CA2039178A1 - Reactifs et methodes immunochimiques pour la mesure de la croissance de microorganismes et de la quantite de proteines au cours d'une fermentation industrielle - Google Patents
Reactifs et methodes immunochimiques pour la mesure de la croissance de microorganismes et de la quantite de proteines au cours d'une fermentation industrielleInfo
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Abstract
L'invention est relative à des réactifs de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une préparation d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, obtenue en utilisant comme immunogène une préparation purifiée d'un antigène protéique issu de microorganismes, dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré d'évolution du processus de fermentation. L'invention englobe également un procédé immunochimique de détermination de l'évolution d'un processus de fermentation, ainsi que des préparations d'antigènes permettant d'obtenir les réactifs conformes à l'invention et des kits comprenant lesdits réactifs.
Description
2~3~3 ~1~
REACTIFS ET METHODES IMMnNOCHIMIQUES POUR LA
MES~RE DE LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES ET DE LA
QUANTITE DE PROTEINES AU COURS D'UNE FERUENTATION
INDUSTRIELLE ~ _ La présente invention est relative à des réac-tifs immunochimiques permettant de suivre l'évolution de processus de fermentation, à un procédé utilisant lesdits réactifs, ainsi qu'à des préparations purifiées d'antigènes permettant l'obtention desdits réactifs, et à
un kit de dosage contenant lesdits réactifs.
Actuellement, les fermentations industrielles prennent de plus en plus d'importance, en particulier dans les industries laitières (fabrication de yaourts et fromages, etc.), les industries de la bière, du vin, du saucisson et de la choucroute.
Les fermentations industrielles sont souvent des processus complexes où interviennent, successivement ou simultanément, différentes souches de microorganismes.
Les interactions et l'équilibre entre ces souches régis-sent pour une grande part l'évolution de la fermentation et les qualités des produits qui en résultent. Il est donc important de pouvoir suivre l'évolution des diffé-rentes populations de microorganismes et de leur activité
biologique au cours des fermentations.
Pour ce faire, différentes approches expéri-mentales, utilisant des methodes microbiologiques ou bio-chimiques, ont été développées. Les méthodes microbio-logiques consistent soit à observer directement au micro-scope un échantillon pris dans le milieu fermentaire,soit à ensemencer une dilution dudit milieu de culture sur des milieux gélosés, éventuellement sélectifs, pour procéder à un dénombrement des colonies des différentes espèces et souches de microorganismes [BOQUIEN et al., (1988) Applied Environmental Microbiology, 54, 2527-2531]. Les méthodes biochimiques consistent à mesurer les produits de fermentation, soit directement (C02, f~ ~i [SPINNLER et al, 1987, Appl. ~Sicrobiol. Biotechnol.,25, 464-470], alcool, sucres,...), soit indirectement (par - exemple la mesure du pH sert d'indicateur de la produc-tion d'acide lactique). BOQUIEN et al (Applied Microbiol.
Biotechnol., 1989, 30, 402-407) ont montré qu'11 est aussi possible de mesurer l'activité de certaines enzymes bactériennes (aminopeptidase, ~-galactosidase).
Cependant ces méthodes présentent des inconvé-nients. L'observation directe ne permet pas la distinc-tion entre des souches ou espèces de morphologievoisine ; l'ensemencement sur milieux gélosés donne des résultats tardifs, ce qui ne permet pas d'intervenir rapidement si une anomalie de la population bactérienne est décelée. La mesure du pH ne donne des renseignements que sur l'évolution de la population globale de microorganismes, et ne permet pas de suivre le devenir d'une population déterminée en culture mixte (cas le plus fréquent en fermentation industrielle). D'autres méthodes biochimiques, qui ont l'avantage de permettre de suivre précisément et en temps réel l'évolution de la fermen-tation, nécessitent des appareils coûteux (par exemple des chromatographes). La mesure de l'activité enzymatique est également une méthode relativement lourde.
Il est donc particulièrement souhaitable de disposer de méthodes simples à mettre en oeuvre, permet-tant une détermination rapide et fiable de la population globale de microorganismes, d'une part, et de l'état de chacune des espèces et souches coexistant dans la masse fermentaire, d'autre part. Les Inventeurs se sont proposé
d'adapter dans ce but des méthodes immunochimiques.
L'immunochimie a été développée en agro-alimentaire, par exemple:
- pour identifier les composants du lait. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre les caséines [OTANI et al., 1987, Agric.Biol.Chem, ~1, 2049-2054] la ~-globuline, l'a-lactalbumine [BECK et al., 1977, J.Dairy Sci., 60, 542--545] et la lactoferrine.
- - pour détecter le développement de bactéries indésirables car modifiant les caractères organoleptiques du produit (Pseudomonas, Clostridium tyrobutyricum [BERGERE et al., 1987, Sci. Aliments,7, 89-98]. Ces études ont été faites avec des antigènes de paroi ou de structure, parfois avec des protéines enzymatiques (protéinase de Pseudomonas) [BIRKELAND et al., 1985, Appl. Environ.Microbiol.,49, 382-387 ]
- pour détecter la présence de bactéries pou-vant jouer un rôle pathoqène pour l'homme [Listeria, Staphylococcus, (FREED et al., 1987, Appl. Environ.
Microbiol., 44, 1349-1355), Salmonella etc.].
- pour identifier les bactéries lactiques et étudier leur physiologie. Il a par exemple été montré
qu'un antigène de paroi de Lactobacillus lactis peut être reconnu par des anticorps polyclonaux [BAER et al., 1987, Schweiz.Milchw.Forschung,16, 84-88]. Bien qu'une corrélation existe entre la quantité de cet antigène et la population bactérienne, ledit antigène ne permet pas le suivi, en temps r~el, de cette population bactérienne, car son évolution suit, celle de ladite population, avec un retard de 10 heures environ.En outre cette corrélation n'est observée qu'en culture pure.
Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre différentes enzymes de bactéries lactiques : protéinase [LAAN et al., 1988, Appl. Environ.
Microbiol., 54, 2250-2256 ; AKUZAWA et al., 1985, Agric.
Biol.Chem.,49, 197-199], dipeptidase [VAN BOVEN et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol.,54,43-49; KONINGS et al., 1988, Demande de Brevet Européen 286 171.], lactate déshydrogénase [GASSER et al., 1971, J.Bact., 106, 113-125].
Toutefois, jusqu'à présent, aucune méthode de dosage immunochimique permettant le sulvi d'un processus de fermentation, en particulier en culture mixte, n'a été
- proposée. En effet, la mise au point d'une telle méthode implique l'obtention de réactifs, anticorps et antigènes, répondant à des critères bien précis : il convient tout d'abord de choisir des antigènes dont la quantité dans la masse fermentaire est en corrélation directe avec la population d'au moins une espèce ou une souche de microorganismes ; de préférence, il s'agit d'antigènes associés à des constituants des microorganismes interve-nant dans le processus fermentaire, par exemple des enzymes impliquées dans la fermentation ; il convient en outre que la réaction antigène/anticorps qui permet le dosage puisse être effectuée directement sur un échantil-lon prélevé dans le mélange complexe que constitue lamasse fermentaire, sans que la sensibilité et la spécifi-cité de cette réaction soient perturbées par d'autres constituants de ce mélange.
Des anticorps de sp~cificité plus ou moins étroite peuvent être utilisés, ce qui permet d'obtenir à
la fois des informations concernant l'évolution globale de la population de microorganismes, et des informations concernant l'évolution d'une sous-population, par exemple une souche déterminée. Toutefois, la spécificité de cha-cun des anticorps utilisés doit être bien définie, afind'éviter que les mesures ne soient faussées par des réac-tions croisées imprévisibles avec d'autres antigènes sus-ceptibles d'être présents dans la masse fermentaire.
La présente invention a pour but de pourvoir à
des réactifs immunochimiques qui permettent d'identifier et de doser une ou plusieurs protéines de microorganismes impliqués dans la fermentation, en particulier des pro-téines à activité enzymatique et d'établir une corréla-tion entre la quantité de protéines mesurée et la crois-sance des microorganismes et/ou l'activité enzymatique, ~9~
de façon à permettre une meilleure appréciation et uneamélioration des conditlons de fermentation.
- La présente invention a également pour but de pourvoir à une technique immunochimique quantitative per-mettant la mesure de la croissance et de l'activité des microorganismes (bactéries, levures, champignons) au sein de cultures industrielles fermentaires (lait, bière, vin, choucroute, saucisson, pain), en particulier de cultures mixtes.
Les inventeurs ont donc mis au point des ré-actifs et une méthode immunochimique permettant de quan-tifier une ou plusieurs protéines importantes en fermen-tation, et pour lesquelles il existe une corrélation, entre la production de ces protéines, d'une part, et la population de microorganismes et/ou les caractéristiques du produit de fermentation obtenu, d'autre part.
La présente invention a pour objet un réactif de dosage immunochimique pour la détermination du degré
d'évolution d'un processus de fermentation, lequel réac-tif est caractérisé en ce qu'il comprend au moins unepréparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, obte-nue en utilisant comme immunogène une préparation puri-fiée d'une enzyme intervenant dans le processus de fer-mentation, et dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré d'évolution dudit processus.
Le Tableau (I) ci-dessous indique plusieurs enzymes pouvant convenir à l'obtention de ladite prépara-tion.
_ .
.
h !~ 3 ~
TABLEAU I
- ENZYMES DU METABOLISME DU LACTOSE
- D-lactate déshydrogénase - L-lactate déshydrogénase - ~-galactosidase - P-B-galactosidase ______________________________________________ ENZYMES DU METABOLISME PROTEIQUE
- protéinase de paroi - peptidases ENZYMES DU METABOLISME DU CITRATE
- diacétyle réductase - acétoïne réductase - citrate lyase ENZYMES DU METABOLISME DE L'ARGININE
- arginine déimlnase - ---_______________________ ENZYMES DU METABOLISME DES LIPIDES
- estérase ______________________________________________ AUTRES ENZYMES
- - uréase ( Streptococcus thermophilus) - thréonine aldolase (L.bulgaricus) Lors de travaux précédents, les inventeurs ont mis en évidence, chez Lactococcus lactis subsp. cremoris, certaines activités enzymatiques qui sont en corrélation directe avec la population de microorganismes [BOQUIEN et al; Le Lait (1989) 69, 71-81 et BOQUIEN et al (Applied Microbiology Biotechnology, 1989, 30, 402-407)] ; il s'agit de l'aminopeptidase, de la citrate lyase, et de l'a-galactosidase ; toutefois, comme de nombreuses
REACTIFS ET METHODES IMMnNOCHIMIQUES POUR LA
MES~RE DE LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES ET DE LA
QUANTITE DE PROTEINES AU COURS D'UNE FERUENTATION
INDUSTRIELLE ~ _ La présente invention est relative à des réac-tifs immunochimiques permettant de suivre l'évolution de processus de fermentation, à un procédé utilisant lesdits réactifs, ainsi qu'à des préparations purifiées d'antigènes permettant l'obtention desdits réactifs, et à
un kit de dosage contenant lesdits réactifs.
Actuellement, les fermentations industrielles prennent de plus en plus d'importance, en particulier dans les industries laitières (fabrication de yaourts et fromages, etc.), les industries de la bière, du vin, du saucisson et de la choucroute.
Les fermentations industrielles sont souvent des processus complexes où interviennent, successivement ou simultanément, différentes souches de microorganismes.
Les interactions et l'équilibre entre ces souches régis-sent pour une grande part l'évolution de la fermentation et les qualités des produits qui en résultent. Il est donc important de pouvoir suivre l'évolution des diffé-rentes populations de microorganismes et de leur activité
biologique au cours des fermentations.
Pour ce faire, différentes approches expéri-mentales, utilisant des methodes microbiologiques ou bio-chimiques, ont été développées. Les méthodes microbio-logiques consistent soit à observer directement au micro-scope un échantillon pris dans le milieu fermentaire,soit à ensemencer une dilution dudit milieu de culture sur des milieux gélosés, éventuellement sélectifs, pour procéder à un dénombrement des colonies des différentes espèces et souches de microorganismes [BOQUIEN et al., (1988) Applied Environmental Microbiology, 54, 2527-2531]. Les méthodes biochimiques consistent à mesurer les produits de fermentation, soit directement (C02, f~ ~i [SPINNLER et al, 1987, Appl. ~Sicrobiol. Biotechnol.,25, 464-470], alcool, sucres,...), soit indirectement (par - exemple la mesure du pH sert d'indicateur de la produc-tion d'acide lactique). BOQUIEN et al (Applied Microbiol.
Biotechnol., 1989, 30, 402-407) ont montré qu'11 est aussi possible de mesurer l'activité de certaines enzymes bactériennes (aminopeptidase, ~-galactosidase).
Cependant ces méthodes présentent des inconvé-nients. L'observation directe ne permet pas la distinc-tion entre des souches ou espèces de morphologievoisine ; l'ensemencement sur milieux gélosés donne des résultats tardifs, ce qui ne permet pas d'intervenir rapidement si une anomalie de la population bactérienne est décelée. La mesure du pH ne donne des renseignements que sur l'évolution de la population globale de microorganismes, et ne permet pas de suivre le devenir d'une population déterminée en culture mixte (cas le plus fréquent en fermentation industrielle). D'autres méthodes biochimiques, qui ont l'avantage de permettre de suivre précisément et en temps réel l'évolution de la fermen-tation, nécessitent des appareils coûteux (par exemple des chromatographes). La mesure de l'activité enzymatique est également une méthode relativement lourde.
Il est donc particulièrement souhaitable de disposer de méthodes simples à mettre en oeuvre, permet-tant une détermination rapide et fiable de la population globale de microorganismes, d'une part, et de l'état de chacune des espèces et souches coexistant dans la masse fermentaire, d'autre part. Les Inventeurs se sont proposé
d'adapter dans ce but des méthodes immunochimiques.
L'immunochimie a été développée en agro-alimentaire, par exemple:
- pour identifier les composants du lait. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre les caséines [OTANI et al., 1987, Agric.Biol.Chem, ~1, 2049-2054] la ~-globuline, l'a-lactalbumine [BECK et al., 1977, J.Dairy Sci., 60, 542--545] et la lactoferrine.
- - pour détecter le développement de bactéries indésirables car modifiant les caractères organoleptiques du produit (Pseudomonas, Clostridium tyrobutyricum [BERGERE et al., 1987, Sci. Aliments,7, 89-98]. Ces études ont été faites avec des antigènes de paroi ou de structure, parfois avec des protéines enzymatiques (protéinase de Pseudomonas) [BIRKELAND et al., 1985, Appl. Environ.Microbiol.,49, 382-387 ]
- pour détecter la présence de bactéries pou-vant jouer un rôle pathoqène pour l'homme [Listeria, Staphylococcus, (FREED et al., 1987, Appl. Environ.
Microbiol., 44, 1349-1355), Salmonella etc.].
- pour identifier les bactéries lactiques et étudier leur physiologie. Il a par exemple été montré
qu'un antigène de paroi de Lactobacillus lactis peut être reconnu par des anticorps polyclonaux [BAER et al., 1987, Schweiz.Milchw.Forschung,16, 84-88]. Bien qu'une corrélation existe entre la quantité de cet antigène et la population bactérienne, ledit antigène ne permet pas le suivi, en temps r~el, de cette population bactérienne, car son évolution suit, celle de ladite population, avec un retard de 10 heures environ.En outre cette corrélation n'est observée qu'en culture pure.
Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre différentes enzymes de bactéries lactiques : protéinase [LAAN et al., 1988, Appl. Environ.
Microbiol., 54, 2250-2256 ; AKUZAWA et al., 1985, Agric.
Biol.Chem.,49, 197-199], dipeptidase [VAN BOVEN et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol.,54,43-49; KONINGS et al., 1988, Demande de Brevet Européen 286 171.], lactate déshydrogénase [GASSER et al., 1971, J.Bact., 106, 113-125].
Toutefois, jusqu'à présent, aucune méthode de dosage immunochimique permettant le sulvi d'un processus de fermentation, en particulier en culture mixte, n'a été
- proposée. En effet, la mise au point d'une telle méthode implique l'obtention de réactifs, anticorps et antigènes, répondant à des critères bien précis : il convient tout d'abord de choisir des antigènes dont la quantité dans la masse fermentaire est en corrélation directe avec la population d'au moins une espèce ou une souche de microorganismes ; de préférence, il s'agit d'antigènes associés à des constituants des microorganismes interve-nant dans le processus fermentaire, par exemple des enzymes impliquées dans la fermentation ; il convient en outre que la réaction antigène/anticorps qui permet le dosage puisse être effectuée directement sur un échantil-lon prélevé dans le mélange complexe que constitue lamasse fermentaire, sans que la sensibilité et la spécifi-cité de cette réaction soient perturbées par d'autres constituants de ce mélange.
Des anticorps de sp~cificité plus ou moins étroite peuvent être utilisés, ce qui permet d'obtenir à
la fois des informations concernant l'évolution globale de la population de microorganismes, et des informations concernant l'évolution d'une sous-population, par exemple une souche déterminée. Toutefois, la spécificité de cha-cun des anticorps utilisés doit être bien définie, afind'éviter que les mesures ne soient faussées par des réac-tions croisées imprévisibles avec d'autres antigènes sus-ceptibles d'être présents dans la masse fermentaire.
La présente invention a pour but de pourvoir à
des réactifs immunochimiques qui permettent d'identifier et de doser une ou plusieurs protéines de microorganismes impliqués dans la fermentation, en particulier des pro-téines à activité enzymatique et d'établir une corréla-tion entre la quantité de protéines mesurée et la crois-sance des microorganismes et/ou l'activité enzymatique, ~9~
de façon à permettre une meilleure appréciation et uneamélioration des conditlons de fermentation.
- La présente invention a également pour but de pourvoir à une technique immunochimique quantitative per-mettant la mesure de la croissance et de l'activité des microorganismes (bactéries, levures, champignons) au sein de cultures industrielles fermentaires (lait, bière, vin, choucroute, saucisson, pain), en particulier de cultures mixtes.
Les inventeurs ont donc mis au point des ré-actifs et une méthode immunochimique permettant de quan-tifier une ou plusieurs protéines importantes en fermen-tation, et pour lesquelles il existe une corrélation, entre la production de ces protéines, d'une part, et la population de microorganismes et/ou les caractéristiques du produit de fermentation obtenu, d'autre part.
La présente invention a pour objet un réactif de dosage immunochimique pour la détermination du degré
d'évolution d'un processus de fermentation, lequel réac-tif est caractérisé en ce qu'il comprend au moins unepréparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, obte-nue en utilisant comme immunogène une préparation puri-fiée d'une enzyme intervenant dans le processus de fer-mentation, et dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré d'évolution dudit processus.
Le Tableau (I) ci-dessous indique plusieurs enzymes pouvant convenir à l'obtention de ladite prépara-tion.
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h !~ 3 ~
TABLEAU I
- ENZYMES DU METABOLISME DU LACTOSE
- D-lactate déshydrogénase - L-lactate déshydrogénase - ~-galactosidase - P-B-galactosidase ______________________________________________ ENZYMES DU METABOLISME PROTEIQUE
- protéinase de paroi - peptidases ENZYMES DU METABOLISME DU CITRATE
- diacétyle réductase - acétoïne réductase - citrate lyase ENZYMES DU METABOLISME DE L'ARGININE
- arginine déimlnase - ---_______________________ ENZYMES DU METABOLISME DES LIPIDES
- estérase ______________________________________________ AUTRES ENZYMES
- - uréase ( Streptococcus thermophilus) - thréonine aldolase (L.bulgaricus) Lors de travaux précédents, les inventeurs ont mis en évidence, chez Lactococcus lactis subsp. cremoris, certaines activités enzymatiques qui sont en corrélation directe avec la population de microorganismes [BOQUIEN et al; Le Lait (1989) 69, 71-81 et BOQUIEN et al (Applied Microbiology Biotechnology, 1989, 30, 402-407)] ; il s'agit de l'aminopeptidase, de la citrate lyase, et de l'a-galactosidase ; toutefois, comme de nombreuses
2 ~
variables peuvent influer sur l'activité enzymatique, il n'avait pas été possible, jusqu'à présent, de déterminer si cette variation de l'activité enzymatique résultait d'une variation quantitative desdites enzymes présentes.
En outre, un problème supplémentaire était posé par l'obtention de préparations d'enzymes suffisamment purifiées pour permettre la production d'anticorps utilisables comme réactifs conformément à l'invention.
En poursuivant leurs travaux, les Inventeurs sont parvenus à obtenir de telles préparations purifiées d'enzymes constituant des marqueurs de populations et/ou de sous populations bactériennes, et à produire diffé-rents anticorps, polyclonaux et monoclonaux, permettant le dosage de ces marqueurs dans un échantillon prélevé
dans le milieu fermentaire.
Selon un mode de réalisation préféré d'un réactif de dosage immunochimique conforme à la présente invention, il comprend au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre une enzyme de bactéries lac-tiques choisie dans le groupe comprenant l'aminopeptidase de Lactococcus lactis ssp. cremoris, la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, la X-prolyl dipeptidyl peptidase de ~actococcus lactis ssp.
lactis.
- Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, un réactif conforme à l'invention comprend un anticorps polyclonal dirigé contre l'aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, un reactif conforme à l'invention comprend un anticorps polyclonal dirigé contre la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp.
lactis.
Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, un réactif conforme à l'invention ~ 1~ 3 ~
comprend un anticorps polyclonal dirigé contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.
- diacetylactis.
Selon encore une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, un réactif conforme à l'invention comprend un anticorps monoclonal dirigé contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.
diacetylactis.
Selon une modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG1, qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Selon une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG2b qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Selon une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG2a qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Selon une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG1 qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité ~ de ladite citrate lyase.
- Selon encore une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgM qui reconnait un épitope situé
sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Des cultures d'hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux anti-citrate lyase conformes à
l'Invention ont été déposées le 29 Août 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de MicroorganismeS
(CNCM) tenue par l'INSTITUT pAsrrEuR~ 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS (FRANCE) i ces cultures sont :
- - Une culture d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal (dénommé anticorps 1.17, de classe IgG2a qui reconnaît un épitope situé sur la sous-unité a de la citrate lyase ; cette culture a reçu le numéro de dépôt I-994.
- Une culture d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal (dénommé anticorps 9.9, de classe IgG1 qui reconnaît un épitope situé sur la sous-unité a de la citrate lyase ; cette culture a reçu le numéro de dépôt I-995.
- Une culture d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal (dénommé anticorps 9.11, de classe IgGl qui reconnaît un épitope situé sur la sous-unité
de la citrate lyase ; cette culture a reçu le numéro de dépôt I-996.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de détermination du degré d'évolution d'un pro-cessus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprendau moins une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon prélevé dans la masse fermentaire avec un réactif immunochimique tel que défini plus haut, et une étape au cours de laquelle on mesure, par tous moyens appropriés,- la quantité de l'enzyme ou des enzymes recherchée(s) ayant réagi avec le ou les anticorps pré-sent(s) dans le réactif.
Les enzymes dosées à l'aide des réactifs conformes à l'invention peuvent être soit excrétées par les microorganismes, soit libérées après lyse de ceux-ci.
Dans ce dernier cas, la lyse peut être opérée au moment du dosage, sur l'échantillon prélevé dans le milieu fer-mentaire, par tous moyens appropriés , par exemple par sonication. La lyse peut également être spontanée, résul-tant par exemple de l'attaque de bactériophages i dans ce 10cas, le test immunochimique conforme à l'invention, réa-lisé sur l'échantillon tel que prélevé, permet de déceler - rapidement l'anomalie.
En outre, le dosage quantitatif d'une enzyme déterminée peut être réalisé parallèlement à la mesure de l'activité de ladite enzyme, ce qui permet d'en apprécier et éventuellement d'en améliorer les effets sur le pro-cessus de fermentation.
Toutes les techniques immunochimiques peuvent être utilisées dans la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention ; il peut s'agir, par exemple, de tech-niques d'agglutination passive ou de techniques de type ELISA.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une analyse quantitative rapide (moins de 30 minutes) et de pouvoir agir sur la fermentation si cette analyse a mis en évidence une quelconque anomalie dans la crois-sance des populations de microorganismes ou dans la quan-tité d'enzyme produite.
Le procédé conforme à l'invention permet donc de :
- suivre la croissance d'une souche dans un mélange de microorganismes, en choisissant de mesurer la concentration d'une protéine qui ne soit synthétisée que par la souche considérée, ou, au contraire, en choisis-sant une protéine commune à plusieurs souches, de suivre la croissance de l'ensemble de ces souches.
- mesurer l'effet d'une enzyme produite par plusieurs bactéries n'appartenant pas forcément au même genre ou à la même espèce.
- détecter précocement une attaque phagique en corrélant la libération d'une enzyme intracellulaire avec cette attaque.
- déterminer le moment où l'on doit arrêter une fermentation industrielle lors de la production de ~ ~ 3 ~ j tjl (~3 yaourts, fromage, saucisson, vin, bière, choucroute, etc.
La présente invention a en outre pour objet des préparations purifiées d'enzymes issues de microor-ganismes, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être utilisées comme immunogènes pour l'obtention des réactifs de dosage immunochimique définis plus haut.
Selon un mode de réalisation préféré d'une préparation purifiée conforme à la présente invention, elle est constituée par une préparation d'une enzyme de bactéries lactiques choisie dans le groupe comprenant l'aminopeptidase de Lactococcus lactis ssp. cremoris, la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.
diacetylactis, la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp. lactis.
L'aminopeptidase purifiée à partir de Lactococcus lactis subsp. cremoris, est caractérisée en ce que son poids moléculaire est de 300 kDa, en ce qu'elle est composée de 6 sous-unités identiques de 50 kDa, non reliées entre elles par des ponts disulfure, et contenant la séquence polypeptidique N-terminale suivan-te : Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
Elle hydrolyse les acides aminés substitués par la naphtylamide, les di- et les tripeptides, et dans une moindre mesure, des cha~nes polypeptidiques plus longues telles que la chaine B de l'insuline. La constante de Michaelis (Km) et la vitesse maximale d'hydrolyse(Vm) sont respectivement de 4,5 mM et de 3600 pkat/mg lorsque l'His-~-naphthylamide est utilisée comme substrat (un katal (kat) correspond à la quantité
d'enzyme (en milligrammes) qui libère une mole de naph-tylamine par seconde). L'activité de cette enzyme est inhibée par les inhibiteurs actifs sur les groupes thiols ainsi que par les ions Cu2+ Zn2+ et Co2+ ; en revanche, les inhibiteurs des métalloprotéases sont inactifs, ainsi que les agents réducteurs, la plupart des inhibiteurs des sérine-protéases, et les ions Mg2+ et Mn2+.
- L'aminopeptidase, conforme à l'invention peut trouver d'autres utilisations dans l'industrie agro-alimentaire, par exemple pour améliorer des produits résultant de la fermentation du lait ; en effet cette préparation d'enzyme purifiée permettent l'hydrolyse controlée de certaines des protéines de ces produits, ce qui présente un grand intérêt pour l'amélioration de leur qualités organoleptiques.
La présente invention a également pour objet des kits de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, lesquels kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un réactif immunochimique tel que défini plus haut, éventuellement une préparation purifiée de l'enzyme contre laquelle est dirigé l'anticorps contenu dans ledit réactif, ainsi que des moyens de révélation usuels de la formation d'un complexe antigène-anticorps.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation des réactifs et de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre de description de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
variables peuvent influer sur l'activité enzymatique, il n'avait pas été possible, jusqu'à présent, de déterminer si cette variation de l'activité enzymatique résultait d'une variation quantitative desdites enzymes présentes.
En outre, un problème supplémentaire était posé par l'obtention de préparations d'enzymes suffisamment purifiées pour permettre la production d'anticorps utilisables comme réactifs conformément à l'invention.
En poursuivant leurs travaux, les Inventeurs sont parvenus à obtenir de telles préparations purifiées d'enzymes constituant des marqueurs de populations et/ou de sous populations bactériennes, et à produire diffé-rents anticorps, polyclonaux et monoclonaux, permettant le dosage de ces marqueurs dans un échantillon prélevé
dans le milieu fermentaire.
Selon un mode de réalisation préféré d'un réactif de dosage immunochimique conforme à la présente invention, il comprend au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre une enzyme de bactéries lac-tiques choisie dans le groupe comprenant l'aminopeptidase de Lactococcus lactis ssp. cremoris, la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, la X-prolyl dipeptidyl peptidase de ~actococcus lactis ssp.
lactis.
- Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, un réactif conforme à l'invention comprend un anticorps polyclonal dirigé contre l'aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, un reactif conforme à l'invention comprend un anticorps polyclonal dirigé contre la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp.
lactis.
Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, un réactif conforme à l'invention ~ 1~ 3 ~
comprend un anticorps polyclonal dirigé contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.
- diacetylactis.
Selon encore une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, un réactif conforme à l'invention comprend un anticorps monoclonal dirigé contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.
diacetylactis.
Selon une modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG1, qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Selon une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG2b qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Selon une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG2a qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Selon une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgG1 qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité ~ de ladite citrate lyase.
- Selon encore une autre modalité préférée de cette disposition, ledit anticorps monoclonal est un anticorps de classe IgM qui reconnait un épitope situé
sur la sous-unité a de ladite citrate lyase.
Des cultures d'hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux anti-citrate lyase conformes à
l'Invention ont été déposées le 29 Août 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de MicroorganismeS
(CNCM) tenue par l'INSTITUT pAsrrEuR~ 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS (FRANCE) i ces cultures sont :
- - Une culture d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal (dénommé anticorps 1.17, de classe IgG2a qui reconnaît un épitope situé sur la sous-unité a de la citrate lyase ; cette culture a reçu le numéro de dépôt I-994.
- Une culture d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal (dénommé anticorps 9.9, de classe IgG1 qui reconnaît un épitope situé sur la sous-unité a de la citrate lyase ; cette culture a reçu le numéro de dépôt I-995.
- Une culture d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal (dénommé anticorps 9.11, de classe IgGl qui reconnaît un épitope situé sur la sous-unité
de la citrate lyase ; cette culture a reçu le numéro de dépôt I-996.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de détermination du degré d'évolution d'un pro-cessus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprendau moins une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon prélevé dans la masse fermentaire avec un réactif immunochimique tel que défini plus haut, et une étape au cours de laquelle on mesure, par tous moyens appropriés,- la quantité de l'enzyme ou des enzymes recherchée(s) ayant réagi avec le ou les anticorps pré-sent(s) dans le réactif.
Les enzymes dosées à l'aide des réactifs conformes à l'invention peuvent être soit excrétées par les microorganismes, soit libérées après lyse de ceux-ci.
Dans ce dernier cas, la lyse peut être opérée au moment du dosage, sur l'échantillon prélevé dans le milieu fer-mentaire, par tous moyens appropriés , par exemple par sonication. La lyse peut également être spontanée, résul-tant par exemple de l'attaque de bactériophages i dans ce 10cas, le test immunochimique conforme à l'invention, réa-lisé sur l'échantillon tel que prélevé, permet de déceler - rapidement l'anomalie.
En outre, le dosage quantitatif d'une enzyme déterminée peut être réalisé parallèlement à la mesure de l'activité de ladite enzyme, ce qui permet d'en apprécier et éventuellement d'en améliorer les effets sur le pro-cessus de fermentation.
Toutes les techniques immunochimiques peuvent être utilisées dans la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention ; il peut s'agir, par exemple, de tech-niques d'agglutination passive ou de techniques de type ELISA.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une analyse quantitative rapide (moins de 30 minutes) et de pouvoir agir sur la fermentation si cette analyse a mis en évidence une quelconque anomalie dans la crois-sance des populations de microorganismes ou dans la quan-tité d'enzyme produite.
Le procédé conforme à l'invention permet donc de :
- suivre la croissance d'une souche dans un mélange de microorganismes, en choisissant de mesurer la concentration d'une protéine qui ne soit synthétisée que par la souche considérée, ou, au contraire, en choisis-sant une protéine commune à plusieurs souches, de suivre la croissance de l'ensemble de ces souches.
- mesurer l'effet d'une enzyme produite par plusieurs bactéries n'appartenant pas forcément au même genre ou à la même espèce.
- détecter précocement une attaque phagique en corrélant la libération d'une enzyme intracellulaire avec cette attaque.
- déterminer le moment où l'on doit arrêter une fermentation industrielle lors de la production de ~ ~ 3 ~ j tjl (~3 yaourts, fromage, saucisson, vin, bière, choucroute, etc.
La présente invention a en outre pour objet des préparations purifiées d'enzymes issues de microor-ganismes, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être utilisées comme immunogènes pour l'obtention des réactifs de dosage immunochimique définis plus haut.
Selon un mode de réalisation préféré d'une préparation purifiée conforme à la présente invention, elle est constituée par une préparation d'une enzyme de bactéries lactiques choisie dans le groupe comprenant l'aminopeptidase de Lactococcus lactis ssp. cremoris, la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar.
diacetylactis, la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp. lactis.
L'aminopeptidase purifiée à partir de Lactococcus lactis subsp. cremoris, est caractérisée en ce que son poids moléculaire est de 300 kDa, en ce qu'elle est composée de 6 sous-unités identiques de 50 kDa, non reliées entre elles par des ponts disulfure, et contenant la séquence polypeptidique N-terminale suivan-te : Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
Elle hydrolyse les acides aminés substitués par la naphtylamide, les di- et les tripeptides, et dans une moindre mesure, des cha~nes polypeptidiques plus longues telles que la chaine B de l'insuline. La constante de Michaelis (Km) et la vitesse maximale d'hydrolyse(Vm) sont respectivement de 4,5 mM et de 3600 pkat/mg lorsque l'His-~-naphthylamide est utilisée comme substrat (un katal (kat) correspond à la quantité
d'enzyme (en milligrammes) qui libère une mole de naph-tylamine par seconde). L'activité de cette enzyme est inhibée par les inhibiteurs actifs sur les groupes thiols ainsi que par les ions Cu2+ Zn2+ et Co2+ ; en revanche, les inhibiteurs des métalloprotéases sont inactifs, ainsi que les agents réducteurs, la plupart des inhibiteurs des sérine-protéases, et les ions Mg2+ et Mn2+.
- L'aminopeptidase, conforme à l'invention peut trouver d'autres utilisations dans l'industrie agro-alimentaire, par exemple pour améliorer des produits résultant de la fermentation du lait ; en effet cette préparation d'enzyme purifiée permettent l'hydrolyse controlée de certaines des protéines de ces produits, ce qui présente un grand intérêt pour l'amélioration de leur qualités organoleptiques.
La présente invention a également pour objet des kits de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, lesquels kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un réactif immunochimique tel que défini plus haut, éventuellement une préparation purifiée de l'enzyme contre laquelle est dirigé l'anticorps contenu dans ledit réactif, ainsi que des moyens de révélation usuels de la formation d'un complexe antigène-anticorps.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation des réactifs et de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre de description de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
3 ~
I PREPARATION DES REACTIFS DE DOSAGE IMMUNO-C~IMIQUE CONFORMES A L'INVEN~ION
- A) Obtention de pr~parations purifi~es d'enzymes utilisables comme immunogènes.
Exemple 1 : Obtention et caractérisation d'une préparation purifiée d'aminopeptidase de Laetoeoeeus lactis subsp. cremoris AM2.
TURE
Une souche de Laetoeoeeus laetis subsp. cremo-ris AM2, désignée par le numéro CRNZ 380 a été obtenue auprès de la collection de culture du Centre de Recherche de Jouy-en-Josas (France), de l'Institut National de la Recherche Agronomique.
Ladite souche est conservée à -18~C.
Des cultures sont effectuées sur un milieu contenant 40g/l de lactose, 20g/l de bacto tryptone (Difco), et 7g/l d'extrait de levure, à une température de 30nc et sous agitation mécanique de 100rpm. Le pH du milieu est ajusté à 6,5 par l'addition d'une solution de soude 10N.
La croissance bactérienne a été déterminée par spectrophotométrie dans un échantillon de la culture di-lué au 1/10 dans une solution à 0,2% d'EDTA (pH 12). A la fin de la phase de croissance exponentielle, les cellules sont centrifugées à 6000 x g pendant 10 minutes et lavées trois fois dans 0,05M de tampon ~-glycérophosphate (pH
8).
Des sphéroplastes sont obtenus en mettant en suspension 30g de cellules lavées dans 250 ml de tampon Tris (pH 8) 0,03M contenant 30% de sucrose et 0,3 mg/ml de lysozyme. Après incubation pendant 3 heures à 37~C, les sphéroplastes sont recueillis par centrifugation à
10000 x g pendant 20mm et remis en suspension dans le même tampon sans sucrose, dans le but de provoquer leur lyse. Après la lyse, la suspension est centrifugée à
20000 x g pendant 30 minutes pour séparer l'extrait acellulaire des membranes et des débris de parois cellulaires.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
Les acides nucléiques présents dans l'extrait acellulaire sont hydrolysés par la RNase et la DNase. La solution est alors précipitée en présence de 50mM de MnSO4 et centrifugée à 20000 x g pendant 30 minutes.
L'aminopeptidase est purifiée à partir de cette solution par deux étapes consécutives de chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne FPLC (Mono Q HR 10/10 Pharmacia Uppsala, Suède). La colonne est équilibrée par 20mM de Tris-HCl (pH 7,5).
lère étape.
150 mg de protéines obtenues à partir de l'extrait acellulaire sont injectés dans la colonne et les protéines sont éluées par un gradient linéaire de NaCl de 0 à 0,6M pendant 1 heure à un débit de 3 ml/minute. Des fractions de 3 ml sont recueillies. Les fractions actives sur His-Phe-~-NA sont collectées et dialysées contre 20mM de Tris-HCl (pH 7,5).
A l'issue de cette Ière étape, 4 fractions hydrolysant le substrat His-Phe-~-NA sont recueillies.
L'une d'entre elles, qui représente 35% de l'activité
totale aminopeptidase n'a pas été adsorbée sur la colonne. Les trois autres, qui représentent respective-ment 1%, 3% et 46% de l'activite totale aminopeptidase, sont éluées respectivement à 0,23M, 0,33M et 0,47M NaCl.
2ème étape .
La fraction éluée à 0,47 M à l'issue de la Ière étape est injectée dans la colonne et éluée par un gradient linéaire de NaCl de 0,4 à 0,5M pendant 1 heure.
A l'issue de cette 2ème étape, deux fractions sont recueillies; l'une d'entre elles, qui est éluée à
0,45M NaCl contient l'activité aminopeptidase. C'est cette fraction dont les caractéristiques physico-chi-miques et enzymatiques ont été déterminées, qui a été
choisie comme immunogène pour la production de réactifs de diagnostic conformes à l'invention Durant toute la procédure les fractions ac-tives sont conservées à -18~C en présence de stabilisant (10% de glycérol, 100mM de sulfate d'ammonium, lmM de dithiothréitol). Le Tableau II illustre les différentes étapes de la purification.
TABLEAU II
ETAPE ACTIVITE PROTEINES ACTIVITE RENDEMENT
DE TOTALE TOTALESSPECIFIQUE
15 PURIFICATIO~ (nkat) (mg)(pkat/mg) (~) SPHEROPLASTES 210 ,~ = 17,5 100 ECHANGE32 0,65 99215 D'IONS (1) 20ECHANGE 19 0,08 23759 D'IONS (2)
I PREPARATION DES REACTIFS DE DOSAGE IMMUNO-C~IMIQUE CONFORMES A L'INVEN~ION
- A) Obtention de pr~parations purifi~es d'enzymes utilisables comme immunogènes.
Exemple 1 : Obtention et caractérisation d'une préparation purifiée d'aminopeptidase de Laetoeoeeus lactis subsp. cremoris AM2.
TURE
Une souche de Laetoeoeeus laetis subsp. cremo-ris AM2, désignée par le numéro CRNZ 380 a été obtenue auprès de la collection de culture du Centre de Recherche de Jouy-en-Josas (France), de l'Institut National de la Recherche Agronomique.
Ladite souche est conservée à -18~C.
Des cultures sont effectuées sur un milieu contenant 40g/l de lactose, 20g/l de bacto tryptone (Difco), et 7g/l d'extrait de levure, à une température de 30nc et sous agitation mécanique de 100rpm. Le pH du milieu est ajusté à 6,5 par l'addition d'une solution de soude 10N.
La croissance bactérienne a été déterminée par spectrophotométrie dans un échantillon de la culture di-lué au 1/10 dans une solution à 0,2% d'EDTA (pH 12). A la fin de la phase de croissance exponentielle, les cellules sont centrifugées à 6000 x g pendant 10 minutes et lavées trois fois dans 0,05M de tampon ~-glycérophosphate (pH
8).
Des sphéroplastes sont obtenus en mettant en suspension 30g de cellules lavées dans 250 ml de tampon Tris (pH 8) 0,03M contenant 30% de sucrose et 0,3 mg/ml de lysozyme. Après incubation pendant 3 heures à 37~C, les sphéroplastes sont recueillis par centrifugation à
10000 x g pendant 20mm et remis en suspension dans le même tampon sans sucrose, dans le but de provoquer leur lyse. Après la lyse, la suspension est centrifugée à
20000 x g pendant 30 minutes pour séparer l'extrait acellulaire des membranes et des débris de parois cellulaires.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
Les acides nucléiques présents dans l'extrait acellulaire sont hydrolysés par la RNase et la DNase. La solution est alors précipitée en présence de 50mM de MnSO4 et centrifugée à 20000 x g pendant 30 minutes.
L'aminopeptidase est purifiée à partir de cette solution par deux étapes consécutives de chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne FPLC (Mono Q HR 10/10 Pharmacia Uppsala, Suède). La colonne est équilibrée par 20mM de Tris-HCl (pH 7,5).
lère étape.
150 mg de protéines obtenues à partir de l'extrait acellulaire sont injectés dans la colonne et les protéines sont éluées par un gradient linéaire de NaCl de 0 à 0,6M pendant 1 heure à un débit de 3 ml/minute. Des fractions de 3 ml sont recueillies. Les fractions actives sur His-Phe-~-NA sont collectées et dialysées contre 20mM de Tris-HCl (pH 7,5).
A l'issue de cette Ière étape, 4 fractions hydrolysant le substrat His-Phe-~-NA sont recueillies.
L'une d'entre elles, qui représente 35% de l'activité
totale aminopeptidase n'a pas été adsorbée sur la colonne. Les trois autres, qui représentent respective-ment 1%, 3% et 46% de l'activite totale aminopeptidase, sont éluées respectivement à 0,23M, 0,33M et 0,47M NaCl.
2ème étape .
La fraction éluée à 0,47 M à l'issue de la Ière étape est injectée dans la colonne et éluée par un gradient linéaire de NaCl de 0,4 à 0,5M pendant 1 heure.
A l'issue de cette 2ème étape, deux fractions sont recueillies; l'une d'entre elles, qui est éluée à
0,45M NaCl contient l'activité aminopeptidase. C'est cette fraction dont les caractéristiques physico-chi-miques et enzymatiques ont été déterminées, qui a été
choisie comme immunogène pour la production de réactifs de diagnostic conformes à l'invention Durant toute la procédure les fractions ac-tives sont conservées à -18~C en présence de stabilisant (10% de glycérol, 100mM de sulfate d'ammonium, lmM de dithiothréitol). Le Tableau II illustre les différentes étapes de la purification.
TABLEAU II
ETAPE ACTIVITE PROTEINES ACTIVITE RENDEMENT
DE TOTALE TOTALESSPECIFIQUE
15 PURIFICATIO~ (nkat) (mg)(pkat/mg) (~) SPHEROPLASTES 210 ,~ = 17,5 100 ECHANGE32 0,65 99215 D'IONS (1) 20ECHANGE 19 0,08 23759 D'IONS (2)
4/ CARACTERISATION DE L'AMINOPEPTIDASE PURI-FIEE
_/ Electrophorèse :
La fraction purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10% d'acry-lamide) en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et en présence ou en l'absence de ~-mercaptoéthanol. Dans les deu~ cas, une seule bande est observée qui correspond à un poids moléculaire de 50 kDa.
2~
B/ Filtration sur gel :
Le poids moléculaire de l'enzyme a été estimé
- par filtration à travers une colonne d'Ultrogel AcA 34 (IBF Villeneuve-la-Garenne, France) de 90 x lcm, en uti-lisant un tampon Tris-HCl 20mM (pH 7,5) contenant 0,15M
de NaCl, à un débit de 12 ml/heure.
Le poids moléculaire de l'enzyme estimé par cette méthode est égal à 300 kDa.
Le rapprochement des résultats obtenus par électrophorèse et par filtration sur gel montre que l'aminopeptidase native est un hexamère composé de 6 sous-unités identiques; ces sous-unités ne sont pas re-liées entre elles par des ponts disulfure.
C/ Détermination de la séquence N-terminale :
La séquence N-terminale est déterminée par dégradation d'Edman, en utilisant un séquenceur automa-tique ( Applied biosystems, San Jose, CA, USA).
L'échantillon a été dessalé par HPLC en phase inverse sur une colonne Aquapore RP300 de 30 x 4,6mm, 7~m, 300 A
(Brownlee, Santa Clara, CA, USA). L'élution a été réali-sée avec un gradient linéaire de 100% du solvant A
(0,115% d'acide trifluoroacétique) à 100% du solvant B
(0,1% d'acide trifluoroacétique dans un mélange acétoni-trile/2-propanol/eau, 37,5/37,5/30, V/V/V) pendant 50 minutes à 40~C avec un débit de 1 ml/minute.
Par ce procédé les 19 acides aminés N-termi-naux ont été déterminés; leur séquence est la suivante :
Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
D/ Détermination de la quantité de protéines et de la composition en acides aminés.
La quantité de protéines a été déterminée à
chaque étape de la purification en utilisant la méthode de BRADFORD et al, avec le lysozyme comme étalon.
En fin de purification, la composition en 7 ~ 3 acides aminés a également été déterminée (après hydrolyse à 110~C pendant 24 heures) en utilisant un analyseur d'acides aminés LC 5000 (Biotronik, Munich, RFA) La composition en acides aminés est donnée dans le Tableau III.
TABLEAU III
ACIDE QUANTITEPOURCENTAGE NOMBRE DE
AMINE (nmoles) MOLAIRE RESIDUS
Asx 16,3 11,7 54 Thr 9,4 6,7 31 Ser 9,4 6,7 31 Glx 19,3 13,9 64 Gly 9,7 6,9 32 Ala 10, 2 7,3 34 Cys 1,5 l 5 Val 8,2 5,9 27 Met 3,6 2,6 12 Ile 2,9 2,1 10 Leu 10, 6 7,6 35 Tyr 5,2 3,7 17 Phe 7,8 5, 626 His 2,8 2,0 9 Trp 1, 3 0,9 4 Lys -8,8 6,3 29 2S Arg 4,1 2,9 14 Pro 7,7 5,5 26 E/ Mesure de l'activité aminopeptidase de la préparation purifiée L'activité aminopeptidase a été déterminée, en utilisant comme substrat soit des dipeptides ou des acides aminés substitués par la ~-naphthylamide, solt des di- et tripeptides. La préparation d'enzyme est incubée à
37~C et à pH 7 en présence de 0,4mM de substrat. Lorsque le substrat est constitué par un acide amlné ou un dipep-h3~ , 9 tide substitué par la ~-naphtylamide, l'activité est mesurée en dosant la naphtylamine libérée, selon la tech-nique décrite par BOQU:LEN et al [Appl.
Microbio.Biotechnol. (1989) 30 ; 402-407]. Lorsque le substrat est constitué par des di- ou des tripeptides, le produit de la réaction est révélé par l'addition d'un volume égal à celui du mélange réactionnel, d'une solu-tion de ninhydrine [20g de ninhydrine, 750 ml de méthyl-cellosolve, 250 ml de tampon acétate 4M (pH 5,51), 7 ml de chlorure de titane]. Après chauffage à 100~C pendant 10 minutes et addition de trois volumes d'éthanol à 50%, l'absorbance de la solution est mesurée à 440 nm pour la proline et 570 nm pour les autres acides aminés. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau IV
ci-après.
~\
.~.J ~ i.?
TABLEAU lV
Substrat Activité relative (%) Ala-~-NA 100 Lys-~-NA 100 His-~-NA 100 Glu-~-NA 80 Phe-~-NA 75 Leu-~-NA 70 Pro-~-NA O
10 His-Phe-~-NA 47 His-Pro-~-NA O
His-Phe 100 Leu-Leu 61 Met-Ala 56 15 Met-Pro O
CBZ-Gly-Tyr O
CBZ-Phe-Phe O
Phe-Gly-Gly 100 Leu-Gly-Gly 89 20 Met-Leu-Gly 85 Leu-Leu-Leu 78 Ala-Leu-Gly 74 ~-NA = ~-naphtylamide CBZ = carboxybenzoyle L'enzyme purifiée hydrolyse tous les substrats constitués par les acides aminés ou les dipeptides sub-stitués par la naphtylamide, à l'exception de ceux conte-nant de la proline. De la même façon les di- et tripep-tides sont hydrolysés sauf s'ils contiennent de la pro-line ou si leur extrémité N-terminale est bloquée.
L'enzyme n'a pas d'activité carboxypeptidase. L'hydrolyse du substrat His-Phe-~-NA par l'enzyme purifiée produit de l'histidine et la phénylalanine libres, ce qui montre que cette enzyme n'est pas une dipeptidylaminopeptidase, mais une aminopeptidase.
L'activité enzymatique a également été mesurée - en présence de différents inhibiteurs. Les inhibiteurs actifs sur les groupes SH de protéines inhibent totale-S ment [iodoacétamide, acide iodoacétique, acide para-chlormercuro-benzoïque (PCMB)], ou partiellement (N-éthylmaléimide) l'activité enzymatique. Les inhibiteurs des sérine-protéases [diisopropyl-fluorophosphate (DFP), fluorure de phényl-méthylsulfoyle (PMSF) ] et des métal-loprotéases (EDTA, 1,10-phénanthroline, phosphoramidon) ainsi que les agents réducteurs (dithiothréitol, ~-mer-captoéthanol) n'ont aucun effet sur l'activité de l'enzyme purifiée.
Les cations divalents Cu++, Zn++, et Co++ in-hibent l'activité à une concentration de 0,lmM, alors que Mg++ et Mn++ n'ont aucun effet, à cette même concen-tration.
Exemple 2 : Obtention d'une préparation puri-fiée de citrate lyase de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis.
TURE
Une souche de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, désignée par le numéro CRNZ 125 a été obtenue auprès de la collection de culture du Centre de Recherche de Jouy-en-Josas (France), de l'Institut National de la Recherche Agronomique.
Ladite souche est conservée à -18~C.
Des cultures sont effectuées sur un milieu contenant 40g/l de lactose, 20g/l de bacto tryptone (Difco), et 7g/l d'extrait de levure, en présence de citrate, à une température de 30~C et sous agitation mécanique à 25 tpm. Le pH du milieu est ajusté à 6,5 par l'addition d'une solution de soude 10N.
La croissance bactérienne a été déterminée par spectrophotométrie dans un échantillon de la culture di-lué au 1/10 dans une solution à 0,2% d'EDTA (pH 12).
- Toutes les étapes de purification sont effec-tuées à 4~C. Arès 5h de culture, les cellules sont centrifugées à 10000 g pendant 30 minutes et lavées trois fois dans du tampon de purification (tampon phosphate de potassium l00mM, MgCl2 3 mM, pH 7,2).
Les bactéries sont lysées par incubation en présence de lysozyme (15000 unités/ml) et de mutanolysine (15 unités/ml), dans le tampon de purification. Après incubation pendant 30 minutes à 30~C puis 30 minutes à
20~C, le lysat est centrifugé à 20000g pendant 60 minutes. Le surnageant est conservé.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
a) Précipitation des acides nucléiques:
Le surnageant obtenu précédemment est traité
par l'addition d'une solution à 2% (p/v) de protamine sulfate (rapport protamine sulfate : protéines = 0,3), afin de précipiter les acides nucléiques. La solution est centrifugée à 20000 x g pendant 50 minutes.
b) Précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium:
Le surnageant est recueilli et additionné de sulfate d'ammonium à 95% de saturation. Après 45 minutes d'agitation lente, l'ensemble est centrifugé 20 minutes à
20000g et le surnageant est soumis à une deuxième préci-pitation par le sulfate d'ammonium à 60% de saturation. ;
l'ensemble est agité lentement pendant 45 minutes, puis centrifugé pendant 20 minutes à 20000g ; le culot est remis en suspension dans l0 ml de tampon de purification.
c) Filtration sur gel :
Le culot resuspendu est injecté sur une colonne de filtration sur gel SEPHACRYL S-300 HR
(l00x2,5 cm), préalablement équilibrée avec le tampon de J ~ l5J
puriflcation ; des fractions de 5 ml sont recueillies, à
un débit de 30 ml/h ; les fractions 38 à 41 sont - conservées.
d) Chromatographle d'échange d'ions :
Les fractions recueillies précédemment sont injectées sur une colonne FPLC (Mono Q 10/10, Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée avec le tampon de purifica-tion dont la molarité en phosphate a été ramenée à 50mM.
Les protéines retenues sur la colonne sont éluées avec le tampon de purification dont la force ionique a été aug-mentée suivant un gradient linéaire de NaCl de 0 à 1 M.
La citrate lyase est éluée à 300mM, en un seul pic.
Le Tableau V ci-après résume les différentes étapes de la purification.
TABLEAU V
ETAPE ACTIVITE PROTEINES ACTIVITERENDEMENT
DE TOTALE TOTALESSPECIFIQUE (~i) PURIFICATION (4U /ml) (mg/ml)(U /mg~
EXTRAIT 739 2852,6 100 20 CELLULAIRE ..
SULFATE DE 686 2223,1 93 PROTAMINE
60% SULFATE 279 1701,6 38 D'AMMONIUM
FILTRATION 194 17 11,4 26 SUR GEL
ECHANGE 116 0,9 129 16 Unité citrate lyase : quantité de cltrate consommé, en ~mol/mn et à 30~C
4/ CARACTERISATION DL LA PR~PARATION PURIFIEE
DE CITRATE LYASE
- La fraction purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (15% d'acry-lamide) en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS). 3 bandes sont observées qui correspondent aux sous-unités ~, ~, et y, à des poids moléculaires respectifs de 55, 33, et 11 kDa. Cette fraction purifiée est utilisée comme immunogène.
Exemple 3 : Obtention d'une préparation purifiée de X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis subsp. lactis.
TURE
Une souche de Lactococcus lactis subsp.
lactis, désignée par le numéro NCDO 763 a été obtenue auprès de la National Collection of Food Bacteria (Shinfield, Reading, UK).
Des cultures sont effectuées sur un milieu M
17 (Difco) et à une température de 30 C.
A la fin de la phase de croissance exponen-tielle, les cellules sont centrifugées à 8000 g pendant 15 minutes et lavées trois fois dans du tampon ~-glycérophosphate 0,05M, CaCl2 0,02M, pH 7.
Des sphéroplastes sont obtenus selon la procé-dure décrite à l'Exemple l.
Après la lyse des sphéroplastes, la suspension est centrifugée à 20000 x g pendant 30 minutes pour séparer l'extrait acellulaire des membranes et des débris de parois cellulaires.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
L'enzyme est purifiée suivant la procédure décrite par ~ZEVACO et al., Journal of Applied Bacteriology, 68, 357-366, (1990)]
~ a~
B) Obtention et caractérisation de pré-~rations d'anticorps.
- ~xemple 4: Préparation d'anticorps polyclonaux anti-aminopeptidase a) Obtention d'anticorps chez le lapin et la souris.
100 ~g d'une préparation d'enzyme purifiée se-lon le protocole décrit dans l'exemple 1, additionnée d'adjuvant complet de Freund sont injectés à des lapins.
Des injections de rappel mensuelles sont effectuées en utilisant 50 ~g d'enzyme additionnée d'adjuvant incomplet de FREUND. Les lapins sont saignés 5r 10 et 15 jours après chaque injection de rappel.
L'immunsérum est obtenu par centrifugation du sang à 10000 x g pendant 10 minutes.
Le même protocole est utilisé pour la produc-tion d'anticorps chez des souris Balb/c. Dans ce cas la quantité d'aminopeptidase injectée est de 5~g.
b) Démonstration de la spécificité des anti-corps obtenus (transfert immunoélectrophorétique):
Après électrophorèse des échantillons conte-nant soit l'extrait acellulaire, soit l'enzyme purifiée, les protéines séparées sur le gel sont transférées sur une feuille de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBI~ et al. (Pro. Natl. Acad. Sci. USA
(1979),76:4350-4354). La feuille de nitrocellulose est ensuite incubée dans une solution contenant 5% de lait écrémé, dans le but d'éviter une adsorption non spé-cifique des anticorps, puis incubée avec l'immunsérum de lapin anti-aminopeptidase dilué au 1/500. La réaction an-tigène-anticorps est mise en évidence par incubation avec un immunsérum de chèvre anti-immunoglobuline de lapin, conjugué à la peroxydase, et dilué au l/1000. La réaction de la peroxydase est visualisée en utilisant comme sub-strat le 4-chloro-1-naphtol.
Aussi bien dans le cas de la préparation d'enzyme purifiée, que dans celui de l'extrait acellu-- laire total, une seule bande est mise en évidence par l'immunsérum de lapin ou de souris anti-aminopeptidase.
Ceci montre que les immunsérums obtenus sont spécifiques de l'aminopeptidase purifiée.
Les anticorps anti-aminopeptidase ainsi obte-nus ont été testés contre différentes souches de bacté-ries, en particulier de bactéries lactiques.
L'aminopeptidase a ainsi été détectée chez toutes les souches de lactocoques testées (Lactococcus lactis ssp.
lactis, ssp. cremoris, et ssp. lactis biovar diacetylactis). En revanche, elle n'a été détectée chez aucune souche de Lactobacillus, Streptococcus, et Leuconostoc. En outre, ces anticorps ne présentent aucune réaction croisée avec une protéine de 95kDa qui correspond à l'aminopeptidase, purifiée par TAN et KONINGS [Appl. Environ. Microbiol., 56, 526-532 (1990)]
chez Lactococcus lactis ssp cremoris WG2.
Exemple 5 : Préparation et caractérisation d'anticorps polyclonaux anti-X-Prolyl dipeptidyl peptidase a) Obtention d'anticorps chez le lapin :
Un immunsérum est obtenu chez le lapin, selon le protoco-le d'immunisation décrit dans l'exemple 4, en utilisant, pour la première injection, 100 ~g de X-Prolyl dipeptidyl peptidase purifiée comme décrit dans l'exemple 3. Les injections de rappel sont effectuées en utilisant 50 ~g d'enzyme.
b) Démonstration de la spécificité des anti-corps obtenus (transfert immunoélectrophorétique):
Des échantillons contenant soit l'extrait acellulaire, soit l'enzyme purifiée, sont transférés après électrophorèse, sur une feuille de nitrocellulose et incubés avec l'immun sérum comme décrit précédemment.
~. ~ '3 ~
Aussi bien dans le cas de la préparation d'enzyme puri-fiée, que dans celui de l'extrait acellulaire total, une - seule bande, à 85kDa, est mise en évidence par l'immunsérum de lapin anti-X-Prolyl dipeptidyl peptidase.
Les anticorps anti-X-Prolyl dipeptidyl pepti-dase ainsi obtenus ont été testés contre 4 souches de lactocoques La X-Prolyl dipeptidyl peptidase a été
détectée chez toutes ces souches : Lactococcus lactis ssp. lactis, ssp. cremoris, et ssp. lactis biovar diacetylactis.
Exemple 6 : Préparation et caractérisation d'anticorps polyclonaux anti-citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis a) Obtention d'anticorps chez le lapin :
Un immunsérum est obtenu chez le lapin, selon le protocole d'immunisation décrit dans l'exemple 4, en utilisant, pour la première injection, 100 ~g de citrate lyase purifiée comme décrit dans l'exemple 2. Les injec-tions de rappel sont effectuées en utilisant 50 ~g d'enzyme.
b) Démonstration de la spécificité des anti-corps obtenus (transfert immunoélectrophorétique):
Le transfert immunoélectrophorétique est effectué comme décrlt précédemment, soit avec l'extrait acellulaire, soit avec l'enzyme purifiée. Dans les 2 cas, deux bandes, à 55 et 33 kDa, apparaissent qui correspon-dent aux sous-unités ~ et ~ de la citrate lyase.
L'immunsérum obtenu a été testé contre 6 souches de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis. Les sous-unités ~ et ~ de la citrate lyase ont été détectées chez toutes ces souches. En revanche, aucune bande n'apparait chez Lactococcus lactis ssp.
lactis, et ssp. cremoris .
L'immunsérum a également été testé chez 6 souches de Leuconostoc. Une bande correspondant à la ~ ~ 3 ~ ~3 sous-unité ~ est reconnue chez les 6 souches ; la sous-unité ~ n'est reconnue que chez les 2 souches de - Leuconostoc lactis et les 2 souches de Leuconostoc mesenteroides, mais pas chez Leuconostoc cremoris.
Parmi les lactobacilles, l'immunsérum recon-naît également Lactobacillus brevis.
Exemple 7 : Préparation et caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis a) Préparation des anticorps monoclonaux :
Des souris sont sensibilisées à la citrate lyase suivant le protocole d'immunisation décrit à
l'exemple précédent. Les anticorps monoclonaux sont pré-parés selon le protocole de KOHLER et MILSTEIN [~ature, 256, 495-497, (1975)~ Trois jours avant la fusion cellu-laire, les souris subissent une dernière injection d'enzyme purifiée (50~g).
Les lymphocytes de la rate sont ensuite récol-tés et fusionnés à des cellules myélomateuses de souris (X63) compatibles, par adjonction de polyéthylène glycol 1500 (Boehringer).
Des hybridomes produisant des anticorps qui reconnaissent à la fois la préparation purifiée de citrate lyase et les extraits cellulaires sont ensuite sélectionnés et clonés. Les propriétés des anticorps sécrétés par ces hybridomes sont indiquées dans le Tableau IV ci-apr~s.
~ ~ 3 ~
TABLEAU VI
ANTICORPS CL~l) CL(2) CL(3) SOUS- CLASSE
UNITE D'Ig 1.2>1000 >1000 >1000 a M .
1.17 1 12 >1000 a G2a 2.20 4 40 >1000 a G1 2.F6 4 40 >1000 a G1 2.G3 4 40 >1000 a G1
_/ Electrophorèse :
La fraction purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10% d'acry-lamide) en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et en présence ou en l'absence de ~-mercaptoéthanol. Dans les deu~ cas, une seule bande est observée qui correspond à un poids moléculaire de 50 kDa.
2~
B/ Filtration sur gel :
Le poids moléculaire de l'enzyme a été estimé
- par filtration à travers une colonne d'Ultrogel AcA 34 (IBF Villeneuve-la-Garenne, France) de 90 x lcm, en uti-lisant un tampon Tris-HCl 20mM (pH 7,5) contenant 0,15M
de NaCl, à un débit de 12 ml/heure.
Le poids moléculaire de l'enzyme estimé par cette méthode est égal à 300 kDa.
Le rapprochement des résultats obtenus par électrophorèse et par filtration sur gel montre que l'aminopeptidase native est un hexamère composé de 6 sous-unités identiques; ces sous-unités ne sont pas re-liées entre elles par des ponts disulfure.
C/ Détermination de la séquence N-terminale :
La séquence N-terminale est déterminée par dégradation d'Edman, en utilisant un séquenceur automa-tique ( Applied biosystems, San Jose, CA, USA).
L'échantillon a été dessalé par HPLC en phase inverse sur une colonne Aquapore RP300 de 30 x 4,6mm, 7~m, 300 A
(Brownlee, Santa Clara, CA, USA). L'élution a été réali-sée avec un gradient linéaire de 100% du solvant A
(0,115% d'acide trifluoroacétique) à 100% du solvant B
(0,1% d'acide trifluoroacétique dans un mélange acétoni-trile/2-propanol/eau, 37,5/37,5/30, V/V/V) pendant 50 minutes à 40~C avec un débit de 1 ml/minute.
Par ce procédé les 19 acides aminés N-termi-naux ont été déterminés; leur séquence est la suivante :
Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
D/ Détermination de la quantité de protéines et de la composition en acides aminés.
La quantité de protéines a été déterminée à
chaque étape de la purification en utilisant la méthode de BRADFORD et al, avec le lysozyme comme étalon.
En fin de purification, la composition en 7 ~ 3 acides aminés a également été déterminée (après hydrolyse à 110~C pendant 24 heures) en utilisant un analyseur d'acides aminés LC 5000 (Biotronik, Munich, RFA) La composition en acides aminés est donnée dans le Tableau III.
TABLEAU III
ACIDE QUANTITEPOURCENTAGE NOMBRE DE
AMINE (nmoles) MOLAIRE RESIDUS
Asx 16,3 11,7 54 Thr 9,4 6,7 31 Ser 9,4 6,7 31 Glx 19,3 13,9 64 Gly 9,7 6,9 32 Ala 10, 2 7,3 34 Cys 1,5 l 5 Val 8,2 5,9 27 Met 3,6 2,6 12 Ile 2,9 2,1 10 Leu 10, 6 7,6 35 Tyr 5,2 3,7 17 Phe 7,8 5, 626 His 2,8 2,0 9 Trp 1, 3 0,9 4 Lys -8,8 6,3 29 2S Arg 4,1 2,9 14 Pro 7,7 5,5 26 E/ Mesure de l'activité aminopeptidase de la préparation purifiée L'activité aminopeptidase a été déterminée, en utilisant comme substrat soit des dipeptides ou des acides aminés substitués par la ~-naphthylamide, solt des di- et tripeptides. La préparation d'enzyme est incubée à
37~C et à pH 7 en présence de 0,4mM de substrat. Lorsque le substrat est constitué par un acide amlné ou un dipep-h3~ , 9 tide substitué par la ~-naphtylamide, l'activité est mesurée en dosant la naphtylamine libérée, selon la tech-nique décrite par BOQU:LEN et al [Appl.
Microbio.Biotechnol. (1989) 30 ; 402-407]. Lorsque le substrat est constitué par des di- ou des tripeptides, le produit de la réaction est révélé par l'addition d'un volume égal à celui du mélange réactionnel, d'une solu-tion de ninhydrine [20g de ninhydrine, 750 ml de méthyl-cellosolve, 250 ml de tampon acétate 4M (pH 5,51), 7 ml de chlorure de titane]. Après chauffage à 100~C pendant 10 minutes et addition de trois volumes d'éthanol à 50%, l'absorbance de la solution est mesurée à 440 nm pour la proline et 570 nm pour les autres acides aminés. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau IV
ci-après.
~\
.~.J ~ i.?
TABLEAU lV
Substrat Activité relative (%) Ala-~-NA 100 Lys-~-NA 100 His-~-NA 100 Glu-~-NA 80 Phe-~-NA 75 Leu-~-NA 70 Pro-~-NA O
10 His-Phe-~-NA 47 His-Pro-~-NA O
His-Phe 100 Leu-Leu 61 Met-Ala 56 15 Met-Pro O
CBZ-Gly-Tyr O
CBZ-Phe-Phe O
Phe-Gly-Gly 100 Leu-Gly-Gly 89 20 Met-Leu-Gly 85 Leu-Leu-Leu 78 Ala-Leu-Gly 74 ~-NA = ~-naphtylamide CBZ = carboxybenzoyle L'enzyme purifiée hydrolyse tous les substrats constitués par les acides aminés ou les dipeptides sub-stitués par la naphtylamide, à l'exception de ceux conte-nant de la proline. De la même façon les di- et tripep-tides sont hydrolysés sauf s'ils contiennent de la pro-line ou si leur extrémité N-terminale est bloquée.
L'enzyme n'a pas d'activité carboxypeptidase. L'hydrolyse du substrat His-Phe-~-NA par l'enzyme purifiée produit de l'histidine et la phénylalanine libres, ce qui montre que cette enzyme n'est pas une dipeptidylaminopeptidase, mais une aminopeptidase.
L'activité enzymatique a également été mesurée - en présence de différents inhibiteurs. Les inhibiteurs actifs sur les groupes SH de protéines inhibent totale-S ment [iodoacétamide, acide iodoacétique, acide para-chlormercuro-benzoïque (PCMB)], ou partiellement (N-éthylmaléimide) l'activité enzymatique. Les inhibiteurs des sérine-protéases [diisopropyl-fluorophosphate (DFP), fluorure de phényl-méthylsulfoyle (PMSF) ] et des métal-loprotéases (EDTA, 1,10-phénanthroline, phosphoramidon) ainsi que les agents réducteurs (dithiothréitol, ~-mer-captoéthanol) n'ont aucun effet sur l'activité de l'enzyme purifiée.
Les cations divalents Cu++, Zn++, et Co++ in-hibent l'activité à une concentration de 0,lmM, alors que Mg++ et Mn++ n'ont aucun effet, à cette même concen-tration.
Exemple 2 : Obtention d'une préparation puri-fiée de citrate lyase de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis.
TURE
Une souche de Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, désignée par le numéro CRNZ 125 a été obtenue auprès de la collection de culture du Centre de Recherche de Jouy-en-Josas (France), de l'Institut National de la Recherche Agronomique.
Ladite souche est conservée à -18~C.
Des cultures sont effectuées sur un milieu contenant 40g/l de lactose, 20g/l de bacto tryptone (Difco), et 7g/l d'extrait de levure, en présence de citrate, à une température de 30~C et sous agitation mécanique à 25 tpm. Le pH du milieu est ajusté à 6,5 par l'addition d'une solution de soude 10N.
La croissance bactérienne a été déterminée par spectrophotométrie dans un échantillon de la culture di-lué au 1/10 dans une solution à 0,2% d'EDTA (pH 12).
- Toutes les étapes de purification sont effec-tuées à 4~C. Arès 5h de culture, les cellules sont centrifugées à 10000 g pendant 30 minutes et lavées trois fois dans du tampon de purification (tampon phosphate de potassium l00mM, MgCl2 3 mM, pH 7,2).
Les bactéries sont lysées par incubation en présence de lysozyme (15000 unités/ml) et de mutanolysine (15 unités/ml), dans le tampon de purification. Après incubation pendant 30 minutes à 30~C puis 30 minutes à
20~C, le lysat est centrifugé à 20000g pendant 60 minutes. Le surnageant est conservé.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
a) Précipitation des acides nucléiques:
Le surnageant obtenu précédemment est traité
par l'addition d'une solution à 2% (p/v) de protamine sulfate (rapport protamine sulfate : protéines = 0,3), afin de précipiter les acides nucléiques. La solution est centrifugée à 20000 x g pendant 50 minutes.
b) Précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium:
Le surnageant est recueilli et additionné de sulfate d'ammonium à 95% de saturation. Après 45 minutes d'agitation lente, l'ensemble est centrifugé 20 minutes à
20000g et le surnageant est soumis à une deuxième préci-pitation par le sulfate d'ammonium à 60% de saturation. ;
l'ensemble est agité lentement pendant 45 minutes, puis centrifugé pendant 20 minutes à 20000g ; le culot est remis en suspension dans l0 ml de tampon de purification.
c) Filtration sur gel :
Le culot resuspendu est injecté sur une colonne de filtration sur gel SEPHACRYL S-300 HR
(l00x2,5 cm), préalablement équilibrée avec le tampon de J ~ l5J
puriflcation ; des fractions de 5 ml sont recueillies, à
un débit de 30 ml/h ; les fractions 38 à 41 sont - conservées.
d) Chromatographle d'échange d'ions :
Les fractions recueillies précédemment sont injectées sur une colonne FPLC (Mono Q 10/10, Pharmacia, Uppsala, Suède), équilibrée avec le tampon de purifica-tion dont la molarité en phosphate a été ramenée à 50mM.
Les protéines retenues sur la colonne sont éluées avec le tampon de purification dont la force ionique a été aug-mentée suivant un gradient linéaire de NaCl de 0 à 1 M.
La citrate lyase est éluée à 300mM, en un seul pic.
Le Tableau V ci-après résume les différentes étapes de la purification.
TABLEAU V
ETAPE ACTIVITE PROTEINES ACTIVITERENDEMENT
DE TOTALE TOTALESSPECIFIQUE (~i) PURIFICATION (4U /ml) (mg/ml)(U /mg~
EXTRAIT 739 2852,6 100 20 CELLULAIRE ..
SULFATE DE 686 2223,1 93 PROTAMINE
60% SULFATE 279 1701,6 38 D'AMMONIUM
FILTRATION 194 17 11,4 26 SUR GEL
ECHANGE 116 0,9 129 16 Unité citrate lyase : quantité de cltrate consommé, en ~mol/mn et à 30~C
4/ CARACTERISATION DL LA PR~PARATION PURIFIEE
DE CITRATE LYASE
- La fraction purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (15% d'acry-lamide) en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS). 3 bandes sont observées qui correspondent aux sous-unités ~, ~, et y, à des poids moléculaires respectifs de 55, 33, et 11 kDa. Cette fraction purifiée est utilisée comme immunogène.
Exemple 3 : Obtention d'une préparation purifiée de X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis subsp. lactis.
TURE
Une souche de Lactococcus lactis subsp.
lactis, désignée par le numéro NCDO 763 a été obtenue auprès de la National Collection of Food Bacteria (Shinfield, Reading, UK).
Des cultures sont effectuées sur un milieu M
17 (Difco) et à une température de 30 C.
A la fin de la phase de croissance exponen-tielle, les cellules sont centrifugées à 8000 g pendant 15 minutes et lavées trois fois dans du tampon ~-glycérophosphate 0,05M, CaCl2 0,02M, pH 7.
Des sphéroplastes sont obtenus selon la procé-dure décrite à l'Exemple l.
Après la lyse des sphéroplastes, la suspension est centrifugée à 20000 x g pendant 30 minutes pour séparer l'extrait acellulaire des membranes et des débris de parois cellulaires.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
L'enzyme est purifiée suivant la procédure décrite par ~ZEVACO et al., Journal of Applied Bacteriology, 68, 357-366, (1990)]
~ a~
B) Obtention et caractérisation de pré-~rations d'anticorps.
- ~xemple 4: Préparation d'anticorps polyclonaux anti-aminopeptidase a) Obtention d'anticorps chez le lapin et la souris.
100 ~g d'une préparation d'enzyme purifiée se-lon le protocole décrit dans l'exemple 1, additionnée d'adjuvant complet de Freund sont injectés à des lapins.
Des injections de rappel mensuelles sont effectuées en utilisant 50 ~g d'enzyme additionnée d'adjuvant incomplet de FREUND. Les lapins sont saignés 5r 10 et 15 jours après chaque injection de rappel.
L'immunsérum est obtenu par centrifugation du sang à 10000 x g pendant 10 minutes.
Le même protocole est utilisé pour la produc-tion d'anticorps chez des souris Balb/c. Dans ce cas la quantité d'aminopeptidase injectée est de 5~g.
b) Démonstration de la spécificité des anti-corps obtenus (transfert immunoélectrophorétique):
Après électrophorèse des échantillons conte-nant soit l'extrait acellulaire, soit l'enzyme purifiée, les protéines séparées sur le gel sont transférées sur une feuille de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBI~ et al. (Pro. Natl. Acad. Sci. USA
(1979),76:4350-4354). La feuille de nitrocellulose est ensuite incubée dans une solution contenant 5% de lait écrémé, dans le but d'éviter une adsorption non spé-cifique des anticorps, puis incubée avec l'immunsérum de lapin anti-aminopeptidase dilué au 1/500. La réaction an-tigène-anticorps est mise en évidence par incubation avec un immunsérum de chèvre anti-immunoglobuline de lapin, conjugué à la peroxydase, et dilué au l/1000. La réaction de la peroxydase est visualisée en utilisant comme sub-strat le 4-chloro-1-naphtol.
Aussi bien dans le cas de la préparation d'enzyme purifiée, que dans celui de l'extrait acellu-- laire total, une seule bande est mise en évidence par l'immunsérum de lapin ou de souris anti-aminopeptidase.
Ceci montre que les immunsérums obtenus sont spécifiques de l'aminopeptidase purifiée.
Les anticorps anti-aminopeptidase ainsi obte-nus ont été testés contre différentes souches de bacté-ries, en particulier de bactéries lactiques.
L'aminopeptidase a ainsi été détectée chez toutes les souches de lactocoques testées (Lactococcus lactis ssp.
lactis, ssp. cremoris, et ssp. lactis biovar diacetylactis). En revanche, elle n'a été détectée chez aucune souche de Lactobacillus, Streptococcus, et Leuconostoc. En outre, ces anticorps ne présentent aucune réaction croisée avec une protéine de 95kDa qui correspond à l'aminopeptidase, purifiée par TAN et KONINGS [Appl. Environ. Microbiol., 56, 526-532 (1990)]
chez Lactococcus lactis ssp cremoris WG2.
Exemple 5 : Préparation et caractérisation d'anticorps polyclonaux anti-X-Prolyl dipeptidyl peptidase a) Obtention d'anticorps chez le lapin :
Un immunsérum est obtenu chez le lapin, selon le protoco-le d'immunisation décrit dans l'exemple 4, en utilisant, pour la première injection, 100 ~g de X-Prolyl dipeptidyl peptidase purifiée comme décrit dans l'exemple 3. Les injections de rappel sont effectuées en utilisant 50 ~g d'enzyme.
b) Démonstration de la spécificité des anti-corps obtenus (transfert immunoélectrophorétique):
Des échantillons contenant soit l'extrait acellulaire, soit l'enzyme purifiée, sont transférés après électrophorèse, sur une feuille de nitrocellulose et incubés avec l'immun sérum comme décrit précédemment.
~. ~ '3 ~
Aussi bien dans le cas de la préparation d'enzyme puri-fiée, que dans celui de l'extrait acellulaire total, une - seule bande, à 85kDa, est mise en évidence par l'immunsérum de lapin anti-X-Prolyl dipeptidyl peptidase.
Les anticorps anti-X-Prolyl dipeptidyl pepti-dase ainsi obtenus ont été testés contre 4 souches de lactocoques La X-Prolyl dipeptidyl peptidase a été
détectée chez toutes ces souches : Lactococcus lactis ssp. lactis, ssp. cremoris, et ssp. lactis biovar diacetylactis.
Exemple 6 : Préparation et caractérisation d'anticorps polyclonaux anti-citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis a) Obtention d'anticorps chez le lapin :
Un immunsérum est obtenu chez le lapin, selon le protocole d'immunisation décrit dans l'exemple 4, en utilisant, pour la première injection, 100 ~g de citrate lyase purifiée comme décrit dans l'exemple 2. Les injec-tions de rappel sont effectuées en utilisant 50 ~g d'enzyme.
b) Démonstration de la spécificité des anti-corps obtenus (transfert immunoélectrophorétique):
Le transfert immunoélectrophorétique est effectué comme décrlt précédemment, soit avec l'extrait acellulaire, soit avec l'enzyme purifiée. Dans les 2 cas, deux bandes, à 55 et 33 kDa, apparaissent qui correspon-dent aux sous-unités ~ et ~ de la citrate lyase.
L'immunsérum obtenu a été testé contre 6 souches de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis. Les sous-unités ~ et ~ de la citrate lyase ont été détectées chez toutes ces souches. En revanche, aucune bande n'apparait chez Lactococcus lactis ssp.
lactis, et ssp. cremoris .
L'immunsérum a également été testé chez 6 souches de Leuconostoc. Une bande correspondant à la ~ ~ 3 ~ ~3 sous-unité ~ est reconnue chez les 6 souches ; la sous-unité ~ n'est reconnue que chez les 2 souches de - Leuconostoc lactis et les 2 souches de Leuconostoc mesenteroides, mais pas chez Leuconostoc cremoris.
Parmi les lactobacilles, l'immunsérum recon-naît également Lactobacillus brevis.
Exemple 7 : Préparation et caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis a) Préparation des anticorps monoclonaux :
Des souris sont sensibilisées à la citrate lyase suivant le protocole d'immunisation décrit à
l'exemple précédent. Les anticorps monoclonaux sont pré-parés selon le protocole de KOHLER et MILSTEIN [~ature, 256, 495-497, (1975)~ Trois jours avant la fusion cellu-laire, les souris subissent une dernière injection d'enzyme purifiée (50~g).
Les lymphocytes de la rate sont ensuite récol-tés et fusionnés à des cellules myélomateuses de souris (X63) compatibles, par adjonction de polyéthylène glycol 1500 (Boehringer).
Des hybridomes produisant des anticorps qui reconnaissent à la fois la préparation purifiée de citrate lyase et les extraits cellulaires sont ensuite sélectionnés et clonés. Les propriétés des anticorps sécrétés par ces hybridomes sont indiquées dans le Tableau IV ci-apr~s.
~ ~ 3 ~
TABLEAU VI
ANTICORPS CL~l) CL(2) CL(3) SOUS- CLASSE
UNITE D'Ig 1.2>1000 >1000 >1000 a M .
1.17 1 12 >1000 a G2a 2.20 4 40 >1000 a G1 2.F6 4 40 >1000 a G1 2.G3 4 40 >1000 a G1
5.12 4 40 >1000 a G1 10 7.12 110 110 >1000 a G2b 7.22 90 12 330 a G1 8.23>1000>1000 >1000 a nd 9.9 12 4 330 a G1 9.11 500 40 >1000 ~ G1 15 9.19 4 4 330 a G1 13.13 1 40 >1000 a G2b 16.16 4 110 >1000 a G1 CL(1), CL(2), CL(3) : concentration d'antigène (ng/ml) pour DO414 = 0,6 CL(1) : citrate lyase CL(2) : citrate lyase dénaturée (60~C 5 minutes) CL(3) : citrate lyase dénaturée (70~C 20 minutes) La spécificité de souche et la spécificité
d'espèce de 8 de ces anticorps monoclonaux ont également été étudiées par immunoélectrotransfert.
Pour chacun des anticorps testés, aucune différence n'est observée entre les profils obtenus avec 5 souches différentes de Lactococcus lactis ssp lactis biovar diac~tylactis.
Les résultats obtenus sur Leuconostoc sont indiqu~s dans le Tableau VII suivant :
~ ~ ~ 'i,3 ii ,J ~)3 TABLEAU ~rII
SO~CHE l l7 ~ 12 7 12 7.22 9.11 9.I9 13.23 l6.l6 ~t j 1 = Leuconostoc cremoris 2 = Leuconostoc mesenteroides 3 = Leuconostoc lactis (+) reconnaissance en immunoélectrotransfert (-) pas de reconnaissance en lmmunoélectrotransfert II/ UTILISATION DES REACTIFS CONFORMES A
L'INVENTION POUR L'EVALUATION D'UNE POPULATION BACTE-RIENNE
Exemple 8 : Utilisation d'anticorps polyclonaux anti-aminopeptidase Des anticorps anti-aminopeptidase obtenus comme décrit à l'exemple 4, ont été utilisés pour mesurer la quantité d'aminopeptidase présente dans un milieu de fermentation contenant la souche Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2, après lyse des bactéries par sonica-tion. Dans ce but, des techniques immunoenzymatiques de type ELISA ont été utilisées. La formation du complexe antigène-anticorps est révélée, à l'aide d'anticorps mar-qués à la peroxydase, en utilisant comme substrat le 2,2'-azino-di-(3)-(éthylbenzothiazoline)-6'-sulfonate, et la détection est faite à 414 nm.
A/ Détermination de la sensibilité du dosage.
Cette détermination a été faite en utilisant comme préparation antigénique témoin la préparation d'aminopeptidase obtenue selon le procédé décrit à
l'exemple l. Elle a permis d'établir des courbes d'étalonnage.
La figure 1 montre la courbe d'étalonnage ob-tenue par ELISA direct en utilisant un anti-sérum de la-- pin, obtenu selon la procédure décrite à l'exemple 3, à
différentes dilutions: (b) 1/3000, (-) 1/9000, (X) 1/27000.
La figure 2 montre la courbe d'étalonnage ob-tenue par ELISA sandwich en utilisant un premier anti-sé-rum de lapin dilué au 1/1000 et un deuxième anti-sérum de souris, également dirigé contre l'aminopeptidase, dilué
au 1/1000 (O) ou au 1/3000 (-).
Les seuils de détection déterminée pour une densité optique de 0,1 de l'aminopeptidase purifiée sont respectivement de 10 et 6 ng/ml, par test ELISA direct ou sandwich, pour les plus faibles dilutions de sérum utilisées.
B/ Dosage de la concentration en aminopepti-dase dans un lysat bactérien.
- Obtention du lysat bactérien :
Des lysats ont été obtenus par sonication des cultures de Lactococcus lactis. Pour optimiser la libéra-tion d'aminopeptidase, la sonication a été réalisée en 3 fois 30 secondes, ou 6 fois 15 secondes, avec une puis-sance de 23 watts - Dosage de l'aminopeptidase dans le lysat bactérien -Ce dosage est effectué par une méthode ELISA
sandwich utilisant un premier anti-sérum de lapin dilué
au l/1000 et un deuxième anti-sérum de souris dilué au 1/1000 ou au 1/3000.
La figure 3 montre les résultats obtenus :
(O) 1/1000, (-) 1/3000.
Il est possible de détecter l'aminopeptidase pour une densité optique de 0,1 à partir de 300 ng/ml de protéines totales, soit environ ~ ng/ml d'équivalent aminopeptidase purifiée.
C/ Evolution de la concentration en aminopep-tidase au cours de la croissance d'une culture de Lacto-coccus lactis subsp. cremoris AM2.
La figure 4 montre l'évolution de la concen-tration d'aminopeptidase, mesurée à l'aide de réactifsconformes à l'invention, au cours de la croissance de L.
lactis ssp cremoris AM2 en culture pure sur lait ; une évolution parallèle est observée en culture mixte.
La figure 5 montre la corrélation, au cours de la croissance de L. lactis sp cremoris AM2 en culture pure sur lait, entre l'activité enzymatique aminopepti-dase mesurée (suivant la procédure décrite à l'exemple 1) sur cellules entières, et la concentration en aminopepti-dase, mesurée par ELISA sur un lysat bactérien à l'aide des réactifs conformes à l'invention .
La figure 6 montre une corrélation linéaire entre le logarithme de la population bactérienne (expri-mée en cfu/ml) et la quantité d'aminopeptidase présente dans le lysat bactérien, exprimée en absorbance à 414 nm.
Cette relation est valable pour une population comprise entre 105 et 101~ cfu/ml.
Exemple 9 : Utilisation d'anticorps polyclo-naux anti-citrate lyase La figure 7 montre l'évolution de la concen-tration en- citrate lyase, mesurée par ELISA sandwich à
l'aide des anticorps obtenus à l'exemple 6 (O), au cours de la croissance de ~. lactis ssp lactis biovar diacetylactis, en culture pure, parallèlement à
l'évolution de la population bactérienne, mesurée par comptage des colonies (-).
Des résultats identiques sont obtenus en cul-ture mixte.
Exemple 10 : Utilisation d'anticorps monoclo-naux anti-citrate lyase La figure 8 montre l'évolution de la concen-tration en citrate lyase, mesurée par ELISA sandwich à
l'aide de l'anticorps monoclonal 2-20 (O) , au cours de la croissance de L. lactis ssp lactis biovar diacetylactis en culture pure, parallèlement à
l'évolution de la population bactérienne, mesurée par comptage des colonies (-). Des résultats identiques sont obtenus en culture mixte.
33 ND d~ la dem~jj1de ;nt~rn~tlOnltl~: PCT/
MlCRO-ORGANlSMi S
Feuille IDCUIII tive rel~th e ~u micro-orpani~me monoonne ~n pa~e 9 li~n~ 3 ~ 7 d~ 1- d-~cripllon ' A IDENTIFICATION DU Dt'POT ' ~ e~ pplemontalre J[~ p. 34 e-t 35 Nom ds l'institution de deDot ~
COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
(CNCM) Adre~se do l'institullon de dbpot (y compri~ Io code po~tal et lo psy~
INSTITUT PASTEUR
28, rue du Docteur Roux --- 7-';7~4_~RIS_(FRANCE) Da~e du depo~ r N d'ordre ~
B INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES ~ (b ne remPlir que ~I nece~-sire) Une teuille ~~p~re~ joln~e pour la ~uite de ce~
r~ngeipnement~ l En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet Européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé
sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet Européen ou jusau'à la date à laquelle sera regetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant.
(règle 28.4) de la CBE).
C ETATS DESIGNES POUR LESI~UELS LES INDICATIONS ':ONT DoNiNtES ~ (d le~ indicAUon~ ne ~on~ pA~ donnee~ pour tou- les Eta~s desi~nees) _ D INDICATIONS FOURI~IES SEPAREMENT Y (a ne rempllr rlue ~i neco~lre) _ _ ___ _ _ Les indlcation- enumere~ ci-~Dr~ ~eront ~oumi~ ulterieuroment ~u Bure-u internation~l r (~peclner 1~ nature ~sner~lo de~ indi-cation~ p e~ ~No d'ordre du depot1 ) E [~1 La presente teuille ~ éRi reCue avec In demande in~ernaUonale lor~rtue celle-a n e~e depo~ee (a verlfier par roffice recep~eur) (FonctlonnAlre ~utorlse) [~ D~to de recep~ion (en proven~nce dù deposanB p~r le Bureau inlernation~
(Fonctlonn~lrs ~ulo~i~e) FormuNire PCTIRO/134 (Janvier 1931) 34 Nodelademandeinternatlonltle:PCTI ~ 3~, t~
MICRO-ORGANISMES
Feuille Mcul~ativ- rolUive au micro oroaniame menlionne en Pap7e 9 lion~ 8-- 12de 1- d-acnPtlon ' A IOENTIFICATION DU DtPoT 7 D'autre~ d~ools sont idnntifles ~ur une huille SUDplemantAlra 3 ~ p. 33 et 35 Nom de l'in~titution de dbPot ' COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
(CNCM) Adre~e de l'in~titutlon de depdt (y compri~ Ie code Pot7tal et le paya) t INSTITUT PASTEUR
28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS (FRANCE) Date du depot ~ ~ N d'ordre ~
B INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES 7 (à ne remplir que a~ noceaaaira~ Une t-uill- ~- ptr~- ~-t plnt- pour llt auite de cea renaeit7nement~ [~
En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet Européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé
ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet Européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requéran .
(règle 28.4. de la CBE).
C ÉTATS DESICNÉS POUR LESl~UELS LES INDICATIONS SONT DoNNtES ~ - indicAtiona no aont pA~ donnee- pour tou~ Ie~ Etats dé~ignoA) _ _ D INDICATIONS FOURNlECt SEPARÉMENT ~ ta ne rempllr que U n0ce~lro) Le~ indkAtion~ enum~r~aa ci-Apr~a ~ront ~oumh-~ ulterleur~m-nt AU i3ur~au intr rnAtionAI ~ (-p-cifler IA nAtUre oener~la da~ Indi-cation~ D e~ ~No d'ordro du dopoN-) E O La pr~senta feuille a éte rocu- AV0C kt damAnde InternAtlonAla lor~qu~ cello-c~ a U~ depod- (~ vorlfler p~r l'oflice r;7cepteur) (FonctlonnAire AUtOd~O) O Date da Ncaption (an provanAnce du depo~nnt) PAr la E~ureAu internetion~
(Fonctionnalro Autorl~e) Formulaire PCT!RO/134 (Jltn~ier 1981~
35 No d~t la d~mltnde intQrnstlon~tle: PCT/ 1 MlCRO~ORGANlSh~ES
Fouill~ t~cultativo relative ~u micro-or~ani-me montionne en paoe 9 lign~ 13--17 de b d~oc~iption ' A IDENTIFICATION DU DÉPOT ~
D'autree dePot~ sont identifie~ sur uno fouille supplementAire J [~ p. 33 et 34 Nom de l'institution de dopdt ' COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
(CNCM) Adres~o de l'institution do depot (~ compri~ Ie code postal et 19 pay~) ~
INSTITUT PASTEUR
28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS (FRANCE) Date du dapOt s ¦ N d'ordre ~
B. INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ~ (a ne remplir que ~i nbcrJ~rr~) Une hu~ dop~b~ ~t jotnte pour 1~ ~uite do ~e~
ren~ei~nement~
En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet Européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet Européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert dési-gné par le requérant.
(règle 28.4 de la CBE).
C ÉTAT5 DESIGNES POUR LESOUELS LES INDICATIONS SONT DONNEEtl ~ (~i lo~ indic~tlon~ ne ~ont pa~ donn~o~ pour tou~ 109 Etat~ de~iqnos) -I
D INDICATIONS FOURNIES StPAREMENT ~ (~ nrl romplir que ~i nece~ir~) Le~ indic~ttlon~ enumeree~ ci apr~ ronl ~ouml-rlo ult~rleuremenl ~u Ltur-au int~n~t~on~ p~lller 1~ n~ture peneral~ do~ Indi-collon~ p eI ~No d'ordre du d~pol~) E. O L~ presonte leuillo a ete rocue avoc la demande Internationalo lor~que celle-ci a bto dbpo~be (e verifier par rofrlce rocepteur) (Fonctlonn~ire ~utori~e) O Date de ~ecoption (on provonanc~ du ddpo~ant) plr lo E~uro~u internUion~l ' (FonctionnDiro autori~e) Formulairo PCT/RO/13~ (Jrlnvior 1981)
d'espèce de 8 de ces anticorps monoclonaux ont également été étudiées par immunoélectrotransfert.
Pour chacun des anticorps testés, aucune différence n'est observée entre les profils obtenus avec 5 souches différentes de Lactococcus lactis ssp lactis biovar diac~tylactis.
Les résultats obtenus sur Leuconostoc sont indiqu~s dans le Tableau VII suivant :
~ ~ ~ 'i,3 ii ,J ~)3 TABLEAU ~rII
SO~CHE l l7 ~ 12 7 12 7.22 9.11 9.I9 13.23 l6.l6 ~t j 1 = Leuconostoc cremoris 2 = Leuconostoc mesenteroides 3 = Leuconostoc lactis (+) reconnaissance en immunoélectrotransfert (-) pas de reconnaissance en lmmunoélectrotransfert II/ UTILISATION DES REACTIFS CONFORMES A
L'INVENTION POUR L'EVALUATION D'UNE POPULATION BACTE-RIENNE
Exemple 8 : Utilisation d'anticorps polyclonaux anti-aminopeptidase Des anticorps anti-aminopeptidase obtenus comme décrit à l'exemple 4, ont été utilisés pour mesurer la quantité d'aminopeptidase présente dans un milieu de fermentation contenant la souche Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2, après lyse des bactéries par sonica-tion. Dans ce but, des techniques immunoenzymatiques de type ELISA ont été utilisées. La formation du complexe antigène-anticorps est révélée, à l'aide d'anticorps mar-qués à la peroxydase, en utilisant comme substrat le 2,2'-azino-di-(3)-(éthylbenzothiazoline)-6'-sulfonate, et la détection est faite à 414 nm.
A/ Détermination de la sensibilité du dosage.
Cette détermination a été faite en utilisant comme préparation antigénique témoin la préparation d'aminopeptidase obtenue selon le procédé décrit à
l'exemple l. Elle a permis d'établir des courbes d'étalonnage.
La figure 1 montre la courbe d'étalonnage ob-tenue par ELISA direct en utilisant un anti-sérum de la-- pin, obtenu selon la procédure décrite à l'exemple 3, à
différentes dilutions: (b) 1/3000, (-) 1/9000, (X) 1/27000.
La figure 2 montre la courbe d'étalonnage ob-tenue par ELISA sandwich en utilisant un premier anti-sé-rum de lapin dilué au 1/1000 et un deuxième anti-sérum de souris, également dirigé contre l'aminopeptidase, dilué
au 1/1000 (O) ou au 1/3000 (-).
Les seuils de détection déterminée pour une densité optique de 0,1 de l'aminopeptidase purifiée sont respectivement de 10 et 6 ng/ml, par test ELISA direct ou sandwich, pour les plus faibles dilutions de sérum utilisées.
B/ Dosage de la concentration en aminopepti-dase dans un lysat bactérien.
- Obtention du lysat bactérien :
Des lysats ont été obtenus par sonication des cultures de Lactococcus lactis. Pour optimiser la libéra-tion d'aminopeptidase, la sonication a été réalisée en 3 fois 30 secondes, ou 6 fois 15 secondes, avec une puis-sance de 23 watts - Dosage de l'aminopeptidase dans le lysat bactérien -Ce dosage est effectué par une méthode ELISA
sandwich utilisant un premier anti-sérum de lapin dilué
au l/1000 et un deuxième anti-sérum de souris dilué au 1/1000 ou au 1/3000.
La figure 3 montre les résultats obtenus :
(O) 1/1000, (-) 1/3000.
Il est possible de détecter l'aminopeptidase pour une densité optique de 0,1 à partir de 300 ng/ml de protéines totales, soit environ ~ ng/ml d'équivalent aminopeptidase purifiée.
C/ Evolution de la concentration en aminopep-tidase au cours de la croissance d'une culture de Lacto-coccus lactis subsp. cremoris AM2.
La figure 4 montre l'évolution de la concen-tration d'aminopeptidase, mesurée à l'aide de réactifsconformes à l'invention, au cours de la croissance de L.
lactis ssp cremoris AM2 en culture pure sur lait ; une évolution parallèle est observée en culture mixte.
La figure 5 montre la corrélation, au cours de la croissance de L. lactis sp cremoris AM2 en culture pure sur lait, entre l'activité enzymatique aminopepti-dase mesurée (suivant la procédure décrite à l'exemple 1) sur cellules entières, et la concentration en aminopepti-dase, mesurée par ELISA sur un lysat bactérien à l'aide des réactifs conformes à l'invention .
La figure 6 montre une corrélation linéaire entre le logarithme de la population bactérienne (expri-mée en cfu/ml) et la quantité d'aminopeptidase présente dans le lysat bactérien, exprimée en absorbance à 414 nm.
Cette relation est valable pour une population comprise entre 105 et 101~ cfu/ml.
Exemple 9 : Utilisation d'anticorps polyclo-naux anti-citrate lyase La figure 7 montre l'évolution de la concen-tration en- citrate lyase, mesurée par ELISA sandwich à
l'aide des anticorps obtenus à l'exemple 6 (O), au cours de la croissance de ~. lactis ssp lactis biovar diacetylactis, en culture pure, parallèlement à
l'évolution de la population bactérienne, mesurée par comptage des colonies (-).
Des résultats identiques sont obtenus en cul-ture mixte.
Exemple 10 : Utilisation d'anticorps monoclo-naux anti-citrate lyase La figure 8 montre l'évolution de la concen-tration en citrate lyase, mesurée par ELISA sandwich à
l'aide de l'anticorps monoclonal 2-20 (O) , au cours de la croissance de L. lactis ssp lactis biovar diacetylactis en culture pure, parallèlement à
l'évolution de la population bactérienne, mesurée par comptage des colonies (-). Des résultats identiques sont obtenus en culture mixte.
33 ND d~ la dem~jj1de ;nt~rn~tlOnltl~: PCT/
MlCRO-ORGANlSMi S
Feuille IDCUIII tive rel~th e ~u micro-orpani~me monoonne ~n pa~e 9 li~n~ 3 ~ 7 d~ 1- d-~cripllon ' A IDENTIFICATION DU Dt'POT ' ~ e~ pplemontalre J[~ p. 34 e-t 35 Nom ds l'institution de deDot ~
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B INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES ~ (b ne remPlir que ~I nece~-sire) Une teuille ~~p~re~ joln~e pour la ~uite de ce~
r~ngeipnement~ l En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet Européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé
sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet Européen ou jusau'à la date à laquelle sera regetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant.
(règle 28.4) de la CBE).
C ETATS DESIGNES POUR LESI~UELS LES INDICATIONS ':ONT DoNiNtES ~ (d le~ indicAUon~ ne ~on~ pA~ donnee~ pour tou- les Eta~s desi~nees) _ D INDICATIONS FOURI~IES SEPAREMENT Y (a ne rempllr rlue ~i neco~lre) _ _ ___ _ _ Les indlcation- enumere~ ci-~Dr~ ~eront ~oumi~ ulterieuroment ~u Bure-u internation~l r (~peclner 1~ nature ~sner~lo de~ indi-cation~ p e~ ~No d'ordre du depot1 ) E [~1 La presente teuille ~ éRi reCue avec In demande in~ernaUonale lor~rtue celle-a n e~e depo~ee (a verlfier par roffice recep~eur) (FonctlonnAlre ~utorlse) [~ D~to de recep~ion (en proven~nce dù deposanB p~r le Bureau inlernation~
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MICRO-ORGANISMES
Feuille Mcul~ativ- rolUive au micro oroaniame menlionne en Pap7e 9 lion~ 8-- 12de 1- d-acnPtlon ' A IOENTIFICATION DU DtPoT 7 D'autre~ d~ools sont idnntifles ~ur une huille SUDplemantAlra 3 ~ p. 33 et 35 Nom de l'in~titution de dbPot ' COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
(CNCM) Adre~e de l'in~titutlon de depdt (y compri~ Ie code Pot7tal et le paya) t INSTITUT PASTEUR
28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS (FRANCE) Date du depot ~ ~ N d'ordre ~
B INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES 7 (à ne remplir que a~ noceaaaira~ Une t-uill- ~- ptr~- ~-t plnt- pour llt auite de cea renaeit7nement~ [~
En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet Européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé
ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet Européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requéran .
(règle 28.4. de la CBE).
C ÉTATS DESICNÉS POUR LESl~UELS LES INDICATIONS SONT DoNNtES ~ - indicAtiona no aont pA~ donnee- pour tou~ Ie~ Etats dé~ignoA) _ _ D INDICATIONS FOURNlECt SEPARÉMENT ~ ta ne rempllr que U n0ce~lro) Le~ indkAtion~ enum~r~aa ci-Apr~a ~ront ~oumh-~ ulterleur~m-nt AU i3ur~au intr rnAtionAI ~ (-p-cifler IA nAtUre oener~la da~ Indi-cation~ D e~ ~No d'ordro du dopoN-) E O La pr~senta feuille a éte rocu- AV0C kt damAnde InternAtlonAla lor~qu~ cello-c~ a U~ depod- (~ vorlfler p~r l'oflice r;7cepteur) (FonctlonnAire AUtOd~O) O Date da Ncaption (an provanAnce du depo~nnt) PAr la E~ureAu internetion~
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35 No d~t la d~mltnde intQrnstlon~tle: PCT/ 1 MlCRO~ORGANlSh~ES
Fouill~ t~cultativo relative ~u micro-or~ani-me montionne en paoe 9 lign~ 13--17 de b d~oc~iption ' A IDENTIFICATION DU DÉPOT ~
D'autree dePot~ sont identifie~ sur uno fouille supplementAire J [~ p. 33 et 34 Nom de l'institution de dopdt ' COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES
(CNCM) Adres~o de l'institution do depot (~ compri~ Ie code postal et 19 pay~) ~
INSTITUT PASTEUR
28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS (FRANCE) Date du dapOt s ¦ N d'ordre ~
B. INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ~ (a ne remplir que ~i nbcrJ~rr~) Une hu~ dop~b~ ~t jotnte pour 1~ ~uite do ~e~
ren~ei~nement~
En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet Européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet Européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert dési-gné par le requérant.
(règle 28.4 de la CBE).
C ÉTAT5 DESIGNES POUR LESOUELS LES INDICATIONS SONT DONNEEtl ~ (~i lo~ indic~tlon~ ne ~ont pa~ donn~o~ pour tou~ 109 Etat~ de~iqnos) -I
D INDICATIONS FOURNIES StPAREMENT ~ (~ nrl romplir que ~i nece~ir~) Le~ indic~ttlon~ enumeree~ ci apr~ ronl ~ouml-rlo ult~rleuremenl ~u Ltur-au int~n~t~on~ p~lller 1~ n~ture peneral~ do~ Indi-collon~ p eI ~No d'ordre du d~pol~) E. O L~ presonte leuillo a ete rocue avoc la demande Internationalo lor~que celle-ci a bto dbpo~be (e verifier par rofrlce rocepteur) (Fonctlonn~ire ~utori~e) O Date de ~ecoption (on provonanc~ du ddpo~ant) plr lo E~uro~u internUion~l ' (FonctionnDiro autori~e) Formulairo PCT/RO/13~ (Jrlnvior 1981)
Claims (19)
1) Réactif de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fer-mentation, lequel réactif est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une préparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, obtenue en utilisant comme immunogène une préparation purifiée d'une enzyme de micro-organismes intervenant dans le processus de fermentation, et dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré
d'évolution dudit processus de fermentation.
d'évolution dudit processus de fermentation.
2) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre une enzyme de bactéries lactiques choisie dans le groupe comprenant l'aminopeptidase de Lactococcus lactis ssp.
cremoris, la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp.
lactis biovar. diacetylactis, la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp. lactis,
cremoris, la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp.
lactis biovar. diacetylactis, la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp. lactis,
3) Réactif de dosage immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé
contre l'aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp.
cremoris.
en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé
contre l'aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp.
cremoris.
4) Réactif de dosage immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé
contre la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp. lactis.
en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé
contre la X-prolyl dipeptidyl peptidase de Lactococcus lactis ssp. lactis.
5) Réactif de dosage immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé
contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal dirigé
contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
6) Réactif de dosage immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé
en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal dirigé
contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal dirigé
contre la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
7) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal de classe IgG1, qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité .alpha. de la citrate lyase.
8) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal de classe IgG2a, qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité .alpha. de la citrate lyase.
9) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal de classe IgG2b, qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité .alpha. de la citrate lyase.
10) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal de classe IgG1, qui reconnait un épitope situé sur la sous-unité .beta. de la citrate lyase.
11) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps monoclonal de classe IgM, qui reconnait un épi-tope situé-sur la sous-unité .alpha. de la citrate lyase.
12) Procédé de détermination du degré
d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé
en ce qu'il comprend au moins une étape dans laquelle on met en contact un échantillon prélevé dans la masse fer-mentaire avec un réactif immunochimique selon l'une que-lconque des revendications 1 à 11, et une étape au cours de laquelle on mesure, par tous moyens appropriés, la quantité de l'enzyme ou des enzymes recherchée(s) ayant réagi avec le ou les anticorps présent(s) dans le réactif.
d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé
en ce qu'il comprend au moins une étape dans laquelle on met en contact un échantillon prélevé dans la masse fer-mentaire avec un réactif immunochimique selon l'une que-lconque des revendications 1 à 11, et une étape au cours de laquelle on mesure, par tous moyens appropriés, la quantité de l'enzyme ou des enzymes recherchée(s) ayant réagi avec le ou les anticorps présent(s) dans le réactif.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, préalablement au dosage, on soumet l'échantillon prélevé dans la masse fermentaire à un traitement approprié, de façon à lyser les microorga-nismes présents dans l'échantillon.
14) Préparation purifiée d'enzyme issue de microorganismes, susceptible d'être utilisée comme immunogène pour l'obtention de réactifs selon la revendi-cation 1, et caractérisée en ce qu'elle est constituée par une préparation d'une enzyme de bactéries lactiques choisie dans le groupe comprenant l'aminopeptidase de Lactococcus lactis ssp. cremoris, et la citrate lyase de Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis.
15) Préparation purifiée d'une enzyme issue de microorganismes, selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation purifiée d'aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris, en ce que ladite aminopeptidase a un poids moléculaire de 300 kDa, en ce qu'elle est composée de 6 sous-unités identiques, non reliées entre elles par des ponts disulfure, et contenant la séquence polypeptidique N-terminale suivante : Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
16) Kit de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fer-mentation, lequel kit est caractérisé en ce qu'il com-prend au moins un réactif immunochimique selon une quel-conque des revendications 1 à 11, ainsi que les moyens de révélation usuels permettant la mise en évidence d'une réaction antigène/anticorps.
17) Hybridome, déposé le 29 Août 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), sous le numéro de dépôt I-994 et caractérisé en ce qu'il sécrète un anticorps monoclonal selon la Revendication 8, lequel anticorps est dénommé
anticorps 1.17.
anticorps 1.17.
18) Hybridome, déposé le 29 Août 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), sous le numéro de dépôt I-995 et caractérisé en ce qu'il sécrète un anticorps monoclonal selon la Revendication 7, lequel anticorps est dénommé
anticorps 9.9.
anticorps 9.9.
19) Hybridome, dépose le 29 Août 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), sous le numéro de dépôt I-995 et caractérisé en ce qu'il sécrète un anticorps monoclonal selon la Revendication 10, lequel anticorps est dénommé
anticorps 9.11.
anticorps 9.11.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8911432 | 1989-08-31 | ||
| FR8911432A FR2651328B1 (fr) | 1989-08-31 | 1989-08-31 | Reactifs et methodes immunochimiques pour la mesure de la croissance des microorganismes et de la quantite de proteines au cours d'une fermentation industrielle. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2039178A1 true CA2039178A1 (fr) | 1991-03-01 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CA002039178A Abandoned CA2039178A1 (fr) | 1989-08-31 | 1990-08-31 | Reactifs et methodes immunochimiques pour la mesure de la croissance de microorganismes et de la quantite de proteines au cours d'une fermentation industrielle |
Country Status (7)
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|---|---|
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| JP (1) | JPH04503115A (fr) |
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Family Cites Families (1)
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-
1989
- 1989-08-31 FR FR8911432A patent/FR2651328B1/fr not_active Expired - Fee Related
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1990
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- 1990-08-31 EP EP90913709A patent/EP0440781A1/fr not_active Withdrawn
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| AU6401990A (en) | 1991-04-08 |
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| FR2651328A1 (fr) | 1991-03-01 |
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| FZDE | Dead |