CA2157760A1 - Bistramides biologiquement actifs, leur obtention et leurs applications en therapeutique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des dérivés de bistramides de toxicité faible, voire inexistante, de formule (I) dans laquelle -R1, X, Y et R2, représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 20 atomes de carbone, saturée ou insaturée, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle (a), ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, -R3, R4 et R5, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe -COOH, -OH, -NH2 ou -NO2, ou un atome d'halogène, leurs dérives tels qu'éthers ou esters, ainsi que leurs isomères, à l'exclusion des bistramides A, B et C sont utiles notamment comme médicaments à effet cytostatique, en particulier comme médicaments antitumoraux ou anti-parasitaires.

Description

~ 94/205~ 2 1 ~ 7 7 6 -~ PCTA~V4/00256 BISTRAMIDES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS, LEUR OBTENTION ET
LEURS APPLICATIONS EN THERAPEUTIQUE

L'invention a pour objet de nouveaux dérivés de bistramides, leur obtention et leurs applications en thérapeutique.
Les bistramides sont ainsi appelés par analogie avec un organisme marin à partir duquel ils peuvent être extraits, à savoir l'ascidie T.; ~r,r.l i nllm h;s~r~tllm qui vit en symbiose avec ses prochlorons.
Plusieurs bistramides ont déjà été décrits. Il s'agit en particulier des bistramides A, B et C.
Leur structure chimique, complexe, n'a été
élucidée que récemment (voir article de Foster et al.
dans J.A.C.S. 1992, 114). Elle correspond à la formule (A) suivante:

W O 94noso3 2 15 7 7 6 ~ PCTAFR94/0025C ~

Formule A

R

R ~ ~ ~ i avec Rl et R~ représentant, respectivement, pou- le '~is._G~ide ~ L ~ 40~36 pcur le b-s~-a.mice 3 pou~ le ~is~ramlde C

~ 94/20503 2 1 ~ 7 7 6 ~ PCT~94/00~6 L'intérêt pour ces produits résulte, d'une manière générale, de la forte activité cytostatique qu'ils présentent en particulier ;n vi tro. Cependant, leur cytotoxicité et leur toxicité élevées ;n vivo ne permettent pas d'envisager la mise à profit de leurs propriétés pour des utilisations comme médicaments.
La DLso de ces bistramides est en effet de l'ordre de 1,7 mg/kg (mesure sur la souris, après injection du produit par voie intraveineuse en dose unique).
Les travaux des inventeurs sur les invertébrés marins, en particulier sur l~ascidie T.; ~so~l i nl~m hi ~tr~t~,m Sluiter, accompagnée ou non de ses prochlorons symbiotes, les ont conduits à mettre au point des conditions d'extraction spécifiques permettant d'isoler de nouveaux bistramides présentant diverses activités biologiques de grand intérêt.
De manière surprenante, l'étude de ces nouveaux bistramides a montré qu'ils étaient dotés d'un effet cytostatique in vi~ro et d'effets thérapeutiques in v;vo, mais que, contrairement aux bistramides évoqués plus haut, leur cytotoxicité et leur toxicité in vivo étaient beaucoup plus faibles, voire inexistantes autorisant leur utilisation en thérapeutique.
L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux dérivés présentant un squelette structural du type des bistramides.
Elle a également pour but de fournir un procédé
d'obtention de ces produits par extraction à partir de 30 Thi ~tr~t~m et/ou de ses prochlorons.
L'invention vise également les applications biologiques et biochimiques de ces nouveaux bistramides, en particulier pour la thérapie de c~nc~rs, notamment, de tumeurs h~ ~m~ ine~ solides, ou le traitement de maladies parasitaires.

W094/20503 ; PCT~94/00~6 ~
215776~

Les bistramides de l'invention sont caractérisés en ce que - ils sont capables d'exercer ;n v;vo une activité antitumorale entrainant la différenciation des cellules tumorales, avec inhibition ~n vitro de l'expression de l'oncogène erb-2 normalement exprimé par les cellules des lignées bronchopl~lmon~lres non a petites cellules, - leur DLso est supérieure à 30 mg/kg, voire 160 mg/kg ou plus, et - ils répondent à la formule (I) lS ~ Y - NN - C0 (I) R

dans laquelle -Rl, X, Y et R2, identiques ou différents les uns des autres, représentent une chaîne hydrocar~onée de 1 a 20 atomes de carbone, saturée ou insaturee, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle ~ 5 , ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, -R3, R1 et Rs, identi~ues ou différents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 a 4 atomes de carbone, un groupe -COOH, -OH, -NH2 ou -NO2, ou un atome d'halogène, étant entendu que, lorsque R3 et R4 représentent chacun un ~ 94,205~ ~ ~ 5 7 7 6 O PCTA~94/002~6 atome d'hydrogène, Rl et R2 ne représentent pas respectivement de ch~;ne~
~3 CH3-CH=CH - CO - CH7 ~ol et (CH3, OH) CH - C(CH3)=
. ~ C~3 ou, CH3 - (CH ~) ~ - CO - CH~ et (CH3, OH) CH - C (CH3) =

ou encore, ~ C~3 CH3 - CH = CH - CO - CH~ ol et CH3 - CO - C (CH3) =-On rappellera que les composés correspondant à
ces 3 exclusions sont les bistramides A, B et C de l'état de la technique évoqué ci-dessus.
L'expression "activité antitumorale ~n v; vn"
telle qu'utilisée ci-dessus signifie qu'une inhibition de la prolifération tumorale des cA~c~rs bronchopulmonaires non ~ petites cellules (80% des tumeurs pulmonaires) a été mise en évidence, sans toxicité aigue pour 1~ ~ni ~
Ces propriétés autorisent l'obtention d'un plateau thérapeutique permettant l'accès aux normes du National CA~cer Institute pour les produits avec T 42 %.
C
La "DLso" des produits de l'invention a été
mesurée sur la souris après in;ection des produits par voie intraveineuse.
Compte tenu de la valeur de la DLso des bistramides ainsi définis, les bistramides A, B, et C
mentionnés plus haut se trouvent exclus du champ de l'invention. On notera de plus qu'en raison de leur forte toxicité ces bistramides A, B et C ne pourraient conduire, pendant la durée d'un traitement, à l'obtention des effets avantageux observés avec les produits de l'invention.

W094/20503 215 7 7 G 0 6 PCT~94/00256 ~

L'index thérapeutique atteint une valeur de 5,0 pour certains des bistramides de l'invention.
Les bistr~mides de l'invention sont également caractérisés en ce ~u'ils sont capables d'exercer une activité cytostatigue vis-à-vis de parasites.
Selon une disposition préférée de l'invention, dans la formule I ci-dessus, Rl comporte de l à 15 atomes de carbone.
Selon une autre disposition préférée, R1 comporte une ou deux doubles liaisons éthyléniques.
R2 comprend de préférence de 6 à 10 atomes de carbone, notAr~?nt 8 ou 9, et comporte avantageusement une double liaison éthylénique.
Dans encore une autre disposition préférée, X
et Y comportent de 2 à 8 atomes de carbone, notamment de

2 ~ 6 atomes de carbone, en particulier de 3 à 5.
R3 et Rs représentent avantageusement, dans l'une quelconque des dispositions qui préc~dent, un radical alcoyle ou alcoxy, notamment de 1 ~ 4 atomes de carbone, et R4 un atome d'hydrogène.
L'invention vise également les dérivés des bistramides de formule I, plus particulièrement ceux permettant leur utilisation comme prodrogues. On citera comme exemples les esters et les éthers, notamment les éthers d'alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, ou les dérivés glycosylés.
Des bistramides particulièrement préférés, co...~e tenu de l'intérêt de leurs propriétés thérapeutiques in v~vo qui seront exposées dans la suite de la description, sont choisis parmi - le bistramide D, de formule (II) ~ H

¦ H (II) ~H ~

~ g4,20503 ~ 1 ~ 7 7 6 ~ ~ ~/FRg4/002S6 - le bistramide L de formule (III) 10 1 1 ~
~ ~ (III) - et tout spécialement le bistramide K de formule (IV) ~0 ,~
~y OH ~

Les formes enantiomères ou diastéréoisomeres, seules ou en mélanges, des bistramides définis ci-dessus font également partie de l'invention.
On notera que ces bistramides peuvent exister sous une forme déshydratée.
La ~o~n~icsance de la formule chimique de ces produits permet de recourir aux proc~c de synthese chimique pour leur obtention.

wo g4/205~ 2 i ~ 7 7 6 ~ PCT~4/00256 ~

Il est également possible d'obtenir le bistramide D par hémisynthèse à partir du bistramide A
dont la fonction cétone a, ~-insaturée en position 4 est particulièrement réactive et peut être hydroxylée par réaction avec un agent réducteur. Des modifications des chaînes de substitution peuvent être ensuite apportées en op~rant selon des mé~ho~c connues.
On remarquera que la transformation par hémisynthèses du bistramide A toxique en bistramide D
moins toxique représente une étape essentielle de la présente invention qui correspond au schéma suivant :

0~
1 5 ~J
OH
Bistrarnide A

age~lt réducteur ~f~

H OH

Ri ~tr~mi~ n De plus, le rendement d'extraction du bistramide A à partir de l'ascidie est de l'ordre de 0,1 %, alors qu'il n'est que de 0,021 % pour le bistramide D. La réaction de réduction conduit, en proportion équivalente, aux deux épimères du carbone 4, dont l'un correspond au bistramide D. Cette étape s'effectue avec un rendement moyen de 70 %, ce qui revient donc à multiplier la quantité de bistramide D

g4,20503 2 ~ ~ 7 7 ~ ~ ~ 4/00256 disponible par un facteur d'environ 1,7 (soit 3,5 pour les 2 épimères).
L'invention vlse également les bistramides tels qu'obtenus par extraction à partir de T, h; ~tr~tllm et/ou de ses prochlorons, et les dérivés de ces bistramides.
Ce procédé d'extraction comprend des fractionnements successifs par chromatographie à partir d'un extrait organique de r. hi str~t1~m et/ou de ses prochlorons. Ces fractionnements sont réalisés en mettant en oeuvre les opérations suivantes :
- chromatographie liquide basse pression de l'extrait organique sec pour éliminer au moins la majeure partie des impuretés ayant une polarité supérieure ou inférieure à celles des produits recherchés, - chromatographie liquide haute pression des fractions riches en bistramides, de manière à obtenir des fractions enrichies en un bistramide donné, et avantageusement, - purification de ces fractions par chromatographie liquide haute pression pour isoler sélectivement un bistramide donné.
La nature du support des colonnes de chromatographie et sa granulométrie, ainsi que le ou les mélanges de solvants utilisés sont choisis de manière à
séparer sélectivement en peu d'étapes les bistramides biologiquement actifs. Les deux premiers fractionnements sont avantageusement réalisés sur des colonnes de silice en utilisant des solvants du type de l'acétate d'éthyle, dichlorom~thane, avantagell e~ent additionnés de méthanol.
Dans l'étape de purification finale des fractions, on utilise de l'eau avec des solvants du type du méthanol, du dichlorom~thane ou de l'acétonitrile.
L'élution peut être réalisée selon un gradient, ou en variante de manière isocratique.
Les fractions telles qu'isolées à chaque étape sont également visées par l'invention.

W094/20503 PCT~R94/00256 ~
~, _ ~1~77~ lo L'extrait organique auquel est appliquée cette succession d'étapes de fractionn~?nts est obtenu par le traitement de poudre lyophilisée de T.. h 7 ~tr~tl~7n et/ou de ses prochlorons avec du dichlorométhane.
Les prochlorons sont obtenus à partir de colonies de T,. h; ~tr;7tl7m par tamisage d'une suspension formée par compression des ascidies dans de l'eau de mer.
L'obtention de bistramides selon le procédé
décrit ci-dessus est appliquée à un extrait tel qu'obtenu après congélation, lyophilisation et extraction au dichlorométhane du résidu séparé par tamisage.
L'étude des propriétés pharmacologiques des produits de l'invention a montré qu'ils exercent un effet cytostatique ;n v;tro.
Sur des cellules tumorales, on constate que cet effet s'exerce selon un mécanisme différent de celui observé avec les agents antitumoraux utilisés habituellement en chimiothérapie des cancers.
Il apparaît en effet que les bistramides induisent une différenciation terminale atypique irréversible des cellules tumorales, se concrétisant par un arrêt du développement de la tumeur.
Ce mode d'action, qui avait été envisagé pour le bistramide A, ne pouvait toutefois être mis à profit, étant donné la toxicité aigue de ce produit. Son ~r7.777; n; stration pendant la durée d'un traitement répétitif, entraînerait obligatoirement l'intoxication de l'organisme traité.
Tout au contraire, le caractère faiblement toxique des produits de l'invention pour l'organisme permet à l'effet différenciateur de se manifester sur les cellules souches du tissu tumoral, sans effets défavorables sur les cellules saines, autorisant ainsi l'établissement d'un plateau thérapeutique en vue d'un traitement.

~ 94/20503 2 1 ~ 7 7 6 ~ PCT~V4/00256 De plus, selon un aspect présentant un intérêt majeur, l'effet cytostatique des bistramides de l'invention s'exerce également vis-à-vis de parasites.
D'une manière inattendue, les bistramides provoquent un arrêt de la prolifération parasitaire durant la phase G1 du cycle cellulaire.
En particulier, une activité antipaludique a été mise en évidence chez ces bistramides.
On mesurera l'intérêt de cette activité en rappelant que le paludisme humain représente l'une des toutes premières endémies mondiales, responsable d'une importante morbidité et d'une mortalité estimée actuellement à 1 ou 2 millions d'individus pour la très grande majorité des enfants vivant en zone tropicale.
L'intérêt de fournir de nouvelles molécules actives est d'autant plus grand que les phénomènes de résistance de souches de Pla~mn~i~ f~lc;p~rl7m, l'espèce mortelle, vis-à-vis des médicaments antimalariques usuels se developpent et que, de plus, la protection vaccinale, pour laquelle d'importantes recherches sont effectuées, ne pourra atre effectuée avant plusieurs ~nne~.
Parmi les autres activités anti-parasitaires de ces bistramides, on citera leur activité anti-lei~hm-nienne.
Ainsi, à la dose de 500 7~g/ml, le bistramide D
présente in vitro une activité anti-leishmanienne sur T.. ( r) r7.onov~ni.
L'invention vise donc la mise à profit des propriétés de ces bistramides pour l'élaboration de compositions pharmaceutiques.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité
efficace d'au moins un bistramide tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte. Le bistramide utilisé constitue avantageusement, wo g4,20503 2 ~ ~ 7 7 6 ~ PCTn~4/00256 ~

grâce à la nature de ses substituants, tels qu'éthers ou esters, une prodrogue.
Ces compositions renferment le cas ~héAnt des principes actifs d'autres médicaments. On citera notamment leur association avec des médicaments anti-mitotiques poisons de fuseau, tels que la vincristine, la vinblastine ou la vinorelbine dans le cadre d'applications anti-tumorales, ou avec la chloroquine pour le traitement de maladies parasitaires.
On les utilisera également avec avantage en association avec des composés facilitant leur assimilation tels que des sucres comme le glucose.
Les compositions de l'invention sont particulièrement appropriées pour la chimiothérapie des c~nc~rs dans lesquels peu de cellules se trouvent en état de prolifération. Elles sont ainsi avantageusement utilisables pour le traitement des tumeurs hllm~inec solides à évolution lente, donc très chimiorésistantes, comme 80~ des tumeurs bronchoplll~o~lres et certaines tumeurs coliques, tumeurs du sein et mélanomes pour lesquels la thérapeutique actuelle ne dispose d'aucun médicament réellement efficace.
Ces compositions sont également utilisables pour le traitement de maladies parasitaires, comme le paludisme ou les leishmanioses.
L'invention vise donc également l'application des bistramides définis plus haut pour obtenir un médicament destiné à une utilisation comme anti-parasitaire.
Elle vise en particulier l'utilisation de ces bistramides et notA ?nt de ceux répondant aux formules (II) à (IV), pour élaborer des médicaments pour le traitement du paludisme, ou encore de lei~m~nioses.
Les conditio~nem~nts en vue de la vente, en particulier l'éti~uetage et les notices d'emploi, et avantagell~Am?nt 94/20503 ~ 7 ~ ~ PCT~R94/00256 l'emballage sont élaborés en fonction de l'application thérapeutique prévue.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes, plus spécialement par voie orale ou injectable.
Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des comprimés, pilules, tablettes, gélules, gouttes. Ces compositions renferment avantageusement de lO à lO0 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 40 à 60 mg.
D'autres formes d'administration comprennent des solutions injectables par voie intra-veineuse, sous-cutanée ou intra-musculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions.
Ces formes injectables renferment par unité de prise de lO à 50 mg de principe actif, de préférence de 15 à 30 mg.
A titre indicatif, la posologie utilisable chez l'homme correspond aux doses suivantes : ainsi on administre par exemple au patient lO à 30 à mg/jour, en une ou plusieurs prises pour le traitement de tumeurs bronchopl~lmon~ires.
L'invention vise encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les dérivés de bistramides définis plus haut.
Ces réactifs peuvent ~tre utilisés comme références ou étalons dans des études d'éventuelles activités antitumorales ou anti-parasitaires.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent relatifs à l'obtention de dérivés de bistramides et à
l'étude de leur activité antitumorale et anti-parasitaire et en se référant à la figure unique qui représente une courbe de croissance en fonction du temps de xénogreffes WO 94nos~ 5 7 7 6 J ~41~0156 ~

tumorales pl~lm~n~;res chez la souris nude après traitement avec des bistramides de l'invention.

F~XF~MPT.F~ 1 : Isolement des bistramides D, K et L par extraction à partir de r; .c~:or.l; nllm h; ~:tr~tllm.
On rapporte un exemple d'extraction à partir d'échantillons de T-; ~!:orl; nllm h; ~:tr~tllm, accompagnée de ses prochlorons symbiotes, provenant des îles de Ua et de N'Do, Nouvelle Calédonie. Ces échantillons ont éte débarassés des débris apparents, broyés, puis lyophilisés quelques heures après la récolte.
PROCEDE D'EXTRACTION
Lissoclinum bistratum (5900 g) est traité 3 fois par le dichlorométhane, à raison de 3500 ml de solvant par kilo de matière première lyophilisée, à
température ambiante, et sous agitation. Les solutions organiques sont filtrées, rassemblées, puis évaporées à
sec à l'évaporateur rotatif (température 40 C). Le poids d'extrait brut obtenu est de 44,2 g.
Cet extrait brut est fractionn~ par chromatographie liquide basse pression (silice 60-200 ~m 900 g ; acétate d'éthyle:méthanol 93:7 en élution isocratique, 20 ml/min). Il en résulte 11 fractions, dont la fraction 9 qui contient les bistramides en référence (6000 au 8000ml, 22.3 g) (tous les volumes d'élution mentionnés dans ce procédé comprennent le volume mort de la colonne).
La fraction 9 est traitée par chromatographie liquide à haute pression (colonne Jones Chromatography 52 x 300 mm, silice 8 ~m, dichlorom~thane:m~thanol 95:5 en élution isocratique à 90 ml/min, détection UV 254 nm et RI, masse injectée 3g par cycle). Parmi les fractions obtenues, trois fractions sont ret~nl~es : n 1 (521 au 720ml, 1004 mg), n 2 (1261 au 2520 ml, 2992 mg) et n

3 (2521 au 3780 ml, 532 mg). La fraction intermédiaire 94/20503 ~1 ~ 7 7 6 0 PCTA~4/00~6 non retenue (721 au 1260 ml) correspond au bistramide A.
Le lot n 1 est purifié par CLHP (colonne Interchim 22 x 250 mm, silice lO ~m dichlorométhane:méthanol eau 96:3,9:0,1 à 10 ml/min, détection W 254 nm, bistramide L Tr=9min, puis colonne Biochrom 8 x 250 mm, C18 8 ~m ; acétonitrile: eau 60:40 à

4 ml/min, bistramide L Tr = 16 min), ce qui conduit à
171 mg de bistramide L.
Le lot n 2 est purifié par CLHP (colonne CEDI
52 x 300 mm, C18 15-25 ~m ; méthanol:eau 85:15 à 85 ml/min, détection RI, bistramide D Tr = 22 min) et fournit 1262 mg de bistramide D.
Le lot n 3 est purifié par CLHP (colonne Interchim 22 x 250 mm, C18 lO~m, méthanol:eau 85:15 à 10 ml/min, d~tection RI, bistramide K Tr = 19 min), ce qui conduit à 218 mg de bistramide K.
Les trois produits se présentent comme des solides amorphes non colorés. Ils peuvent être chromatographiés sur couche mince (silice, dichlorométhane:méthanol 90:10) et révélés par un réactif à base de vanilline (vanilline lg, acide sulfurigue pur 100 ml, pulvérisés sur la chromatographie, puis celle-ci est chauffée 10 minutes à 110C, bistramide L:bande brune à Rf = 0,45, bistramide D:bande mauve à Rf = 0,41, bistramide K:bande mauve à Rf = 0,28).

Les rendements, par rapport au poids de poudre sèche, sont de:bistramide D: 21,4.10-3%,bistramide K: 3,7.10-3%, bistramide L : 2,9.10-3%.
.

FORMULES BRUTES ET POIDS MOLECULAIRES

Bistramide D : C4oH7oN2o8~ PM 706 ; ion C40H68N27, PM = 688,5006 W094/20503 PCT~V4/00256 ~
~776~

Bistramide K : C40H70N2og~ PM 706 ; ion C4oH68N2o7 PM = 688,5022 5Bistramide L : C40H68N2o8~ PM 704,4968 FORMULES DEVELOPPEES

Les formules développées données plus haut ont lOété établies sur la base des données spectrales habituelles ( W, IR, RMN et spectrométrie de masse), et par comparaison avec celle du bistramide A comme décrit par Foster et al dans la référence précit~e.
On rapporte dans les tableaux 1 et 2 qui 15suivent les résultats de l'analyse par spe~Lc ~trie de masse concernant les bistramides D et K et par RMN pour les bistramides D, K et L.
Les mesures de ei (electronic impact) et de hrms (high resolution mass spe~L~- ?try) sont 20enregistrées sur un spectomètre Varian MAT 311 à 70 keV, avec un pouvoir de résolution de 1500.
Les mesures de fab (fast atomic bombardment) sont obtenues sur un appareil Kratos Concept II HH. Les échantillons sont dissous dans un thioglycérol et une 25petite goutte de la solution d'échantillon est placée sur la cible en cuivre de la sonde d'insertion directe fab.
L'échantillon est bombardé avec des atomes de xénon de 7 keV. Les ions produits sont accélérés sous 8 kV et les 94t20503 ~ 6 0 PCT~V4/00256 Tableau 1 Bistramide M+ ( expérimental) Formule M+ ( théorique) D 705 ( M-l, fab) C40H7oN2o8 706 K 705 (M-l, fab) C40H7oN2o8 706 D-H20 688,5006 C40H68N2o7688,5026 (ei-hrms,fab) K-H20 688,5022 C40H68N207688,5026 (ei-hrms,fab) 15 Les ions de masses les plus élevées observés pour le bistramide D et pour le bistramide K en spectrométrie de masse ei et fab positive représentent l'ion moléculaire moins H20. Toutefois les ions M-H sont observés pour les deux métabolites dans les spectres fab négatifs.
Les résultats obtenus pour le bistramide K
montrent qu'il s'agit d'un isomère du bistramide D.
Dans le tableau 2, on indique pour les bistramides D, K et L, les ~o~n~ec de l'analyse RMN. Les spectres sont obtenus en utilisant une sonde C-5 double lH et 13C dans un spectromètre Bruker AM 400 WB. Les bistramides purs sont dissous dans CDCl3 et les déplacements chimiques sont appréciés par rapport au tétraméthylsilane (TMS).
Pour les expérimentations sur lH~ les paramètres suivants ont été retenus : largeur spectrale 2994 Hz, largeur de l'impulsion 3,5 ~s (45), 16 balayages, et pour celles sur 13C : largeur spectrale 23809,5 Hz, largeur de l'impulsion 2,4 ~s (45), 1200 balayages.

Tableau 2 C Bistramide D Bis~l- Ide K Bistramide L
13C lH 13C 1H 13C 1H
(mult.) (JHH~Hz) (mult.) (J HH'HZ) (mult.) (JHH~ Hz) 1 17,59 1,65 17,62 1,65 16,04 2,05 ~
(q) (dd, 6,3; 1,4) (q)(dd, 6,4; 1,4) (q) (dd, 1,6; 7,1) ~.
2134,02 5,72 133,53 6,80 144,37 6,31 (d)(dqd, 15,7; 6,3; 1,0) (d)(15,3; 6,4; 1,0) (d) (dq, 11,4: 7,1) 3125,75 5,58 126,26 5,46 127,58 6,09 (d)(dd, 15,7; 6,3; 1,4) (d)(15,3; 6,4; 1,4) (d) (dq, 11,4; 1,5) 4 71,95 4,12 71,90 4,04 200,05 (s) -(d) (t, 6,3) (d) (6,4)

5 42,86 1,70 (m) 40,64 2,20 (m) 49,38 (t)2,47 (dd, 3,3; 17,2) (t) 1,55 (m) (t) 2,14 (m) 2,72 (dd, 8,5; 17,2)

6 69,39 3,87 127,68 5,43 64,70 (d) 4,10 (m) (d) (m) (d) (14,0; 7,0)

7 31,07 1,63 (m) 131,73 5,47 30,31 (t)1,30 (m), 1,63 (m) (t) 1,30 (m) (d) (14,0; 7,0)

8 26,43 1,64 (m) 36,662,13 (13,5; 1,65) 26,35 (t)1,26 (m), 1,55 (m) (t) 1,30 (m) (t)1,94 (13,5; 1,65)

9 32,96 1,93 (m) 38,40 1,58 33,16 (d) 1,72 (m)(d) (d) (m) o

10 16,85 0,83 14,40 0,88 16,92 (q)0,80 (d, 7, 0) (q) (d, 7,0) (q) (d, 6,9) _ _, . _ , . . . . . . ..

1174,22 4,22 (~) 71,43 3,88 74,60 (d) 4,02 (d) (d) (dt, 8,8; 4,2) (ddd, 1,8; 4,75; 11,7) 1233,12 2,68 36,66 2,31 (m) 32,40 (t) 2,70 (dd, 15,0; 11,8) (dd, 11,45; 15,1) (t) 2,18 (t) 2,30 (m) 2,09 (dd, 15,0; 0,5) (dd, 2,0; 15,1) 13172,33 - 173,64 - 173,42 (s) ( s ) 1443,80 3,48 (m) 43,39 3,32 44,51 (t) 3,44 (t) 3,29 (m) (t) (t, 5,6) 3,16 (dt, 5,9; 14,0) 1573,11 3,75 72,57 3,68 73,64 (d) 3,40 (m)(d, 1,9) (m) (d) (dt, 5,4, 5,6) 1643,19 2,35 (m) 43,31 2,33 43,29 (d) 2,31 (d) (d) (m) (dq 5,0; 7,1) ; c~
1715,76 1,21 15,45 1,18 15,34 (q) 1,18 (d, 7,1) . _~
(d, 8,0) (d, 7,0) (q) (d, 7,0) cn 18175,60 - 175,72 - 175,10 (s) (s) (s) 1939,36 3,25 (m) 39,40 3,24 (m) 39,39 (t) 3,21 (q, 6,8) (t) 3,15 (m) (t) 3,19 (m) 2025,59 1,70 (m) 25,56 1,78 (m) 25,68 (t) 1,47 (m), 1,74 (m) (t) 1,50 (m) (t) 1,50 (m) 2130,24 1,64 (m) 30,22 1,65 (m) 30,50 (t) 1,33 (m), 1,63 (m) (t) 1,27 (m)- (t) 1,31 (m) 22 74,17 3,13 74,16 3,12 74,17 (d) 3,08 (dt, 2,3: 9,6) ~o (d) (dt, 6,9; 2,0) (dt, 9,6; 2,1) 23 34,84 1,20 (m) 34,76 1,26 34,72 (d) 1,24 (m) (d) (d) (m) 24 17,95 0,78 17,91 0,78 17,87 (q) 0,74 (d, 6,5) (q) (d, 6,5) (q) (d, 6,5) 25 27,85 1,58 (m) 27,75 1,56 (m) 27,79 (t) 1,37 (m) (t) 1,45 (m) (t) 1,42 (m) 26 36,09 1,61 (m) 35,98 1,60 (m) 35,98 (t) 1,44 (m), 1,56 (m) ~~
(t) 1,47 (m) (t) 1,43 (m) 27 95,50 - 95,48 - 95,36 (s) ( s) (s) 28 35,41 1,53 (m) 35,30 1,53 (m) 35,35 (t) 1,31 (m), 1,52 (m) o (t) 1,31 (m) (t) 1,35 (m) 29 19,22 1,75 (m) 19,14 1,76 (m) 19,09 (t) 1,48 (m), 1,74 (m) (t) 1,50 (m) (t) 1,52 (m) 30 31,24 1,55 (m) 31,17 1,49 (m) 31,22 (t) 1,05 (m), 1,47 (m) (d) 1,12 (m) (t) 1,22 (m) 31 69,13 3,35 (m) 68,98 3,40 68,96 (d) 3,37 (m) (d) (d) (bt) 32 34,01 1,29 (m) 33,87 1,40 (m) 33,96 (t) 1,23 (m), 1,36 (m) (t) 1,42 (m) (t) 1,25 (m) 33 33,48 1,40 (m) 33,35 1,35 (m) 33,37 (t) 1,28 (m) 8 (t) 1,30 (m) (t) 1,30 (m) 34 31,82 2,32 (m) 31,65 2,31 31,73 (d) 2,31 (m) (d) (m) . _ . . . .
.

20,89 0,95 20,83 0,91 20,85 (q) 0,88 (d, 6,6) ~o (q) (d, 6,8) (q) (d, 4,7) 36 131,14 5,20 131,13 5,15 131,17 (d) 5,11 (d) (d, 9,3) (d) (d, 9,40) (d quint, 9,4, 1,1) 37 137,15 - 137,04 - 137,11 (s) (s) (s) 3U 11,95 1,57 11,81 1,58 11,66 (q) 1,55 (d, 1,4) (q) (fd, 1,3) (q) (fd, 1,3) 39 73,224,16 (m) 73,03 4,15 73,09 (d) 4,05 (m) (d) (d) (q, 6,4) 21,78 1,25 21,74 1,21 21,69 (q) 1,18 (d, 6,5) (q) (d, 6,3) (q) (d, 6,3) Nll 7,05 7,12 7,44 (bt, 6,1) l3ll~ (bt, 5,9) (bt, 6,5) _~
NH 6,75 6,80 6,89 (bt, 5,8) ~
I~/l9 (bt, 5,5) (bt, 5,6) -Ol~ n.o n.o n.o.

OH - n.o

11 OH 4,62 4,88 4,60 (large) OH n.o. 2,85 3,65 (lar~e) o W094/20503 PCT~V4/00~6 ~
~577~ 22 ~x~pl~ ? : Obtention de prochlorons à partir de colonies de T., h; ~:tr~tll~

Les ascidies sont détachées de leur support, soigneusement lavées à grande eau pour les débarasser de la vase et des autres débris. Elles sont égouttées, ouvertes une à une au couteau, pressées à la main, puis m~C~n; quement dans un bain d'eau de mer. La suspension dans l'eau de mer est filtrée sur des tamis de plus en plus fins (123, 63, 40, lO et 5 ~m). Les prochlorons sont retenus par le tamis de lO ,um. Le résidu d'algues est congelé, lyophilisé et extrait au dichlorométhane.
L'obtention des bistramides à partir de cet extrait se fait selon le même procédé qu'à partir de l'extrait des ascidies entières.

~xP~pl e 3 : Préparation du bistramide D par réduction du bistramide A.
Une solution de 50 mg (0,07 mmoles) de bistramide A dans 3 ml de THF est refroidie dans un bain de glace. Le bistramide A est obtenu en opérant selon Gouiffes et al. dans Toxicon, 1988, tome 26, pages 1129-1136.
On ajoute 13 mg (0,35 mmoles) de borohydrure de sodium. Après 2 heures d'agitation à température ambiante, le brut réactionnel est versé dans 5 ml d'eau +
glace, puis extrait par deux fois avec 5 ml d'acétate d'éthyle. Après sèchage sur MgSO4, le solvant est évaporé
et le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de silice éluée par un mélange de dichlorométhane méthanol (95 : 5).
Les premières fractions contiennent l'épimère du bistramide D (16 mg ; 32 ~). Le bistramide D (18 mg ;
36 ~) est ensuite récupéré. Le rendement total en produits réduits est de 68 ~.

~ 94/20503 215 7 7 6 ~ PCTn~V4/00256 En variante, on opère comme indiqué ci-dessus, mais en remplaçant le borohydure de sodium par du borohydure de potassium. Le rendement total en produits réduits est de 72 %.
Selon encore une autre variante, on dissout 53 mg (0,07 mmoles) de bistramide A dans 3 ml de méthanol contenant 10 % d'acide acétique. Après refroidissement de la solution dans un bain de glace, on ajoute 13 mg (0,21 mmoles) de cyanoborohydure de potassium. Après 4 heures d'agitation sous atmosphère inerte, le melange réactionnel est versé dans 5 ml d'eau + glace, puis extrait par deux fois avec 5 ml d'acétate d'éthyle. Après séchage sur MgSO4, le solvant est évaporé et le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de silice éluée par un mélange de dichlorométhane : méthanol (95:5)-L'épimère du bistramide D est élué le premier (18 mg , 34 %), puis le bistramide D est récupéré (21 mg ; 39 %). Le rendement total en produits réduits est de 78 %.

~xempl~ 4 : Etude des effets pharmacodynamiques des bistramides D, K, et L in v;tro et ;n vivo . Effets ;n v;tro On rapporte ci-après les résultats des cytoxicités exprimées en CIso en ~g/ml (concentration correspondant à une inhibition de 50 % de la croissance des cellules) sur 6 lignées tumorales à savoir KB, P388, P388/dox (résistant à la doxorubicine), B16 et H429 et NSCLC-N6, qui sont des cellules humaines de carcinome broncho-pl~lmonA;re du type "non à petites cellules".
Les déterminations ont été effectuées selon le protocole donné dans CAnc~r Chemother. Pharmacol. (1991) 28:283-292 par Roussakis et al.

W094/20503 PCT~4/00256 ~

Bistramide D Bistramide K Bistramide L
KB lO,OO > lO 0,72 P388s 0,36 0,57 0,48 p388r 5,82 > lO 0,12 B16 O,lO 1,9O 2,4 HT 29 2,76 5,60 0,29 NSCLC.N6-L16 3,43 3,23 0,12 L'effet cytostatique des produits au niveau du cycle cellulaire a été également étudié par cytofluorimétrie.
La technique utilisée correspond à celle rapportée par Roussakis et al. dans la référence ci-dessus.
On constate un effet antiprolifératif des produits lié à un blocage irréversible en phase G1, entraînant la mort des cellules tumorales bronchopulmonaires "non à petites cellules" (NSCLC-N6).
Ce blocage en phase Gl est suivi d'un passage en phase GlDT, qui caractérise l'état de la différenciation terminale. Les cellules qui atteignent cette phase GlDT produisent une substance intracytoplasmique, antiproliférative, de nature protéique, qui est le produit de l'expression d'un gène spécifique, lequel joue probablement le role d'un anti-oncogène.
Lorsque les cellules NSCLC-N6 sont induites à
la différenciation terminale sous l'effet des bistramides de l'invention, on observe en effet, in vitro, l'inhibition de l'expression de l'oncogène erb-b2, habituellement exprimé par le modèle expérimental utilisé, et de son produit d'expression, l'oncoprotéine c-erb-b2.

94/20503 ~ 5 ~ ~ ~ Q PCTn~94/00256 . Effets ;n v;vo L'activité antitumorale des produits de l'invention a été étudiée à l'encontre de tumeurs solides de type NSCLC greffées chez la souris nude (D. Riou, C.
Roussakis, J.F. Biard, J.F. Verbist : "Comparative study of antitumor activity of bistramides A, D and K against a non-small cell bronchopulmonary car~;no~", Antir.Anc~r Research, 1993, 13, 2321-2334). Chaque souris a recu 0,2 ml d'une solution cellulaire obtenue par dispersion mécanique d'environ 1 g de tumeur de souris excisée dans 4,8 ml d'une solution saline stérile. Les tumeurs greffées en sous-cutanée ont été mesurées sur leur grande longueur L et leur petite longueur 1. Le volume tumoral a été évalué d'après la formule Vt=Lx12/2. La croissance tumorale au jour j a été calculée par la formule Vtj/Vtjo pour chaque souris, Vt~o étant le volume tumoral au début du traitement. La figure unique montre les courbes de croissance tumorale en fonction du temps (jours) obt~n~l~s avec ou sans traitement par les bistramides.

La courbe " ~ se rapporte à
l'expérience témoin, les courbes "---~---", " --~ --" et " --~--" aux expériences avec respectivement lO, 20 et 5 mg/kg de bistramide D et la courbe "----*----" à une expérience avec lO mg/kg de bistramide K. Chaque point est la moyenne des croissances tumorales de 6 souris.
Dans ces expériences, le bistramide K est injecté à raison de lO mg/kg par voie intrapéritonéale, pendant 16 jours, et le bistramide D à raison de 5 mg/kg par voie intrapéritonéale quotidi~n~nt pendant 16 jours ; à lO mg/ kg par voie intraveineuse aux jours 1, 5, 9, 14, et à 20 mg/kg par voie intraveineuse aux jours 1, 5, 9, 14.

W094/20503 PCT~4/00256 ~
2~7~ 26 L'~x~m~n de ces courbes montre que par rapport aux témoins (100 %), la croissance tumorale s'établi-c, au bout de 30 jours, pour les animaux traités, à :

bistramide D (5 mg/kg, IP) :100 %
(10 mg/kg, IV) :76 %
(20 mg/kg, IV) :53 %

bistramide K (10 mg/kg, IP) :49 On notera que le bistramide A, utilisé dans les conditions rapportées ci-dessus, est trop toxique pour qu'un effet anti-tumoral puisse être observé.
~x~mple 5 : Prépraration d'une solution injectable de bistramide D.

On dissout 2 g de bistramide D dans lOOO ml de soluté physiologique apyrogène. La solution obtenue est répartie, dans des conditions aseptiques, dans des ampoules de lO ml, contenant 20 mg de produit par ampoule.

Ex~mp~e 6 : Activité anti-parasitaire des bistramides de l'invention.
On rapporte les résultats d'expériences réalisés sur un modèle in v;vo en utilisant pl ~m~ m v~ncke; petter;, espèce plasmodiale de rongeur entretenue sur souris blanches femelles, qui présente l'intérêt d'une synchronisation parfaite du cycle endo-érythrocytaire.

1. les rongeurs les animaux utilisés sont des souris bl~nche~
femelles, SWISS (IFFA CREDO) pesant environ 30 grammes.
Le nombre de souris, réparties par lot est de cinq.

~ g4~20s03 2 1 ~ 7 7 ~ ~ ~/FR94/00256 2. la souche L'espèce Pl~ ~ vinrk~i p~tt~ri utilisée provient de la souche 279 BY, (voir article Cambie G et al dans CR.Acad.Sci.PARIS 310,série III,183-188). Ce plasmodie réalise un cycle schizogonique en 24h, de façon synchrone. Par la technique de congélation-décongélation de sang infecté, seul le stade mérozoïte résiste, les autres formes étant détruites.
Si l'injection des mérozoites a lieu à Oh, on observe sucessivement comme stade pr~o~inant :
- A 3h le stade anneau (A) - A 6h le stade trophozoïte jeune (TJ) - A 12h le stade trophozoïte moyen (TM) - A 18h le stade trophozoite âgé (TA) La maturation du parasite dans l'hématie, du stade anneau au stade trophozoite âgé correspond à la phase Gl du cycle cellulaire.
Cette phase est suivie par la multiplication du parasite, phases S et M du cycle cellulaire.
Le stade schizonte correspond à l'éclatement et à la libération des mérozoites.
L'observation des parasites sanguins se fait sur frottis colorés réalisés en prélevant une goutte de sang à la queue. Les frottis sont ensuite colorés au May-Grumwald-Giemsa. Le calcul de la parasitémie (nombre de parasites pour lOO hématies) se fait sur frottis.
Les études entreprises nécessitent la constitution d'un stock de sang parasité conservé à -70C dans l'azote liquide. Les souris infestées sont prélevées au sinus rétro-orbitaire à l'aide d'une pipette pasteur héparinée. Une solution de glycérol à lO~ est ajoutée volume à volume au sang parasité. Le sang est ensuite réparti dans des tubes à congélation à raison de 0,5 ml par tube.

W094/20503 PCT~94/00256 ~
2~776~

3. injection du bistramide On utilise, dans ces essais, le bistramide D
dans de l'eau physiologique stérile contenant 5% de DMSO.
Ce produit est injecté par voie sous-cutanée au niveau de la cuisse.

4. Mise en évidence de l'activité

A/ Te~t ~ P~T~R~ ;
Pour vérifier l'activité du composé étudié, on applique le test de PETERS qui constitue la référence pour le criblage de molécules à activité antimalarique.
(PETERS W..1980. Chemoterapy and Drug resistance in Malaria vol II Academic Press).
Après 4 jours de traitement, on compare le pourcentage d'hématies parasitées sur frottis mince entre le lot témoin et le lot traité. On établit de cette façon un pourcentage d'inhibition.

- M~tho~olo~; e a) injection de 107 hématies parasitées par voie I.P. (Jo) b) injection du Bistramide D à 15 mg/kg/jour, pendant 4 jours en sous-cutané (JO,Jl,J2,J3) c) contrôle sur frottis de la parasitémie à J4 ~t~ :
. essai A :
- témoins à J4 : parasitémie 4%
- lot traité à J4 : parasitémie 0,64%
soit 84% d'inhibition . essai B :
- témoins à J4 : parasitémie 4%
- lot traité à J4 : parasitémie 0,50%
soit 87% d'inhibition . essai C :

~ 94/20503 2 1 5 7 7 6 3 PCT~4/00~6 ,:

- témoins à J4 : parasitémie 1,20~
- lot traité à J4 : parasitémie 0,~3%
soit 81% d'inhibition L'ex~ ~n des résultats obtenus dans les trois essals ci-dessus, montre une inhibition moyenne de 84 lorsqu'on administre un bistramide selon l'invention.

B/ RTU~ DU sTAn~ PA~A~TTAT~ TRr~ AUX
RT~::TRAMTDF~;
Pour apprécier le ou les stades parasitaires les plus sensibles à l'action des bistramides de l'invention, on a étudié l'effet de ces bistramides sur chaque stade parasitaire pr~s~inAnt durant le cycle cellulaire d'une espèce de Plasmodium donné.
Les résultats donnés ci-après concernent l'effet du bistramide D sur les stades parasitaires de pl ~cm~ m v; n~.k~; p~tt~r1.
- ~IP,tho~lol O~J; ~0, Après infestation des souris, on constitue cinq lots de cinq souris. Chaque lot est traité par une dose de 15 mg/kg de bistramide D au moment où pr~o~;nPnt l'un des stades.
On dispose donc, en plus, du lot témoin, d'un lot mérozoïtes, d'un lot anneaux, d'un lot trophozoites jeunes, d'un lot trophozoïtes moyens et d'un lot trophozoïtes âgés.
On évalue le retard de parasitémie ou période patente comme le temps en jours nécessaire pour que la parasitémie atteigne 1%.

~t~ :
. lot témoin 5 J
. lot mérozoïtes 5 J
. lot anneaux 5,4 J
. lot trophozoïtes jeunes 5,6 J

W094/20503 PCT~4l00256 _ i 2~57;760^

. lot trophozo~tes moyens 6,25 J
. lot trophozoïtes âgés 6,2 J
Le test statistique de KRUSKAL-WALLIS
unilatéral (BMDP, Statistical software manual 1990, vol.1, Ed WJ DIXON U. of Californy Press) met en évidence une différence significative (p<O,OO1) entre le lot témoin et les lots trophozo~tes moyens et âgés.
On observe donc une activité sélective du bistramide D sur les stades trophozoïtes moyens et âgés.
D'après une étude préliminaire en cytométrie en flux, des hématies murines parasitées par l'espèce p~ lm v;nck~; petter; montrent, en présence de bistramide D, un blocage partiel du parasite au stade de sa maturation. Ceci a pour conséquence un arrêt de la prolifération parasitaire au stade trophozoïte moyen et âgé.
Ce blocage, qui correspond à la phase Gl du cycle cellulaire, est dose-dépendant, et est probablement lié à une maturation atypique du parasite.

C/ COI~lPp~l~ATSON ~F.!~:; SC~F.~ THFF<ApFuTIouF!:;
MONODO!:;F FT MuT TTnO~F
L'objectif est de suivre au quotidien la parasitémie et d'évaluer l'inhibition de la parasitémie selon le schéma thérapeutique adopté pour un traitement.
On met en évidence les modifications morphologiques du parasite par la formule parasitaire, le calcul de la formule parasitaire se fait également sur frottis et permet d'évaluer la proportion de chaque stade : anneau, trophozoïte jeune, trophozo~te moyen, trophozo~te âgé
pour 100 hématies.
La méthodologie appliquée est la suivante :
a) après infestation, on constitue trois lots de cinq souris, à savoir - un lot témoin, à JO, ~ 94/205~ 2 1 5 7 ~ ~ 3 ~ PCT~R94/00256 - un lot dit monodose, pour lequel une seule injection de bistramide D (15mg/kg), à JO, est effectuée sur la souris - un lot dit multidose, ou l'injection de bistramide D est effectuée en ~m;n;strant cinq doses respectivement à JO,Jl,J2,J3,J4 (dose totale 15mg/kg) b) la confection et la lecture des frottis sont effectuées tous les jours pendant 21 jours.
On a déterminé pour chaque lot le pourcentage de parasitémie et le pourcentage d'inhibition du développement du parasite.
Les résultats obtenus sont donnés dans les tableaux 1 et 2.

W094/20503 ;- PCT~4/00256 ~
21~77'~0 Tableau 1 Jour Témoins Monodose Multidoses J0 - _ _ J1 - _ _ J3 0,33 0,16 0,12 J4 1,2 0,80 0,2 J5 5,5 3,5 1,6 J7 50 64 7,4 Tableau 2 Jour Monodose Multidoses J3 51,5 63,6 J4 33,3 83,3 J5 36,3 70,9 J7 0 85,2 J8 16,4 0 J9 12,5 0 Les formules parasitaires dans chacun des lots sont données à J5 et à J7 dans le tableau 3.

~ 94/20503 2 1 ~ 7 7 ~ ~ PCTn~94/002S6 Tableau 3 Stade Témoin MonodoseMultidose A 72,5% 58% 40%47% 25~ 7%
TJ 17,5% 17% 37~31% 28% O~
TM 7% 15~ 14%14% 40% O%
TA 3~ 10% 9% 6% 7% 93%

L'ensemble de ces résultats met en évidence une différence très notable à J7 où la parasitémie du lot multidose est dix fois moins élevé par rapport au lot témoin (le pourcentage d'inhibition est de 85%).
Le parasite se trouve essentiellement sous forme trophozoïte âgé (93%) dans le lot multidose et sous forme anneau dans le lot témoin.
Le parasite apparait donc bloqué au stade trophozoïte âgé.
A partir de J8, la parasitémie entre les deux lots est comparable, le Plasmodium n'étant appare~ment plus sous l'effet du bistramide D.
La dernière injection de la drogue dans ce lot multidose a été effectué à J4, la durée d'action du bistramide D est d'environ 3 jours. Cela semble être confirmé avec le lot monodose : A J4 (trois jours après l'injection de bistramide D) on n'observe pas de différence entre la parasitémie du lot témoin et celle du lot monodose.

Claims

REVENDICATIONS

1. Dérivés de bistramides biologiquement actifs, caractérisés en ce que - ils sont capables d'exercer in vivo une activité antitumorale entraînant la différenciation des cellules tumorales, avec inhibition de l'expression de l'oncogène erb-2 normalement exprimé par les cellules des lignées bronchopulmonaires non à petites cellules, - leur DL50 est supérieure à 30 mg/kg, voire 160 mg/kg ou plus, et - ils répondent à la formule (I) (I) dans laquelle -R1, X, Y et R2, identiques ou différents les uns des autres, représentent une chaîne hydrocarbonée de 1 à 20 atomes de carbone, saturée ou insaturée, substituée par au moins un groupe -OH et/ou une fonction cétone, comportant, le cas échéant, au moins un cycle , ce cycle pouvant comporter une ou plusieurs insaturations, -R3, R4 et R5, identiques ou differents les uns des autres, sont choisis parmi l'hydrogène, les radicaux alcoyle ou alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone, un groupe -COOH, -OH, -NH2 ou -NO2, ou un atome d'halogène, les groupes -OH et -COOH des substituants étant le cas échéant, respectivement, sous forme d'éthers ou d'esters, étant entendu que, lorsque R3 et R4 représentent chacun un atome d'hydrogène, R1 et R2 ne représentent pas respectivement de chaînes et (CH3,OH) CH - C(CH3)=

et (CH3, OH) CH - C (CH3) =

ou encore, et CH3 - CO - C (CH3) =

2. Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont capables d'exercer une activité
cytostatique vis-à-vis de parasites.
3. Dérivés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que R1 comporte de 1 à 15 atomes de carbone.
4. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que R1 comporte 1 ou 2 doubles liaisons éthyléniques.
5. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que R2 comporte de 6 à 10 atomes de carbone, notamment 8 ou 9 et, avantageusement une double liaison éthylénique.
6. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que X et Y comportent de 2 à 8 atomes de carbone, notamment de 2 à 6 atomes de carbone, en particulier de 3 à 5.
7. Dérivés selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que R3 et R5 représentent un radical alcoyle ou alcoxy, notamment de 1 à 4 atomes de carbone, et R4 un atome d'hydrogène.

8. Le bistramide K de formule (IV) (IV) 9. Le bistramide D de formule (II) (II) 10. Le bistramide L de formule (III) (III) 11. Dérivés de bistramides selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisés en ce qu'il s'agit de formes énantiomères ou diastéréoisomères.
12. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité efficace d'au moins un bistramide selon l'une des revendications 1 à 11, en association avec un véhicule pharmaceutique.
13. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles sont administrables par voie orale ou injectable.
14. Compositions pharmaceutiques selon la revendica-tion 13, caractérisées en ce qu'il s'agit de tablettes, comprimés, gélules, pilules et qu'elles renferment de 10 à 100 mg de principe actif par unité de prise, de préférence de 40 à 60 mg.
15. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement par unité de prise de 10 à 50 mg de principe actif, de préférence de 15 à 30 mg.
16. Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 12 à 15, utilisées comme médicaments anti-tumoraux, en particulier pour le traitement de tumeurs solides.
17. Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 12 à 15, utilisées comme médicaments anti-parasitaires, en particulier pour le traitement du paludisme ou des leishmanioses.
18. Utilisation des bistramides selon l'une des revendications 1 à 11, pour l'élaboration de médicaments antiparasitaires, en particulier de médicaments destinés au traitement du paludisme ou des leishmanioses.
l9. Procédé d'obtention de bistramides selon l'une des revendications 1 à 11 par extraction à partir de L.
bistratum, et/ou de ses prochlorons symbiotes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de - chromatographie liquide basse pression de l'extrait organique sec pour éliminer au moins la majeure partie des impuretés ayant une polarité supérieure ou inférieure à celles des produits recherchés.
- chromatographie liquide haute pression des fractions riches en bistramides, de manière à obtenir des fractions enrichies en un bistramide donné, et avantageusement - purification de ces fractions par chromatographie liquide haute pression pour isoler sélectivement un bistramide donné, les deux premiers fractionnements étant avantageu-sement réalisés sur des colonnes de silice en utilisant des solvants du type de l'acétate d'éthyle, dichlorométhane, avantageusement additionnés de méthanol, et l'étape de purification finale des fractions, en utilisant de l'eau avec des solvants du type du méthanol, du dichlorométhane ou de l'acétonitrile.
20. Procédé d'obtention du bistramide D selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction du bistramide A avec un agent réducteur afin d'hydroxyler la fonction cétone .alpha., .beta.-insaturée en position 4.