NL9301525A - Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties. - Google Patents
Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9301525A NL9301525A NL9301525A NL9301525A NL9301525A NL 9301525 A NL9301525 A NL 9301525A NL 9301525 A NL9301525 A NL 9301525A NL 9301525 A NL9301525 A NL 9301525A NL 9301525 A NL9301525 A NL 9301525A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- strains
- proteins
- activity
- lactobacillus
- microorganism
- Prior art date
Links
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 title claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 title claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 28
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 claims abstract description 31
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 26
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims abstract description 11
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 33
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 9
- 230000005070 ripening Effects 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 abstract description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 abstract 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 11
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 11
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 10
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 10
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 9
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 5
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 5
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- JVXXKQIRGQDWOJ-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(=O)N)=CC=C21 JVXXKQIRGQDWOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 3
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 3
- DNDWZFHLZVYOGF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DNDWZFHLZVYOGF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- -1 for example Proteins 0.000 description 3
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 3
- 108010049589 leucyl-leucyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 2
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 2
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 2
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 2
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 2
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 2
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- PUDCZUQFOPHIGU-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl]azanium;chloride Chemical compound Cl.C1=C(N)C(C)=CC(N=NC=2C(=CC=CC=2)C)=C1 PUDCZUQFOPHIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 2
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LEJTXQOVOPDGHS-YOEHRIQHSA-N (2s)-2-[[(2s)-3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 LEJTXQOVOPDGHS-YOEHRIQHSA-N 0.000 description 1
- KYRVEVYREUUAKH-PPHPATTJSA-N (2s)-n-(4-nitrophenyl)pyrrolidine-2-carboxamide;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1NC(=O)[C@H]1NCCC1 KYRVEVYREUUAKH-PPHPATTJSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000006485 Glutamyl Aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010058940 Glutamyl Aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010008292 L-Amino Acid Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007070 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010051054 N-benzyloxycarbonylphenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010580 coupled enzyme reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- OAZUOCJOEUNDEK-UHFFFAOYSA-L disodium;(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 OAZUOCJOEUNDEK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
- A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
- A23J3/343—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins
- A23J3/344—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins of casein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C2220/00—Biochemical treatment
- A23C2220/20—Treatment with microorganisms
- A23C2220/202—Genetic engineering of microorganisms used in dairy technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/147—Helveticus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Titel: Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties
De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe Lacto-bacillus-stam, enzymen en andere eiwitten verkregen met die stam, nucleotide sequenties die coderen voor dergelijke eiwitten, enzymen of andere delen van het Lactobacillus organisme en toepassingen van de organismen, de enzymen en/of andere eiwitten, alsmede de nucleotide sequenties.
Melkzuurbacteriën worden gebruikt bij de fermentatie van een groot aantal produkten, met name bij de fermentatie van voedingsmiddelen. Vroeger was de belangrijkste eigenschap van deze bacteriën dat zij aanwezige koolhydraten (suikers) kunnen omzetten in melkzuur, waardoor het gefermenteerde produkt beter geconserveerd was.
In de huidige processen in de zuivelindustrie zijn andere eigenschappen, zoals het ontwikkelen van een smaak en een constante kwaliteit van het produkt minstens even belangrijk geworden.
Om zuivelprodukten met al de gewenste eigenschappen door fermentatie te verkrijgen, zijn specifieke startcultures die een mengsel van verschillende micro-organismen omvatten, ontwikkeld. Micro-organismen met speciale eigenschappen zijn daarom van groot belang voor de zuivelindustrie.
Bijvoorbeeld bij de bereiding van kaas, waar de rijping van enkele weken tot twee jaar in beslag kan nemen, afhankelijk van de soort kaas.
Dat brengt hoge kosten met zich mee door de gekoelde opslag over een langere termijn, immobilisatie van kapitaal en produktieverliezen ten gevolge van atypische fermentatie, waardoor bijvoorbeeld een bittere smaak ontstaat.
Een versnelling van het rijpingsproces zou een aanzienlijke kostenbesparing op kunnen leveren.
Lactococci worden in de zuivelindustrie veelvuldig toegepast als organisme deel uitmakend van een startculture. Met name de omzetting van verse kaas wrongel naar rijpe kaas wordt bepaald door de proteolytische afbraak van caseïne met behulp van deze Lactococci startcultures.
Het proteolytische systeem van deze Lactococci bestaat uit een aantal proteïnases en een aantal peptidases en is onderwerp geweest van een aantal studies (Tan, P.S.T et al, J.Dairy Res. 60 p.269-286, 1993 en Visser, S., J.Dairy Sci.
76, p.329-350, 1993).
In tegenstelling tot bovengenoemde Lactococcus stammen worden Lactobacillus soorten gewoonlijk niet als startcultures in de rijping van kaas toegepast.
Bij de rijping van een aantal soorten kaas ontwikkelen zich in situ echter cultures van Lactobacillus soorten. Kennelijk spelen deze soorten wel een rol bij de rijping van die kaassoorten (Marth, E.H., J.Dairy Sci. 46, p.869-890, 1963 en Peterson et al, J.Dairy Sci. 73, p.1395-1410, 1990).
Verder wordt verondersteld dat een aantal Lactobacillus soorten een hoge proteolytische activiteit bezitten (Arora et al, J.Dairy Sci.73, p.264-273,1990a) en dat het vermogen van deze Lactobacillus soorten om peptiden te hydrolyseren nodig is om de ophoping van bittere peptiden in kaas te voorkomen. Een aantal proteolytische enzymen van Lactobacillus is bestudeerd (3, 4, 5, 6, 16, 17, 21, 22, 23, 24 en 30)
De uitvinding voorziet in een nieuw micro-organisme dat een proteolytisch systeem bevat met een hogere activiteit dan alle andere Lactobacilli tot nog toe bekend en een hogere activiteit dan de meeste andere melkzuurbacteriën, inclusief een aantal Lactococci.
Het nieuwe micro-organisme wordt gekenmerkt door een unieke combinatie van eigenschappen die het zeer geschikt maakt voor de toepassing bij fermentatieprocessen, met name voor de rijping van kaas.
Karakteristieken van het nieuwe micro-organisme zijn onder andere in vergelijking met andere enigszins vergelijkbare micro-organismen van hetzelfde geslacht of van het geslacht Lactococcus, weergegeven in de figuren la t/m c, figuren 2 en 3, tabel 2 en tabel 6.
Het nieuwe micro-organisme is onder Art 22B van de ROW en het verdrag van Boedapest gedeponeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn onder nummer CBS 404.93 (art. 31F lid 3 van het octrooireglement is van toepassing).
In het kort komen de eigenschappen van het nieuwe micro-organisme op het volgende neer.
Lactobacillus Helveticus (interne code SBT 2171) vormt regelmatige gram-positieve staafjes, kan anaëroob groeien, is obligaat saccharoclastisch, kan glucose, mannose, galactose en lactose als substraat gebruiken en vertoont een gemiddeld zeer hoge proteolytische activiteit.
Deze proteolytische activiteit komt met name tot uiting in het ontbitteren van een tryptisch afbraakprodukt van caseïne (de zogenaamde bittere peptiden in kaas).
Naast het micro-organisme zelf dat door de uitvinding beschikbaar wordt, voorziet de uitvinding ook in de toepassing van dat organisme of delen daarvan in bijvoorbeeld fermen-tatieprocessen of proteolytische stappen in processen.
Bij fermentatieprocessen worden de organismen volgens de uitvinding bijvoorbeeld als onderdeel van een startculture voor de rijping van kaas gebruikt, maar ook kunnen de organismen volgens de uitvinding in een later stadium dan als startculture worden toegevoegd. Daarnaast worden de micro-organis-men bijvoorbeeld gebruikt voor de proteolyse van biologisch actieve peptiden, zoals bijvoorbeeld neuropeptiden, endorfines, LHRH, ACTH, etc.
Ook kunnen ze gebruikt worden voor andere hydrolyses van eiwitten, bijvoorbeeld voor voedingspreparaten.
Naast de toepassing van de micro-organismen op zich kunnen, zoals eerder gesteld ook delen van de micro-organismen worden toegepast. Met name geldt dit voor de nieuwe eiwitten volgens de uitvinding die afkomstig zijn van het nieuwe organisme. Onder die nieuwe eiwitten worden ook actieve frag- menten van deze eiwitten of derivaten, fusies en/of mutanten van deze eiwitten begrepen die
Vergelijkbare activiteit bezitten. De nieuwe eiwitten volgens de uitvinding kunnen alleen of in combinatie met andere eiwitten (al of niet volgens de uitvinding) worden toegepast in allerlei splitsingen van eiwitten en/of peptiden. Bijzondere voorkeur verdient het bij bijvoorbeeld de rijping van kaas om een combinatie van peptidasen en proteïnasen volgens de uitvinding te gebruiken.
Daarnaast kunnen de eiwitten volgens de uitvinding ook worden toegevoegd aan conventionele startcultures, bijvoorbeeld zoals die op basis van Lactococcussoorten.
Ook kunnen de nieuwe eiwitten volgens de uitvinding, net als de micro-organismen ook apart voor andere proteolytische doeleinden worden toegepast, zoals bijvoorbeeld bij de proteolyse van biologisch actieve peptiden zoals LHRH, ACTH, endorfines, etc.
Tegen de eiwitten en andere delen van de micro-organismen kunnen antilichamen worden opgewekt. Deze antilichamen behoren ook tot de uitvinding. Zi-j kunnen bijvoorbeeld worden toegepast om bepaalde proteolytische activiteiten van het nieuwe micro-organisme, die onder sommige omstandigheden misschien minder gewenst kunnen zijn, te onderdrukken.
Daarnaast kunnen zij toegepast worden bij de opzuivering van de eiwitten volgens de uitvinding, middels affiniteits-chromatografie.
Ook kunnen zij gebruikt worden bij het opsporen (de detectie) van micro-organismen volgens de uitvinding. Dit kan nuttig zijn bij het zoeken naar verdere geschikte Lactobacillus stammen en bijvoorbeeld bij de kwaliteitscontrole van het eindprodukt.
Methodes om antilichamen op te wekken, mogen als standaardtechnieken gekenmerkt worden. Over het algemeen wordt een zoogdier, meestal een knaagdier ingespoten met een preparaat waartegen antilichamen opgewekt moeten worden, over het algemeen in combinatie met een adjuvans.
Na een aantal herhaalde injecties (boosters) is over het algemeen een voldoende hoge antilichaamtiter bereikt. De anti-lichamen kunnen dan uit de ascites gezuiverd worden. Tegenwoordig wordt er vaak voor gekozen om monoclonale antilichamen te produceren. Voor deze antilichamen geldt hetzelfde immuni-satieschema. Alleen worden nu de miltcellen van het geïmmuniseerde dier verwijderd en gefuseerd met een myeloma, of geïm-mortaliseerd met behulp van een virus transformatie (bijvoorbeeld EBV). Hierdoor wordt een continue bron van antilichamen met een identieke specificiteit en affiniteit verkregen.
Waar in deze aanvrage antilichamen worden genoemd worden daar zowel polyclonale- als monoclonale antilichamen, alsmede antigeen bindende fragmenten daarvan begrepen. Er zijn inmiddels vele technieken bekend om antigeen bindende fragmenten te verkrijgen.
Fab fragmenten en Fab'2 fragmenten kunnen eenvoudig door chemische splitsing verkregen worden. Kleinere bindende fragmenten tot en met MRU's (Molecular Recognition Units: bestaan slechts uit een CDR (complementarity determining region)) worden meestal via recombinant DNA technieken bereid.
Middels deze recombinant DNA technieken kunnen ook antilichamen met twee specificiteiten of gekoppeld aan andere eiwitten bereid worden. Al deze, en andere, technieken zijn bruikbaar om antilichamen volgens de uitvinding te verkrijgen.
Recombinant DNA technieken zijn ook zeer geschikt om sequenties van de nieuwe micro-organismen volgens de uitvinding toe te passen. Zo kunnen sequenties die coderen voor proteolytische enzymen in andere cellen dan Lactobacillus tot expressie worden gebracht, zodat een zuiverder preparaat met een hogere opbrengst verkregen wordt. Het tot expressie brengen van een dergelijk eiwit in een gastheercel (bijvoorbeeld E.Coli of andere prokaryoten, Saccharomyces of andere gisten, schimmels, insektecellen, plantecellen en/of zoogdier-cellen) gebeurt meestal door de DNA sequentie, die men kan isoleren uit het organisme, of kan verkrijgen door mRNA uit het organisme te isoleren en daarvan cDNA te bereiden, in een geschikte vector voor transfectie of transformatie van de gastheercel te brengen onder controle van een aantal geschikte regelelementen, zoals promotoren, enhancers, etc.
Ook voor deze sequenties geldt weer dat het niet altijd nodig zal zijn om de gehele sequentie coderend voor een eiwit toe te passen. Vaak zal een deel ook de gewenste activiteit kunnen bezitten.
Ook kunnen aan de sequenties volgens de uitvinding andere sequenties gekoppeld worden, bijvoorbeeld om fusie-eiwitten te produceren.
Daarnaast kunnen de sequenties worden toegepast in ampli-ficatietechnieken of hybridisatietechnieken die inmiddels ook wijde bekendheid hebben bij de gemiddelde vakman.
De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.
MATERIAAL EN METHODEN Organismen
In de voorbeelden werden de volgende Lactobacillus en Lactococcus soorten gebruikt.
Lb. acidophilus, Lb.brevis, Lb.buchneri, Lb.casei ssp.casei, Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus, Lb.delbrueckii ssp.delbrueckii, Lb.delbrueckii ssp.lactis, Lb.fermentum,
Lb.helveticus, Lb.paracasei ssp.paracasei, Lb.plantarum, Lb.rhamnosus, Lactococcus lactis ssp.cremoris, Lactococcus lactis ssp.lactis, Lactococcus lactis ssp.diacetylactis. Stammen met een SBT-nummer zijn verkregen van de Snow Brand Type Culture Collection, Tokyo, Japan. Alle typen stammen werden verkregen van de "National Collection of Food Bacteria (NCFB); Agricultural and Food Research Council; Institute of Food Research, Reading, Great Britain. Lactococcus lactis ssp. cremoris AMI, E*, HP, SK112 en Wg2 en Lactococcus lactis ssp.lactis ML3 werden verkregen bij het Nederlands Instituut voor Zuivelonderzoek (NIZO), Ede.
De organismen werden routinematig in subculture gehouden (3X) in MRS bouillon (Merck-Darmstadt, Duitsland) bij 30 of 37°C en als "stock-cultures" bewaard in MRS bouillon met 10% v/v glycerol bij -55°C.
Groeikrommes
Van elke stam werden groeikrommes verkregen door 1% zaai-culture te enten uit de "stock-culture" in 10 ml MRS of MRX, gevolgd door een tweede enting: de pre-culture, waaruit 1% werd geënt in de groeibuizen (13 x 150 mm) die 10 ml MRS bevatten. De groei werd gevolgd middels meting van de optische dichtheid (OD) bij 650 nm gedurende een aantal uren.
Bereiding van celvriï extract
De cellen werden gegroeid in MRS bouillon (400 ml), geoogst in de late log fase door te centrifugeren bij 7500 x g gedurende 10 min bij 40 C, gewassen in HEPES (4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur) met 10 mM CaCl2 bij pH=7 en tenslotte gesuspendeerd in 10 ml HEPES.
Voor de tweede screening werden de cellen gegroeid in MRX. MRX is MRS aangevuld met 15 mM CaCl2 en gemodificeerd volgens Hugenholtz et al. (15) .
Celextracten werden verkregen door de cellen te sonifi-ceren gedurende een aantal perioden van 10 min. (Vibra cell; Sonics & Materials Inc. Danbury, Connecticut, USA; 50% output, 20% pulse) met intervallen van 10 min. rust bij 0°C. Celvrije extracten werden verkregen door de celmassa 10 min. bij 30000 x g te centrifugeren bij 40°C.
Enzymfagpalingen
Proteolytische activiteit werd gemeten met een brede variëteit van synthetische en chromogene substraten zoals beschreven voor Lactococcus soorten (zie tabel 1) .
De hydrolyse van de p-nitroanilide substraten werd bepaald met de methode van Exterkate (12) . De enzymmengsels bevatten 20 μΐ celextract en 200 μΐ HEPES (pH 7) .
De reacties werden ingeleid door 200 μΐ van een 2 mM p-nitroanilide oplossing toe te voegen. Er werd gedurende een aantal minuten bij 30°C geïncubeerd.
De reacties werden gestopt door 100 μΐ 52% (v/v) azijnzuur toe te voegen. De reactiemengsels werden gecentrifugeerd bij 1400 rpm gedurende 5 min. De hoeveelheid p-nitroanilide in het supernatant werd gemeten bij 410 nm (U-2000 spectrofot-ometer, Hitachi). De concentratie van het p-nitroanilide werd berekend met de molaire absorptiecoëfficiënt (ε 8800 M~1cm~1) .
In sommige gevallen werd het vrijkomen van p-nitroanilide continu gemeten.
De hydrolyse van de β-naftylamidesubstraten werd bepaald met een gemodificeerde methode volgens Elleman (11). Het enzym-mengsel bevatte 20 μΐ celextract en 200 μΐ HEPES 100 mM pH=7.
De reacties werden gestart door toevoegen van 200 μΐ van een 2 mM β-naftylamide-substraatoplossing in water en er werd geïncubeerd bij 30°C gedurende een aantal min. De reacties werden gestopt door het toevoegen van 200 μΐ 1M acetaat, pH=4, die 1 mg/ml Fast Garnet GBC?? en 5% (w/v) Brij 35 bevatte. Het reactiemengsel liet men gedurende 10 min de optimale kleur-ontwikkeling bereiken en daarna werd er gecentrifugeerd op 14000 rpm gedurende 5 min. De hoeveelheid β-naftylamide in het supernatant werd berekend met de molaire absorptiecoëfficiënt (ε 20000 M~1cm~1) .
De hydrolyse van niet-chromogene synthetische peptiden werd bepaald door de hoeveelheid vrijgekomen aminozuren te meten met de gemodificeerde cadmium-ninhydrine methode, zoal beschreven door Doi et al (8). De enzym mengsels bevatten 100 μΐ verdund celextract in 100 mM HEPES pH 7. De reacties werden in gang gezet door het toevoegen van 100 μΐ van een 2 mM peptide oplossing en gedurende een aantal minuten bij 30°C geïncubeerd. De reacties werden gestopt met behulp van 1.5 ml Cd-ninhydrine reagens en daaropvolgend geïncubeerd gedurende een aantal min. bij 84°C. Na afkoelen werden de mengsels bij 14000 rpm gecentrifugeerd en werd de absorptie gemeten bij 515 nm met een Vitalab 10 spectrofotometer '(Vital scientific, Dieren).
De specifieke peptidase-activiteit werd gedefinieerd als de hoeveelheid enzym nodig om vanuit het substraat per minuut onder de experimentele condities 1 μηιοί van L-Leucine equivalent aminozuur te produceren (26) .
De hydrolyse van resorufine gelabeld caseïne (Boehringer Mannheim GmbH, Duitsland) werd bepaald zoals beschreven in het protocol gegeven door de fabrikant, in 50 mM HEPES bij 37°C.
Alle mengsels werden op 30°C gebracht voordat de reacties werden gestart.
De APIZYM bepaling
De APIZYM kits (LRA ZYM AP 1 tot en met 6) werden verkregen van API SYSTEM (La Balme Les Grottes, Frankrijk). Cel (vrij) extract 70 μΐ (65 of 125 mg eiwit/ml) werd toegevoegd aan elk van de cups die gedehydrateerd chromogeen enzymsub-straat bevatten, waarna de mengsels gedurende twee of vier uur bij 37°C werden geïncubeerd. De reacties werden ingeleid door het toevoegen van de enzymmengsels, die de chromogene substraten rehydrateerden. Hydrolytische activiteit van de respectievelijke enzymen in de celextracten op het β-naphtylamide-substraat resulteerde in het vrijkomen van de β-naphtylamide-groep. De reactie werd gestopt door het toevoegen 50 μΐ reagens ZYM A en de kleur werd ontwikkeld door het toevoegen van 50 μΐ ZYM B. Activiteiten werden bepaald door de kleur die zich in vijf minuten ontwikkelde te vergelijken met de kleurenkaart zoals geleverd door de fabrikant.
SDS-PAGE
Natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gel electroforese (SDS-PAGE) en preparatieve slab gel electroforese werd uitgevoerd met respectievelijk een Mini-Protean II en een Protean II xi (Bio-Rad Laboratoria, Richmond, Californië, Ver. Staten) en uitgevoerd zoals beschreven in de instructies zoals aangeleverd door de fabrikant. De moleculaire afmetingen van de enzymen werden geschat door voorgekleurde SDS-PAGE standaards te gebruiken in het interval van 14.400 tot 97.400 Da (Bio-Rad Laboratoria, Richmond, Californië, Ver. Staten).
Inrounoblotting
Eiwitten, die gescheiden waren op een gel werden overgebracht op vellen polyvinylideendifluoride (PVDF) met een Mini Trans-Blott cel (Bio-Rad Laboratoria, Richmond, Californië,
Ver. Staten) volgens de instructies van de fabrikant. De PVDF membranen waren verzadigd met 1% afgeroomde melk en geïncu-beerd met antilichamen tegen verschillende proteolytische enzymen: polyclonale en monoclonale antilichamen in verdunningen van respectievelijk 1/4000 tot 1/8000 en 1/10. Na wassen met 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) die 150 mM NaCl bevatte en 0,05 % Tween-20 (TBST) werd het membraan geincubeerd met alkalische fosfatase geconjugeerd aan geit anti-konijn immuno-globuline serum of geit anti-muis (Bio-Rad Laboratoria, Richmond, Californië, Ver. Staten) 1/3000 verdund. Het PVDF membraan werd gewassen met TBST en het enzym antilichaam complex werd zichtbaar gemaakt door het membraan te incuberen in carbonaatbuffer (0,1 M NaHC03, 1,0 mM MgCl2 (pH 9,8) met 1% (v/v) nitroblauw tetrazolium (30 mg/ml) in 70% dimethylforma-mide en 1% (v/v) 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat dinatrium-zout (15 mg/ml) in 100% dimethylformamide. Antilichamen werden verkregen van het Departement van Microbiologie, van de Rijksuniversiteit Groningen (14, 18, 27).
Detectie van peptidase activiteit op polvacrvlamide gel
Eiwitten in het celvrije extract werden gescheiden op preparatieve gel elektroforese (7,5%). De gel werd vertikaal in 7 mm strips gesneden en daaropvolgend gewassen (2x) met 0,1 mM HEPES (pH 7) voor 10 minuten. De strips werden geincubeerd in een 10 ml oplossing die 1 mM β-naftylamide substraat bevatte en verdund in 100 mM HEPES pH 7, gedurende 2 tot 60 minuten (afhankelijk van de activiteit) bij 37°. De peptidase activiteit werd zichtbaar gemaakt binnen 5 minuten na toevoeging van een 10 ml Fast Garnet GBC oplossing (2 mg/ml water) (Sarath et al.). In het alternatief, werd de peptidase activiteit bekeken in de gelstrips door de detectie van leucine in een gekoppelde enzymreactie waarin orthodianisidine wordt geoxydeerd tot een roodbruine kleur. De gelstrips werden gedurende 60 min. bij 37°C geïncubeerd in een 8,4 ml oplossing bevattende 9 ml 100 mM HEPES (pH 7,5), 160 μΐ van een 50 mM Leu-Leu of Leu-Leu-Leu oplossing, 80 μΐ 23,3 mM ortho-dianisidine in 0,1 N zoutzuur, 80 μΐ 5000 units/ml peroxydase in 3,2 M ammoniumsulfaat en 80 μΐ 1 mg/ml L-aminozuuroxydase in 3,2 M ammoniumsulfaat.
Z int u i gel i j k <s_ t e s.t.
Een mengsel bevattende 2 ml 10% (w/v) van een tryptisch afbraakprodukt van caseïne in 25 mM kaliumfosfaat pH 7 en 0,5 mg van eiwit uit celextract werd geïncubeerd gedurende 6 uur bij 30°C. De bitterheid van het caseïneprodukt werd organoleptisch geëvalueerd door een panel van 6 personen. Geen verandering in bitterheid werd bitter genoemd, overblijvende bitterheid werd enigszins ontbitterd genoemd en geen bittere smaak werd volledig ontbitterd genoemd.
Gedeeltelijke zuivering van de. verschillende peptidasen
De condities voor de zuivering op Mono-Q ionenwisselaar chromatografie middels FPLC werden bepaald als volgt: 4 mg celvrij extract (100 μΐ) werd op een Mono-Q HR 5/5 kolom gebracht (Pharmacia LKB, Uppsala, Zweden). De enzymactiviteit werd geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0,15 tot 0,5 M NaCl in 20 mM Tris hydrochloride (pH 8,0). De stroomsnelheid was 1 ml/min. en fracties van 1 ml werden opgevangen en getest op peptidase activiteit met verschillende (chromogene) peptiden.
Eiwitbeoaling
Eiwitconcentraties werden bepaald met de Bio-Rad eiwit-bepaling (Bio-Rad Laboratoria, Richmond, Cal., Verenigde Staten) met bovine serum albumine als standaard.
Chemicaliën en reagentia
Tenzij anders vermeld, bevatten alle aminozuren en peptide derivaten gebruikt in deze studie, de L-anomeren van aminozuren. Alle chemicaliën waren "reagent grade" en werden verkregen van commerciële bronnen.
RESULTA1E.H
Screening met 178 Lactobacillus en Lactococcus stammen
Celvrije extracten van 178 Lactobacillus en Lactococcus stammen, verdeeld over 13 verschillende soorten, werden op hun proteolytische activiteit getest onder gebruikmaking van de volgende substraten: Lys-pNA en Arg-pNA (voor aminopeptidase in het algemeen), Glu-pNA (voor glutamyl aminopeptidase), Pro-pNA (voor prolydase), Ala-Pro-pNA (voor X-prolyldipeptidyl aminopeptidase) en Suc-Phe-pNa en MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (voor endopeptidase/proteïnase).
In fig. 1 worden de gemiddelde proteolytische activiteiten (in de figuur aangegeven als zwarte stippen) voor drie belangrijke substraten (Lys-pNA (Fig. IA), Ala-Pro-pNA (Fig. 1B) en MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (Fig. 1C)) weergegeven voor elke soort. Ook weergegeven zijn de maximum en minimum waarden. De resultaten laten duidelijk een grote variatie van proteolytische activiteit zien voor elke soort. Hoge activiteiten zijn gevonden, maar ook zeer lage activiteiten. Hetzelfde gold voor de bepalingen met de andere substraten (resultaten niet weergegeven). De resultaten laten ook zien dat Lactobacillus helveticus de hoogst gemiddelde activiteit met betrekking tot alle drie de chromogene peptiden heeft. Hetzelfde is waar voor andere peptiden, met uitzondering van Suc-Phe-pNA (resultaten niet weergegeven).
Om de ontbitteringseigenschappen van de Lactobacilli te bepalen, werden experimenten uitgevoerd met een bitter tryp-tisch digest van caseïne (zie materiaal en methode). Fig. 2 laat een aantal stammen zien die een tryptisch digest van caseïne kunnen ontbitteren binnen 6 uur (geheel ontbitterd, zwarte balk; gedeeltelijk ontbitterd, grijze balk; en niet ontbitterd, witte balk). In het bijzonder Lactobacillus helveticusstammen (20 stammen) en ook een aantal andere stammen (met name Lactococcussoorten (2 stammen) en Lactobacillus casei (5 stammen)), laten een significante ontbitteringsactiviteit zien.
Vergelijking tussen de proteolvtische activiteit van Lactobacillus helveticus SBT 2171 en andere melkzuurbacteriën
Lactobacillus helveticus SBT 2171, 8 andere sterk proteolytische Lactobacillus stammen en 2 Lactococcus stammen zijn verder onderzocht wat betreft hun peptidase en proteinase activiteit.
De resultaten van de hydrolyserende activiteit op 21 substraten zijn samengevat in Tabel 2. De hoogste proteolytische activiteiten zijn vet gedrukt. Lactobacillus helveticus SBT 2171 heeft de hoogste activiteit voor 12 van de 21 substraten waaronder enkele interessante carboxypeptidase substraten. Verder is de stam SBT 2171 tevens een van de hoogste actieve stammen voor een aantal andere substraten. In het bijzonder de activiteiten van peptidasen zijn het hoogst voor Lactobacillus helveticus SBT 2171: Leu-Leu-Leu, Lys-pNA, Leu-Leu, Lys-pNA, Leu-Leu en MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-PNA (S2586). Maar ook Ala-Pro-pNA en resorufin-caseïne worden door deze stam zeer goed gehydrolyseerd.
Gly-Phe-βΝΑ, Lys-Ser-4MPNA, Phe-Pro-Ala-βΝΑ, Pro-Arg-βΝΑ en Ser-Met-βΝΑ worden ook door Lactobacillus helveticus STB het best gehydrolyseerd.
Wanneer de proteolytische activiteit van Lactobacillus helveticus SBT 2171 met de activiteit van startcultuur Lactococci wordt vergeleken (L. lactis ssp. cremoris Wg2 en L. lactis ssp. lactis SK112), vallen een aantal significante verschillen op. Bij voorbeeld, Lactobacillus helveticus SBT 2171 laat een vijf- tot zevenvoudig hogere activiteit voor Lys-pNA zien, een meer dan 90-voudig hogere activiteit voor Pro-pNA en een bijna 10-voudig hogere activiteit voor MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA. Verder worden behalve Glu-Glu substraten alle andere substraten het best gehydrolyseerd door stam SBT 2171.
De resultaten laten duidelijk zien dat Lactobacillus helveticus SBT 2171 de hoogste proteolytische activiteit van alle geteste stammen bevat, waaronder een aantal starter-cultures Lactococci.
Ontbitteringsexperimenten zijn uitgevoerd met een aantal hoog proteolytische stammen. De resultaten laten zien dat alle stammen een zekere ontbitteringsactiviteit bezitten, waarvan die van Lactobacillus helveticus SBT 2171 de hoogste is (fig.3).
Aanvullende APIZYM experimenten werden uitgevoerd met geselecteerde Lactobacilli en Lactococci. Voor dit experiment werden 59 substraten onderzocht. De meeste stammen laten hydrolytische activiteit voor een breed spectrum van substraten zien. Beide APIZYM experimenten laten zien dat Lactobacillus helveticus SBT 2171 een hydrolytische activiteit heeft voor een wijd spectrum van substraten (Tabel 3).
Detectie van peptidase activiteit van Lactobacillus helveticus SBT 2171 op polyacrylamide gel (zymogramkleurinai
Zymogramstudies werden uitgevoerd om te bepalen hoeveel exo-peptidases er aanwezig zijn in Lactobacillus helveticus SBT 2171. Lactococcus lactis ssp. lactis Wg2 werd gebruikt als referentiestam. Tabel 4 laat de Rp-waarde zien van de hydrolyse activiteit, die na elektroforese van celvrij extract van beide stammen met verschillende substraten werden gevonden op een 7,5% polyacrylamide gel. De vergelijkbare resultaten werden gevonden voor Lactococcus lactis ssp. lactis Wg2. De Rp-waardes verschillen echter significant van die van Lactobacillus helveticus SBT 2171. Daarnaast hydrolyseert Lactococcus lactis ssp. cremoris Wg2 maar 6 van de 11 substraten, terwijl Lactobacillus helveticus SBT 2171 alle substraten in de gel hydrolyseert. Deze resultaten geven aan dat verschillende proteolytische enzymen aanwezig zijn in Lactobacillus helveticus SBT 2171 en Lactococcus lactis ssp. lactis Wg2.
SUIVEfilNg
De huidige experimenten laten een proteolytische activiteit van verschillende Lactobacillus soorten zien. Vergelijkende studies voor peptidases zijn eerder uitgevoerd voor Lactobacillus casei subspecies (1, 2, 9). Slechts een paar stammen van Lactobacillus caseï en een paar enzymactiviteiten zijn beschreven terwijl in de onderhavige experimenten 178 stammen van 12 Lactobacillus soorten zijn vergeleken voor proteolytische activiteit. Bovendien zijn ongeveer 13 verschillende peptidase en proteinase activiteiten gemeten voor elke stam door gebruik te maken van meer dan 20 verschillende substraten en werden 60 additionele substraten gebruikt in een micro enzym APIZYM systeem. De resultaten van deze studie laten duidelijk zien dat er een grote variatie aan proteolytische activiteit in de verschillende geteste Lactobacillus stammen bestaat. Hoog proteolytisch actieve stammen waren aanwezig, maar ook stammen met nauwelijks enige activiteit werden gevonden. Bovendien verschilt de proteolytische activiteit van stammen van dezelfde soort significant (Bijvoorbeeld de meeste Lactobacillus helveticus stammen zijn hoog proteolytisch, terwijl Lactobacillus helveticus SBT 0351 nauwelijks of geen proteolytische activiteit vertoont (resultaten niet weergegeven) . Er kan worden geconcludeerd, dat van de geteste Lactobacillus en Lactococcussoorten, Lactobacillus helveticus het meest proteolytische soort is voor een breed spectrum van substraten. Maar ook de afname in bitterheid, als gezien na incubatie van het tryptisch β caseïne digest met celextracten van Lactobacillus helveticus, is significant hoger dan met andere melkzuurbacteriesoorten. Hoewel geen duidelijke correlatie tussen een specifieke peptidase activiteit en ontbitteringsactiviteit kan worden gemaakt, is dit fenomeen waarschijnlijk te verklaren door een afname van bittere peptiden in het mengsel.
Verdere studie met een selectie van een aantal hoog proteolytische Lactobacillus stammen laat duidelijk zien, dat Lactobacillus helveticus SBT 2171 het meest proteolytisch is.
Deze stam heeft de hoogste proteolytische activiteit voor: Lys-pNA, Arg-pNA, Glu-pNA, His-βΝΑ, Leu-Leu, Leu-Leu-Leu, pro- pNA en Pro-Ala, MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA, Bzl-Cys-pNA, Z-Phe-Ala, Z-Ala-Ile en Hyp-Lys. Daarnaast heeft deze stam zeer hoge activiteiten gemeten voor andere substraten zoals Ala-Pro-pNA en resorufine-caseïne. Het lijkt erop dat het algemene aminopeptidase van stam SBT 2171 ook in staat is Pro-pNA te hydrolyseren. Dit gegeven was nog niet eerder bekend voor Lactobacillus helveticus.
Er kan worden geconcludeerd dat Lactobacillus helveticus SBT 2171 een hogere proteolytische activiteit laat zien dan de geteste Lactococci stammen. Dit is een interessante conclusie aangezien voor het rijpen van de meeste kazen (met uitzondering van Emmenthaler en Gruyère) (19) voornamelijk Lactococcus startercultures worden gebruikt, hetgeen een grote bijdrage impliceert van deze stammen aan proteolyse. Het moge duidelijk zijn dat de ontwikkeling van een stam met superieure proteolytische activiteiten zoals Lactobacillus helveticus het rijpen van kaas significant zal kunnen beïnvloeden. De hoge proteolytische activiteit van Lactobacillus helveticus SBT 2171 kan een gevolg zijn van individuele enzymen, maar ook onbekende expressie of regulatoire factoren kunnen in het spel zijn.
Claims (14)
1. Lactobacillus Helveticus SBT 2171 of een mutant daarvan, met de volgende eigenschappen; hoge proteolytische activiteit en ontbitteren van een tryptisch hydrolysaat van caseïne in zes uur.
2. Lactobacillus Helveticus SBT 2171 zoals gedeponeerd onder het nummer CBS404.93.
3. Gebruik van een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2 in een fermentatieproces.
4. Gebruik volgens conclusie 3, waarbij het fermentatieproces wordt toegepast bij de rijping van kaas.
5. Recombinant DNA molecule dat tenminste codeert voor tenminste een deel van een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2, van welk recombinant DNA molecule het coderende deel onder stringente omstandigheden hybridiseert met het DNA van het gedeponeerde micro-organisme met het nummer CBS404.93.
6. Gebruik van een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2, bij de proteolyse van biologisch actieve peptiden.
7. Farmaceutische formulering die een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2, alsmede een farmaceutisch acceptabele drager omvat.
8. Proteolytisch enzym afkomstig van een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2.
9. Gebruik van tenminste een enzym volgens conclusie 8, voor de proteolyse van biologisch actieve peptiden.
10. Farmaceutische formulering die tenminste een enzym volgens conclusie 8, alsmede een farmaceutisch acceptabele drager omvat.
11. Werkwijze voor het fermenteren van een van melk afkomstig preparaat, waarbij een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2 in cultuur wordt gegroeid in aanwezigheid van het preparaat, onder voor Lactobacillus reguliere groeiomstandigheden.
12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij het preparaat verse kaaswrongel is.
13. Antilichamen opgewekt tegen een of meerdere bestanddelen van een micro-organisme volgens conclusie 1 of 2.
14. Antilichamen volgens conclusie 13, die specifiek zijn voor een organisme volgens conclusie 1 of 2. LITERATUUR
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9301525A NL9301525A (nl) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties. |
| JP23591294A JP3618122B2 (ja) | 1993-09-03 | 1994-09-05 | 新規なラクトバチルス属菌株、たんぱく質及びそのシークエンスならびにこれらの菌株、たんぱく質及びシークエンスの利用法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9301525A NL9301525A (nl) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties. |
| NL9301525 | 1993-09-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9301525A true NL9301525A (nl) | 1995-04-03 |
Family
ID=19862831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9301525A NL9301525A (nl) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3618122B2 (nl) |
| NL (1) | NL9301525A (nl) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003012074A2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Den Kgl. Veterinær- Og Landbohøjskole | Bacterial strains belonging to lactobacillus species and their use in food and feed industry |
| WO2005096847A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-10-20 | Campina Nederland Holding B.V. | Method of preparing a food ingredient and food product having angiotensin-i-converting enzyme inhibiting properties and products thus obtained |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4628508B2 (ja) * | 1999-08-23 | 2011-02-09 | 株式会社伸栄フェルメンテック | 痛みの緩和・除去剤および痛みの緩和・除去用医療補助具 |
| JP2009296972A (ja) * | 2008-06-16 | 2009-12-24 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 酵素処理チーズ及びその製造方法 |
| JP7160652B2 (ja) * | 2018-11-29 | 2022-10-25 | 雪印メグミルク株式会社 | 歯周病予防用組成物 |
| CN117801080B (zh) * | 2024-01-24 | 2024-10-22 | 东北农业大学 | 一种干酪乳杆菌细菌素及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0365173A1 (en) * | 1988-10-05 | 1990-04-25 | Agricultural Genetics Company Limited | Novel microorganism and use thereof in ripening cheese |
-
1993
- 1993-09-03 NL NL9301525A patent/NL9301525A/nl not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-09-05 JP JP23591294A patent/JP3618122B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0365173A1 (en) * | 1988-10-05 | 1990-04-25 | Agricultural Genetics Company Limited | Novel microorganism and use thereof in ripening cheese |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.KOK AND G.VENEMA: "Genetics of proteinases of lactic acid bacteria", BIOCHIMIE, vol. 70, 1988, pages 475 - 488, XP002041320 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003012074A2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Den Kgl. Veterinær- Og Landbohøjskole | Bacterial strains belonging to lactobacillus species and their use in food and feed industry |
| WO2003012074A3 (en) * | 2001-07-30 | 2004-03-25 | Den Kgl Veterinaer Og Landboho | Bacterial strains belonging to lactobacillus species and their use in food and feed industry |
| WO2005096847A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-10-20 | Campina Nederland Holding B.V. | Method of preparing a food ingredient and food product having angiotensin-i-converting enzyme inhibiting properties and products thus obtained |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3618122B2 (ja) | 2005-02-09 |
| JPH07274949A (ja) | 1995-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sasaki et al. | Comparison of proteolytic activities in various lactobacilli | |
| KR100404154B1 (ko) | 트리펩티드 고생산성 락토바실루스·헬베티커스 유산균 및발효유 제품, 그리고 그 제조법 | |
| Shihata et al. | Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria | |
| Gobbetti et al. | The proteolytic system of Lactobacillus sanfrancisco CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidase | |
| Law et al. | The release of intracellular dipeptidase from starter streptococci during Cheddar cheese ripening | |
| Valence et al. | Zymogram and preliminary characterization of Lactobacillus helveticus autolysins | |
| US4158607A (en) | Enzymatic preparation for ripening of milk protein products | |
| Requena et al. | Characterization of Lactococci and Lactobacilli isolated from semihard goats' cheese | |
| GILBERT et al. | Comparison of cell surface proteinase activities within the Lactobacillus genus | |
| El Soda et al. | Detection and localization of peptide hydrolases in Lactobadllus casei | |
| Kenny et al. | Growth phase and growth medium effects on the peptidase activities of Lactobacillus helveticus | |
| Choi et al. | Culture conditions for the production of esterase from Lactobacillus casei CL96 | |
| Wohlrab et al. | Purification and characterization of a dipeptidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | |
| Miyakawa et al. | Purification and characterization of an X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus LBU-147 | |
| Arora et al. | Comparative studies on peptidases of Lactobacillus casei subspecies | |
| Stepaniak et al. | Characterization of the principal intracellular endopeptidase from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363 | |
| NL9301525A (nl) | Nieuwe Lactobacillusstammen, eiwitten en sequenties daarvan, alsmede werkwijzen voor de toepassing van deze stammen, eiwitten en sequenties. | |
| Khalid et al. | Esterases of Lactobacillus helveticus and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus | |
| Abo‐Elnaga et al. | Peptidases of Lactobacillus casei and L. plantarum | |
| EP0415470B1 (en) | Aminopeptidase | |
| JP3684577B2 (ja) | トランスグルタミナーゼ産生微生物のスクリーニング方法 | |
| El-Din et al. | Proteolytic, lipolytic and autolytic activities of enterococci strains isolated from Egyptian dairy products | |
| Simitsopoulou et al. | Purification and partial characterization of a tripeptidase from Pediococcus pentosaceus K9. 2 | |
| El Soda et al. | The intracellular peptide-hydrolases of Lactobacillus plantarum. Comparison with Lactobacillus casei | |
| Fernandez-Espla et al. | Purification and characterization of a dipeptidase from Lactobacillus casei ssp. casei IFPL 731 isolated from goat cheese made from raw milk |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BV | The patent application has lapsed | ||
| BV | The patent application has lapsed |