CA2214095A1 - Nouvelle utilisation de compositions contenant de la nacre - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une nouvelle utilisation de la nacre à des fins médicales et/ou cosmétologiques. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques destinées à améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines. La présente invention a encore pour objet l'utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de son application dans des milieux de cultures cellulaires, afin d'améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines.
Description
CA 0221409~ 1997-08-l9 W O ~7/23231 PCTn~R96/02053 NOUVELI E IJTILISATION DE COMPOSITIONS
CONTENANT DE LA NACRE
L'invention concerne une nouvelle utilisation de la nacre à des fins médicales etlou cosmétologiques.
La référence Chemical Abstracts, Vol. 124, No. 1 1, 1996, p. 1084 décrit une prépar~lion de nacre associée à de la kératine; cette préparation est obtenue par 10 digestion à l'acide lactique de nacre pulvérulente, qui détruit la composante minérale de la nacre.
La référence US-A~ 393 045 (E.G. HENDERSON et al.) a pour objet des composants de la nacre ayant un effet curatif, par application d'une préparationobtenue après mise en contact d'un fruit contenant de l'acide citrique avec la 15 coquille d'un mollusque contenant la partie nacrée. On ne conserve ainsi que la partie organique de la nacre.
La référence EP-A-0 393 267 (M. KATO et al.) décrit une substance bioactive obtenue par c'nauffage de la nacre pendant plusieurs heures à température très élevée. Il semble que ce chauffage active un agent de croissance de plantes et 20 d'animaux.
La référence WO-A-95 30426 (S. CAMPRASSE et al.) concerne un produit de régénération et de cicatrisation cutanée, obtenu à partir d'un broyat du test nacré et d'un Iyophilisat de cellules animales que l'on traite par voie enzymatique et thermique.
25 La référence DE-A-34 37 184 (E. IWAN et al.~ concerne un agent pour traiter les brûlures à base d'un mélange de coquilles pulvérisées de moules et d'escargots.
Les coquilles sont au préalable lavées à l'eau et séchées.
Ce mélange a une action antibactérienne.
Le brevet FR-A-2 715 568 (J. VIRASSAMY~ revendique l'utilisation de poudre de 30 nacre pour la reconstruction osseuse.
La nacre est connue depuis longtemps pour ses propriétés régénératrices des os.
CA 022l409~ l997-08-l9 La Demanderesse a constaté que la nacre contenait dans sa structure cristalline des substances susceptibles d'activer les cellules de l'animal et notamment de permettre de réparer la coquille des conchifères lorsque celie-ci est lésée. Certaines substances contenues dans le biominéral qu'est la nacre sont de nature protéique et 5 répondent bien aux anticorps dirigés contre les collagènes humains et de rats, de type I et lll. Il existe donc une analogie entre la peau et la coquille des conchifères.
Sur la base de cette observation, la Demanderesse a étudié et vérifié que la nacre contenait des substances originales qui pouvaient intervenir dans les processus de restructuration, de stimulation, etc., de la peau.
La nécessité de donner à la peau un aspect stimulé ou rajeuni utilise jusqu'à ce jour des soins qui éliminent la couche cornée superficielle, afin de faire apparaître les couches cellulaires sousjacenles. C'est ainsi que l'on donne à la peau un aspectrajeuni, mais avec la triple conséquence:
15 - d'affiner la peau par un amincissement de l'épiderme alors que celui-ci voit son épaisseur diminuer avec l'âge, - de diminuer le nombre de cellules de l'épiderme, entamant ainsi le capital de réplication cellulaire, - d'enlever les cellules apoptosées ou mortes de la partie superficielle de l'épiderme, 20 éli",i"a"L ainsi le film protecteur du stratum corneum et plus particulièrement du stratum disjonctum, sensibilisant la peau aux agressions extérieures.
D'autres techniques de soins font appel à des aspects stric;lemellt visuels, comme le dépôt d'un film lipophile ou siliconé, brillant ou satiné, qui rend étanches les couches 25 externes et évite ainsi leur déshydralalion. Enfin, les modifications de la couleur de la peau assurent un aspect plus chaleureux (bronzage) ou juvénile (blanchiment) en s'associant souvent à des protecteurs solaires (écrans organiques ou minéraux) ou des stimulants du bronzage naturel ou artificiel (Dihydroxyacétone ou D.H.A.). Ces soins ne contribuent en aucune façon à améliorer la qualité naturelle de la peau30 puisqu'ils ne sont, en fait, que des maquillages.
CA 0221409~ 1997-08-l9 C'est pourquoi la présente invention vise à résoudre le problème technique qui n'avait pas été résolu jusqu'ici, de présenter à la surface de la peau une structure néoformée qui lui confère un aspect jeune et dynamique sans éliminer les cellules.
5 La Demanderesse a étudié les conséquences de l'emploi de la nacre sur d'autrestypes de cellules comme les fibroblastes, les Iymphocytes, les kératinocytes et les cellules endothéliales.-L'observation des comportements cellulaires a permis de constater la survenue denouvelles propriétés non décrites à ce jour et qui per",ellent d'employer la nacre 10 pour ces nouvelles ulilisdliGns.
En effet, la poudre de nacre ajoutée dans la culture de kératinocytes provoque de manière inattendue une synthèse accrue de cytokératines.
La structure présente à la surface cutanée doit etre une substance naturellement15 produite par les cellules épithéliales, comme les kératinocytes, qui co, Ill ibue à
l'épaississement physiologique de l'épiderme.
La solution retenue a été de choisir de ne pas décaper la peau pour amener à la surface de nouvelles structures cellulaires, mais de faire produire aux kératinocytes 20 des substances néoformées, les cytokératines, que génèrent normalement ces cellules lorsqu'elles sont jeunes ou actives.
Ces substances protéiques contribuent ainsi à l'épaississement de l'épiderme parl'amélioration de la qualité cytoplasmique des kératinocytes ainsi que des cornéocytes, et par voie de conséquence à sa résistance passive aux agressions 25 extérieures. De plus, la restructuration des stratum épithéliaux améliore la masse de l'épiderme, constituant ainsi une réserve de messagers et contribuant à sa résistance active aux agressions extérieures.
La partie la plus superficielle de la peau est constituée par des cellules anucléées 30 dont les couches les plus externes forment le Stratum corneum. Cette couche cornée externe peut être à l'image de la coquille des bivalves. Il y a donc tout lieu de penser que les processus de restauration de cette structure, (constituée d'une matière sans matériel nucléaire et génétique comme l'est la coquille), peuvent CA 0221409~ 1997-08-19 répondre aux mêmes signaux de restauration. Il reste cependant un problème dfflicile à résoudre du fait que la coquille des bivalves baigne dans l'eau et que les substances relarguées à partir de la coquille à l'occasion d'une lésion doivent répondre à une spécificité d'action très précise.
5 De ce fait, les études menées par la Demanderesse se sont heurtées à de nombreuses difficultés pour faire exprimer cette activité et la mettre en évidence.
L'analyse des protéines après un broyage traditionnel de la nacre montre que celle-ci peut contenir ~i,6 mg de substances protéiques par gramme. On a constaté que 10 ces substances ne développen~ pas selon la dilution la même activité (phosphatase alcaline) sur une culture d'ostéoblastes. De plus, on a noté de manière inattendue que si l'on dilue la nacre en poudre par une autre poudre constituée essentiellement par de l'aragonite (constituant minéral de la nacre), la réponse des cellules à la présence de biocristaux de nacre se trouve amplifiée. C'est donc avec une 15 préparation constituée de nacre et d'aragonite que les essais décrits plus loin ont été réalisés. Selon l'effet souhaité, il est possible d'utiliser des dilutions ayant un pourcentage variable de nacre dans le mélange total.
La présente invention consiste plus spécifiquement dans l'utilisation d'une poudre 20 formée de nacre et éventuellement d'aragonite, sous forme finement pulvérulerite et mélangée à des excipients convenables, en vue de la réaiisation de compositions pharmaceutiques etlou cosr"eli4ues destinées à améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines.
L'invention consiste encore dans l'utilisation d'une poudre formée de nacre et 25 éventuellement d'aragonite, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de son application dans des milieux de cultures cellulaires afin d'améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines.
La synthèse très importante de nouvelles cytokératines assure l'amélioration des30 qualités et de l'aspect de la peau, et permet notarnl~ent d'assurer les processus de restauration de la structure de la peau, d'exercer un rôle protecteur sur la peau et de lui conférer une résistance active dans des conditions extérieures agressives (soleil, froid, e~osition prolongée à l'eau, etc.), d'assurer l'amélioration des propriétés CA 0221409~ 1997-08-19 W O g7/23~31 PCTAFR96/02053 mécaniques de la peau, de lui co"rérer un aspect jeune et dynamique, grâce à unestructure néoformée à la surface.
r~
La poudre formée de nacre et d'aragonite est constituée de telle sorte que le 5 mélange contient de la nacre dans une proportion allant de 0,1 % à 98 % dans le mélange total, et de préférence dans une propollion allant de 5 à 20 % dans le mélange total.
Les essais décrits plus loin ont été réalisés de préférence avec une préparationconstituée de 10 % de nacre et de 90 % d'aragonite.
10 La présente invention concerne encore les compositions pl ,armaceutiques et/ou cosmétiques assurant l'amélioration des ~ tes et de l'aspect de la peau, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de nacre, éventuellement additionnée d'aragonite, en association ou en mélange avec un excipient ou un diluant inerte, non toxique, pulvérulent.
Si la nacre permet de développer un effet dermo-protecteur, c'est dans la synthèse des constituants du Stratum corneum que l'on trouve le plus de modiFications. Lacouche cornée étant constit- ~ée par la condensation des cytokératines, la Demanderesse a orienté ses analyses vers cette matière. Les conséquences 20 envisageables sont essentiellement dans la qualité de la réponse des cellules au stress d'une agression (synthèse d'interleukine 1 : IL-1). De plus, la peau est soumise à une impor~ante activité photolumineuse à laquelle elle répond par la synthèse d'un élément photoprolecteur: la mélanine. On observe de ce fait une diminution de la synthèse de la mélanine ou une meilleure répartition de celle-ci 25 dans les kératinocytes.
Rôle de la nacre dans la synthèse des cytokératines Les cytokératines se distinguent par leur poids moléculaire et pour la plupart d'entre elles il existe un a"licor~,s spéciFique. Afin d'étudier l'ensemble du phénomène, on a 30 utilisé un anticorps dirigé contre l'ensemble des cytokératines. De ce fait, il est appelé anti-pan cytokératines.
On a donc réalisé une culture cellulaire de kératinocytes obtenus à partir de prélèvements chirurgicaux de peau. La peau est traitée par digestion enzymatique et CA 022l409~ l997-08-l9 W O 97/23231 PCT~R96/02053 mise en incubation dans un milieu spécifique (Mac Koy modifié ou du type KBM-Kératinocytes Basal Medium -): milieu de culture ne contenant pas de sérum.
105 cellules sont incubées pendant 24 heures en présence de 50 mg de nacre par 5 ml de milieu dépourvu de sérum de veau foetal ou de sérum protéique similaire.Les cellules sont rincées, le surnageant éliminé, les cellules sont séparées de la nacre, Iysées, puis un ~ Western Blot ~ est réalisé sur la fraction cellulaire. La technique du ~ Western Blot ~ est une technique analytique ~asée sur une séparation des protéines selon leur poids moléculaire par électrophorèse suivie 10 d'une détection immunologique. Un anticorps de deuxième couche greffé à un enzyme révèle le premier anticorps lors de la mise en contact avec un substrat cl ,ro, nogène. Pour oi~tenir des résultats interprétables, plusieurs dilutions sont testées et la ~ua"liricdlion de la substance à doser, -ici les pan cytokératines- se fait par simple spe~tropho~o"~e~,ie d'absorption ou par analyse d'image de la plaque de 15 révélation. Dans ces conditions, on a constaté que l'hypothèse de base était vérifiée et que la nacre était susceptibie de doubler la quantité de cytokératines synthétisée par les kératinocytes. Les résultats sont étudiés en tenant compte de la synthèse protéique totale sur plusieurs dilutions, car d'une part le nombre de cellules n'est pas rigoureusement constant, et d'autre part leur activité n'est pas nécessai~n,ent 20 coor~lo"née.
Protéines totales (en ,ug) volume testé en ~ul: 10 20 40 témoin (sans nacre) 8 9,3 18,3 nacre 3 7,5 12 Signal cytokératine volume testé en IJI: 10 20 40 témoin (sans nacre) 62,8 70,9 178 nacre 18,4 108 275 Signal cytokératine (X 10)1 Protéines totales volume testé en ,ul: 10 20 40 témoin (sans nacre) 78 76 97 nacre 61 130 230 CA 0221409~ 1997-08-19 W O 97/23231 PCT~FR96/02053 Rapport Nacre I témoin volume testé en ,ul: 10 20 40 rapport 0,78 1,89 2,36 5 On note donc que la nacre augmente la synthèse des pan cytokératines d'un facteur multiplicatif de l'ordre de 2.
La figure 1 est une représentation graphique de l'évolution de la synthèse des pan cytokératines en fonction du volume testé.
10 On y a montré le rapport slgnal cytokératine X 10 /llg de protéines totales pour le témoin et pour les préparations à base de nacre.
On notera que l'analyse prend toute sa sensibilité lors de l'électrophorèse d'aumoins 20 ~
Si la synthèse des cytokératines améliore les propriétés mécaniques de la peau, il 15 est possible d'envisager un rôle protPctl~nr de la nacre lors des agressions. On peut considérer deux types de réponses aux agressions: les réponses aux agressions detype chimique ou biologique mettant en jeu l'interleukine en première intention et les réponses impliquant la mélanine.
20 Role de la nacre sur la synthèse de l'interleukine 1 (IL-1):
La figure 2 représente les résultats obtenus lors de la culture de la lignée celluiaire HL 60 en présence de nacre.
On note une diminution importante de la sécrétion d'lL-1 lorsque les celhlles sont cultivées en présence de nacre.
Réaction de protection mettant en ~eu la mélanine La culture de mélanocytes (lignée de l'ECACC) lignée G 361 en présence de nacre ne modifie que faiblement la sécrétion de la mélanine.
Moyenne témoin 0,150 0,149 0,1480,149 nacre 0,5 % 0,150 0,132 0,1400,141 nacre 1% 0,139 0,137 0,1430,141 CA 02214095 1997-08-l9 W O 97/23231 PCTrFR96/02053 On constate néanmoins que le nombre de dendrites des mélanocytes est augmenté
lors de la coculture mélanocytes - kératinocytes issus d'e~q~lants de la peau.
(nombre de dendrites) témoin 5 nacre 0,2 % 12 nacre 1 % 1 5 On en déduit une meilleure répartition de la mélanine.
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CONTENANT DE LA NACRE
L'invention concerne une nouvelle utilisation de la nacre à des fins médicales etlou cosmétologiques.
La référence Chemical Abstracts, Vol. 124, No. 1 1, 1996, p. 1084 décrit une prépar~lion de nacre associée à de la kératine; cette préparation est obtenue par 10 digestion à l'acide lactique de nacre pulvérulente, qui détruit la composante minérale de la nacre.
La référence US-A~ 393 045 (E.G. HENDERSON et al.) a pour objet des composants de la nacre ayant un effet curatif, par application d'une préparationobtenue après mise en contact d'un fruit contenant de l'acide citrique avec la 15 coquille d'un mollusque contenant la partie nacrée. On ne conserve ainsi que la partie organique de la nacre.
La référence EP-A-0 393 267 (M. KATO et al.) décrit une substance bioactive obtenue par c'nauffage de la nacre pendant plusieurs heures à température très élevée. Il semble que ce chauffage active un agent de croissance de plantes et 20 d'animaux.
La référence WO-A-95 30426 (S. CAMPRASSE et al.) concerne un produit de régénération et de cicatrisation cutanée, obtenu à partir d'un broyat du test nacré et d'un Iyophilisat de cellules animales que l'on traite par voie enzymatique et thermique.
25 La référence DE-A-34 37 184 (E. IWAN et al.~ concerne un agent pour traiter les brûlures à base d'un mélange de coquilles pulvérisées de moules et d'escargots.
Les coquilles sont au préalable lavées à l'eau et séchées.
Ce mélange a une action antibactérienne.
Le brevet FR-A-2 715 568 (J. VIRASSAMY~ revendique l'utilisation de poudre de 30 nacre pour la reconstruction osseuse.
La nacre est connue depuis longtemps pour ses propriétés régénératrices des os.
CA 022l409~ l997-08-l9 La Demanderesse a constaté que la nacre contenait dans sa structure cristalline des substances susceptibles d'activer les cellules de l'animal et notamment de permettre de réparer la coquille des conchifères lorsque celie-ci est lésée. Certaines substances contenues dans le biominéral qu'est la nacre sont de nature protéique et 5 répondent bien aux anticorps dirigés contre les collagènes humains et de rats, de type I et lll. Il existe donc une analogie entre la peau et la coquille des conchifères.
Sur la base de cette observation, la Demanderesse a étudié et vérifié que la nacre contenait des substances originales qui pouvaient intervenir dans les processus de restructuration, de stimulation, etc., de la peau.
La nécessité de donner à la peau un aspect stimulé ou rajeuni utilise jusqu'à ce jour des soins qui éliminent la couche cornée superficielle, afin de faire apparaître les couches cellulaires sousjacenles. C'est ainsi que l'on donne à la peau un aspectrajeuni, mais avec la triple conséquence:
15 - d'affiner la peau par un amincissement de l'épiderme alors que celui-ci voit son épaisseur diminuer avec l'âge, - de diminuer le nombre de cellules de l'épiderme, entamant ainsi le capital de réplication cellulaire, - d'enlever les cellules apoptosées ou mortes de la partie superficielle de l'épiderme, 20 éli",i"a"L ainsi le film protecteur du stratum corneum et plus particulièrement du stratum disjonctum, sensibilisant la peau aux agressions extérieures.
D'autres techniques de soins font appel à des aspects stric;lemellt visuels, comme le dépôt d'un film lipophile ou siliconé, brillant ou satiné, qui rend étanches les couches 25 externes et évite ainsi leur déshydralalion. Enfin, les modifications de la couleur de la peau assurent un aspect plus chaleureux (bronzage) ou juvénile (blanchiment) en s'associant souvent à des protecteurs solaires (écrans organiques ou minéraux) ou des stimulants du bronzage naturel ou artificiel (Dihydroxyacétone ou D.H.A.). Ces soins ne contribuent en aucune façon à améliorer la qualité naturelle de la peau30 puisqu'ils ne sont, en fait, que des maquillages.
CA 0221409~ 1997-08-l9 C'est pourquoi la présente invention vise à résoudre le problème technique qui n'avait pas été résolu jusqu'ici, de présenter à la surface de la peau une structure néoformée qui lui confère un aspect jeune et dynamique sans éliminer les cellules.
5 La Demanderesse a étudié les conséquences de l'emploi de la nacre sur d'autrestypes de cellules comme les fibroblastes, les Iymphocytes, les kératinocytes et les cellules endothéliales.-L'observation des comportements cellulaires a permis de constater la survenue denouvelles propriétés non décrites à ce jour et qui per",ellent d'employer la nacre 10 pour ces nouvelles ulilisdliGns.
En effet, la poudre de nacre ajoutée dans la culture de kératinocytes provoque de manière inattendue une synthèse accrue de cytokératines.
La structure présente à la surface cutanée doit etre une substance naturellement15 produite par les cellules épithéliales, comme les kératinocytes, qui co, Ill ibue à
l'épaississement physiologique de l'épiderme.
La solution retenue a été de choisir de ne pas décaper la peau pour amener à la surface de nouvelles structures cellulaires, mais de faire produire aux kératinocytes 20 des substances néoformées, les cytokératines, que génèrent normalement ces cellules lorsqu'elles sont jeunes ou actives.
Ces substances protéiques contribuent ainsi à l'épaississement de l'épiderme parl'amélioration de la qualité cytoplasmique des kératinocytes ainsi que des cornéocytes, et par voie de conséquence à sa résistance passive aux agressions 25 extérieures. De plus, la restructuration des stratum épithéliaux améliore la masse de l'épiderme, constituant ainsi une réserve de messagers et contribuant à sa résistance active aux agressions extérieures.
La partie la plus superficielle de la peau est constituée par des cellules anucléées 30 dont les couches les plus externes forment le Stratum corneum. Cette couche cornée externe peut être à l'image de la coquille des bivalves. Il y a donc tout lieu de penser que les processus de restauration de cette structure, (constituée d'une matière sans matériel nucléaire et génétique comme l'est la coquille), peuvent CA 0221409~ 1997-08-19 répondre aux mêmes signaux de restauration. Il reste cependant un problème dfflicile à résoudre du fait que la coquille des bivalves baigne dans l'eau et que les substances relarguées à partir de la coquille à l'occasion d'une lésion doivent répondre à une spécificité d'action très précise.
5 De ce fait, les études menées par la Demanderesse se sont heurtées à de nombreuses difficultés pour faire exprimer cette activité et la mettre en évidence.
L'analyse des protéines après un broyage traditionnel de la nacre montre que celle-ci peut contenir ~i,6 mg de substances protéiques par gramme. On a constaté que 10 ces substances ne développen~ pas selon la dilution la même activité (phosphatase alcaline) sur une culture d'ostéoblastes. De plus, on a noté de manière inattendue que si l'on dilue la nacre en poudre par une autre poudre constituée essentiellement par de l'aragonite (constituant minéral de la nacre), la réponse des cellules à la présence de biocristaux de nacre se trouve amplifiée. C'est donc avec une 15 préparation constituée de nacre et d'aragonite que les essais décrits plus loin ont été réalisés. Selon l'effet souhaité, il est possible d'utiliser des dilutions ayant un pourcentage variable de nacre dans le mélange total.
La présente invention consiste plus spécifiquement dans l'utilisation d'une poudre 20 formée de nacre et éventuellement d'aragonite, sous forme finement pulvérulerite et mélangée à des excipients convenables, en vue de la réaiisation de compositions pharmaceutiques etlou cosr"eli4ues destinées à améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines.
L'invention consiste encore dans l'utilisation d'une poudre formée de nacre et 25 éventuellement d'aragonite, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de son application dans des milieux de cultures cellulaires afin d'améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines.
La synthèse très importante de nouvelles cytokératines assure l'amélioration des30 qualités et de l'aspect de la peau, et permet notarnl~ent d'assurer les processus de restauration de la structure de la peau, d'exercer un rôle protecteur sur la peau et de lui conférer une résistance active dans des conditions extérieures agressives (soleil, froid, e~osition prolongée à l'eau, etc.), d'assurer l'amélioration des propriétés CA 0221409~ 1997-08-19 W O g7/23~31 PCTAFR96/02053 mécaniques de la peau, de lui co"rérer un aspect jeune et dynamique, grâce à unestructure néoformée à la surface.
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La poudre formée de nacre et d'aragonite est constituée de telle sorte que le 5 mélange contient de la nacre dans une proportion allant de 0,1 % à 98 % dans le mélange total, et de préférence dans une propollion allant de 5 à 20 % dans le mélange total.
Les essais décrits plus loin ont été réalisés de préférence avec une préparationconstituée de 10 % de nacre et de 90 % d'aragonite.
10 La présente invention concerne encore les compositions pl ,armaceutiques et/ou cosmétiques assurant l'amélioration des ~ tes et de l'aspect de la peau, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de nacre, éventuellement additionnée d'aragonite, en association ou en mélange avec un excipient ou un diluant inerte, non toxique, pulvérulent.
Si la nacre permet de développer un effet dermo-protecteur, c'est dans la synthèse des constituants du Stratum corneum que l'on trouve le plus de modiFications. Lacouche cornée étant constit- ~ée par la condensation des cytokératines, la Demanderesse a orienté ses analyses vers cette matière. Les conséquences 20 envisageables sont essentiellement dans la qualité de la réponse des cellules au stress d'une agression (synthèse d'interleukine 1 : IL-1). De plus, la peau est soumise à une impor~ante activité photolumineuse à laquelle elle répond par la synthèse d'un élément photoprolecteur: la mélanine. On observe de ce fait une diminution de la synthèse de la mélanine ou une meilleure répartition de celle-ci 25 dans les kératinocytes.
Rôle de la nacre dans la synthèse des cytokératines Les cytokératines se distinguent par leur poids moléculaire et pour la plupart d'entre elles il existe un a"licor~,s spéciFique. Afin d'étudier l'ensemble du phénomène, on a 30 utilisé un anticorps dirigé contre l'ensemble des cytokératines. De ce fait, il est appelé anti-pan cytokératines.
On a donc réalisé une culture cellulaire de kératinocytes obtenus à partir de prélèvements chirurgicaux de peau. La peau est traitée par digestion enzymatique et CA 022l409~ l997-08-l9 W O 97/23231 PCT~R96/02053 mise en incubation dans un milieu spécifique (Mac Koy modifié ou du type KBM-Kératinocytes Basal Medium -): milieu de culture ne contenant pas de sérum.
105 cellules sont incubées pendant 24 heures en présence de 50 mg de nacre par 5 ml de milieu dépourvu de sérum de veau foetal ou de sérum protéique similaire.Les cellules sont rincées, le surnageant éliminé, les cellules sont séparées de la nacre, Iysées, puis un ~ Western Blot ~ est réalisé sur la fraction cellulaire. La technique du ~ Western Blot ~ est une technique analytique ~asée sur une séparation des protéines selon leur poids moléculaire par électrophorèse suivie 10 d'une détection immunologique. Un anticorps de deuxième couche greffé à un enzyme révèle le premier anticorps lors de la mise en contact avec un substrat cl ,ro, nogène. Pour oi~tenir des résultats interprétables, plusieurs dilutions sont testées et la ~ua"liricdlion de la substance à doser, -ici les pan cytokératines- se fait par simple spe~tropho~o"~e~,ie d'absorption ou par analyse d'image de la plaque de 15 révélation. Dans ces conditions, on a constaté que l'hypothèse de base était vérifiée et que la nacre était susceptibie de doubler la quantité de cytokératines synthétisée par les kératinocytes. Les résultats sont étudiés en tenant compte de la synthèse protéique totale sur plusieurs dilutions, car d'une part le nombre de cellules n'est pas rigoureusement constant, et d'autre part leur activité n'est pas nécessai~n,ent 20 coor~lo"née.
Protéines totales (en ,ug) volume testé en ~ul: 10 20 40 témoin (sans nacre) 8 9,3 18,3 nacre 3 7,5 12 Signal cytokératine volume testé en IJI: 10 20 40 témoin (sans nacre) 62,8 70,9 178 nacre 18,4 108 275 Signal cytokératine (X 10)1 Protéines totales volume testé en ,ul: 10 20 40 témoin (sans nacre) 78 76 97 nacre 61 130 230 CA 0221409~ 1997-08-19 W O 97/23231 PCT~FR96/02053 Rapport Nacre I témoin volume testé en ,ul: 10 20 40 rapport 0,78 1,89 2,36 5 On note donc que la nacre augmente la synthèse des pan cytokératines d'un facteur multiplicatif de l'ordre de 2.
La figure 1 est une représentation graphique de l'évolution de la synthèse des pan cytokératines en fonction du volume testé.
10 On y a montré le rapport slgnal cytokératine X 10 /llg de protéines totales pour le témoin et pour les préparations à base de nacre.
On notera que l'analyse prend toute sa sensibilité lors de l'électrophorèse d'aumoins 20 ~
Si la synthèse des cytokératines améliore les propriétés mécaniques de la peau, il 15 est possible d'envisager un rôle protPctl~nr de la nacre lors des agressions. On peut considérer deux types de réponses aux agressions: les réponses aux agressions detype chimique ou biologique mettant en jeu l'interleukine en première intention et les réponses impliquant la mélanine.
20 Role de la nacre sur la synthèse de l'interleukine 1 (IL-1):
La figure 2 représente les résultats obtenus lors de la culture de la lignée celluiaire HL 60 en présence de nacre.
On note une diminution importante de la sécrétion d'lL-1 lorsque les celhlles sont cultivées en présence de nacre.
Réaction de protection mettant en ~eu la mélanine La culture de mélanocytes (lignée de l'ECACC) lignée G 361 en présence de nacre ne modifie que faiblement la sécrétion de la mélanine.
Moyenne témoin 0,150 0,149 0,1480,149 nacre 0,5 % 0,150 0,132 0,1400,141 nacre 1% 0,139 0,137 0,1430,141 CA 02214095 1997-08-l9 W O 97/23231 PCTrFR96/02053 On constate néanmoins que le nombre de dendrites des mélanocytes est augmenté
lors de la coculture mélanocytes - kératinocytes issus d'e~q~lants de la peau.
(nombre de dendrites) témoin 5 nacre 0,2 % 12 nacre 1 % 1 5 On en déduit une meilleure répartition de la mélanine.
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Claims (12)
1. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite, en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques destinées à améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines
2. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite, en vue de son application dans des milieux de cultures cellulaires afin d'améliorer la synthèse de nouvelles cytokératines.
3. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon les revendications 1 et 2, dans laquelle la poudre est constituée de telle sorteque le mélange contient de la nacre dans une proportion allant de 0,1 % à
98 % dans le mélange total.
98 % dans le mélange total.
4. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon la revendication 3, dans laquelle la poudre est constituée de telle sorte que le mélange contient de la nacre dans une proportion allant de 5 % à 20 % dans le mélange total, et de préférence de 10 % dans le mélange total.
5. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon la revendication 2, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de son application dans une culture de kératinocytes.
6. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon la revendication 1, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques assurant l'amélioration des qualités de la peau.
7. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon les revendications 1 et 6, en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques assurant les processus de restauration de la structure de la peau.
8. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon les revendications 1 et 6, en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques exerçant un rôle protecteur sur la peau, et lui conférant une résistance active dans des conditions extérieures agressives.
9. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selon la revendication 1, sous forme finement pulvérulente et mélangée à des excipients convenables, en vue de la réalisation de compositions cosmétiques assurant l'amélioration de l'aspect de la peau.
10. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selonles revendications 1 et 9, en vue de la réalisation de compositions cosmétiques assurant l'amélioration des propriétés mécaniques de la peau.
11. Utilisation d'une poudre formée de nacre et éventuellement d'aragonite selonl'une au moins des revendications 1, 6 et 9, en vue de la réalisation de compositions conférant un aspect jeune et dynamique à la peau, grâce à une structure néoformée à la surface.
12. Compositions pharmaceutiques et/ou cosmétiques assurant l'amélioration des qualités et de l'aspect de la peau, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de nacre, éventuellement additionnée d'aragonite, en association ou en mélange avec un excipient ou un diluant inerte, non toxique, pulvérulent.
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