FR2651328A1 - Reactifs et methodes immunochimiques pour la mesure de la croissance des microorganismes et de la quantite de proteines au cours d'une fermentation industrielle. - Google Patents
Reactifs et methodes immunochimiques pour la mesure de la croissance des microorganismes et de la quantite de proteines au cours d'une fermentation industrielle. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention est relative à des réactifs de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une préparation d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, obtenue en utilisant comme immunogène une préparation purifiée d'un antigène protéique issu de microorganismes, dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré d'évolution du processus de fermentation. L'invention englobe également un procédé immunochimique de détermination de l'évolution d'un processus de fermentation, ainsi que des préparations d'antigènes permettant d'obtenir les réactifs conformes à l'invention et des kits comprenant lesdits réactifs.
Description
La présente invention est relative à des réactifs immunochimiques permettant de suivre l'évolution de processus de fermentation, à un procédé utilisant lesdits réactifs, ainsi qu'à des préparations purifiées d'antigènes permettant l'obtention desdits réactifs, et à un kit de dosage contenant lesdits réactifs
Actuellement, les fermentations industrielles prennent de plus en plus d'importance, en particulier dans les industries laitières (fabrication de yaourts et fromages, etc...), les industries de la bière, du vin, du saucisson et de la choucroute. Il devient important de pouvoir suivre l'évolution des différentes populations de microorganismes et de leur activité biologique au cours des fermentations.
Actuellement, les fermentations industrielles prennent de plus en plus d'importance, en particulier dans les industries laitières (fabrication de yaourts et fromages, etc...), les industries de la bière, du vin, du saucisson et de la choucroute. Il devient important de pouvoir suivre l'évolution des différentes populations de microorganismes et de leur activité biologique au cours des fermentations.
Pour ce faire, deux approches expérimentales, utilisant des méthodes microbiologiques ou biochimiques, ont été développées , Les méthodes microbiologiques consistent à ensemencer une dilution du milieu de culture sur un milieu gélosé [BOQUIEN et al., (1988) Applied Environmental Microbiology, 54, 2527-2531] . Les méthodes biochimiques consistent à mesurer les produits de fermentation, soit directement (C02, [SPINNLER et al, 1987,
Appl. Microbiol. Biotechnol.,25, 464-470], alcool, sucres,....), soit indirectement (par exemple la mesure du pH sert d'indicateur de la production d'acide lactique). BOQUIEN et al (Applied Microbiol. Biotechnol., 1989, 30, 402-407) ont montré qu'il est aussi possible de mesurer l'activité de certaines enzymes bactériennes (aminopeptidase, a-galactosidase).
Appl. Microbiol. Biotechnol.,25, 464-470], alcool, sucres,....), soit indirectement (par exemple la mesure du pH sert d'indicateur de la production d'acide lactique). BOQUIEN et al (Applied Microbiol. Biotechnol., 1989, 30, 402-407) ont montré qu'il est aussi possible de mesurer l'activité de certaines enzymes bactériennes (aminopeptidase, a-galactosidase).
Cependant ces méthodes présentent des inconvénients. Les méthodes microbiologiques donnent des résultats tardifs. La mesure de l'activité enzymatique est une méthode relativement lourde. Les méthodes biochimiques nécessitent des appareils coûteux (par exemple des chromatographes) mais ont l'avantage de permettre de suivre précisément et en temps réel l'évolution de la fermen tation. La mesure du pH ne donne des renseignements que sur l'évolution globale des populations de microorganismes en culture mixte (cas le plus fréquent en fermentation industrielle).
Une nouvelle approche utilisant des méthodes plus rapides et plus simples que celles connues dans l'art antérieur a donc été recherchée. C'est l'approche immunochimique qui semble la mieux adaptée pour cela.
L'immunochimie a été développée en agroalimentaire:
- pour identifier les composants du lait. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre les caséines [OTANI et al., 1987, Agric.Biol.Chem, 51, 2049-20541 la B globuline, l'a-lactalbumine [BECK et al., 1977, J.Dairy Sci., 60, 542-545] et la lactoferrine.
- pour identifier les composants du lait. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre les caséines [OTANI et al., 1987, Agric.Biol.Chem, 51, 2049-20541 la B globuline, l'a-lactalbumine [BECK et al., 1977, J.Dairy Sci., 60, 542-545] et la lactoferrine.
- pour détecter le développement de bactéries indésirables car modifiant les caractères organoleptiques du produit (Pseudomonas, Clostridium tyrobutyricum [BERGERE et al., 1987, Sci. Aliments,7, 89-98]. Ces études ont été faites avec des antigènes de paroi ou de structure, parfois avec des protèines enzymatiques (protéinase de Pseudomonas) [BIRKELAND et al., 1985,
Appl. Environ.Microbiol.,49, 382-387
- pour détecter la présence ou le développement de bactéries pouvant jouer un rôle pathogène pour l'homme [Listeria, Staphylococcus, (FREED et al., 1987,
Appl.Environ.Microbiol., 44, 1349-1355) , Salmonella].
Appl. Environ.Microbiol.,49, 382-387
- pour détecter la présence ou le développement de bactéries pouvant jouer un rôle pathogène pour l'homme [Listeria, Staphylococcus, (FREED et al., 1987,
Appl.Environ.Microbiol., 44, 1349-1355) , Salmonella].
- pour identifier les bactéries lactiques et étudier leur physiologie. Il a par exemple été montré qu'un antigène de paroi de Lactobacillus lactis peut être reconnu par des anticorps polyclonaux [BAER et al., 1987, Schweiz.Milchw.Eorschung,16, 84-88], ce qui permet de différentier cette espèce d'autres lactobacilles. Il faut noter qu'unie corrélation existe entre la quantité de cet antigène et la population bactérienne. Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été produits contre différentes enzymes de bactéries lactiques : protéinase [LA et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 2250-2256 ;
AKUZAWA et al., 1985, Agric. Biol.Chem.,49, 197-199], dipeptidase [VAN BOVEN et al., 1988, Appl.Envi ron.Microbiol.,54,43-49; KONINGS et al., 1988, Demande de
Brevet Européen 286 171 .], lactate deshydrogénase [GASSER et al., 1971, J.Bact., 106, 113-125].
AKUZAWA et al., 1985, Agric. Biol.Chem.,49, 197-199], dipeptidase [VAN BOVEN et al., 1988, Appl.Envi ron.Microbiol.,54,43-49; KONINGS et al., 1988, Demande de
Brevet Européen 286 171 .], lactate deshydrogénase [GASSER et al., 1971, J.Bact., 106, 113-125].
Toutefois, jusqu a présent, aucune méthode de dosage immunochimique rapide n'a été trouvée qui permette de suivre la croissance des microorganismes et la production de protéines pendant une fermentation.
La présente invention a pour but de pourvoir à des réactifs immunochimiques qui permettent d'identifier et de doser une ou plusieurs protéines de microorganismes impliqués dans la fermentation, en particulier des protéines à activité enzymatique et d'établir une corrélation entre la quantité de protéines mesurée et la croissance des microorganismes et/ou l'activité enzymatique, de façon à permettre une meilleure appréciation et une amélioration des conditions de fermentation.
La présente invention a également pour but de pourvoir à une technique immunochimique quantitative permettant la mesure de la croissance et de l'activité des microorganismes (bactéries, levures, champignons) au sein de cultures industrielles fermentaires (lait, bière, vin, choucroute, saucisson, pain).
Les inventeurs ont donc mis au point des réactifs et une méthode immunochimique permettant de quantifier une ou plusieurs protéines importantes en fermentation, et pour lesquelles il existe une corrélation, entre la production de ces protéines, d'une part, et la population de microorganismes et/ou les caractéristiques du produit de fermentation obtenu, d'autre part.
La présente invention a pour objet un réactif de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une préparation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, obtenue en utilisant comme immunogène une préparation purifiée d'un antigène protéique, issu de microorganismes, et dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré d'évolution du processus de fermentation.
Selon un mode de réalisation préférée de la présente invention, la préparation purifiée d'antigène protéique issu de microorganismes est une préparation purifiée d'une enzyme intervenant dans le processus de fermentation.
Selon une modalité préférée de ce mode de réalisation la préparation purifiée d'antigène protéique issu de microorganismes est une préparation purifiée d'une enzyme de bactéries lactiques.
De façon particulièrement avantageuse la préparation purifiée d'antigène protéique issu de microorganismes est une préparation purifiée d'une aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2.
Les préparations d'anticorps conformes à l'invention englobent aussi bien des préparations d'anticorps non purifiées (immunsérums, liquides d'ascites, milieux de culture d'hybridomes, etc...) que des préparations d'anticorps purifiés.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de détermination du degré d'évolution drun processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape dans laquelle on met en contact un échantillon prélevé dans la masse fermentaire et susceptible de contenir l'antigène protéique issu de microorganismes que l'on souhaite doser, avec un réactif immunochimique tel que défini plus haut, et une étape au cours de laquelle on mesure, par tous moyens appropriés, la quantité de l'antigène recherché ayant réagi avec l'anticorps présent dans le réactif. Ce procédé sert donc à mesurer la croissance des microorganismes. Il est applicable lors de la production de levains et lors de leur utilisation , pour la production de fromages, yaourts, bières, vins, choucroute ou saucissons.
Ce procédé immunochimique permet également la mesure de la production de protéines, et en particulier d'enzymes. Celles-ci sont soit excrétées par les microorganismes, soit libérées après lyse de ceux-ci. Si la lyse est spontanée, le test immunochimique permet de mesurer directement l'apparition d'enzymes intracellulaires.
Sinon, la lyse peut être réalisée par tout procédé connu, par exemple par sonication. La mesure quantitative d'une enzyme déterminée peut ainsi être comparée à l'activité de ladite enzyme, ce qui permet d'en apprécier et éventuellement d'en améliorer les effets sur le processus de fermentation.
Toutes les techniques immunochimiques peuvent être utilisées dans la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention; il peut s' agir, par exemple, d'une technique d'agglutination passive ou une technique de type
ELISA.
ELISA.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une analyse quantitative rapide (moins de 15 minutes) et de pouvoir agir sur la fermentation si cette analyse a mis en évidence une quelconque anomalie dans la croissance des populations de microorganismes ou dans la quantité d'enzyme produite
Le procédé conforme à l'invention permet en outre de:
- suivre la croissance d'une souche dans un mélange de microorganismes, en choisissant de mesurer la concentration d'une protéine qui ne soit synthétisée que par la souche considérée, ou, au contraire, en choisissant une protéine commune à plusieurs souches, de suivre la croissance de l'ensemble de ces souches.
Le procédé conforme à l'invention permet en outre de:
- suivre la croissance d'une souche dans un mélange de microorganismes, en choisissant de mesurer la concentration d'une protéine qui ne soit synthétisée que par la souche considérée, ou, au contraire, en choisissant une protéine commune à plusieurs souches, de suivre la croissance de l'ensemble de ces souches.
- mesurer l'effet d'une enzyme produite par plusieurs bactéries n' appartenant pas forcément au même genre ou à la même espèce.
- détecter précocement une attaque phagique en corrélant la libération d'une enzyme intracellulaire avec cette attaque.
- déterminer le moment où l'on doit arrêter une fermentation industrielle lors de la production de yaourts, fromage, saucisson, vin, bière, choucroute, etc...
La présente invention a en outre pour objet une préparation purifiée d'une protéine issue de microorganismes, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être utilisée comme immunogène pour l'obtention de réactifs de diagnostics tels que définis plus haut.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite préparation est une préparation purifiée d'une enzyme bactérienne obtenue à partir de bactéries lactiques. Le tableau (I) indique plusieurs enzymes pouvant convenir à ladite préparation.
TABLEAU I
ENZYMES DU METABOLISME DU LACTOSE
- D-lactate déshydrogènase
- L-lactate déshydrogènase P-galactosidase
- P-B-galactosidase
ENZYMES DU METABOLISME PROTEIQUE
- protéinase de paroi
- peptidase au sens large = ( amino-, endo-, exo-, carboxy-, dipeptidase)
ENZYMES DU METABOLISME DU CITRATE
- diacétyle réductase
- acétone réductase
ENZYMES DU METABOLISME DE L'ARGININE
- arginine déiminase
ENZYMES DU METABOLISME DES LIPIDES
- estérase
AUTRES ENZYMES
- uréase ( streptococcus thermophilus)
- thréonine aldolase ( L. bulgaricus)
Il est particulièrement avantageux d'utiliser, comme immunogène pour l'obtention de réactifs conformes à l'invention, une préparation purifiée d'une enzyme impliquée dans la fermentation, et dont l'activité soit en corrélation directe avec l'évolution de ce processus, et en particulier avec la population de microorganismes.
ENZYMES DU METABOLISME DU LACTOSE
- D-lactate déshydrogènase
- L-lactate déshydrogènase P-galactosidase
- P-B-galactosidase
ENZYMES DU METABOLISME PROTEIQUE
- protéinase de paroi
- peptidase au sens large = ( amino-, endo-, exo-, carboxy-, dipeptidase)
ENZYMES DU METABOLISME DU CITRATE
- diacétyle réductase
- acétone réductase
ENZYMES DU METABOLISME DE L'ARGININE
- arginine déiminase
ENZYMES DU METABOLISME DES LIPIDES
- estérase
AUTRES ENZYMES
- uréase ( streptococcus thermophilus)
- thréonine aldolase ( L. bulgaricus)
Il est particulièrement avantageux d'utiliser, comme immunogène pour l'obtention de réactifs conformes à l'invention, une préparation purifiée d'une enzyme impliquée dans la fermentation, et dont l'activité soit en corrélation directe avec l'évolution de ce processus, et en particulier avec la population de microorganismes.
Lors de travaux précédents, les inventeurs ont mis en évidence, chez Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2, l'existence d'une activité aminopeptidase qui présentait de tels avantages [BOQUIEN et al; Le Lait (1989) 69, 7181 et BOQUIEN et al (Applied Microbiology Biotechnology, 1989, 30, 402-407)] ; toutefois, il n'avait pas été possible, jusqu a présent d'obtenir, sous forme purifiée, l'enzyme responsable de cette activité
Les inventeurs sont maintenant parvenus à purifier, à partir de Lactococcus lactis subsp. cremoris
AM2, une préparation d' aminopeptidase qui constitue un immunogène particulièrement avantageux pour l'obtention de réactifs conformes à l'invention
Ladite aminopeptidase purifiée est caractérisée en ce que son poids moléculaire est de 300 kDa, en ce qu'elle est composée de 6 sous-unités identiques de 50 kDa, non reliées entre elles par des ponts disulfurer et contenant la séquence polypeptidique N-terminale suivante : Thr-Val-Thr-Glu-.. -Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn
Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
Les inventeurs sont maintenant parvenus à purifier, à partir de Lactococcus lactis subsp. cremoris
AM2, une préparation d' aminopeptidase qui constitue un immunogène particulièrement avantageux pour l'obtention de réactifs conformes à l'invention
Ladite aminopeptidase purifiée est caractérisée en ce que son poids moléculaire est de 300 kDa, en ce qu'elle est composée de 6 sous-unités identiques de 50 kDa, non reliées entre elles par des ponts disulfurer et contenant la séquence polypeptidique N-terminale suivante : Thr-Val-Thr-Glu-.. -Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn
Phe-Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
Ladite aminopeptidase purifiée hydrolyse les acides aminés substitués par la naphtylamide, les di- et les tripeptides, et dans une moindre mesure, des chaines polypeptidiques plus longues telles que la chaine B de l'insuline. La constante de Michealis (Km) et la vitesse maximale dthydrolyse(Vm) sont respectivement de 4,5 mM et de 3600 pkat/mg lorsque l'His--naphthylamide est utilisée comme substrat (un katal (kat) correspond à la quantité d'enzyme (en milligrammes) qui libère une mole de naphtylamine par seconde).L'activité de cette enzyme est inhibée par les inhibiteurs actifs sur les groupes thiols ainsi que par les ions Cu2+ Zn2+ et Co2+ ; en revanche, les inhibiteurs des métalloprotéases sont inactifs, ainsi que les agents réducteurs, la plupart des inhibiteurs des sérine-protéases, et les ions Mg2+ et
Mn2+.
Mn2+.
Cette enzyme purifiée est également utilisable dans l'industrie agroalimentaire, dans des procédés permettant d'améliorer les qualités organoleptiques de produits résultant de la fermentation du lait, en controlant l'hydrolyse des protéines.
Pour l'obtention de réactifs conformes à la présente invention, des anticorps ont été obtenus contre ladite aminopeptidase; en particulier des anticorps polyclonaux ont été produits contre cette enzyme chez diverses espèces animales ; ces anticorps permettent de doser avec précision la quantité d'aminopeptidase dans une masse fermentaire et de suivre spécifiquement la croissance de la population bactérienne, et l'évolution de l'activité enzymatique.
La présente invention a également pour objet un kit de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, lequel kit est caractérisé en ce qu' il comprend au moins un réactif immunochimique tel que défini plus haut, éventuellement une préparation purifiée de l'antigène protéique spécifique de l'anticorps contenu dans ledit réactif, ainsi que les moyens de révélation usuels de la formation d'un complexe antigène-anticorps.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation des réactifs et de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre de description de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation-.
I. PREPARATION DES REACTIFS DE DOSAGE IMMUNO
CHIMIQUE CONFORMES A L'INVENTION
Exemple 1 : Obtention et caractérisation d'une préparation purifiée d'un antigène protéique: aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2.
CHIMIQUE CONFORMES A L'INVENTION
Exemple 1 : Obtention et caractérisation d'une préparation purifiée d'un antigène protéique: aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2.
1/ SOUCHES BACTERIENNES ET CONDITIONS DE CUL
TURE
Une souche de Lactococcus lactis subsp. cremo ris AM2 également désignée par le numéro CRNZ 380 a été obtenue auprès de la collection de culture du Centre de
Recherche de Jouy-en-Josas (France), de l'Institut
National de la Recherche Agronomique
Ladite souche est conservée à -18 C.
TURE
Une souche de Lactococcus lactis subsp. cremo ris AM2 également désignée par le numéro CRNZ 380 a été obtenue auprès de la collection de culture du Centre de
Recherche de Jouy-en-Josas (France), de l'Institut
National de la Recherche Agronomique
Ladite souche est conservée à -18 C.
Des cultures sont effectuées sur un milieu contenant 40g/l de lactose, 20g/l de bacto tryptone (Difco), et 7g/l d'extrait de levure, à une température de 30"C et sous agitation mécanique de 100rpm. Le pH du milieu est ajusté à 6,5 par l'addition d'une solution de soude 10N.
La croissance bactérienne a été déterminée par spectrophotométrie dans un échantillon de la culture dilué au 1/10 dans une solution à 0,2% d'EDTA (pH 12). A la fin de la phase de croissance exponentielle, les cellules sont centrifugées à 6000 x g pendant lOmn et lavées trois fois dans 0,05M de tampon -glycérophosphate (pH 8).
2/ FRACTIONNEMENT CELLULAIRE
Des sphéroplastes sont obtenus en mettant en suspension 30g de cellules lavées dans 250ml de tampon
Tris (pH 8) 0,03M contenant 30% de sucrose et 0,3mg/ml de lysozyme. Après incubation pendant 3 heures à 37"C, les sphéroplastes sont recueillis par centrifugation à 10000 x g pendant 20mm et remis en suspension dans le même tampon sans sucrose, dans le but de provoquer leur lyse.
Des sphéroplastes sont obtenus en mettant en suspension 30g de cellules lavées dans 250ml de tampon
Tris (pH 8) 0,03M contenant 30% de sucrose et 0,3mg/ml de lysozyme. Après incubation pendant 3 heures à 37"C, les sphéroplastes sont recueillis par centrifugation à 10000 x g pendant 20mm et remis en suspension dans le même tampon sans sucrose, dans le but de provoquer leur lyse.
Après la lyse, la suspension est centrifugée à 20000 x g pendant 30mn pour séparer l'extrait acellulaire des membranes et des débris de parois cellulaires.
3/ PURIFICATION DE L'ENZYME
Les acides nucléiques présents dans l'extrait acellulaire sont hydrolysés par la RNase et la DNase. La solution est alors précipitée en présence de 50mM de
MnSO4 et centrifugée à 20000 x g pendant 30mn.
Les acides nucléiques présents dans l'extrait acellulaire sont hydrolysés par la RNase et la DNase. La solution est alors précipitée en présence de 50mM de
MnSO4 et centrifugée à 20000 x g pendant 30mn.
L'aminopeptidase est purifiée à partir de cette solution par deux étapes consécutives de chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne FPLC (Mono Q HR 10/10 Pharmacia
Uppsala, Suède). La colonne est équilibrée par 20mM de
Tris-HCl (pH 7,5).
Uppsala, Suède). La colonne est équilibrée par 20mM de
Tris-HCl (pH 7,5).
Ière étape.
150mg de protéines obtenues à partir de l'extrait acellulaire sont injectés dans la colonne et les protéines sont éluées par un gradient linéaire de NaCl de 0 à 0,6M pendant 1 heure à un débit de 3ml/mn.
Des fractions de 3ml sont recueillies. Les fractions actives sur His-Phe--NA sont collectées et dialysées contre 20mM de Tris-HCl (pH 7,5).
A l'issue de cette Ière étape, 4 fractions hydrolysant le substrat His-Phe-ss-NA sont recueillies.
L'une d'entre elles, qui représente 35% de l'activité totale aminopeptidase n' a pas été adsorbée sur la colonne. Les trois autres, qui représentent respectivement 1%, 3% et 46% de l'activité totale aminopeptidase, sont éluées respectivement à 0,23M, 0,33M et 0,47M NaCl.
2ème étape.
La fraction éluée à 0,47 M à l'issue de la Ière étape est injectée dans la colonne et éluée par un gradient linéaire de NaCl de 0,4 à 0,5M pendant 1 heure.
A l'issue de cette 2ème étape, deux fractions sont recueillies; l'une d'entre elles, qui est éluée à 0,45M NaCI contient l'activité aminopeptidase. C'est cette fraction dont les caractéristiques physicochimiques et enzymatiques ont été déterminées, qui a été choisie comme immunogène pour la production de réactifs de diagnostic conformes à l'invention
Durant toute la procédure les fractions actives sont conservées à -18 C en présence de stabilisant (10% de glycérol, 100mM de sulfate d'ammonium, lmM de dithiothréitol). Le Tableau II illustre les différentes étapes de la purification.
Durant toute la procédure les fractions actives sont conservées à -18 C en présence de stabilisant (10% de glycérol, 100mM de sulfate d'ammonium, lmM de dithiothréitol). Le Tableau II illustre les différentes étapes de la purification.
TABLEAU II
ETAPE <SEP> DE <SEP> ACTIVITE <SEP> RENDEMENT <SEP> PROTEINES <SEP> ACTIVITE
<tb> PURIFICATION <SEP> (a) <SEP> TOTALE <SEP> TOTALES <SEP> SPECIFIQUE
<tb> <SEP> (nkat) <SEP> (%) <SEP> (mg) <SEP> (pkat/mg)
<tb> Sphéroplastes <SEP> 210 <SEP> 100 <SEP> 12,000 <SEP> 17,5
<tb> DNase <SEP> 65 <SEP> 31 <SEP> 5,000 <SEP> 13,0
<tb> Ière
<tb> Chromatographie <SEP> 32 <SEP> 15 <SEP> 65 <SEP> 492,0
<tb> 2ème
<tb> Chromatographie <SEP> 19 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 375,0
<tb> (a) Déterminée en utilisant le substrat His-Phe-ss-naphtylamide
4/ CARACTERISATION DE L'AMINOPEPTIDASE PURI
FIEE
A/ Electrophorèse
La fraction purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10% d'acrylamide) en présence de dodecyl sulfate de sodium (SDS) et en présence ou en l'absence de ss-mercaptoéthanol. Dans les deux cas, une seule bande est observée qui correspond à un poids moléculaire de 50 kDa.
<tb> PURIFICATION <SEP> (a) <SEP> TOTALE <SEP> TOTALES <SEP> SPECIFIQUE
<tb> <SEP> (nkat) <SEP> (%) <SEP> (mg) <SEP> (pkat/mg)
<tb> Sphéroplastes <SEP> 210 <SEP> 100 <SEP> 12,000 <SEP> 17,5
<tb> DNase <SEP> 65 <SEP> 31 <SEP> 5,000 <SEP> 13,0
<tb> Ière
<tb> Chromatographie <SEP> 32 <SEP> 15 <SEP> 65 <SEP> 492,0
<tb> 2ème
<tb> Chromatographie <SEP> 19 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 375,0
<tb> (a) Déterminée en utilisant le substrat His-Phe-ss-naphtylamide
4/ CARACTERISATION DE L'AMINOPEPTIDASE PURI
FIEE
A/ Electrophorèse
La fraction purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10% d'acrylamide) en présence de dodecyl sulfate de sodium (SDS) et en présence ou en l'absence de ss-mercaptoéthanol. Dans les deux cas, une seule bande est observée qui correspond à un poids moléculaire de 50 kDa.
B/ Filtration sur gel
Le poids moléculaire de l'enzyme a été estimé par filtration à travers une colonne d'Ultrogel AcA 34 (IBF Villeneuve-la-Garenne, France) de 90 x lcm, en utilisant un tampon Tris-HCl 20mM (pH 7,5) contenant 0,15M de NaCl, à un débit de 12ml/heure.
Le poids moléculaire de l'enzyme a été estimé par filtration à travers une colonne d'Ultrogel AcA 34 (IBF Villeneuve-la-Garenne, France) de 90 x lcm, en utilisant un tampon Tris-HCl 20mM (pH 7,5) contenant 0,15M de NaCl, à un débit de 12ml/heure.
Le poids moléculaire de l'enzyme estimé par cette méthode est égal à 300 kDa.
Le rapprochement des résultats obtenus par électrophorèse et par filtration sur gel montre que l'aminopeptidase native est un hexamère composé de 6 sous-unités identiques; ces sous-unités ne sont pas reliées entre elles par des ponts disulfure.
C/ Détermination de la séquence N-terminale
La séquence N-terminale est déterminée par dégradation d'Edman, en utilisant un séquenceur automatique ( Applied biosystems, San Jose, CA, USA).
La séquence N-terminale est déterminée par dégradation d'Edman, en utilisant un séquenceur automatique ( Applied biosystems, San Jose, CA, USA).
L'échantillon a été dessalé par HPLC en phase inverse sur une colonne Aquapore RP300 de 30 x 4,6mm, 7Rm, 300 A (Brownlee, Santa Clara, CA, USA). L'élution a été réalisée avec un gradient linéaire de 100% du solvant A (0,115% d'acide trifluoroacétique) à 100% du solvant B (0,1% d'acide trifluoroacétique dans un mélange acétonitrile/2-propanol/eau, 37,5/37,5/30, V/V/V) pendant 50mn à 40"C avec un débit de lml/mn.
Par ce procédé les 19 acides aminés N-terminaux ont été déterminés; leur séquence est la suivante
Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe
Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
Thr-Val-Thr-Glu-...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe
Ala-Gln-Asn-Thr-Lys.
D/ Détermination de la quantité de protéines et la composition en acides aminés.
La quantité de protéines a été déterminée à chaque étape de la purification en utilisant la méthode de BRADFORD et al, avec le lysozyme comme étalon.
Dans le cas des extraits purifiés la composition en acides aminés a également été déterminée (après hydrolyse à 110"C pendant 24 heures) en utilisant un analyseur d'acides aminés LC 5000 (Biotronik, Munich, RFA)
La composition en acides aminés est donnée dans le Tableau III.
La composition en acides aminés est donnée dans le Tableau III.
TABLEAU III
<tb> ACIDE <SEP> AMINE <SEP> QUANTITE <SEP> POURCENTAGE <SEP> NOMBRE <SEP> DE
<tb> <SEP> (nmole) <SEP> MOLAIRE <SEP> % <SEP> REZ <SEP> INDUS <SEP>
<tb> <SEP> Asx <SEP> 16,3 <SEP> 11,7 <SEP> 54
<tb> <SEP> Thr <SEP> 9,4 <SEP> 6,7 <SEP> 31
<tb> <SEP> Ser <SEP> 9,4 <SEP> 6,7 <SEP> 31
<tb> <SEP> Glx <SEP> 19,3 <SEP> 13,9 <SEP> 64
<tb> <SEP> Gly <SEP> 9,7 <SEP> 6,9 <SEP> 32
<tb> <SEP> Ala <SEP> # <SEP> 10,2 <SEP> 7,3 <SEP> 34
<tb> <SEP> Cys <SEP> 1,5 <SEP> 1 <SEP> 5
<tb> <SEP> Val <SEP> 8,2 <SEP> 5,9 <SEP> 27
<tb> <SEP> Met <SEP> 3,6 <SEP> 2,6 <SEP> 12
<tb> <SEP> Ile <SEP> 2,9 <SEP> 2,1 <SEP> 10
<tb> <SEP> Leu <SEP> 10,6 <SEP> 7,6 <SEP> 35
<tb> <SEP> Tyr <SEP> 5,2 <SEP> 3,7 <SEP> 17
<tb> <SEP> Phe <SEP> 7,8 <SEP> # <SEP> 5,6 <SEP> 26
<tb> <SEP> His <SEP> 2,8 <SEP> 2,0 <SEP> 9
<tb> <SEP> Trp <SEP> 1,3 <SEP> 0,9 <SEP> 4
<tb> <SEP> Lys <SEP> 8,8 <SEP> - <SEP> 6,3 <SEP> 29
<tb> <SEP> Arg <SEP> 4,1 <SEP> 2,9 <SEP> 14
<tb> <SEP> Pro <SEP> 7,7 <SEP> 5,5 <SEP> 26
<tb>
E/ MESURE DE L'ACTIVITE AMINOPEPTIDASE
L'activité aminopeptidase a été déterminée, en utilisant comme substrat soit des dipeptides ou des acides aminés substitués par la ss-naphthylamide, soit des di- et tripeptides. La préparation d'enzyme est incubée à 37"C et à pH 7 en présence de 0,4mM de substrat. Lorsque le substrat est constitué par un acide aminé ou un dipeptide substitué par la ss-naphtylamide, l'activité est mesurée en dosant la naphtylamine libérée, selon la technique décrite par BOQUIEN et al [Appl.
<tb> <SEP> (nmole) <SEP> MOLAIRE <SEP> % <SEP> REZ <SEP> INDUS <SEP>
<tb> <SEP> Asx <SEP> 16,3 <SEP> 11,7 <SEP> 54
<tb> <SEP> Thr <SEP> 9,4 <SEP> 6,7 <SEP> 31
<tb> <SEP> Ser <SEP> 9,4 <SEP> 6,7 <SEP> 31
<tb> <SEP> Glx <SEP> 19,3 <SEP> 13,9 <SEP> 64
<tb> <SEP> Gly <SEP> 9,7 <SEP> 6,9 <SEP> 32
<tb> <SEP> Ala <SEP> # <SEP> 10,2 <SEP> 7,3 <SEP> 34
<tb> <SEP> Cys <SEP> 1,5 <SEP> 1 <SEP> 5
<tb> <SEP> Val <SEP> 8,2 <SEP> 5,9 <SEP> 27
<tb> <SEP> Met <SEP> 3,6 <SEP> 2,6 <SEP> 12
<tb> <SEP> Ile <SEP> 2,9 <SEP> 2,1 <SEP> 10
<tb> <SEP> Leu <SEP> 10,6 <SEP> 7,6 <SEP> 35
<tb> <SEP> Tyr <SEP> 5,2 <SEP> 3,7 <SEP> 17
<tb> <SEP> Phe <SEP> 7,8 <SEP> # <SEP> 5,6 <SEP> 26
<tb> <SEP> His <SEP> 2,8 <SEP> 2,0 <SEP> 9
<tb> <SEP> Trp <SEP> 1,3 <SEP> 0,9 <SEP> 4
<tb> <SEP> Lys <SEP> 8,8 <SEP> - <SEP> 6,3 <SEP> 29
<tb> <SEP> Arg <SEP> 4,1 <SEP> 2,9 <SEP> 14
<tb> <SEP> Pro <SEP> 7,7 <SEP> 5,5 <SEP> 26
<tb>
E/ MESURE DE L'ACTIVITE AMINOPEPTIDASE
L'activité aminopeptidase a été déterminée, en utilisant comme substrat soit des dipeptides ou des acides aminés substitués par la ss-naphthylamide, soit des di- et tripeptides. La préparation d'enzyme est incubée à 37"C et à pH 7 en présence de 0,4mM de substrat. Lorsque le substrat est constitué par un acide aminé ou un dipeptide substitué par la ss-naphtylamide, l'activité est mesurée en dosant la naphtylamine libérée, selon la technique décrite par BOQUIEN et al [Appl.
Microbio.Biotechnol. (1989) 30 ; 402 - 407]. Lorsque le substrat est constitué par des di- ou des tripeptides, le produit de la réaction est révèlé par l'addition d'un volume égal à celui du mélange réactionnel, d'une solution de ninhydrine [20g de ninhydrine, 750ml de méthylcellosolve, 250ml de tampon acétate 4M (pH 5,51), 7ml de chlorure de titane] Après chauffage à 100oC pendant lOmn et addition de trois volumes d'éthanol à 50%, l'absorbance de la solution est mesurée à 440nm pour la proline et 570nm pour les autres acides aminés.Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau IV. TABLEAU IV
SUBSTRAT <SEP> ACTIVITE <SEP> SUBSTRAT <SEP> ACTIVITE <SEP> SUBSTRAT <SEP> ACTIVITE
<tb> <SEP> RELATIVE <SEP> RELATIVE <SEP> RELATIVE
<tb> <SEP> (a) <SEP> % <SEP> % <SEP> %
<tb> Ala-ssNAb <SEP> 100 <SEP> His-Phe <SEP> 100 <SEP> Phe-Gly-Gly <SEP> 100
<tb> Lys-ssNA <SEP> 100 <SEP> Leu-Leu <SEP> 61 <SEP> Leu-Gly-Gly <SEP> 89
<tb> His-ssNA <SEP> 100 <SEP> Met-Ala <SEP> 56 <SEP> Met-Leu-Gly <SEP> 85
<tb> Glu-ssNA <SEP> 80 <SEP> Leu-Gly <SEP> 53 <SEP> Leu-Leu-Leu <SEP> 78
<tb> Phe-ssNA <SEP> 75 <SEP> Leu-Tyr <SEP> 50 <SEP> Ala-Leu-Gly <SEP> 74
<tb> Leu-ssNA <SEP> 70 <SEP> Met-Pro <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
Pro-ssNA <SEP> 0 <SEP> CBZc-Gly-Tyr <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
His-Phe-ssNA <SEP> 47 <SEP> CBZ-Phr-Phe <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
His-Pro-ssNA <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Gly-Pro-ssNA <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> (a) exprimée en # de l'activité maximale mesurée en utilisant comme substrat des acides aminés substitués par la naphtylamide, des dipeptides ou des tripeptides.
<tb> <SEP> RELATIVE <SEP> RELATIVE <SEP> RELATIVE
<tb> <SEP> (a) <SEP> % <SEP> % <SEP> %
<tb> Ala-ssNAb <SEP> 100 <SEP> His-Phe <SEP> 100 <SEP> Phe-Gly-Gly <SEP> 100
<tb> Lys-ssNA <SEP> 100 <SEP> Leu-Leu <SEP> 61 <SEP> Leu-Gly-Gly <SEP> 89
<tb> His-ssNA <SEP> 100 <SEP> Met-Ala <SEP> 56 <SEP> Met-Leu-Gly <SEP> 85
<tb> Glu-ssNA <SEP> 80 <SEP> Leu-Gly <SEP> 53 <SEP> Leu-Leu-Leu <SEP> 78
<tb> Phe-ssNA <SEP> 75 <SEP> Leu-Tyr <SEP> 50 <SEP> Ala-Leu-Gly <SEP> 74
<tb> Leu-ssNA <SEP> 70 <SEP> Met-Pro <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
Pro-ssNA <SEP> 0 <SEP> CBZc-Gly-Tyr <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
His-Phe-ssNA <SEP> 47 <SEP> CBZ-Phr-Phe <SEP> 0 <SEP> - <SEP>
His-Pro-ssNA <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
Gly-Pro-ssNA <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> (a) exprimée en # de l'activité maximale mesurée en utilisant comme substrat des acides aminés substitués par la naphtylamide, des dipeptides ou des tripeptides.
b ssNA = ss-naphtylamide c CBZ = carboxybenzoyle
L'enzyme purifiée hydrolyse tous les substrats constitués par les acides aminés ou les dipeptides substitués par la naphtylamide, à l'exception de ceux contenant de la proline. De la même façon les di- et tripeptides sont hydrolysés sauf s'ils contiennent de la proline ou si leur extrémité N-terminale est bloquée.
L'enzyme purifiée hydrolyse tous les substrats constitués par les acides aminés ou les dipeptides substitués par la naphtylamide, à l'exception de ceux contenant de la proline. De la même façon les di- et tripeptides sont hydrolysés sauf s'ils contiennent de la proline ou si leur extrémité N-terminale est bloquée.
L'enzyme n' a pas d'activité carboxypeptidase. L'hydrolyse du substrat His-Phe-ss-NA par l'enzyme purifiée produit de l'histidine et la phénylalanine libres, ce qui montre que cette enzyme n'est pas une dipeptidylaminopeptidase, mais une aminopeptidase.
Une activité aminopeptidase a également été observée en utilisant la chaine B de l'insuline comme substrat; après 16 heures d'incubation à 40"C il a été possible de détecter dans le mélange réactionnel 4,4% de phénylalanine (résidu N-terminal de la chaine B ) et 3,1% de valine (pénultième résidu). En revanche, aucune activité endopeptidase n'a été observée.
L'activité enzymatique a également été mesurée en présence de différents inhibiteurs. Les inhibiteurs actifs sur les groupes SH de protéines inhibent totalement [iodoacétamide, acide iodoacétique, acide parachlormercuro-benzoïque (PCMB)] , ou partiellement (Néthylmaléimide) l'activité enzymatique. Les inhibiteurs des sérine-protéases [diisopropyl-fluorophosphate (DFP), fluorure de phényl-méthylsulfoyle (PMSF) ] et des métalloprotéases (EDTA, 1, l0-phénanthroline, phosphoramidon) ainsi que les agents réducteurs (dithiothréitol, p-mer- captoéthanol) n'ont aucun effet sur 1 l'activité de l'enzyme purifiée.
Les résultats obtenus sont présentés dans le
Tableau V.
Tableau V.
TABLEAU V
<tb> <SEP> INHIBITEUR <SEP> CONCENTRATION <SEP> ACTIVITE
<tb> <SEP> (nm) <SEP> RESIDUELLE
<tb> <SEP> (%)
<tb> Iodoacétamide <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Acide <SEP> iodoacétique <SEP> 1 <SEP> O <SEP>
<tb> PCMB <SEP> 1 <SEP> O <SEP>
<tb> N-éthylmalémide <SEP> 1 <SEP> 30
<tb> DFP <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> PMSF <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> EDTA <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> 1,10 <SEP> Phénanthroline <SEP> 1 <SEP> 90
<tb> DTT <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> Mercaptoéthanol <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> N-tosyl-L-lysine
<tb> chlorométhyl <SEP> cétone <SEP> 1 <SEP> 16
<tb> Phosphoramidon <SEP> a <SEP> 100
<tb> (a) rapport molaire enzyme inhibiteur= 1/200
Les cations divalents Cu++, Zn++, et Co++ inhibent l'activité à une concentration de 0,lmM pendant que Mg++ et Mn++ n'ont aucun effet, à cette même concentration.
<tb> <SEP> (nm) <SEP> RESIDUELLE
<tb> <SEP> (%)
<tb> Iodoacétamide <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Acide <SEP> iodoacétique <SEP> 1 <SEP> O <SEP>
<tb> PCMB <SEP> 1 <SEP> O <SEP>
<tb> N-éthylmalémide <SEP> 1 <SEP> 30
<tb> DFP <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> PMSF <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> EDTA <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> 1,10 <SEP> Phénanthroline <SEP> 1 <SEP> 90
<tb> DTT <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> Mercaptoéthanol <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> N-tosyl-L-lysine
<tb> chlorométhyl <SEP> cétone <SEP> 1 <SEP> 16
<tb> Phosphoramidon <SEP> a <SEP> 100
<tb> (a) rapport molaire enzyme inhibiteur= 1/200
Les cations divalents Cu++, Zn++, et Co++ inhibent l'activité à une concentration de 0,lmM pendant que Mg++ et Mn++ n'ont aucun effet, à cette même concentration.
Exemple 2 : Obtention et caractérisation d'une préparation d'anticorps anti-aminopeptidase.
1/ PREPARATION DES ANTICORPS
100 Rg d'une préparation d'enzyme purifiée selon le protocole décrit dans l'exemple 1, additionnée d'adjuvant complet de Freund sont injectés à des lapins.
100 Rg d'une préparation d'enzyme purifiée selon le protocole décrit dans l'exemple 1, additionnée d'adjuvant complet de Freund sont injectés à des lapins.
Des injections de rappel mensuelles sont effectuées en utilisant 50 Ag d'enzyme additionnée d'adjuvant incomplet de FREUND. Les lapins sont saignés 5, 10 et 15 jours après chaque injection de rappel.
L'immunsérum est obtenu par centrifugation du sang à 10000 x g pendant 10mn.
2/ DEMONSTRATION DE LA SPECIFICITE DES ANTI
CORPS OBTENUS
Après électrophorèse des échantillons contenant soit lrextrait acellulaire, soit l'enzyme purifiée, les protéines séparées sur le gel sont transférées sur une feuille de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBIN et al. (Pro. Natl.Acad. Sci. USA (1979),76:4350-4354). La feuille de nitrocellulose est ensuite incubée dans une solution contenant 5% de lait écrémé, dans le but d'éviter une adsorption non spécifique des anticorps, puis incubée avec l'immunsérum de lapin anti-aminopeptidase dilué au 1/500. La réaction antigène-anticorps est mise en évidence par incubation avec un immunsérum de chèvre anti-immunoglobuline de lapin, conjugué à la peroxidase, et dilué au 1/1000. La réaction de la peroxidase est visualisée en utilisant comme substrat le 4-chloro-l-naphtol.
CORPS OBTENUS
Après électrophorèse des échantillons contenant soit lrextrait acellulaire, soit l'enzyme purifiée, les protéines séparées sur le gel sont transférées sur une feuille de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBIN et al. (Pro. Natl.Acad. Sci. USA (1979),76:4350-4354). La feuille de nitrocellulose est ensuite incubée dans une solution contenant 5% de lait écrémé, dans le but d'éviter une adsorption non spécifique des anticorps, puis incubée avec l'immunsérum de lapin anti-aminopeptidase dilué au 1/500. La réaction antigène-anticorps est mise en évidence par incubation avec un immunsérum de chèvre anti-immunoglobuline de lapin, conjugué à la peroxidase, et dilué au 1/1000. La réaction de la peroxidase est visualisée en utilisant comme substrat le 4-chloro-l-naphtol.
Dans le cas où les échantillons proviennent de la préparation d'enzyme purifiée, aussi bien que dans celui où ils proviennent de l'extrait acellulaire total, une seule bande est mise en évidence par l'immunsérum de lapin anti-aminopeptidase. Ceci montre que les immunsérums obtenus sont spécifiques de 1' aminopeptidase purifiée.
II/ UTILISATION DES REACTIFS CONFORMES A
L'INVENTION POUR L'EVALUATION D'UNE POPULATION BACTE
RIENNE
Des anticorps anti-aminopeptidase obtenus comme décrit à l'exemple 2, ont été utilisés pour mesurer la quantité d'aminopeptidase présente dans un milieu de fermentation contenant la souche Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 , après lyse des bactéries par sonicution. Dans ce but, des techniques immunoenzymatiques de type ELISA ont été utilisées. La formation du complexe antigène-anticorps est révèlée, à l'aide d'anticorps marqués à la peroxidase, en utilisant comme substrat le 2,2' -azino-di- (3) - (éthylbenzothiazoline) -6' -sulfonate, et la détection est faite à 414nm
A/ Détermination de la sensibilité et la spécificité du dosage.
L'INVENTION POUR L'EVALUATION D'UNE POPULATION BACTE
RIENNE
Des anticorps anti-aminopeptidase obtenus comme décrit à l'exemple 2, ont été utilisés pour mesurer la quantité d'aminopeptidase présente dans un milieu de fermentation contenant la souche Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 , après lyse des bactéries par sonicution. Dans ce but, des techniques immunoenzymatiques de type ELISA ont été utilisées. La formation du complexe antigène-anticorps est révèlée, à l'aide d'anticorps marqués à la peroxidase, en utilisant comme substrat le 2,2' -azino-di- (3) - (éthylbenzothiazoline) -6' -sulfonate, et la détection est faite à 414nm
A/ Détermination de la sensibilité et la spécificité du dosage.
Cette détermination a été faite en utilisant comme préparation antigènique, la préparation d'aminopeptidase obtenue selon le procédé décrit plus haut. Elle a permis d'établir des courbes d'étalonnage.
La figure 1 montre la courbe d'étalonnage obtenue par ELISA direct en utilisant un anti-sérum de lapin , obtenu selon la procédure décrite à l'exemple 2, à différentes dilutions: ( 61 ) 1/3000, À # ) 1/9000, (X)1/27000
La figure 2 montre la courbe d'étalonnage obtenue par ELISA sandwich en utilisant un premier anti-sérum de lapin dilué au 1/1000 et un deuxième anti-sérum de souris, également dirigé contre l'aminopeptidase, dilué au 1/1000 ( Q ) ou au 1/3000 (4
Ces figures montrent que les seuils de détection sont respectivement de 300 et lOng/ml, par test
ELISA direct ou sandwich, pour les plus faibles dilutions de sérum utilisées.
La figure 2 montre la courbe d'étalonnage obtenue par ELISA sandwich en utilisant un premier anti-sérum de lapin dilué au 1/1000 et un deuxième anti-sérum de souris, également dirigé contre l'aminopeptidase, dilué au 1/1000 ( Q ) ou au 1/3000 (4
Ces figures montrent que les seuils de détection sont respectivement de 300 et lOng/ml, par test
ELISA direct ou sandwich, pour les plus faibles dilutions de sérum utilisées.
B/ Dosage de la concentration en aminopeptidase dans un lysat bactérien.
Ce dosage est effectué par une méthode ELISA sandwich utilisant un premier anti-sérum de lapin dilué au 1/1000 et un deuxième anti-sérum de souris dilué au 1/1000 ou au 1/3000.
La figure 3 montre les résultats obtenus (D ) 1/1000, (+ ) 1/3000.
Il est possible de détecter l'aminopeptidase à partir de 300 ng/ml de protéines totales, soit environ 5 ng/ml d'équivalent aminopeptidase purifiée.
C/ Evolution de la concentration en aminopeptidase au cours de la croissance d'une culture de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2.
La figure 4 montre l'évolution de la concentration d'aminopeptidase, mesurée à l'aide des réactifs conforme à l'invention, au cours de la croissance de L.
lactis ssp cremoris AM2 en culture pure sur lait ; une évolution parallèle est observée en culture mixte.
La figure 5 montre la corrélation entre l'activité enzymatique de l'aminopeptidase mesurée sur cellules entières, suivant la procédure décrite à l'exemple 2 et la concentration en aminopeptidase mesurée sur un lysat bactérien à l'aide des réactifs conformes à l'invention, au cours de la croissance de L. lactis sp cremoris AM2 en culture pure sur lait.
La figure 6 montre une corrélation linéaire entre le logarithme de la population bactérienne (exprimée en cfu/ml) et la quantité d'aminopeptidase présente dans le lysat bactérien, exprimée en absorbance à 414 nm.
Cette relation est valable pour une population comprise entre 105 et 1010 cfu/ml.
Claims (10)
1) Réactif de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une préparation d'anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, obtenue en utilisant comme immunogène une préparation purifiée d'un antigène protéique issu de microorganismes, dont la quantité dans la masse fermentaire est un indice du degré d'évolution du processus de fermentation.
2) Réactif de dosage immunochimique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la préparation purifiée d'antigène protéique issu de microorganismes est une préparation purifiée d'une enzyme intervenant dans le processus de fermentation.
3) Réactif de dosage immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce que la préparation purifiée d'antigène protéique issu de microorganismes est une préparation purifiée d'une enzyme de bactéries lactiques.
4) Réactif de dosage immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 , caractérisé en ce que la préparation purifiée d'antigène protéique issu de microorganismes est une préparation purifiée d'une aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp.
cremoris AM2
5) Procédé de détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape dans laquelle on met en contact un échantillon, prélevé dans la masse fermentaire et susceptible de contenir l'antigène protéique issu de microorganismes, que l'on souhaite doser, avec un réactif immunochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, et une étape au cours de laquelle on mesure, par tous moyens appropriés, la quantité de l'antigène recherché ayant réagi avec l'anticorps présent dans le réactif.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, préalablement au dosage, on soumet l'échantillon prélevé dans la masse fermentaire a un traitement approprié, de façon à lyser les microorganismes présents dans l'échantillon.
7) Préparation purifiée d'une protéine issue de microorganismes, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être utilisée comme immunogène pour l'obtention de réactifs de diagnostics selon la revendication 1.
8) Préparation purifiée d'une protéine issue de microorganismes, selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite préparation est une préparation purifiée d'une enzyme bactérienne obtenue à partir de bactéries lactiques.
9) Préparation purifiée d'une protéine issu de microorganismes selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une préparation purifiée d'aminopeptidase de Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 , en ce que ladite aminopeptidase a un poids moléculaire de 300 Kda, en ce qu'elle est composée de 6 sous-unités identiques, non reliées entre elles par des ponts disulfure, et contenant la séquence polypeptidique N-terminale suivante : Thr-Val-Thr-Glu ...-Phe-Glu-Gln-Lys-Leu-Tyr-Glu-Asn-Phe-Ala-Gln-Asn-Thr
Lys.
10) Kit de dosage immunochimique pour la détermination du degré d'évolution d'un processus de fermentation, lequel kit est caractérisé en ce qu' il comprend au moins un réactif immunochimique selon une quelconque des revendications 1 à 4, éventuellement une préparation purifiée de l'antigène protéique spécifique de l'anticorps, ainsi que les moyens de révélation usuels permettant la mise en évidence d'une réaction antigène/anticorps.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (6)
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|---|
| APP. & ENVIRONMENTAL MICROBIOL., vol. 54, no. 9, septembre 1988, pages 2250-2256; H. LAAN et al.: "Monoclonal antibodies to the cell-wall-associated proteinase of Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2" * |
| APPL. & ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 54, no. 1, janvier 1988, pages 43-49; A. VAN BOVEN et al.: "Purification and characterization of a dipeptidase from Streptococcus cremoris Wg2" * |
| APPL. MICROB. BIOTECHNOL., vol. 30, 1989 (avant juillet), pages 402-407; C.Y. BOQUIEN et al.: "Enzymatic methods for determining populations of Streptococcus cremoris AM2 and Leuconostoc lactis CNRZ 1091 in pure and mixed cultures" * |
| BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 85, no. 9, 1988, page 447, résumé 89302, Philadelphia, PA, US; Y. FUKE et al.: "Changes in proteins and protease activities during ripening of cheese-like product from soymilk using Penicillium caseicolum", & J. JPN. SOC. FOOD SCI. TECHNOL. 34(12): 826-833. 1987 * |
| JOURNAL OF APPLIED BACTERIOLOGY, vol. 46, 1979, pages 455-463; B.A. LAW: "Extracellular peptidases in group N streptococci used as cheese starters" * |
| JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 106, no. 1, avril 1971, pages 113-125; F. GASSER et al.: "Immunological relationships among lactic dehydrogenases in the genera Lactobacillus and Leuconostoc" * |
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