EP1455767A2 - Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires - Google Patents

Methodes et compositions pour le traitement de pathologies respiratoires

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EP1455767A2
EP1455767A2 EP02805413A EP02805413A EP1455767A2 EP 1455767 A2 EP1455767 A2 EP 1455767A2 EP 02805413 A EP02805413 A EP 02805413A EP 02805413 A EP02805413 A EP 02805413A EP 1455767 A2 EP1455767 A2 EP 1455767A2
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EP
European Patent Office
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compound
use according
pulmonary
medicament
preparation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02805413A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Lionel Bueno
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Rytek Sarl
Original Assignee
Rytek Sarl
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Filing date
Publication date
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Application filed by Rytek Sarl filed Critical Rytek Sarl
Publication of EP1455767A2 publication Critical patent/EP1455767A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the present application relates to compositions and methods for the treatment of respiratory diseases. It also relates to compositions and methods for regulating the paracellular permeability of pulmonary epithelium.
  • the compositions and methods of the invention are based in particular on the use of agents or conditions modulating the cytoskeletal tension of pulmonary epithelial cells.
  • the invention is useful for the preventive or curative treatment of various pathologies, such as asthma, allergies, obstructive diseases, etc., in mammals, especially humans.
  • the pulmonary epithelium is the center of very important exchanges between the external environment and the organism. These exchanges can take place either through the cells of the epithelium or through parallel networks.
  • the transport of water or electrolytes, or the absorption of small molecules (molecular weight generally less than about 1000 Da) in the gastric mucosa, intestinal or colonic is carried out transcellularly, through epithelial cells or enterocytes.
  • the absorption of large molecules and the passage of toxins or immune cells is mainly paracellular, at the level of "tight junctions", which are arranged between the epithelial cells.
  • TJ tight junctions epithelial
  • the tight junctions epithelial are structures of connection between the cells bordering the mucous epithelia (digestive tract, lungs). These structures provide and control the transepithelial paracellular transport, from the outside to the submucosa, of various macromolecules (irritants, microorganisms). These structures also allow the migration of immune cells (eg, immunocytes) to the outside.
  • Tight junctions are flexible structures consisting of a complex assembly of transmembrane proteins (occludins, claudines) and cytoplasmic proteins (zona ocludens ZO-1, ZO-2, ZO-3 proteins, AF7 proteins, cingulin or 7H6, etc.), variable according to the epithelia considered, which are associated to elements of the cytoskeleton (filaments of myosin, actin, etc.).
  • agents disrupting the actin cytoskeleton have been shown to increase the activity of NO synthase in endothelial cells (WO00 / 03746).
  • the allergen sensitization process is a very important risk factor in the development of allergies and asthma.
  • the mechanisms by which allergens are able to initiate the sensitization phenomenon are not clearly documented in vivo.
  • allergens When allergens are inhaled, they come into contact with the pulmonary epithelial wall which prevents their introduction into the body and their contact with the cells of immunity.
  • the conditions under which this transfer is possible remain poorly documented in vivo.
  • some reports suggest, on in vitro cell cultures, a role of tight junctions in this process, no demonstration has been made of the involvement of these junctions in vivo in the development of sensitization.
  • the present application results from the demonstration of an in vivo role of the tight junctions of the pulmonary epithelium in the allergen sensitization process.
  • the present application also results from the development of new therapeutic strategies for the treatment of respiratory pathologies, based on a modulation of the para-cellular permeability of the pulmonary epithelium.
  • the present application proposes, for the first time, a therapeutic approach to respiratory pathologies based on the use of compounds or conditions for modulating the cytoskeletal tension of pulmonary epithelial cells. This approach makes it possible in particular to control the opening and closing of the tight junctions of the pulmonary epithelium, without necessarily resorting to de novo protein synthesis and / or to significant protein and / or structural degradations at the level of the epithelium.
  • This strategy makes it possible to regulate the permeability of the pulmonary epithelium in a specific, fine and reactive manner, and thus to act on the transfer of allergens to the cells of the immunity.
  • This strategy is particularly adapted to obtaining a rapid and controllable biological effect over time (reversible).
  • the results presented in the application show that substances capable of relaxing the tight epithelial junctions (PAR-2 receptor activating peptide, LPS) promote the alveolar accumulation of neutrophils and eosinophils, as is observed in bronchial diseases. -sulmonary such as asthma.
  • results show that a chemical capable of reducing the permeability of the tight junctions of the pulmonary epithelium prevents the accumulation of neutrophils and eosinophils.
  • results provide evidence that molecules, agents, conditions or processes that can reduce or suppress the opening of the tight junctions of the pulmonary alveolar or bronchial epithelium are of interest in the treatment of pulmonary diseases, particularly those characterized by intrabronchial and alveolar neutrophils or eosinophils, especially asthma.
  • a first object of the invention therefore lies more particularly in the use of a compound modulating the cytoskeletal tension of pulmonary epithelial cells, for the preparation of a medicament intended for the preventive or curative treatment of respiratory pathologies, preferably at least one patient.
  • exclusion of hypoxia caused by these conditions in particular excluding hypoxia caused by pulmonary dysfunction.
  • pulmonary dysfunction may be caused by emphysema, cigarette smoke, chronic bronchitis, asthma, infectious agents, pneumonitis (infectious or chemical), lupus, rheumatoid arthritis, congenital disorders such as cystic fibrosis, obesity and hereditary deficiency in antitrypsin.
  • Hypoxia is defined herein as the decrease below the normal level of oxygen in a tissue.
  • Another subject of the invention resides in a method of preventive or curative treatment of respiratory pathologies, comprising the administration to a subject of a effective amount of a compound modulating the cytoskeletal tension of pulmonary epithelial cells.
  • the invention thus relies on the use of compounds modulating the tension and the state of contraction of the cytoskeleton of the cells of the pulmonary epithelium.
  • this approach makes it possible to control the opening and closing of the tight junctions of the pulmonary epithelium, without necessarily resorting to de novo protein synthesis and / or to significant protein and / or structural degradations at the level of the lung. 'epithelium.
  • the proteins composing the tight junctions are associated with the cytoskeleton of the cells they connect. It is proposed in the context of the invention that the cytoskeletal tension can be modulated in subjects with respiratory diseases or disorders to act in a non-destructive and transient manner on the permeability of their pulmonary epithelium. Thus, the contraction of the cytoskeleton should favor the opening of the tight junctions, while a relaxation of the cytoskeleton (or an inhibition of the contraction) should favor the closing of the junctions.
  • Compounds (or conditions) that modulate the contraction of the cytoskeleton of pulmonary epithelial cells are preferably used in the context of the invention, preferably without substantially (substantially) modulating the permeability of the vascular endothelium and / or pulmonary circulatory hemodynamics.
  • compounds that inhibit or stimulate or promote the contraction of the cytoskeleton of pulmonary epithelial cells are used.
  • the activity of the compound on the cytoskeletal tension may be direct or indirect, that is, directed to the very constituents of the cytoskeleton or regulators of its voltage.
  • the compounds are preferred acting directly on the cytoskeletal tension.
  • compounds with selective cytoskeletal voltage-selective activity are also preferred, that is, typically compounds that do not directly affect the structure of the tight junction proteins.
  • a compound is considered to modulate the cytoskeletal tension as it modulates the opening of tight junctions.
  • An inhibitory effect of the contraction does not have to be complete or complete, but it suffices that it diminishes the contraction sufficiently to reduce the opening of the tight junctions corresponding to a minimum decrease of about 30% of the paracellular permeability of the pulmonary epithelium, preferably about 40%, more preferably about 50%.
  • the term "compound” must be taken in a broad sense, that is to say as designating any agent, substance, composition, condition, treatment or process that modulates the cytoskeleton tension. . It is advantageously an agent (e.g., a molecule) or a combination or combination of molecules.
  • inhibiting compounds (or modulators) of the contraction of the myosin light chain, or inhibitory (or modulating) compounds of the degradation of actin are used.
  • a particularly preferred mode of implementation of the invention lies in the use of compounds which inhibit the contraction of the myosin light chain or the degradation of actin, preferentially compounds which inhibit the phosphorylation of the light chain.
  • myosin Such compounds that inhibit myosin light chain phosphorylation may be inhibitors of myosin light chain kinase (MLCK).
  • a particular example of a selective MLCK inhibitor is ML-7 ⁇ 1- (5-iodonaphthalene-1-sulfonyl) -1H-hexahydro-1,4-diazepine ⁇ (Makishima M. et al., FEBS Lett 1991; 287: 175).
  • Other examples of such inhibitors include ML-9 (Wilson DP et al., J Biol Chem 2001; 13: 165) or other non-selective ones: Wortmannin (Warashina A. Life Sci 2000; 13: 2587). -93), H-7 (Piao Zf et al Mol Cell Biol Res Commun 2001; 4: 307-12) and KT 7692 (Warashina A.
  • a preferred object of the invention is the use of MLCK inhibiting compounds selected from ML-7, ML-9, Wortmannin, H-7 and KT 7692, alone or in combination.
  • Preferred compounds of the invention are compounds having no significant or substantial effect on vascular permeability and / or pulmonary circulatory hemodynamics.
  • MLCK inhibiting compounds are used with the exception of BDM [2,3-butanedione 2-monoxime], ML-7, ML-9 [1- (5-chloronaphthalene) 1-sulfonyl) -1H-hexahydro-1,4-diazepine hydrochloride], wortmannin, H-7 [1- (5-isoquinoline sulphonyl) -2-methylpiperazine dihydro-chloride], Fasudil (HA ⁇ 077) [Hexahydro 1- ( 5-isoquinolinesulphonyl) -1H-1,4-diazepine], W-7 [N- (6-aminohexyl) -5-chloro-1-naphthalenesulfonamide] and A-3 [N- (6-Aminoethyl) -5- chloro-1-naphthalenesulfonamide].
  • Other compounds that inhibit the phosphorylation of the myosin light chain may be used with the exception of
  • myosin binding proteins such as, for example, cingulin, or the junction molecules, such as E-cadherin, ⁇ -catenin or desmosomes. Modulation of the activity or expression of these proteins allows regulating the cytoskeletal tension in the context of the present invention.
  • a particular object of the invention therefore lies in the use of a modulator (especially an inhibitor) of the activity or the structure or expression of cytoskeletal molecules.
  • the compound may be for example an antisense nucleic acid, a synthetic molecule, an antibody fragment, etc.
  • inhibiting compounds of protein synthesis or other molecules that bind cytoskeletal proteins to tight junction proteins may be used.
  • proteins of the tight junctions mention may be made in particular of the occludin, claudin, ZO-1, ZO-2, ZO-3, AF7 and 7H6 proteins.
  • One means according to the invention of modulating the opening or the closing of the tight junctions resides in the regulation of the synthesis of the binding proteins between the cytoskeleton and the proteins of the tight junctions. By stimulating this synthesis, it is expected a strengthening of the bonds between the tight junctions and the cytoskeleton, leading to a lower permeability of the epithelium.
  • MAPKK mitogen-activated kinase inhibitors
  • MEK1 kinase or PI3 kinase such as PD098,059 ⁇ 2- ( Amino-3-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one (Alessi et al., J.Biol.Chem.1995; 270, 27589) or LY294002 ⁇ 2- (4-Morpholinyl) -8phenyl-1 (4H); ) -benzopyran-4-one ⁇ (Vlahos et alJ.Biol.Chem 1994; 269: 5241).
  • MAPKK mitogen-activated kinase inhibitors
  • HGF hepatic growth factor
  • EGF endothelial growth factor
  • cytokines capable of being released by immunocytes, such as interleukins-1, -4, -13, or factors such as IGF-1 or interferon gamma.
  • Another approach for indirectly regulating the cytoskeletal tension is based on the use of taurine or GLP2 peptide ("glucagon-like peptide 2") or derivatives thereof, which can make it possible to alter the permeability of the pulmonary epithelium by an indirect effect on the contraction of the cytoskeleton.
  • certain molecules acting on receptors located at the apical pole of epithelial cells eg: proteinase receptors, PAR-2
  • a preferred embodiment of the invention comprises the use of agents acting directly on the cytoskeletal tension, in particular molecules that inhibit the contraction of the cytoskeleton, in particular molecules that inhibit the contraction of the light chain.
  • myosin, or inhibitors of the degradation of actin preferentially compounds which inhibit the phosphorylation of the myosin light chain.
  • the compounds used are advantageously molecules, which may be in isolated form or in combination form, biological extracts, etc. These molecules can be synthetic, semi-synthetic or biological, in particular of animal, viral, plant or bacterial origin.
  • the present invention may be used for the treatment or the management of pathologies or disorders of the respiratory system, in particular asthma, allergies, obstructive pathologies (bronchitis, bronchiolitis, emphysema, etc.), especially when these pathologies have a particular problem. chronic or severe character. It is particularly adapted to the preventive or curative treatment of asthma or various allergies (dust, pollen, pollution, etc.) as well as local treatment of pulmonary inflammation. It can be used preventively in subjects with predispositions or sensitivity to this type of disorder, or in a curative manner, for example during seizures or over longer periods.
  • the compositions and methods of the invention make it possible to reduce the suffering or the respiratory difficulties of the subjects, to reduce the symptoms or the cause of these disorders.
  • a particular object of the invention lies in the use of a compound as defined above for the preparation of a medicament intended to control, in particular to reduce the paracellular permeability of the pulmonary epithelium in subjects suffering from diseases respiratory, including pulmonary diseases characterized by intrabronchial and alveolar accumulation of neutrophils or eosinophils, for example asthma or allergy.
  • Another particular object of the invention resides in the use of a compound as defined above for the preparation of a medicinal product intended to reduce allergen sensitization in subjects suffering from or sensitive to respiratory diseases, particularly diseases.
  • pulmonary systems characterized by intrabronchial and alveolar accumulation of neutrophils or eosinophils, eg asthma or allergy.
  • Another particular object of the invention resides in the use of a compound as defined above for the preparation of a medicament for reducing the transepithelial migration of immunocytes and the accumulation of immunocytes in the lung of subjects with a respiratory condition, including a lung condition characterized by intrabronchial and alveolar accumulation of neutrophils or eosinophils, eg asthma or allergy.
  • the invention also relates to methods of treatment of the conditions indicated above, comprising the administration to a subject suffering from a respiratory pathology or sensitive to respiratory diseases, a compound or treatment as defined above.
  • the compound or treatment is administered in a dose effective to reduce paracellular permeability of the pulmonary epithelium and / or to reduce allergen sensitization and / or to reduce transepithelial migration of immunocytes and accumulation of immunocytes. in the lung.
  • the compound can be administered by different routes and in different forms.
  • the compound may be in liquid, solid or aerosol form, typically in the form of a tablet, capsule, aerosol, ampoule or oral solution, injectable solution, etc.
  • Compounds formulated in adminiscable form are preferred locally (e.g., in the airways (e.g., respiratory)) or orally (oral solutes, tablets, ampoules, syrups, sprays, etc.). Aerosol packaging is particularly preferred where possible.
  • other forms of administration are possible, such as injections (intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, etc.), pastes, gels, suppositories, etc.
  • the compounds can be used alone or in combination and / or in combination with other active agents, for example other active substances used in the treatment of respiratory diseases.
  • active agents for example other active substances used in the treatment of respiratory diseases. Examples which may be mentioned include ⁇ 2-agonists and anti-cholinergic compounds, corticosteroids, anti-leukotrienes, etc. These different agents can be used in therapeutic combination, and administered in separate, combined, time-spread or concomitant form.
  • Another subject of the invention is a product or a pharmaceutical combination comprising at least one modulating compound of the blood pressure.
  • compositions comprising at least one pulmonary epithelial cell cytoskeleton tension-modulating compound according to the invention, preferably a compound inhibiting the contraction of the myosin light chain, more particularly a compound inhibiting the phosphorylation of the myosin light chain, more particularly an MLCK inhibitor or a myosin phosphatase activator, and a pharmaceutically acceptable carrier, said composition being formulated preferentially for oral or aerial administration.
  • the composition is in aerosol form and comprises a carrier gas, or in the form of an oral solution.
  • the pulmonary epithelial cell cytoskeleton modulator compound used as a pharmaceutical active agent is used in therapeutically effective amounts. It is understood that the dose administered may be adapted by those skilled in the art depending on the subject (patient) to be treated, the pathology concerned, the mode of administration, etc.
  • the amounts or doses of the compounds administered or used in the compositions according to the invention can be determined according to their ability to modulate the cytoskeletal tension of pulmonary epithelial cells. This capacity and therefore the evaluation of the dose to be administered can in particular be determined by the experimental protocol described in Example 7.
  • FIG. 1 Influence of ML-7 on the increase in paracellular pulmonary permeability of T-labeled human serum albumin induced by intratracheal perfusion of Pseudomonas aeruginosa LPS.
  • LPS decreases the levels of radioactivity measured in bronchoalveolar lavage fluids (LBAs) whereas, compared with controls, these levels are significantly higher in the lungs.
  • LBAs bronchoalveolar lavage fluids
  • This increase in pulmonary permeability is suppressed by pre-treatment of animals with ML7. Indeed, values similar to the control values of radioactivity levels in both LBAs and lungs were measured in these animals.
  • FIG. 2 Western blot of phosphorylated forms of the myosin light chain (p-MLC) and the native form (MLC) following the treatment of human bronchial cells NCI-H292 in culture by LPS. Incubation times are indicated on each blot (T corresponding to the control).
  • p-MLC myosin light chain
  • MLC native form
  • the bronchial and alveolar epithelium has epithelial cell binding structures that provide controlled passage of immunocytes through the airways.
  • This example shows that certain molecules known for their effect of increasing paracellular permeability at the intestinal level such as SLIGRL promote the intra-alveolar accumulation of immunocytes. (neutrophils, macrophage) and that this effect can be prevented (eg, inhibited, reduced) by oral treatment with taurine.
  • ML-7 reduces the intra-alveolar accumulation of immunocytes observed after intratracheal infusion of taurocholate associated with the opening of tight junctions.
  • Control sterile water infused 20 min tracheally; 5 mM Taurocholate infused tracheally; ML7 (1 mg / kg / 12 h, 36 h IP) + Taurocholate * p ⁇ 0.001 significantly different from control values
  • Control NaCl 0.9% sterile infused 20 min intratracheally; taurocholate 5mM: rat perfused tracheally; PD-98059 (1 mg / kg / 12 h, 36 h) ⁇ taurocholate.
  • Example 4 Inhibition by ML7 of the increase in pulmonary permeability induced by Pseudomonas aeruginosa LPS in rats.
  • ML7 Myosin Light Chain Kinase Inhibitor, MLCK
  • LPS Intrcerebral lipopolysaccharide
  • Pulmonary permeability was measured using a tracer, 125 I- labeled human serum albumin, which, after intratracheal infusion, is measured in urine, plasma, lung tissue and bronchoalveolar lavage.
  • this example shows that Pseudomonas aeruginosa LPS increases the paracellular permeability at the pulmonary level favoring the accumulation of immunocytes at the pulmonary level and that this effect can be prevented by a treatment involving an MLCK blocker.
  • Example 5 ML-7 Reduction of Pseudomonas aeruginosa LPS-induced Bronchial Inflammatory Response in Rats
  • This example complements the previous example and illustrates the reduction, by the ML7, of the bronchial inflammatory response induced by Pseudomonas Aeruginosa LPS administered by intra-tracheal perfusion.
  • ML-7 thus reduces the intra-alveolar accumulation of immunocytes.
  • Control 5% bovine albumin + PBS solution infused 20 min intratracheally; LPS 1 ⁇ g / rat perfused tracheally; ML-7 (3 mg / kg then 1 mg / kg 3 times daily for 48h IP) + LPS * p ⁇ 0.05 significantly different from the control values. # p ⁇ 0.05 significantly different from LPS values.
  • Example 6 Stimulation of the phosphorylation of the myosin light chain of human bronchial epithelial cells by LPS.
  • the human cell line used NCI-H292 was obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA).
  • the reagents used, RPMI 1640 medium, fetal calf serum and other cell culture reagents were provided by GIBCO, the protease inhibitor cocktail by ROCHE (1697498) and LPS (E.coli S055: B5) and other reagents. by SIGMA.
  • NCI-H292 cells were cultured on RPMI 1640 medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 10% fetal calf serum.
  • the cells were cultured at 37 ° C in humidified air containing 5% C0 2 and subcultured twice a week.
  • the cells were disseminated in 6-well plates, each containing 5 ⁇ 10 cells.
  • the cells were incubated in RPMI 1640 containing 0.1% Bovine Serum Albumin (BSA) overnight.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the cells are then rinsed with RPMI 1640 without BSA and exposed to LPS (2 ⁇ g / ml) or to physiological saline as a control (0.9% NaCl) for periods ranging from 30 minutes to 24 hours.
  • Proteins from the NCI-H292 cells exposed to LPS were separated by SDS-PAGE in a 15% polyacrylamide gel and electrophoretically transferred onto nitrocellulose membrane in 25 mM Tris-amino, 192 mM glycine and 20% methanol.
  • Immunoprecipitation was performed with a 1/500 diluted human phosphorylated goat anti-myosin antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc.) or a human anti-myosin mouse monoclonal antibody (light chains 20K, Sigma-Aldrich, Inc. ) diluted 1/1000, for the detection of p-MLC and MLC-20, respectively.
  • Recombinant peroxidase-Protein G was used at 1/1000 dilution as a secondary antibody.
  • the immunolabeled bands were revealed by fluorography with ECL reagent (Enhanced Chemiluminescence, Pierce, Perbio Science, Inc.).
  • In vitro screening of pharmaceutical formulations can be an effective and cost-effective method for identifying the lead candidate prior to in vivo testing.
  • the cells produce tight junctions that inhibit the passage of low molecular weight solution substances and electrical current flow, allowing the use of trans-epithelial resistance (RTE) as a permeability correlate.
  • RTE trans-epithelial resistance
  • Pseudomonas aeriginosa LPS decreases the electrical resistance in a dose-dependent manner.
  • the data obtained corresponding to the maximum dose inducing a response with the maximum decrease of the TEN is considered as the 100% response and is reported for the test compounds.
  • Test compounds Using the same protocol with the maximum dose of LPS (100% response), the test compounds are incubated 1 hour earlier at concentrations varying from 10 ⁇ M to 500 ⁇ M.
  • the doses of the test compounds selected for future investigations or tests are the concentrations for which there is a 50% reversal of the maximum decrease in LPS-induced TEN.
  • This assay can be used to evaluate the 50% inhibitory effect of test compounds on the decrease of TEN following LPS exposure of cellular monolayers from human bronchial epithelial cells (NCI-H292).

Abstract

La présente demande concerne des compositions et méthodes pour letraitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette, plus particuliírement des composés inhibant la contraction de la chaîne légíre de la myosine des cellules épithéliales pulmonaires, notamment des entérocytes. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifíres, notamment les humains.

Description

METHODES ET COMPOSITIONS POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES RESPIRATOIRES
La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement de pathologies respiratoires. Elle concerne également des compositions et méthodes permettant de réguler la perméabilité paracellulaire de Pépithélium pulmonaire. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur l'utilisation d'agents ou de conditions modulant la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. L'invention est utilisable pour le traitement préventif ou curatif de pathologies variées, telles que asthme, allergies, maladies obstructives, etc., chez les mammifères, notamment les humains.
L'épithélium pulmonaire est le centre d'échanges très importants entre le milieu extérieur et l'organisme. Ces échanges peuvent s'effectuer soit à travers les cellules de l'épithélium, soit par des réseaux parallèles. Ainsi, le transport d'eau ou d'électrolytes, ou encore l'absorption de petites molécules (poids moléculaire généralement inférieur à 1000 Da environ) au niveau de la muqueuse gastrique, intestinale ou colique, s'effectue par voie transcellulaire, à travers les cellules épithéliales ou enterocytes. Par contre, l'absorption de grosses molécules et le passage de toxines ou de cellules immunitaires se fait principalement par voie paracellulaire, au niveau de «jonctions serrées », qui sont disposées entre les cellules épithéliales.
Les jonctions serrées épithéliales (ou « tight junction », « TJ ») sont des structures de liaison entre les cellules bordant les épithéliums muqueux (tube digestif, poumons). Ces structures assurent et contrôlent le transport trans- épithélial paracellulaire, de l'extérieur vers la sous-muqueuse, de macromolécules variées (irritants, microorganismes). Ces structures permettent également la migration de cellules immunitaires (e.g., immunocytes) vers l'extérieur. Les jonctions serrées sont des structures souples constituées d'un assemblage complexe de protéines transmembranaires (occludines, claudines) et de protéines cytoplasmiques (protéines zona ocludens ZO-1, ZO-2, ZO-3, protéines AF7, cinguline ou 7H6, etc.), variable selon les épithéliums considérés, qui sont associées à des éléments du cytosquelette (filaments de myosine, d'actine, etc.). En outre, des agents désorganisant le cytosquelette d'actine ont été montrées comme augmentant l'activité de la NO synthase dans les cellules endothéliales (WO00/03746).
Dans des conditions physiologiques, le degré d'ouverture « partielle » de ces jonctions serrées permet au système immunitaire local d'être renseigné sur la nature ou sur la « qualité » du contenu des voies aériennes.
Si l'épithélium intestinal et la structure des jonctions serrées de celui-ci ont été étudiés dans l'art antérieur, il existe aujourd'hui moins d'informations concernant l'épithélium pulmonaire et le fonctionnement de ses jonctions serrées.
Le processus de sensibilisation aux allergènes est un facteur de risque très important dans le développement des allergies et de l'asthme. Toutefois, les mécanismes par lesquels des allergènes sont capables d'initier le phénomène de sensibilisation ne sont pas clairement documentés in vivo. Lorsque des allergènes sont inhalés, ils entrent en contact avec la paroi épithéliale pulmonaire qui empêche leur introduction dans l'organisme et leur mise en contact avec les cellules de l'immunité. Toutefois, pour qu'une sensibilité se développe, cela implique que certains allergènes sont capables de traverser cet épithélium pour interagir avec les cellules immunitaires. Les conditions dans lesquelles ce transfert est possible demeurent peu documentées in vivo. Ainsi, bien que certains rapports suggèrent, sur des cultures de cellules in vitro, un rôle des jonctions serrées dans ce processus, aucune démonstration n'a été apportée de l'implication de ces jonctions in vivo dans le développement d'une sensibilisation. De même, si Gordon et al (Exp. Lung Res. 24 (1998) 659) suggèrent un effet protecteur de la taurine sur les jonctions serrées, aucun résultat présenté n'établit de corrélation entre les jonctions serrées et un processus de sensibilisation ou de transfert d' allergènes à travers l'épithélium pulmonaire.
Une corrélation entre l'état d'ouverture des jonctions serrées et la réponse à des allergènes d'origine aérienne a été suggérée au travers d'études expérimentales (WAN, H et al. J. Clin. Invest, 1999 ; 104(1) : 123-33) et par la mise en évidence chez le sujet asthmatique d'une corrélation entre la largeur des espaces extracellulaires et le seuil de réponse respiratoire à l'inhalation d'acétylcholine (OHASHI et al. Aerugi 1990 Nov ; 39(11) : 1541-5). Cependant, ces observations préliminaires n'ont pas été confirmées ou n'ont pas donné lieu à de nouvelles approches thérapeutiques.
La présente demande résulte de la mise en évidence d'un rôle in vivo des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire dans le processus de sensibilisation aux allergènes. La présente demande découle également de la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de pathologies respiratoires, basées sur une modulation de la perméabilité para-cellulaire de l'épithélium pulmonaire. En particulier, la présente demande propose, pour la première fois, une approche thérapeutique des pathologies respiratoires basée sur l'emploi de composés ou conditions permettant de moduler la tension du cytosquelette des cellules épithéliales pulmonaires. Cette approche permet notamment de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium. Cette stratégie permet de réguler la perméabilité de l'épithélium pulmonaire de manière spécifique, fine et réactive, et ainsi d'agir sur le transfert d'allergènes vers les cellules de l'immunité. Cette stratégie est particulièrement adaptée à l'obtention d'un effet biologique rapide et contrôlable dans le temps (réversible). A cet égard, les résultats présentés dans la demande montrent que des substances susceptibles de relâcher les jonctions serrées épithéliales (peptide activateur du récepteur PAR-2, LPS) favorisent l'accumulation alvéolaire de neutrophiles et éosinophiles, comme cela est observé dans les maladies broncho-pulmonaires telles que l'asthme. Les résultats obtenus montrent également qu'une substance chimique capable de réduire la perméabilité des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire empêche l'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles. Ces résultats apportent la preuve que des molécules, agents, conditions ou procédés susceptibles de réduire ou supprimer l'ouverture des jonctions serrées de l'épithélium alvéolaire ou bronchique pulmonaire offrent un intérêt dans le traitement des affections pulmonaires, notamment celles caractérisées par l'accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, en particulier l'asthme.
Un premier objet de l'invention réside donc plus particulièrement dans l'utilisation d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, de préférence à l'exclusion de l'hypoxie causée par ces pathologies, en particulier à l'exclusion de l'hypoxie causée par un dysfonctionnement pulmonaire. A ce titre, un dysfonctionnement pulmonaire peut être causée par un emphysème, la fumée de cigarettes, bronchite chronique, asthme, agents infectieux, pneumonite (infectieuse ou chimique), lupus, arthrite rhumatoïde, désordres congénitaux tels que fibrose cystique, obésité et déficit héréditaire en al-antitrypsine. L'hypoxie est définie dans la présente demande comme la diminution en dessous du niveau normal d'oxygène dans un tissu.
Un autre objet de l'invention réside dans une méthode de traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, comprenant l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'un composé modulant la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires.
L'invention repose ainsi sur l'utilisation de composés modulant la tension et l'état de contraction du cytosquelette des cellules de l'épithélium pulmonaire. Comme indiqué plus avant, cette approche permet de contrôler l'ouverture et la fermeture des jonctions serrées de l'épithélium pulmonaire, sans nécessairement recourir à une synthèse protéique de novo et/ou à des dégradations protéiques et/ou structurales importantes au niveau de l'épithélium.
Les protéines composant les jonctions serrées sont associées au cytosquelette des cellules qu'elles relient. Il est proposé dans le cadre de l'invention que la tension du cytosquelette puisse être modulée chez des sujets atteints de maladies ou désordres respiratoires pour agir de manière non destructrice et transitoire sur la perméabilité de leur épithélium pulmonaire. Ainsi, la contraction du cytosquelette doit favoriser l'ouverture des jonctions serrées, tandis qu'un relâchement du cytosquelette (ou qu'une inhibition de la contraction) doit favoriser la fermeture des jonctions.
On utilise donc préférentiellement dans le cadre de l'invention des composés (ou conditions) qui modulent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires (notamment humaines), de préférence sans moduler de façon importante (substantiellement) la perméabilité de l'endothélium vasculaire et/ou l'hémodynamique circulatoire pulmonaire. Selon la condition à traiter, on utilise des composés qui inhibent la contraction du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires, ou qui activent ou favorisent celle-ci.
L'activité du composé sur la tension du cytosquelette peut être directe ou indirecte, c'est-à-dire dirigée sur les constituants mêmes du cytosquelette ou sur des régulateurs de sa tension. Bien que non limitatif, on préfère les composés agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette. En outre, on préfère également des composés présentant une activité sélective sur la tension du cytosquelette, c'est-à-dire typiquement des composés qui n'affectent pas directement la structure des protéines constitutives des jonctions serrées.
Un composé est considéré comme modulant la tension du cytosquelette lorsqu'il module lOuverture des jonctions serrées. Un effet inhibiteur de la contraction ne doit pas nécessairement être complet ou total, mais il suffit qu'il diminue la contraction suffisamment pour réduire l'ouverture des jonctions serrées correspondant à une diminution minimale d'environ 30% de la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire, préférentiellement d'environ 40%, de façon plus préférée d'environ 50%.
Différents types de composés peuvent être utilisés dans le cadre de la présente demande. Ainsi, au sens de l'invention, le terme « composé » doit être pris dans un sens large, c'est-à-dire comme désignant tout agent, substance, composition, condition, traitement ou procédé permettant de moduler la tension du cytosquelette. Il s'agit avantageusement d'un agent (e.g., d'une molécule) ou d'une combinaison ou association de molécules.
Selon un premier mode de réalisation préféré, on utilise des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou des composés inhibiteurs (ou modulateurs) de la dégradation de l'actine.
Un mode particulièrement préféré de mise en œuvre de l'invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de la contraction de la chaîne légère de la myosine ou de la dégradation de l'actine, préférentiellement des composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine. De tels composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine peuvent être des inhibiteurs de la kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCK).
Un exemple particulier d'inhibiteur sélectif de MLCK est le composé ML-7 {1- (5-iodonaphtalène-l-sulfonyl)-lH-hexahydro-l,4-diazepine} (Makishima M. et al. FEBS Lett. 1991; 287:175). D'autres exemples de tels inhibiteurs sont notamment le composé ML-9 (Wilson DP. et al. J Biol Chem. 2001; 13: 165) ou d'autres non sélectifs: Wortmannin (Warashina A. Life Sci 2000;13: 2587-93), H-7 (Piao Zf et al. Mol Cell Biol Res Commun 2001;4: 307-12) et KT 7692 (Warashina A. Life Sci 2000; 13: 2587-93). Un objet préféré de l'invention réside dans l'utilisation de composés inhibiteurs de MLCK choisis parmi ML-7, ML-9, Wortmannin, H-7 et KT 7692, seuls ou en combinaison. Des composés préférés de l'invention sont des composés n'ayant pas d'effet significatif ou substantiel sur la perméabilité vasculaire et/ou l'hémodynamique circulatoire pulmonaire. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise des composés inhibiteurs de MLCK à l'exception de BDM [2,3-butanedione 2-monoxime], ML-7, ML-9 [1- (5-chloronaphthalene-l- sulfonyl) -lH-hexahydro-1, 4-diazepine hydrochloride], wortmannin, H-7 [1- (5-isoquinoline sulphonyl) -2- methylpiperazine dihydro-chloride], Fasudil (HAÏ 077) [Hexahydro 1- (5- isoquinolinesulphonyl) - 1 H- 1, 4- diazepine], W-7 [N- (6-Aminohexyl) -5- chloro- 1-naphthalenesulfonamide] and A-3 [N- (6-Aminoethyl) -5-chloro-l- naphthalenesulfonamide]. D'autres composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine peuvent être des activateurs de la myosine phosphatase.
D'autres cibles agissant sur la tension du cytosquelette sont notamment les protéines de liaison à la myosine, telles que par exemple la cinguline, ou les molécules de jonction, telles que la cadherine-E, la catenine-α ou les desmosomes. La modulation de l'activité ou de l'expression de ces protéines permet de réguler la tension du cytosquelette, dans le cadre de la présente invention.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un modulateur (notamment d'un inhibiteur) de l'activité ou de la structure ou de l'expression des molécules du cytosquelette. Le composé peut être par exemple un acide nucléique antisens, une molécule synthétique, un fragment d'anticorps, etc.
Selon un autre mode de réalisation, on peut utiliser des composés inhibiteurs de la synthèse de protéines ou autres molécules assurant la liaison entre les protéines du cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. Parmi les protéines des jonctions serrées, on peut citer notamment les protéines occludines, claudines, ZO-1, ZO-2, ZO-3, AF7 et 7H6. Un moyen selon l'invention de moduler l'ouverture ou la fermeture des jonctions serrées réside donc dans la régulation de la synthèse des protéines de liaison entre le cytosquelette et les protéines des jonctions serrées. En stimulant cette synthèse, il est attendu un renforcement des liaisons entre les jonctions serrées et le cytosquelette, conduisant à une plus faible perméabilité de l'épithélium.
D'autres composés utilisables dans le cadre de l'invention sont par exemple des inhibiteurs de kinases activées par les mitogènes (MAPKK), notamment de la kinase MEK1 ou de la kinase-PI3, tels que les composés PD098,059 {2-(Amino- 3-methoxyphenyl)-4H-l-benzopyran-4-one}(Alessi et al. J.Biol.Chem.1995; 270, 27589) ou LY294002 {2-(4-Morpholinyl)-8phenil-l(4H)-benzopyran-4-one} (Vlahos et alJ.Biol.Chem 1994;269: 5241).
D'autres molécules utilisables pour réguler, de manière indirecte, la tension du cytosquelette, sont des facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance hépatique (HGF), le facteur de croissance endothélial (EGF) ou certaines cytokines susceptibles d'être libérées par les immunocytes, telles que les interleukines-1, -4, -13, ou les facteurs tels que IGF-1 ou l'interféron gamma.
Une autre approche permettant de réguler de manière indirecte la tension du cytosquelette repose sur l'utilisation de la taurine ou du peptide GLP2 (« glucagon-like peptide 2 ») ou encore des dérivés de ces derniers, qui peuvent permettre d'altérer la perméabilité de l'épithélium pulmonaire par un effet indirect sur la contraction du cytosquelette. De même, certaines molécules agissant sur des récepteurs situés au pôle apical des cellules épithéliales (ex: récepteurs aux protéinases; PAR-2) peuvent agir indirectement sur le cytosquelette.
Un mode préféré de mise en œuvre de l'invention comprend l'utilisation d'agents agissant de manière directe sur la tension du cytosquelette, notamment de molécules inhibitrices de la contraction du cytosquelette, en particulier de molécules inhibitrices de la contraction de la chaîne légère de la myosine, ou inhibitrices de la dégradation de l'actine, préférentiellement des composés inhibiteurs de la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
Comme indiqué ci-avant, les composés utilisés sont avantageusement des molécules, qui peuvent être sous forme isolée ou sous forme de combinaison, d'extraits biologiques, etc. Ces molécules peuvent être synthétiques, semi- synthétiques ou biologiques, notamment d'origine animale, virale, végétale ou bactérienne.
La présente invention peut être utilisée pour le traitement ou la prise en charge de pathologies ou désordres du système respiratoire, notamment de l'asthme, des allergies, des pathologies obstructives (bronchites, bronchiolites, emphysème, etc), notamment lorsque ces pathologies ont un caractère chronique ou sévère. Elle est particulièrement adaptée au traitement préventif ou curatif de l'asthme ou de diverses allergies (poussières, pollens, pollution, etc.) ainsi qu'au traitement local d'inflammations pulmonaires. Elle est utilisable de manière préventive chez des sujets présentant des prédispositions ou une sensibilité à ce type de désordres, ou de manière curative, par exemple lors de crises ou sur des périodes plus longues. Lès compositions et méthodes de l'invention permettent de réduire la souffrance ou les difficultés respiratoires des sujets, d'atténuer les symptômes ou la cause de ces désordres.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à contrôler, notamment à réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire chez des sujets atteints de maladies respiratoires, notamment d'affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires, notamment aux affections pulmonaires caractérisées par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépitheliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire, notamment d'une affection pulmonaire caractérisée par une accumulation intrabronchique et alvéolaire de neutrophiles ou d'éosinophiles, par exemple d'asthme ou d'allergie. L'invention est également relative à des méthodes de traitement des conditions indiquées ci-dessus, comprenant l'administration à un sujet atteint d'une pathologie respiratoire ou sensible aux pathologies respiratoires, d'un composé ou traitement tel que défini ci-avant. De préférence, le composé ou traitement est administré dans une dose efficace pour réduire la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire et/ou pour réduire la sensibilisation aux allergènes et/ou pour réduire la migration transépitheliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon.
Le composé peut être administré par différentes voies et sous différentes formes. Ainsi, le composé peut être sous forme liquide, solide ou en aérosol, typiquement sous forme de comprimé, gélule, aérosol, ampoule ou soluté buvable, solution injectable, etc. On préfère des composés formulés sous une forme admiriistrable par voie locale (e.g., dans les voies aériennes (e.g., respiratoires)) ou par voie orale (solutés buvables, comprimés, ampoules, sirops, sprays, etc.). Le conditionnement en aérosol est particulièrement préféré, lorsque cela est possible. Bien entendu, d'autres formes d'administration sont possibles, comme des injections (intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra- artérielle, intrapéritonéale, etc.), des pâtes, gels, suppositoires, etc.
Les composés peuvent être utilisés seuls ou en combinaisons et/ou en association avec d'autres agents actifs, comme par exemple d'autres substances actives utilisées dans le traitement des maladies respiratoires. On peut citer par exemple les agonistes-β2 et les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes, les anti-leukotrienes, etc. Ces différents agents peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.
Un autre objet de l'invention réside dans un produit ou une association pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires et au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-β2, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotriènes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires selon l'invention, préférentiellement un composé inhibant la contraction de la chaîne légère de la myosine, plus particulièrement un composé inhibant la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine, plus particulièrement un inhibiteur de la MLCK ou un activateur de la myosine phosphatase, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, ladite composition étant formulée préférentiellement pour une administration par voie orale ou aérienne. De préférence, la composition est sous forme d'aérosol et comporte un gaz porteur, ou sous forme de solution buvable.
Le composé modulateur de la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires utilisé à titre d'actif pharmaceutique est mis en œuvre dans des quantités thérapeutiquement efficaces. Il est entendu que la dose administrée peut être adaptée par l'homme du métier en fonction du sujet (patient) à traiter, de la pathologie concernée, du mode d'administration, etc. Les quantités ou doses des composés administrées ou utilisées dans les compositions selon l'invention peuvent être déterminées en fonction de leur capacité à moduler la tension du cytosquelette de cellules épithéliales pulmonaires. Cette capacité et donc l'évaluation de la dose à administrer peuvent notamment être déterminées par le protocole expérimental décrit dans l'exemple 7.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES :
Figure 1 : Influence du ML-7 sur l'augmentation de la perméabilité paracellulaire pulmonaire de la sérum albumine humaine marquée à T induite par la perfusion intra-trachéale de LPS de Pseudomonas aeruginosa. Le LPS diminue les taux de radioactivité mesurés au niveau des liquides de lavage bronchoalvéolaires (LBAs) alors que, comparés aux témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons. Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un pré-traitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité tant au niveau des LBAs que des poumons ont été mesurées chez ces animaux. Figure 2 : Western blot des formes phosphorylées de la chaîne légère de myosine (p-MLC) et de la forme native (MLC) à la suite du traitement des cellules bronchiques humaines NCI-H292 en culture par le LPS. Les temps d'incubation sont indiqués sur chaque blot (T correspondant au témoin).
EXEMPLES :
Exemple 1 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par la taurine
L'épithélium bronchique et alvéolaire possède des structures de liaison des cellules épithéliales qui assurent un passage contrôlé des immunocytes dans les voies aériennes. Cet exemple montre que certaines molécules connues pour leur effet d'augmentation de la perméabilité paracellulaire au niveau intestinal tel que le SLIGRL favorisent l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes (neutrophiles, macrophage) et que cet effet peut être prévenu (e.g., inhibé, réduit) par un traitement oral par la taurine.
Pour ce faire, quatre lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu pendant 10 jours une eau de boisson contenant (lots 1 et 2) ou ne contenant pas (lots 3 et 4) de la taurine (5 %).
Au temps t = 10 j, les 4 lots d'animaux sont soumis à l'instillation intranasale lente de 200 μl de sérum physiologique contenant (lots 2 et 4) ou ne contenant
(lots 1 et 3) 0,2 mg de SLIGRL. Au temps t = 3 h après l'instillation intra-nasale, les animaux ont été anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 1 ci-après. Ces résultats montrent que l'instillation intranasale du SLIGRL entraîne, à t = 3 h., l'accumulation d'éosinophiles et de neutrophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL) chez les animaux contrôles mais pas chez ceux ayant reçu la taurine (tableau 1). Ces résultats confirment in vivo l'implication des jonctions serrées dans la perméabilité aux immunocytes de l'épithélium pulmonaire.
Tableau 1 : Influence de la Taurine sur le niveau d'accumulation de neutrophiles et d'éosinophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intrasanale de SLIGRL chez le rat (moyennes ± SD ; n = 10)
Exemple 2 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le ML-7
Cet exemple montre que le ML-7 réduit l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes observée après perfusion intratrachéale de taurocholate associée à l'ouverture des jonctions serrées.
Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le ML-7 par voie IP à la dose de 1 mg/kg/12h pendant 36 heures soit son solvant. Une heure après la dernière injection, une instillation intratrachéale lente de 200 μl de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 50 mM de taurocholate.
Au temps t = 2 h après l'instillation intratrachéale, les animaux ont été anesthésiés pour la réalisation d'un lavage bronchoalvéolaire, puis sacrifiés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 2 ci-après. Ils montrent que le composé ML-7 permet de réduire de manière significative l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes.
Tableau 2 : Influence du ML-7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire induite par l'instillation intratrachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes ± SD ; n = 8)
Témoin : eau stérile perfusée 20 min par voie trachéale; Taurocholate 5 mM perfusé par voie trachéale; ML7 (1 mg/kg /12 h, 36 h IP) + Taurocholate * p< 0.001 signifïcativement différent des valeurs témoins
Exemple 3 : Réduction de la réponse inflammatoire bronchique par le PD- 98059
Cet exemple montre que le PD-98059 (inhibiteur de la kinase MEK1), réduit l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes associée à l'ouverture des jonctions serrées, observée après la perfusion intra-trachéale de taurocholate (Tableau 3). Pour ce faire, trois lots de 8 rats mâles Wistar (250-300 g) ont reçu soit le PD- 98059 par voie IP (1 mg/kg/12 h, 36 h) soit son solvant (DMSO). Une heure après la dernière administration, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion intra-trachéale lente de 200 μl de sérum physiologique contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 5 mM/rat de taurocholate est réalisée. Les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés 2 heures après la perfusion intra-trachéale de taurocholate ou de son solvant.
Tableau 3 : Influence du PD-98059 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire induit par la perfusion intra-trachéale de taurocholate (5 mM/rat) chez le rat (moyennes ± SEM ; n=8). Résultat exprimé en nombre de cellules / mm de LBA.
Témoin : NaCl 0.9% stérile perfusée 20 min par voie intra-trachéale ; taurocholate 5mM :rat perfusé par voie trachéale ; PD-98059 (1 mg/kg/12 h, 36 h) ± taurocholate.
* p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins.
# p< 0.05 significativement différentes des valeurs taurocholates.
Exemple 4 : Inhibition par le ML7 de l'augmentation de la perméabilité pulmonaire induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat.
Cet exemple montre que le ML7 (inhibiteur de la kinase de la chaîne légère de la myosine, MLCK) bloque de façon significative l'augmentation de la perméabilité pulmonaire liée à la perfusion intra-trachéale de lipopolysaccharide (LPS ) de Pseudomonas aeruginosa.
La perméabilité pulmonaire a été mesurée à l'aide d'un traceur, la sérum albumine humaine marquée à 1T125, lequel, après perfusion intra-trachéale, est mesuré dans les urines, le plasma, le tissu pulmonaire et les lavages bronchoalvéolaires.
Pour ce faire, trois lots de 6 rats mâles Wistar (200-225 g) ont reçu soit un prétraitement de ML-7 par voie IP (3 mg/kg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l' avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion intra-trachéale lente de 150 μl d'une solution iso-osmolaire (5% albumine bovine ± PB S) additionnée du traceur contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 μg/rat de LPS, a été réalisée. 4 heures après la perfusion intra-trachéale, les urines, le sang, les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les poumons ont été collectés puis la radioactivité
I a été mesurée sur chacun de ces prélèvements.
Les résultats obtenus montrent que le LPS diminue les taux de radioactivité mesurés au niveau des LBAs alors que, parallèlement, comparés à ceux des témoins, ces taux sont significativement plus élevés au niveau des poumons. Cette augmentation de la perméabilité pulmonaire est supprimée par un prétraitement des animaux au ML7. En effet, des valeurs similaires aux valeurs témoins des taux de radioactivité, tant au niveau des LBAs que des poumons, ont été mesurées chez ces animaux (figure 1). Chez les trois lots d'animaux testés, aucune différence dans les taux de radioactivité mesurés au niveau plasmatique n'a été observée. Ces résultats montrent que dans nos conditions expérimentales - extrapolables à l'asthme et autres pathologies respiratoires allergiques - le ML-7 ne possède pas d'effet sur les cellules endothéliales vasculaires susceptibles de modifier la perméabilité de l'endothélium, son tonus (vasodilatation) et donc en général sur l'hémodynamique circulatoire pulmonaire (débit, oxygénation i.e. amélioration de l'hypoxie).
De plus aucune trace de radioactivité n'a été retrouvée dans les urines. En conclusion, cet exemple montre que le LPS de Pseudomonas aeruginosa augmente la perméabilité paracellulaire au niveau pulmonaire favorisant l'accumulation d'immunocytes au niveau pulmonaire et que cet effet peut être prévenu par un traitement impliquant un bloqueur de la MLCK.
Exemple 5 : Réduction par le ML-7 de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas aeruginosa chez le rat. Cet exemple complète l'exemple précédent et illustre la réduction, par le ML7, de la réponse inflammatoire bronchique induite par le LPS de Pseudomonas Aeruginosa adn-nnistré par perfusion intra-trachéale. Le ML-7 réduit ainsi l'accumulation intra-alvéolaire d'immunocytes.
Pour ce faire, trois lots de 7 rats mâles Wistar (200 - 225 g) ont été utilisés. Les animaux ont reçu soit un pré-traitement de ML-7 par voie IP (3 mg/kg puis 1 mg/kg, 3 fois par jour pendant 48h) soit son solvant (éthanol 10%). Une heure après l' avant-dernière administration de ML-7, sous anesthésie à l'uréthane (25 mg/kg IP), une perfusion intra-trachéale lente de 150 μl d'une solution iso- osmolaire (5% albumine bovine ± PBS) contenant (2 lots) ou ne contenant pas (lot témoin) 1 μg/rat de LPS a été réalisée. 4 heures après la perfusion intratrachéale, les lavages broncho-alvéolaires (LBAs) ont été réalisés. Les résultats obtenus montrent que le LPS augmente les taux d'immunocytes présents au niveau des LBAs et plus particulièrement des polynucléaires neutrophiles. Cette augmentation de la neutrophilie est réduite par un prétraitement des animaux au ML7 (Tableau 4).
Tableau 4 : Influence du ML7 sur le niveau d'accumulation d'immunocytes dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire induite par la perfusion intra-trachéale de LPS (1 μg/rat) chez le rat (moyennes ± SEM ; n=7). Résultats exprimés en nombre de cellules / mm de LBA.
Témoin : Solution à 5% albumine bovine + PBS perfusée 20 min par voie intratrachéale ; LPS 1 μg/rat perfusé par voie trachéale ; ML-7 (3 mg/kg puis 1 mg/kg 3 fois par jour pendant 48h IP) + LPS * p<0.05 significativement différentes des valeurs témoins. # p< 0.05 significativement différentes des valeurs LPS.
Exemple 6 : Stimulation de la phosphorylation de la chaîne légère de myosine des cellules épithéliales bronchiques humaines par le LPS.
Matériel : La lignée cellulaire humaine utilisée NCI-H292 a été obtenue de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA). Les réactifs utilisés, milieu RPMI 1640, sérum de veau fétal et autres réactifs de culture cellulaire ont été fournis par GIBCO, le cocktail d'inhibiteurs de protéases par ROCHE (1697498) et le LPS (E.coli S055 :B5) et autres réactifs par SIGMA.
Culture cellulaire : Les cellules NCI-H292 ont été cultivées sur un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 10% de sérum de veau fétal. Les cellules ont été cultivées à 37°C sous air humidifié contenant 5% de C02 et repiquées 2 fois par semaine. Les cellules ont été disséminées dans des plaques à 6 puits, chacun contenant 5.10 cellules. Au stade de confluence, les cellules ont été incubées dans du RPMI 1640 contenant 0.1 % de Sérum Albumine Bovine (BSA) pendant une nuit. Les cellules sont ensuite rincées avec du RPMI 1640 sans BSA et exposées au LPS (2 μg/ml) ou au sérum physiologique comme témoin (NaCl 0.9%) pour des durées allant de 30 mn à 24 heures.
Western Blot : Pour cette analyse, les cellules ont été lysées à différent temps après traitement au LPS avec un tampon RIPA (1% triton, 150mM NaCl, ImM EDTA, lOmM Tris pH7,4 et le cocktail d'inhibiteurs de protéases à la concentration recommandée par le fournisseur). La forme phosphorylée de la chaîne légère de myosine (p-MLC) et la forme non phosphorylée de la chaîne légère de myosine (MLC-20) ont été détectées dans ces cellules aux temps 30mn, 1, 2 et 3 heures d'exposition au LPS ainsi qu'aux temps plus longs (6, 12 et 24 heures). Les protéines des cellules NCI-H292 exposées au LPS ont été séparées par SDS-PAGE dans un gel de polyacrylamide à 15% et soumises au transfert électrophorétique sur membrane de nitrocellulose dans 25 mM de Tris-amino, 192 mM de glycine et 20% de méthanol. L'immunoprécipitation a été effectuée avec un anticorps de chèvre anti-myosine phosphorylée humaine dilué au 1/500 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) ou un anticorps monoclonal de souris anti- myosine humaine (light chains 20 K, Sigma- Aldrich, Inc.) dilué au 1/1000, pour la détection respective de p-MLC et de MLC-20. La peroxydase-Protein G recombinante a été utilisée à la dilution 1/1000 comme anticorps secondaire. Les bandes immunomarquées ont été révélées par fluorographie avec le réactif ECL (Enhanced chemiluminescence, Pierce, Perbio Science, Inc.).
Résultats : Par rapport au témoin (sérum pysiologique), il a été constaté une augmentation quantitative de l'expression de la foπne phosphorylée p-MLC dans les cellules traitées au LPS maximale après 30mn et 1 heure d'exposition (fig. 2), avec un retour aux valeurs contrôles en 6 heures. L'expression de la forme non- phosphorylée MLC-20 est faible quant à elle après 30mn et 1 heure de traitement au LPS et augmente progressivement dans le temps (fig. 2 : illustration des analyses western-blot). Conclusions: L'exposition des cellules bronchiques humaines au LPS entraîne une augmentation rapide (30mn -1 heure) de la phosphorylation des chaînes légères de myosine qui constituent le cytosquelette de ces cellules. Cette phosphorylation traduit la contraction du cytosquelette et l'ouverture des jonctions serrées favorisant ainsi la pénétration des allergènes et l'accumulation d'immunocytes dans les bronches. Exemple 7 : Protocole expérimental pour déterminer in vitro les concentrations actives plasmatiques en composés tests et susceptibles d'agir.
Le criblage in vitro de formulations pharmaceutiques peut être une méthode efficace et rentable pour identifier le candidat tête de série avant les tests in vivo. Les cellules produisent des jonctions serrées qui inhibent le passage de substances en solution de bas poids moléculaire et le flux de courant électrique, permettant l'utilisation de résistance trans-épithéliale (RTE) comme corrélat de perméabilité.
Mesure de la résistance électrique : les cellules humaines pulmonaires croissent jusqu'à confluence sur des inserts de membranes de cultures de cellules poreuses et leurs résistances électriques sont mesurées à l'aide d'un système de résistance électrique. Un insert sans monocouche cellulaire sert de témoin pour déterminer la résistance de base et les inserts avec des monocouches cellulaires à confluence traités avec du PB S servent de contrôles. Les LPS des Pseudomonas aeruginosa sont ajoutés à des concentrations variant de 1,0 ng/ml à 10 μl/ml et incubés pendant 6 heures à 37°C. La résistance électrique trans-épithéliale (ohms x centimètre carré) est calculée à partir de l'équation suivante : (RTEéchantiiion - RTEtémoin) χ surface. Le LPS de Pseudomonas aeriginosa diminue la résistance électrice de manière dose dépendante. La donnée obtenue correspondant à la dose maximale induisant une réponse avec la diminution maximale de la RTE est considérée comme la réponse à 100%> et est reportée pour les composés-tests.
Composés-tests : Utilisant le même protocole avec la dose maximale de LPS (réponse à 100%), les composés-tests sont incubés 1 heure auparavant à des concentrations variant de 10 μM à 500 μM. Les doses des composés-tests retenues pour les investigations ou essais futurs sont les concentrations pour lesquelles on constate une inversion de 50% de la diminution maximale de la RTE induite par le LPS. Ce test peut être utilisé pour évaluer l'effet inhibiteur à 50% de composés-tests sur la diminution de la RTE suite à l'exposition au LPS de monocouches cellulaires issues de cellules épithéliales bronchiques humaines (NCI-H292).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un composé inhibant la contraction de la chaîne légère de la myosine des cellules épithéliales pulmonaires, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit composé est utilisé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif de pathologies respiratoires, à l'exclusion de l'hypoxie causée par lesdites pathologies.
3. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé inhibe la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur de MLCK.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est le ML-7.
6. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le composé est un activateur de la myosine phosphatase.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé réduit la perméabilité paracellulaire de l'épithélium pulmonaire, sans effet substantiel sur la perméabilité de l'endothélium vasculaire.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la sensibilisation aux allergènes chez des sujets atteints ou sensibles aux maladies respiratoires.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif ou curatif des allergies, de l'asthme ou des maladies obstructives.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un médicament destiné à réduire la migration transépitheliale d'immunocytes et l'accumulation d'immunocytes dans le poumon de sujets atteints d'une pathologie respiratoire.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé est administré par voie orale ou aérienne.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé est utilisé en association avec au moins un autre agent actif sélectionné parmi les agonistes-β2, les composés anti-cholinergiques, les corticostéroïdes et les anti-leukotrienes, en vue d'une utilisation combinée, séparée ou espacée dans le temps.
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