 134 99 +
(mm3) Mac3ophages945 + 25 5559 + 1651 + 72 1967 + 103 63 +
(mm ) Neutrophiles +
4+0,3 65641 34+3 343 (mm3) Eosinophiles +
0,2+0,7 322 17~ 1 17+ 1 (mm3) Lymphocytes144 ~ 11 297 ~ 28 22 ~ 8 22 + 8 (mm3) * p < 0,05 from PAR 2 values ; ' : p < U,US trom lvaL1 vaines ; lin : m miranasa~
Exemple 2 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le ML-7 Cet exemple montre que le ML-7 réduit l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes observée après perfusion intratrachéale de taurocholate associée à l'ouverture des jonctions serrées.
Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le par voie IP à la dose de 1 mg/kg/12h pendant 36 heures soit son solvant. Une heure après la dernière injection, une instillation intratrachéale lente de 200 ~,1 de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 50 mM
de taurocholate.
Au temps t = 2 h après l'instillation intratrachéale, les animaux ont été
anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-après. Ils montrent que le composé ML-7 permet de réduire de manière significative l' accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes.
Tableau 2 : Influence du ML-7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intratrachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes ~ SD ; n = 8) Tmoin Taurocholate ML-7 +
Taurocholate Leucocytes 4032 ~ 919 35200 ~ 1270.84160 ~ 573 * _ Macrophages 3419 ~ 762 33288 ~ 155313585 ~ 398 *
Lymphocytes 166 ~ 68 3654 ~ 2443 101 ~ 44 *
Neutrophiles 445 ~ 113 5732 ~ 2279 473 ~ 216 *
Témoin : eau stérile perfusée 20 min par voie trachéale; Taurocholate 5 mM
perfusé par voie trachéale; ML7 (1 mg/kg /12 h, 36 h IP) + Taurocholate * p< 0.001 significativement different des valeurs temoins Exemple 3 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le PD-Cet exemple montre que le PD-98059 (inhibiteur de la kinase MEK1), réduit l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes associée à l'ouverture des jonctions serrées, observée après la perfusion infra-trachéale de taurocholate (Tableau 3).
Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le PD-98059 par voie IP (1 mg/kg/12 h, 36 h) soit son solvant (DMSO). Une heure après la dernière administration, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion infra-trachéale lente de 200 ~.1 de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 5 mM/rat de taurocholate est réalisée.
Les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés 2 heures après la perfusion infra-trachéale de taurocholate ou de son solvant.
Tableau 3 : Influence du PD-98059 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire induit par la perfusion infra-trachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes ~ SEM ; n=8). Résultat exprimé
en nombre de cellules / mm3 de LBA.
Tmoin Taurocholate PD-98059 +
taurocholate Leucocytes 5040 628 56637 9791 * 21424 3164*#
Macrophages 4582 586 40234 5799* 17956 2465*#
Lymphocytes 136 31 4251 940* 774 183*#
Neutrophiles 320 62 11769 5787* 2652 600*#
(Eosinophiles)0 602 173 27 27*#
Témoin : NaCI 0.9% stérile perfusée 20 min par voie infra-trachéale ;
taurocholate SmM :rat perfusé par voie trachéale ; PD-98059 (1 mg/kg/12 h, 36 h) + taurocholate.
* p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.
# p< 0.05 significativement différentes des valeurs taurocholates.
Exemple 4 : Inhibition par le ML7 de l'augmentation de la perméabilité
pulmonaire induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.
Cet exemple montre que le ML7 (inhibiteur de la kinase de la chaine légère de la myosine, MLCK) bloque de façon significative l'augmentation de la perméabilité
pulmonaire liée à la perfusion infra-trachéale de lipopolysaccharide (LPS ) de Pseudomonas aeruginosa.
La perméabilité pulmonaire a été mesurée à l'aide d'un traceur, la sérum albumine humaine marquée à l'Ilzs, lequel, après perfusion infra-trachéale, est mesuré dans les urines, le plasma, le tissu pulmonaire et les lavages broncho alvéolaires.
Pour ce faire, trois lots de 6 rats mâles Wistar (200-225 g) ont reçu soit un pré-traitement de ML-7 par voie IP (3 mglkg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l'avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion infra-trachéale lente de 150 ~,l d'une solution iso-osmolaire (5%
albumine bovine + PBS) additionnée du traceur contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 ~g/rat de LPS, a été réalisée.
4 heures après- la perfusion infra-trachéale, les - urines, ie sang, les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les poumons ont été collectés puis la radioactivité
has a été mesurée sur chacun de ces prélèvements.
Les résultats obtenus montrent que le LPS diminue les taux de radioactivité
mesurés au niveau des LBAs alors que, parallèlement, comparés à ceux des témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons.
Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un pré-traitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité, tant au niveau des LBAs que des poumons, ont été mesurées chez ces animaux (figure 1).
Chez les trois lots d' animaux testés, aucune différence dans les taux de radioactivité mesurés au niveau plasmatique n'a été observée.
Ces résultats montrent que dans nos conditions expérimentales - extrapolables à
l' asthme et autres pathologies respiratoires allergiques - le ML-7 ne possède pas d'effet sur les cellules endothéliales vasculaires susceptibles de modifier la perméabilité de l'endothélium, son tonus (vasodilatation) et donc en général sur l'hémodynamique circulatoire pulmonaire (débit, oxygénation i.e. amélioration de l'hypoxie).
De plus aucune trace de radioactivité n'a été retrouvée dans les urines.
En conclusion, cet exemple montre que le LPS de Pseudomonas aeruginosa augmente la perméabilité paracellulaire au niveau pulmonaire favorisant l'accumulation d'immunocytes au niveau pulmonaire et que cet effet peut être prévenu par un traitement impliquant un bloqueur de la MLCK.
Exemple 5 : Réduction par le ML-7 de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.
Cet exemple complète l' exemple précédent et illustre la réduction, par le ML7, de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas Aeruginosa administré par perfusion infra-trachéale. Le ML-7 réduit ainsi 5 l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes.
Pour ce faire, trois lots de 7 rats mâles Wistar (200 - 225 g) ont été
utilisés. Les animaux ont reçu soit un pré-traitement de ML-7 par voie IP (3 mg/kg puis 1 mg/kg, 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l'avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 10 mg/kg IP), une perfusion infra-trachéale lente de 150 ~.1 d'une solution iso-osmolaire (5% albumine bovine + PBS) contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 ~,g/rat de LPS a été réalisée. 4 heures après la perfusion intra-trachéale, les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés.
Les résultats obtenus montrent que le LPS augmente les taux d'inununocytes
Pour ce faire, quatre lots de ~ rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu pendant jours unè eau de boisson contenant (lots l et 2) ou-ne contenant pas (lots 3 et 4) de la taurine (5 %).
Au temps t = 10 j, les 4 lots d'animaux sont soumis à l'instillation intranasale lente de 200 ~.l de sérum physiologique contenant (lots 2 et 4) ou ne contenant (lots 1 et 3) 0,2 mg de SLIGRL.
Au temps t = 3 h après l'instillation infra-nasale, les animaux ont été
anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 1 ci-après.
Ces résultats montrent que l'instillation intranasale du SLIGRL entraîne, à t = 3 h., l'accumulation d'éosinophiles et de neutrophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL) chez les animaux contrôles mais pas chez ceux ayant reçu la taurine (tableau 1). Ces résultats confirment in vivo l'implication des jonctions serrées dans la perméabilité aux immunocytes de l'épithélium pulmonaire.
Tableau 1 : Influence de la Taurine sur le niveau d'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intrasanale de SLIGRL chez le rat (moyennes + SD ; n = 10) PAR Z (0,2 Taurine 10 mg/kg IN % + PAR
(mean ~
NaCI 0,9 PAR 2 NaCI 0,9 PAR 2 % %
SEM
Tot.
Leucocytes 960 + 112 6464 + 1728 + 111 2086 + 134 99 +
(mm3) Mac3ophages945 + 25 5559 + 1651 + 72 1967 + 103 63 +
(mm ) Neutrophiles +
4+0,3 65641 34+3 343 (mm3) Eosinophiles +
0,2+0,7 322 17~ 1 17+ 1 (mm3) Lymphocytes144 ~ 11 297 ~ 28 22 ~ 8 22 + 8 (mm3) * p < 0,05 from PAR 2 values ; ' : p < U,US trom lvaL1 vaines ; lin : m miranasa~
Exemple 2 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le ML-7 Cet exemple montre que le ML-7 réduit l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes observée après perfusion intratrachéale de taurocholate associée à l'ouverture des jonctions serrées.
Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le par voie IP à la dose de 1 mg/kg/12h pendant 36 heures soit son solvant. Une heure après la dernière injection, une instillation intratrachéale lente de 200 ~,1 de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 50 mM
de taurocholate.
Au temps t = 2 h après l'instillation intratrachéale, les animaux ont été
anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-après. Ils montrent que le composé ML-7 permet de réduire de manière significative l' accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes.
Tableau 2 : Influence du ML-7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intratrachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes ~ SD ; n = 8) Tmoin Taurocholate ML-7 +
Taurocholate Leucocytes 4032 ~ 919 35200 ~ 1270.84160 ~ 573 * _ Macrophages 3419 ~ 762 33288 ~ 155313585 ~ 398 *
Lymphocytes 166 ~ 68 3654 ~ 2443 101 ~ 44 *
Neutrophiles 445 ~ 113 5732 ~ 2279 473 ~ 216 *
Témoin : eau stérile perfusée 20 min par voie trachéale; Taurocholate 5 mM
perfusé par voie trachéale; ML7 (1 mg/kg /12 h, 36 h IP) + Taurocholate * p< 0.001 significativement different des valeurs temoins Exemple 3 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le PD-Cet exemple montre que le PD-98059 (inhibiteur de la kinase MEK1), réduit l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes associée à l'ouverture des jonctions serrées, observée après la perfusion infra-trachéale de taurocholate (Tableau 3).
Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le PD-98059 par voie IP (1 mg/kg/12 h, 36 h) soit son solvant (DMSO). Une heure après la dernière administration, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion infra-trachéale lente de 200 ~.1 de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 5 mM/rat de taurocholate est réalisée.
Les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés 2 heures après la perfusion infra-trachéale de taurocholate ou de son solvant.
Tableau 3 : Influence du PD-98059 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire induit par la perfusion infra-trachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes ~ SEM ; n=8). Résultat exprimé
en nombre de cellules / mm3 de LBA.
Tmoin Taurocholate PD-98059 +
taurocholate Leucocytes 5040 628 56637 9791 * 21424 3164*#
Macrophages 4582 586 40234 5799* 17956 2465*#
Lymphocytes 136 31 4251 940* 774 183*#
Neutrophiles 320 62 11769 5787* 2652 600*#
(Eosinophiles)0 602 173 27 27*#
Témoin : NaCI 0.9% stérile perfusée 20 min par voie infra-trachéale ;
taurocholate SmM :rat perfusé par voie trachéale ; PD-98059 (1 mg/kg/12 h, 36 h) + taurocholate.
* p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.
# p< 0.05 significativement différentes des valeurs taurocholates.
Exemple 4 : Inhibition par le ML7 de l'augmentation de la perméabilité
pulmonaire induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.
Cet exemple montre que le ML7 (inhibiteur de la kinase de la chaine légère de la myosine, MLCK) bloque de façon significative l'augmentation de la perméabilité
pulmonaire liée à la perfusion infra-trachéale de lipopolysaccharide (LPS ) de Pseudomonas aeruginosa.
La perméabilité pulmonaire a été mesurée à l'aide d'un traceur, la sérum albumine humaine marquée à l'Ilzs, lequel, après perfusion infra-trachéale, est mesuré dans les urines, le plasma, le tissu pulmonaire et les lavages broncho alvéolaires.
Pour ce faire, trois lots de 6 rats mâles Wistar (200-225 g) ont reçu soit un pré-traitement de ML-7 par voie IP (3 mglkg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l'avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion infra-trachéale lente de 150 ~,l d'une solution iso-osmolaire (5%
albumine bovine + PBS) additionnée du traceur contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 ~g/rat de LPS, a été réalisée.
4 heures après- la perfusion infra-trachéale, les - urines, ie sang, les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les poumons ont été collectés puis la radioactivité
has a été mesurée sur chacun de ces prélèvements.
Les résultats obtenus montrent que le LPS diminue les taux de radioactivité
mesurés au niveau des LBAs alors que, parallèlement, comparés à ceux des témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons.
Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un pré-traitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité, tant au niveau des LBAs que des poumons, ont été mesurées chez ces animaux (figure 1).
Chez les trois lots d' animaux testés, aucune différence dans les taux de radioactivité mesurés au niveau plasmatique n'a été observée.
Ces résultats montrent que dans nos conditions expérimentales - extrapolables à
l' asthme et autres pathologies respiratoires allergiques - le ML-7 ne possède pas d'effet sur les cellules endothéliales vasculaires susceptibles de modifier la perméabilité de l'endothélium, son tonus (vasodilatation) et donc en général sur l'hémodynamique circulatoire pulmonaire (débit, oxygénation i.e. amélioration de l'hypoxie).
De plus aucune trace de radioactivité n'a été retrouvée dans les urines.
En conclusion, cet exemple montre que le LPS de Pseudomonas aeruginosa augmente la perméabilité paracellulaire au niveau pulmonaire favorisant l'accumulation d'immunocytes au niveau pulmonaire et que cet effet peut être prévenu par un traitement impliquant un bloqueur de la MLCK.
Exemple 5 : Réduction par le ML-7 de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.
Cet exemple complète l' exemple précédent et illustre la réduction, par le ML7, de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas Aeruginosa administré par perfusion infra-trachéale. Le ML-7 réduit ainsi 5 l'accumulation infra-alvéolaire d'immunocytes.
Pour ce faire, trois lots de 7 rats mâles Wistar (200 - 225 g) ont été
utilisés. Les animaux ont reçu soit un pré-traitement de ML-7 par voie IP (3 mg/kg puis 1 mg/kg, 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l'avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 10 mg/kg IP), une perfusion infra-trachéale lente de 150 ~.1 d'une solution iso-osmolaire (5% albumine bovine + PBS) contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 ~,g/rat de LPS a été réalisée. 4 heures après la perfusion intra-trachéale, les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés.
Les résultats obtenus montrent que le LPS augmente les taux d'inununocytes
15 présents au niveau des LBAs et plus particulièrement des polynucléaires neutrophiles. Cette augmentation de la neutrophilie est réduite par un pré
traitement des animaux au ML7 (Tableau 4).
Tableau 4 : Influence du ML7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans 20 le liquide de lavage broncho-alvéolaire induite par la perfusion infra-trachéale de LPS (1 ~.g/rat) chez le rat (moyennes ~ SEM ; n=7). Résultats exprimés en nombre de cellules / mm3 de LBA.
Tmoin LPS ML-7 +
LPS
Leucocytes 5883 961 37968 6912 17243 2956 * * #
Macrophages 4760 738 16670 3060 10708 1713 *
Lymphocytes 188 70 2253 905 * 902 375 Neutrophiles 934 707 19045 4892 6587 1749 * * #
Témoin : Solution à 5% albumine bovine + PBS perfusée 20 min par voie intra-trachéale ; LPS 1 p,g/rat perfusé par voie trachéale ; ML-7 (3 mg/kg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h IP) + LPS
'~ p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.
# p< 0.05 significativement différentes des valeurs LPS.
Exemple 6: Stimulation de la phosphorylation de la chaîne légère de myosine des cellules épithéliales bronchiques humaines par le LPS.
Matériel : La lignée cellulaire humaine utilisée NCI-H292 a été obtenue de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA). Les réactifs utilisés, milieu RPMI 1640, sérum de veau fétal et autres réactifs de culture cellulaire ont été
fournis par GIBCO, le cocktail d'inhibiteurs de protéases par ROCHE (1697498) et le LPS (E.coli SO55 :BS) et autres réactifs par SIGMA.
Culture cellulaire : Les cellules NCI-H292 ont été cultivées sur un milieu RPMI
1640 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml penicilline,100 ~,g/ml de streptomycine et 10% de sérum de veau fétal. Les cellules ont été cultivées à
37°C sous air humidifié contenant 5% de C02 et repiquées 2 fois par semaine. Les cellules ont été disséminées dans des plaques à 6 puits, chacun contenant 5..10 3 cellules. Au stade de confluence, les cellules ont été incubées dans du RPMI
contenant 0.1 % de Serum Albumine Bovine (BSA) pendant une nuit. Les cellules sont ensuite rincées avec du RPMI 1640 sans BSA et exposées au LPS
(2~,g/ml) ou au sérum physiologique comme témoin (NaCI 0.9%) pour des durées allant de 30 mn à 24 heures.
Western Blot : Pour cette analyse, les cellules ont été lysées à différent temps après traitement au LPS avec un tampon RIPA (1% triton, 150mM NaCI, 1mM
EDTA, lOmM Tris pH7,4 et le cocktail d'inhibiteurs de protéases à la concentration recommandée par le fournisseur). La forme phosphorylée de la chaîne légère de myosine (p-MLC) et la forme non phosphorylée de la chaîne légère de myosine (MLC-20) ont été détectées dans ces cellules aux temps 30mn, 1, 2 et 3 heures d'exposition au LPS ainsi qu'aux temps plus longs (6, 12 et heures). Les protéines des cellules NCI-H292 exposées au LPS ont été séparées par SDS-PAGE dans un gel de polyacrylamide à 15% et soumises au transfert électrophorétique sur membrane de nitrocellulose dans 25 mM de Tris-amino, 192 mM de glycine-et 20% de méthanol. L'immunoprécipitation a été effectuée avec un anticorps de chèvre anti-myosine phosphorylée humaine dilué au 1/500 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) ou un anticorps monoclonal de souris anti-myosine humaine (light chains 20 K, Sigma-Aldrich, Inc.) dilué au 1/1000, pour la détection respective de p-MLC et de MLC-20. La peroxydase-Protein G
recombinante a été utilisée à la dilution 1/1000 comme anticorps secondaire.
Les bandes immunomarquées ont été révélées par fluorographie avec le réactif ECL
(Enhanced chemiluminescence, Pierce, Perbio Science, Inc.).
Résultats : Par rapport au témoin (sérum pysiologique), il a été constaté une augmentation quantitative de l'expression de la forme phosphorylée p-MLC dans les cellules traitées au LPS maximale après 30mn et 1 heure d'exposition (fig.
2), avec un retour aux valeurs contrôles en 6 heures. L' expression de la forme non-phosphorylée MLC-20 est faible quant à elle après 30mn et 1 heure de traitement au LPS et augmente progressivement dans le temps (fig. 2 : illustration des analyses western-blot).
Conclusions: L'exposition des cellules bronchiques humaines au LPS entraîne une augmentation rapide (30mn -1 heure) de la phosphorylation des chaînes légères de myosine qui constituent le cytosquelette de ces cellules. Cette phosphorylation traduit la contraction du cytosquelette et l'ouverture des jonctions serrées favorisant ainsi la pénétration des allergènes et l'accumulation d'ünmunocytes dans les bronches.
Exemple 7: Protocole expérimental pour déterminer in vitro les concentrations actives plasmatiques en composés tests et susceptibles d'agir.
Le criblage in vitro de formulations pharmaceutiques peut être une méthode efficace et rentable pour identifier le candidat tête de série avant les tests in vivo.
Les cellules produisent des jonctions serrées qui inhibent le passage de substances en solution de bas poids moléculaire et le flux de courant électrique, permettant l'utilisation de résistance trans-épithéliale (RTE) comme corrélat de perméabilité.
Mesure de la résistance électrique : les cellules humaines pulmonaires croissent jusqu'à confluence sur des inserts de membranes de cultures de cellules poreuses et leurs résistances électriques sont mesurées à l'aide d'un système de résistance électrique. Un insert sans monocouche cellulaire sert de témoin pour déterminer la résistance de base et les inserts avec des monocouches cellulaires à
confluence traités avec du PBS servent de contrôles. Les LPS des Pseudomofaas aeruginosa sont ajoutés à des concentrations variant de 1,0 ng/ml à 10 ~,l/ml et incubés pendant 6 heures à 37°C. La résistance électrique trans-épithéliale (ohms x centimètre carré) est calculée à partir de l' équation suivante :
(RTEéchantillon -RTEte",oi") x surface. Le LPS de Pseudomohas aerigihosa diminue la résistance électrice de manière dose dépendante. La donnée obtenue correspondant à la dose maximale induisant une réponse avec la diminution maximale de la RTE est considérée comme la réponse à 100% et est reportée pour les composés-tests.
Composés-tests : Utilisant le même protocole avec la dose maximale de LPS
(réponse à 100%), les composés-tests sont incubés 1 heure auparavant à des concentrations variant de 10 ~M à 500 g.M. Les doses des composés-tests retenues pour les investigations ou essais futurs sont les concentrations pour lesquelles on constate une inversion de 50% de la düninution maximale de la RTE induite par le LPS.
Ce test peut être utilisé pour évaluer l'effet inhibiteur à 50% de composés-tests sur la diminution de la RTE suite à l'exposition au LPS de monocouches cellulaires issues de cellules épithéliales bronchiques humaines (NCI-H292).
traitement des animaux au ML7 (Tableau 4).
Tableau 4 : Influence du ML7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans 20 le liquide de lavage broncho-alvéolaire induite par la perfusion infra-trachéale de LPS (1 ~.g/rat) chez le rat (moyennes ~ SEM ; n=7). Résultats exprimés en nombre de cellules / mm3 de LBA.
Tmoin LPS ML-7 +
LPS
Leucocytes 5883 961 37968 6912 17243 2956 * * #
Macrophages 4760 738 16670 3060 10708 1713 *
Lymphocytes 188 70 2253 905 * 902 375 Neutrophiles 934 707 19045 4892 6587 1749 * * #
Témoin : Solution à 5% albumine bovine + PBS perfusée 20 min par voie intra-trachéale ; LPS 1 p,g/rat perfusé par voie trachéale ; ML-7 (3 mg/kg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h IP) + LPS
'~ p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.
# p< 0.05 significativement différentes des valeurs LPS.
Exemple 6: Stimulation de la phosphorylation de la chaîne légère de myosine des cellules épithéliales bronchiques humaines par le LPS.
Matériel : La lignée cellulaire humaine utilisée NCI-H292 a été obtenue de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA). Les réactifs utilisés, milieu RPMI 1640, sérum de veau fétal et autres réactifs de culture cellulaire ont été
fournis par GIBCO, le cocktail d'inhibiteurs de protéases par ROCHE (1697498) et le LPS (E.coli SO55 :BS) et autres réactifs par SIGMA.
Culture cellulaire : Les cellules NCI-H292 ont été cultivées sur un milieu RPMI
1640 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml penicilline,100 ~,g/ml de streptomycine et 10% de sérum de veau fétal. Les cellules ont été cultivées à
37°C sous air humidifié contenant 5% de C02 et repiquées 2 fois par semaine. Les cellules ont été disséminées dans des plaques à 6 puits, chacun contenant 5..10 3 cellules. Au stade de confluence, les cellules ont été incubées dans du RPMI
contenant 0.1 % de Serum Albumine Bovine (BSA) pendant une nuit. Les cellules sont ensuite rincées avec du RPMI 1640 sans BSA et exposées au LPS
(2~,g/ml) ou au sérum physiologique comme témoin (NaCI 0.9%) pour des durées allant de 30 mn à 24 heures.
Western Blot : Pour cette analyse, les cellules ont été lysées à différent temps après traitement au LPS avec un tampon RIPA (1% triton, 150mM NaCI, 1mM
EDTA, lOmM Tris pH7,4 et le cocktail d'inhibiteurs de protéases à la concentration recommandée par le fournisseur). La forme phosphorylée de la chaîne légère de myosine (p-MLC) et la forme non phosphorylée de la chaîne légère de myosine (MLC-20) ont été détectées dans ces cellules aux temps 30mn, 1, 2 et 3 heures d'exposition au LPS ainsi qu'aux temps plus longs (6, 12 et heures). Les protéines des cellules NCI-H292 exposées au LPS ont été séparées par SDS-PAGE dans un gel de polyacrylamide à 15% et soumises au transfert électrophorétique sur membrane de nitrocellulose dans 25 mM de Tris-amino, 192 mM de glycine-et 20% de méthanol. L'immunoprécipitation a été effectuée avec un anticorps de chèvre anti-myosine phosphorylée humaine dilué au 1/500 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) ou un anticorps monoclonal de souris anti-myosine humaine (light chains 20 K, Sigma-Aldrich, Inc.) dilué au 1/1000, pour la détection respective de p-MLC et de MLC-20. La peroxydase-Protein G
recombinante a été utilisée à la dilution 1/1000 comme anticorps secondaire.
Les bandes immunomarquées ont été révélées par fluorographie avec le réactif ECL
(Enhanced chemiluminescence, Pierce, Perbio Science, Inc.).
Résultats : Par rapport au témoin (sérum pysiologique), il a été constaté une augmentation quantitative de l'expression de la forme phosphorylée p-MLC dans les cellules traitées au LPS maximale après 30mn et 1 heure d'exposition (fig.
2), avec un retour aux valeurs contrôles en 6 heures. L' expression de la forme non-phosphorylée MLC-20 est faible quant à elle après 30mn et 1 heure de traitement au LPS et augmente progressivement dans le temps (fig. 2 : illustration des analyses western-blot).
Conclusions: L'exposition des cellules bronchiques humaines au LPS entraîne une augmentation rapide (30mn -1 heure) de la phosphorylation des chaînes légères de myosine qui constituent le cytosquelette de ces cellules. Cette phosphorylation traduit la contraction du cytosquelette et l'ouverture des jonctions serrées favorisant ainsi la pénétration des allergènes et l'accumulation d'ünmunocytes dans les bronches.
Exemple 7: Protocole expérimental pour déterminer in vitro les concentrations actives plasmatiques en composés tests et susceptibles d'agir.
Le criblage in vitro de formulations pharmaceutiques peut être une méthode efficace et rentable pour identifier le candidat tête de série avant les tests in vivo.
Les cellules produisent des jonctions serrées qui inhibent le passage de substances en solution de bas poids moléculaire et le flux de courant électrique, permettant l'utilisation de résistance trans-épithéliale (RTE) comme corrélat de perméabilité.
Mesure de la résistance électrique : les cellules humaines pulmonaires croissent jusqu'à confluence sur des inserts de membranes de cultures de cellules poreuses et leurs résistances électriques sont mesurées à l'aide d'un système de résistance électrique. Un insert sans monocouche cellulaire sert de témoin pour déterminer la résistance de base et les inserts avec des monocouches cellulaires à
confluence traités avec du PBS servent de contrôles. Les LPS des Pseudomofaas aeruginosa sont ajoutés à des concentrations variant de 1,0 ng/ml à 10 ~,l/ml et incubés pendant 6 heures à 37°C. La résistance électrique trans-épithéliale (ohms x centimètre carré) est calculée à partir de l' équation suivante :
(RTEéchantillon -RTEte",oi") x surface. Le LPS de Pseudomohas aerigihosa diminue la résistance électrice de manière dose dépendante. La donnée obtenue correspondant à la dose maximale induisant une réponse avec la diminution maximale de la RTE est considérée comme la réponse à 100% et est reportée pour les composés-tests.
Composés-tests : Utilisant le même protocole avec la dose maximale de LPS
(réponse à 100%), les composés-tests sont incubés 1 heure auparavant à des concentrations variant de 10 ~M à 500 g.M. Les doses des composés-tests retenues pour les investigations ou essais futurs sont les concentrations pour lesquelles on constate une inversion de 50% de la düninution maximale de la RTE induite par le LPS.
Ce test peut être utilisé pour évaluer l'effet inhibiteur à 50% de composés-tests sur la diminution de la RTE suite à l'exposition au LPS de monocouches cellulaires issues de cellules épithéliales bronchiques humaines (NCI-H292).
Claims (12)
1. Utilisation d'un composé inhibant la contraction de la chaîne légère de la myosine des cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit composé
est utilisé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, à l'exclusion de l'hypoxie causée par lesdites pathologies.
est utilisé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, à l'exclusion de l'hypoxie causée par lesdites pathologies.
3. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce que le composé inhibe la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
en ce que le composé inhibe la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur de MLCK.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est le ML-7.
6. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le composé est un activateur de la myosine phosphatase.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé réduit la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire, sans effet substantiel sur la perméabilité de l'endothélium vasculaire.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif des allergies, de l'asthme ou des maladies obstructives.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépithéliale d' immunocytes et l' accumulation d' immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est administré par voie orale ou aérienne.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce que ledit composé est utilisé en association avec au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-.beta.2, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotrienes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
en ce que ledit composé est utilisé en association avec au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-.beta.2, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotrienes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
Applications Claiming Priority (5)
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| FR0116706A FR2833839A1 (fr) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires |
| FR01/16706 | 2001-12-21 | ||
| FR0208606A FR2833840B1 (fr) | 2001-12-21 | 2002-07-09 | Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires |
| FR02/08606 | 2002-07-09 | ||
| PCT/FR2002/004506 WO2003053422A2 (fr) | 2001-12-21 | 2002-12-20 | Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires |
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Family
ID=26213306
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1455767A2 (fr) |
| AR (1) | AR038042A1 (fr) |
| AU (1) | AU2002364679A1 (fr) |
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